JPH10197530A - 免疫学的凝集反応試薬の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 凝集性が高く非特異反応を起こさない試薬を
提供する。 【解決手段】 ブロッキング剤として高分子量化または
会合した変性タンパクを用い、抗原又は抗体がラテック
スなどの不溶性担体に担持された免疫学的凝集反応試薬
を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は抗原抗体反応を利用
する診断用試薬を効率的かつ簡便に製造する方法に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】免疫学的凝集反応試薬は、抗原抗体反応
に伴う凝集反応を利用した代表的な試薬である。即ち、
免疫学的凝集反応試薬では、不溶性担体に特定の抗原又
は抗体が固定化されており、該固定化された抗原（又は
抗体）に対応する抗体（又は抗原）が存在すると抗原抗
体反応により凝集が起こるため、上記の抗体（又は抗
原）が検知できる。最近は、抗原精製技術の進歩により
固定化される抗原や抗体として特異性の高いものが得ら
れるようになり、免疫学的凝集反応試薬の臨床検査にお
ける応用範囲がさらに拡大している。

【０００３】また、近年は、自動分析装置の発展に伴
い、自動分析装置による定量分析のニーズが高まってお
り、免疫学的凝集反応試薬を用いた検査においても鋭敏
性、正確性が求められている。特に、感染症等の診断に
おいては、更に高感度な検査ができる免疫学的凝集反応
試薬が求められている。

【０００４】原理的には、不溶性担体に多くの抗原ある
いは抗体を吸着させれることができれば、免疫学的凝集
反応の感度を高めることができる。しかし、抗原や抗体
の不溶性担体への吸着効率はさほど高くなく、吸着量を
増やすためには高価な抗原や抗体を多量に使用する必要
がある。そこで、試薬の凝集性を高めるために凝集促進
剤として検体希釈液にポリエチレングリコール等の高分
子化合物を添加したり、不溶性担体として凝集力の高い
粒子を使用したりする方法が一般に行なわれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかし、これらの方法
では、試薬の凝集性は高くなるものの、感度低下の原因
となる非特異的な凝集反応も促進されてしまう。また、
凝集促進剤として高分子化合物を添加する方法を採用し
た場合には、その添加量を多くすると試薬粘度が高くな
り、撹拌効率が悪化して測定の再現性が低下するという
問題点があった。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく免疫学的凝集反応試薬を製造する方法につ
いて種々検討した結果、ブロッキング剤として高分子量
化または会合した変性タンパクを用いることによって、
より高感度で且つ非特異的反応が少なく、測定再現性の
良い免疫学的凝集反応試薬が製造できるという知見を
得、本発明を完成するに至った。

【０００７】即ち、本発明は、抗原又は抗体を不溶性担
体に担持させる処理およびブロッキング処理をして免疫
学的凝集反応試薬を製造する方法において、ブロッキン
グ剤として高分子量化または会合した変性タンパクを用
いることを特徴とする免疫学的凝集反応試薬の製造方法
である。

【０００８】本発明では上記の手段によって、感度が高
く且つ非特異反応が少ない免疫学的凝集反応試薬を簡便
に製造することが可能となる。その詳細な理由は明らか
ではないが、ブロッキング剤として、例えば加熱処理す
ることによって得られる高分子量化または会合した変性
タンパクを用いると、該変性タンパクが不溶性担体に吸
着し、非特異的な凝集を引き起こす吸着サイトを覆って
しまうため、非特異的な凝集が抑制されるものと推定さ
れる。そして、その結果として、目的の抗原抗体反応に
対して鋭敏に凝集反応を起こすことが可能になるものと
推察される。

【０００９】

【発明の実施の形態】本発明の製造方法では、抗原又は
抗体を不溶性担体に担持させる処理とブロッキング処理
を行う。

【００１０】本発明で使用される不溶性担体としては、
少なくとも測定試料（検体）溶液並びに担持処理時およ
びブロッキング処理時に使用する分散媒となる溶液に不
溶であり、抗原（又は抗体）を担持した後に、対応する
抗体（又は抗原）と抗原抗体反応を起こして凝集するも
のであれば公知の担体が特に制限されずに使用できる。

【００１１】好適に使用できる不溶性担体を例示すれ
ば、ポリスチレン、スチレン-ブタジエン共重合体、ス
チレン-メタクリル酸共重合体、スチレン-グリシジルメ
タクリレート共重合体、スチレン-スチレンスルホン酸
塩共重合体、メタクリル酸重合体、ポリグリシジルメタ
クリレート、アクリロニトリル-ブタジエン共重合体、
ポリ酢酸ビニルアクリレート、アクロレイン-エチレン
グリコールジメタクリレート共重合体の様な乳化重合に
より得られる有機高分子ラテックス等の有機高分子物質
の微粒子、あるいはシリカ、シリカ-アルミナ、アルミ
ナの様な無機酸化物又は該無機酸化物等にシランカップ
リング処理等を施し、官能基を導入した無機粒子さらに
はヒトO型血球、ヒツジ赤血球等の生物由来の粒子等が
挙げられる。

【００１２】上記不溶性担体の粒径は特に制限されるも
のではないが、抗原抗体反応後の凝集の起こり易さや凝
集の判別のし易さの観点から、平均粒径が0.05〜10μm
の不溶性担体を使用するのが好適である。自動分析装置
での分析に適し、かつ粒子が自然沈降しにくいという点
で0.05〜0.4μｍの担体が特に好適である。

【００１３】本発明で上記の不溶性担体に担持される抗
原（又は抗体）とは、それぞれ検査対象となる抗体（又
は抗原）と抗原抗体反応を起こすものであれば特に限定
されない。本発明で好適に使用される抗原又は抗体を例
示すれば、梅毒診断のためのトレポネーマ・パリダム
（Treponema Pallidum；以下TPと略すこともある。）菌
体成分由来の抗原、Ｂ型肝炎診断のためのＢ型肝炎ウイ
ルス表面抗原（HBs）の他、抗ヒトアルブミン抗体、抗
ヒト免疫グロブリン（IgG）抗体、抗ヒトC反応性タンパ
ク（CRP）抗体、抗α-フェトプロテイン（AFP）抗体、
抗インシュリン抗体、抗β2ーマイクログロブリン（β2ー
m）抗体、抗フィブリノーゲン分解産物（FDP）抗体等が
挙げられる。

【００１４】抗原又は抗体を不溶性担体に担持させる処
理方法としては、既知の方法が特に制限されずに使用で
きる。基本的な担持方法としては物理吸着法と化学的結
合法があり、担持操作の簡便性という点で物理的吸着法
が好適に使用される。

【００１５】物理吸着法では、抗原（又は抗体）を分散
させた分散液に不溶性担体を浸漬し、液中の抗原（又は
抗体）を不溶性担体に物理的に吸着させるのが一般的で
ある。この時使用される溶媒はこれらの物質を溶解もし
くは均一に分散させるものであれば特に限定されず公知
の溶媒が何ら制限なく使用できるが、使用する抗原又は
抗体の生理活性を有効に保つために生理食塩水、あるい
はpHが調節された緩衝作用を持つ水溶液、例えば、pH6
〜8に調節された10mMから200mM程度のリン酸緩衝液、あ
るいはpH7〜9に調節された10mMから200mM程度のグリシ
ン緩衝液、トリス緩衝液等を使用するのが好適である。
上記の分散液中の抗原又は抗体の濃度は特に限定されな
いが、担持効率や担持の均一性等の観点から１（μｇ−
抗原又は抗体／ｍｌ−液）〜１０（ｍｇ−抗原又は抗体
／ｍｌ−液）となるように分散させるのが好適である。
該分散液に不溶性担体を浸漬し、抗原（又は抗体）を吸
着させる条件は、使用する不溶性担体の種類や担持させ
る抗体や抗原の種類ごとに、担持効率や操作性を勘案し
て適宜決定すればよいが、一般的な条件は次の通りであ
る。

【００１６】即ち、該分散液に浸漬する際の担体の使用
量は、抗原や抗体の種類によって適宜決定すればよい
が、担持効率や操作性等の観点から該分散液に浸漬した
ときの重量％で表して、０．００１〜１０wt%であるの
が好適である。なお、これら担体は、懸濁液の形で使用
されるのが一般的である。該分散液に担体を浸漬させる
温度は担体の性質や緩衝液の成分によって適宜選択すれ
ば良いが、一般には４℃〜５０℃が好適に用いられる。
該分散液に担体を浸漬する時間は３０分〜一昼夜行うの
が一般的である。

【００１７】本発明におけるブロッキング処理とは、測
定において目的とする抗体（又は抗原）以外の試料中に
存在するタンパクが担体に吸着して非特異的な反応を起
こすのを抑制するために行う処理で、目的とする抗原抗
体反応に対して不活性なブロッキング処理剤を不溶性担
体に吸着させる処理のことを言う。本発明において、ブ
ロッキング処理は、前述の担持処理を行う際にブロッキ
ング処理剤を共存させて担持処理と同時に行うこともで
きるし、担持処理後に別に行うこともできる。

【００１８】本発明は、ブロッキング処理剤として高分
子量化または会合した変性タンパクを用いることを最大
の特徴としている。

【００１９】本発明でブロッキング処理剤として使用す
る高分子量化または会合した変性タンパクとは、加熱処
理や超音波処理の様な物理的処理法や酸又はアルカリ等
による化学的処理法によって化学結合を介して高分子量
化したタンパク、又はタンパクが水素結合、疎水性相互
作用等により可逆的あるいは不可逆的に会合したもので
ある。

【００２０】上記変性タンパクの原料となるタンパク
（以下、「原料タンパク」ともいう。）は、目的とする
抗原抗体反応に対して不活性で且つ不溶性担体に吸着可
能なタンパクであれば特に限定されないが、入手し易さ
や経済性の点で牛血清アルブミンやカゼイン等が好適に
用いられる。

【００２１】原料タンパクを加熱処理して変性する場合
は、変性効率の観点から0.01%〜20%、好ましくは0.1%〜
5%の原料タンパク溶液を加熱処理する。ここで、加熱と
は３０℃を越える温度で保持することをいう。室温で長
時間保存しても高分子量化あるいは会合は起こるが、要
する時間が長すぎるため実用性に欠ける。３０℃より高
い温度で保持すれば数十時間以内の操作で効果が得られ
る。原料タンパク溶液の濃度が低すぎると変性しにくく
なり、高すぎるとゲル状に凝固したりして変性効率が低
くなることがある。処理時間は、処理温度に応じて適宜
決定すればよい。好適な処理温度および処理時間は、37
℃〜120℃および10分〜24時間である。一般に比較的低
い温度を採用した場合には長時間の処理を要する。十分
な効果をもたらす変性を行うためには、0.1%〜5%の原料
タンパク溶液を摂氏（℃）で表した処理温度Ｔと時間
（ｈ）で表した処理時間ｔとの関係が、15.0＞３lnＴ＋
lnｔ＞12.00（但し、150＞Ｔ＞30）となるような条件で
加熱処理を行うことが特に好適である。例えば100℃で
加熱する場合には、1/6〜１時間程度（３lnＴ＋lnｔ＝1
2.02〜13.82）処理すればよい。処理する温度が低すぎ
ると変性あるいは会合しにくいし、高すぎるとタンパク
が凝固したり着色したりする。

【００２２】原料タンパクを超音波処理や化学的な処理
を行って変性する場合も原料タンパクの濃度、処理温度
および処理時間は加熱処理と同様の条件範囲から適宜選
択すればよい。

【００２３】超音波処理を行う場合は使用する原料タン
パクによって多少異なるが、超音波洗浄機のような比較
的穏やかな条件で30分から数時間処理するのが好まし
い。化学的処理を行う場合も同様に比較的穏やかな条
件、例えば酸性ならばpH3〜6、アルカリ性ならpH9〜12
程度の範囲が好ましい。pHが低すぎると原料タンパクが
凝固したり、pHが高すぎると原料タンパクがかえって低
分子化したりする場合がある。

【００２４】以上のような処理をして得た変性タンパク
は、例えばポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動を
行ない、原料タンパクと分子量を比較することにより、
高分子量化あるいは会合していることが確認できる。ま
た、原料タンパクが変性した場合には、分光光度計によ
り波長λ＝280nmで該ブロッキング液の吸光度変化を測
定することによって変性の有無を確認することもでき
る。このようなタンパクの変性はブロッキング処理後に
おいても、電気泳動等によって確認することができる。

【００２５】ブロッキング処理は、前記の担持処理時
に、分散液中に上記ブロッキング処理剤を共存させる
か、或いは、ブロッキング剤が溶解した溶液に担持処理
をした不溶性担体を浸漬することによって行う。

【００２６】上記ブロッキング処理に用いるブロッキン
グ剤溶液の溶媒は特に制限されないが、生理食塩水、リ
ン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩
衝液又はグッド緩衝液等が一般に使用される。溶液のｐ
Ｈは変性の方法や用いるタンパクによって適宜選択され
るが、一般的にはｐＨ５〜９の範囲であるのが好まし
い。

【００２７】ブロッキング処理時の変性タンパク（ブロ
ッキング剤）の濃度は使用する免疫凝集反応試薬によっ
て異なるが、ブロッキング後に不溶性担体に吸着（保
持）される変性タンパクの量が不溶性担体1mgに対し
て、0.1mg〜10mg となる濃度であることが好ましい。ま
た、不溶性担体に吸着される変性タンパクの量は、必ず
しも溶液の初期濃度で制御する必要はなく、ブロッキン
グ処理中に変性タンパクを適宜溶液に添加して吸着量を
制御しても良い。

【００２８】この様にして抗原又は抗体が担持された担
体はブロッキング処理を行なった後、遠心分離等により
分離洗浄し、最終的に、抗原抗体反応あるいは粒子の凝
集性、保存性等を勘案して適宜選択した緩衝液に分散さ
せて、免疫学的凝集反応試薬とされる。

【００２９】上記のような方法により、感度の高い免疫
凝集反応試薬を得ることができる。

【００３０】本発明の方法によって得られる免疫凝集反
応試薬は、検体中の抗体又は抗原と接触させた時に起こ
る抗原抗体反応に伴い担体が凝集する現象を利用した試
薬であり、定性試薬としては、ラテックス凝集試薬、マ
イクロタイター試薬などが、また定量試薬としては凝集
の度合いを光学的に測定するラテックス定量試薬が例示
できる。

【００３１】次に、本発明の免疫学的凝集反応試薬の例
としてラテックス定量試薬の二液（甲剤、乙剤）からな
る試薬形態を示し、該試薬を用いた検査方法について具
体的に説明する。なお、下記の例示における各物質の濃
度は、試薬として使いやすい範囲を例示するものであっ
て、本発明を限定するものではない。

【００３２】甲剤：下記（１）、（２）及び（３）を基
本成分とする混合液 （１）緩衝液 20〜1000mM、ｐＨ4〜12 （２）抗原（又は抗体）と高分子量化あるいは会合した
変性タンパクを担持した担体0.01％〜0.5％（ｗ/ｖ；甲
剤基準） （３）塩化ナトリウム 50〜300mM 乙剤：下記（４）及び（５）を基本成分とする混合液 （４）緩衝液 20〜1000mM 、pH4〜12 （５）塩化ナトリウム 50〜300mM 緩衝液としてはリン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン
緩衝液、ホウ酸緩衝液又はグッド緩衝液等が例示でき
る。

【００３３】上記免疫学的凝集反応試薬の測定方法は被
検液を乙剤で10倍から30倍程度に希釈して37℃で５分程
度静置する。次いで甲剤を添加し、適当な波長を選択し
て吸光度の経時変化を測定し、試薬の凝集状態を検知す
る。甲剤の使用量は抗体や抗原の種類によって適宜決定
すればよいが、担持効率や操作性の観点から、測定時の
溶液中の担体の濃度が0.001〜15wt%となるように用いる
のが好適であり、懸濁液の形で使用されるのが一般的で
ある。

【００３４】

【発明の効果】高分子量化あるいは会合した変性タンパ
クをブロッキング剤として用いることにより非特異的な
凝集反応を起こすことなく、未処理のタンパクを用いた
ときよりも凝集性に優れた、即ち感度が高い免疫凝集反
応試薬とすることができる。

【００３５】

【実施例】以下、実施例によりさらに本発明を詳細に説
明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもので
はない。

【００３６】実施例１〜８ （１）加熱処理牛血清アルブミン（ＢＳＡ）の調製 市販のＢＳＡ（シグマ）1gを50mMグリシン緩衝液100gに
溶解した。次いで表１に示す温度と時間でゆっくり振と
うした後、4℃に冷却し、保存した。

【００３７】（２）ＴＰ抗原担持ラテックス懸濁液（甲
剤）の調製 平均粒径0.3μｍ、ラテックス濃度5%のポリスチレン粒
子懸濁液0.1mlをpH8.6の20mMグリシン緩衝液で10μg/ml
に希釈したＴＰ抗原液0.9mlに加えて混合した。4℃で4
時間静置した後、上述の加熱処理ＢＳＡを含む水溶液2m
lを添加し、さらに1.5時間静置した。次いで遠心分離に
より得られた沈さ（ＴＰ抗原担持ラテックス）に2mlの1
00mM塩化ナトリウムと0.1%アジ化ナトリウムを含むpH8
の１００ｍＭトリス緩衝液（以下この混合液をＴＢＳと
略す）を加えて懸濁して甲剤を調製した。

【００３８】（３）緩衝液（乙剤）の調製 １％のＰＥＧ-20000（和光純薬工業）を含むＴＢＳを調
製して乙剤とした。

【００３９】（４）被検液の調製 ヒト正常血清で梅毒陽性コントロール血清（国際試薬）
を２倍に希釈し被検液とした。

【００４０】（５）測定法 乙剤240μlに被検液10μlをガラスセル中で添加攪拌し
た後、37℃で5分間静置した。次いで甲剤を80μl添加攪
拌し、30秒後から200秒までの波長700nmにおける光学密
度変化量を測定した。以上の操作には、自動分析装置Ｔ
ＢＡ−３０Ｒ（東芝メディカル）を用いた。

【００４１】（６）加熱処理条件と光学密度変化量との
関係 異なる温度、処理時間条件で処理した加熱処理ＢＳＡを
ブロッキング剤として使用して調製した甲剤と乙剤を組
み合わせて、梅毒コントロール血清を測定した結果を表
１に示した。

【００４２】なお、各ブロッキング剤の変性の状態は、
界面活性剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を
含まない緩衝溶液を用いて電気泳動（ｎｏｎ−ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ）を行い、次いで銀染色を行って、タンパクの
分画されたバンドを観察することによって確認、評価し
た。即ち、(1)未処理のものと比較して、分子量が２倍
以上の高分子バンドが明瞭に観察されたもの、(2)未処
理のものと比較して、それぞれのバンドに分子量の増加
が観察されたもの及び(3)高分子量のタンパクが多くな
り、バンドがブロード（Broad Band）になって明瞭なバ
ンドが観察されなくなったものをそれぞれ、「＋＋」、
「＋」及び「ＢＢ」として評価した。

【００４３】

【表１】

【００４４】加熱処理したＢＳＡを用いた試薬の光学密
度変化量は、△ＯＤ＝0.271〜0.472であり、未処理のＢ
ＳＡを用いた試薬の光学密度変化量が△ＯＤ＝0.251で
あるのに対して大きいことが判る。

【００４５】この光学密度変化量の大小は凝集性の高低
を意味し、大きいほど凝集性に優れ、ひいては感度が高
いことを示すので、本発明の試薬は感度が向上している
ことが判る。

【００４６】比較例１ （１）未処理ＢＳＡの調製 市販のＢＳＡ（シグマ）1gを２５℃で100mMトリス緩衝
液100gに溶解し、次いで4℃に冷却し、保存した。

【００４７】（２）ＢＳＡの調製以外は実施例１と同様
な操作で行った。

【００４８】（３）加熱処理条件と光学密度変化量との
関係 未処理のＢＳＡをブロッキング剤として使用して調製し
た甲剤と乙剤を組み合わせて、梅毒コントロール血清を
測定した結果を表１に示した。

【００４９】尚、正常血清を測定した時の非特異凝集は
実施例１〜８および比較例１のいずれの試薬でも起こら
なかった。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗原又は抗体を不溶性担体に担持させる
   処理およびブロッキング処理をして免疫学的凝集反応試
   薬を製造する方法において、ブロッキング剤として高分
   子量化または会合した変性タンパクを用いることを特徴
   とする免疫学的凝集反応試薬の製造方法。
2. 【請求項２】 抗原又は抗体を不溶性担体に担持させる
   処理およびブロッキング処理をして免疫学的凝集反応試
   薬を製造する方法において、ブロッキング剤として加熱
   処理されたタンパクを用いることを特徴とする免疫学的
   凝集反応試薬の製造方法。
3. 【請求項３】 不溶性担体がラテックス粒子であり、該
   不溶性担体に担持させる抗原がトレポネーマ・パリダム
   菌体由来の抗原であり、ブロッキング剤が加熱処理され
   た牛血清アルブミンである請求項１又は２記載の免疫学
   的凝集反応試薬の製造方法。