WO2009123061A1 - 精製血清アルブミン及び免疫学的測定方法 - Google Patents

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WO2009123061A1
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solution
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antigen
purified serum
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原康之
赤峰隆之
吉川勝己
川本道子
Original Assignee
積水メディカル株式会社
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/76—Albumins
    • C07K14/765—Serum albumin, e.g. HSA

Definitions

  • the present invention relates to purified serum albumin having a small lot difference and an immunoassay method having high reactivity and less non-specific reaction using the purified serum albumin.
  • an immunological measurement method As a method for measuring trace substances contained in blood, urine and the like, an immunological measurement method is employed.
  • the immunological measurement method is based on specific strong binding of an antigen-antibody reaction, and can specifically measure a target substance with high sensitivity even from a sample in which various substances are mixed.
  • trace components such as cancer markers in blood
  • antigens such as viruses, antibodies against bacteria and viruses
  • further enhancement of sensitivity in immunological measurement methods is strongly demanded. It has become like this.
  • Patent Document 1 a method of adding a reaction accelerator in a measurement reagent
  • Patent Document 2 a method of adding a large amount of inactive protein in a reaction system
  • Patent Document 3 a method in which an antigen or antibody is immobilized on an insoluble carrier and blocked with an immunologically inactive protein or the like, and a blocking agent is denatured by heat
  • Patent Document 3 a method in which an antigen or antibody is immobilized on an insoluble carrier and blocked with an immunologically inactive protein or the like, and a blocking agent is denatured by heat
  • Patent Document 1 has a problem that a nonspecific reaction may be induced.
  • Patent Documents 2 and 3 it is common to use serum-derived albumin as a blocking agent for preventing non-specific reactions.
  • serum albumin has a problem that the reactivity may vary greatly depending on the lot difference or a sufficient effect may not be obtained.
  • an object of the present invention is to provide purified serum albumin having a small lot difference and an immunological measurement method having high reactivity and less non-specific reaction using the purified serum albumin.
  • the present invention relates to serum albumin used in a suspension of a blocking agent and / or an insoluble carrier in an immunoassay method, and an albumin fraction eluted with an eluent having a salt concentration of 150 mM or less in purification by anion exchange chromatography. Purified serum albumin consisting of minutes.
  • the present invention is described in detail below.
  • the present inventors have found that when a specific albumin fraction is used in a suspension of a blocking agent and / or an insoluble carrier, there is almost no lot difference, high reactivity, and non-specific reaction.
  • the present inventors have found that few immunological measurements can be performed and have completed the present invention.
  • Serum albumin in blood usually adsorbs bilirubin, free fatty acids, etc., and plays a role in transporting them. It is thought that the conventional lot difference of serum albumin may have occurred due to the presence or absence and the ratio of these adsorbates.
  • the albumin fraction eluted at a salt concentration of 150 mM or less in the purification of anion exchange chromatography is a fraction with very little adsorbate, and by using this fraction, immunoreactivity is high and non-specific reaction is low. It is thought that the measurement was realized.
  • the purified serum albumin of the present invention consists of an albumin fraction eluted at a salt concentration of 150 mM or less in anion exchange chromatography purification.
  • Serum albumin used as a raw material for the purified serum albumin of the present invention is albumin derived from animal serum, and specifically, for example, serum albumin derived from the serum of large mammals such as humans, cows, horses and sheep is suitable. is there.
  • bovine serum-derived serum albumin is particularly suitable because it is inexpensive and can be obtained in large quantities.
  • the serum albumin is roughly purified by a modified corn method, a heat shock method or the like before performing anion exchange chromatography purification.
  • the column carrier used for the above-described anion exchange chromatography purification is not particularly limited.
  • weak anionic DEAE Separose Fast Flow ANX Separose 4Fast Flow
  • strong anionic Q Separose Fast Flow Q Sepharose XL, etc. Is mentioned.
  • the preferred lower limit of the particle size of the carrier of the column used for the anion exchange chromatography purification is 10 ⁇ m, and the preferred upper limit is 200 ⁇ m.
  • the particle size of the carrier of the column is less than 10 ⁇ m, the back pressure increases, and the flow rate during purification may have to be slowed down.
  • the particle size of the column support exceeds 200 ⁇ m, the resolution may be deteriorated.
  • a more preferable lower limit of the particle size of the carrier of the column is 45 ⁇ m, and a more preferable upper limit is 165 ⁇ m.
  • HiPrep16 / 10DEAE FF HiPrep16 / 10ANX FF (high sub), HiPrep16 / 10Q FF (all manufactured by GE Healthcare) may be used as the column used for the above-described anion exchange chromatography purification.
  • a buffer solution (hereinafter also referred to as a binding solution) used when serum albumin is bound to a column carrier in the anion exchange chromatography purification is not particularly limited, and examples thereof include a phosphate buffer, a glycine buffer, and a Tris buffer. Etc.
  • the concentration of the buffer solution is usually in the range of 5 to 150 mM.
  • the pH of the buffer solution is preferably 4 to 9, and more preferably 5 to 8.
  • Examples of the eluate used for the anion exchange chromatography purification include those having a salt concentration of 150 mM or less.
  • a phosphate buffer solution, a glycine buffer solution, a Tris buffer solution or the like has a salt concentration of 150 mM or less.
  • the salt is not particularly limited, and examples thereof include sodium chloride (NaCl) and potassium chloride (KCl).
  • the pH of the eluate is preferably 4 to 9, and more preferably 5 to 8. Usually, however, a solution obtained by adding a salt to the same buffer as the binding solution is used.
  • a preferred example of the purification method by the anion exchange chromatography will be described.
  • a solution in which serum albumin is added to a binding solution for example, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
  • a binding solution for example, 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)
  • serum albumin is adsorbed on the anion exchange column while flowing the binding solution.
  • serum albumin is eluted by flowing an eluate having a salt concentration of 150 mM or less to obtain purified serum albumin.
  • the purified serum albumin of the present invention thus obtained may be further purified by dialysis or gel filtration.
  • the purified serum albumin of the present invention has very little lot difference.
  • immunological measurement with high reactivity and less non-specific reaction can be performed.
  • An immunoassay reagent using the purified serum albumin of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • an immunological measurement method using antigen-antibody reaction an immunological measurement method using the purified serum albumin of the present invention as a suspension of a blocking agent and / or an insoluble carrier is also one aspect of the present invention.
  • the reagent for solid phase preparation used for immunological measurement based on the purified serum albumin of the present invention is also one aspect of the present invention.
  • the monomer obtained by purifying the purified serum albumin of the present invention by gel filtration is further used to improve the reactivity of the immunological measurement reagent.
  • Examples of the substance to be measured that is an object of the immunological measurement method of the present invention include an antigen or an antibody in a biological sample.
  • Specific examples include hepatitis (B-type and C-type) -derived antigens or antibodies, HIV antigens or antibodies, syphilis-derived antibodies, cancer markers such as ⁇ -fetoprotein, hormones such as insulin, and tachoids.
  • anti-treponema paridum antibody which is an antigen derived from syphilis
  • the antigen used in the above anti-treponema / paridum antibody measurement system may be a crushed cell or a purified product.
  • combined artificially by the gene recombination technique and what combined 1 or more types may be used.
  • the immunological measurement method of the present invention is not particularly limited, but a method using an insoluble carrier in which an antigen or antibody is supported is preferable.
  • the insoluble carrier is not particularly limited, and examples thereof include organic polymer powders, microorganisms, blood cells, and cell membrane pieces. Of these, organic polymer powder is preferred.
  • the organic polymer powder is not particularly limited, and examples thereof include natural polymer powder and synthetic polymer powder.
  • the natural polymer powder is not particularly limited, and examples thereof include insoluble agarose, cellulose, and insoluble dextran.
  • the synthetic polymer powder is not particularly limited.
  • examples thereof include a polymer and a vinyl acetate-acrylic acid ester copolymer.
  • the insoluble carrier those having a sulfonic acid group or a carboxyl group introduced on the surface thereof can also be used.
  • the insoluble carrier is particularly preferably latex particles in which a synthetic polymer powder is uniformly suspended.
  • the particle size of the latex particles is not particularly limited, but a preferable lower limit is 0.05 ⁇ m and a preferable upper limit is 1.5 ⁇ m.
  • a preferable lower limit is 0.05 ⁇ m and a preferable upper limit is 1.5 ⁇ m.
  • the particle size of the latex particles is less than 0.05 ⁇ m, the amount of optical change due to aggregation is small, and high sensitivity necessary for measurement may not be obtained.
  • the particle size of the latex particles exceeds 1.5 ⁇ m the amount of optical change due to aggregation of the latex particles exceeds the measurable range, and the measurement range may be reduced.
  • the more preferable lower limit of the particle size of the latex particles is 0.1 ⁇ m, and the more preferable upper limit is 0.8 ⁇ m.
  • the method for supporting the antigen or antibody on the insoluble carrier is not particularly limited, and a conventionally known method for supporting the antigen or antibody by physical or chemical bonding can be used.
  • the purified serum albumin of the present invention is used as a blocking agent for the above-described insoluble carrier (latex particles) carrying an antigen or antibody, or the insoluble carrier contains an antigen or antibody. Or is used as a suspension.
  • a specimen is added to the latex particle suspension carrying the antigen or antibody thus obtained, and allowed to react for a certain period of time.
  • Measure the analyte in the sample by optically measuring or visually observing the degree of aggregation caused by the antigen-antibody reaction between the antigen or antibody supported on the latex particles after the reaction and the analyte in the sample. can do.
  • the method of optically measuring the degree of aggregation is not particularly limited, and the increase / decrease of scattered light intensity, absorbed light intensity, transmitted light intensity, etc. can be changed by selecting the size and concentration of the insoluble carrier particles used and setting the reaction time. taking measurement. These methods can be used in combination.
  • the wavelength of light used for the above measurement is preferably 300 to 900 nm.
  • Examples of the apparatus used in the above optical measurement method include optical instruments that can detect scattered light intensity, transmitted light intensity, absorbance, and the like, and any biochemical automatic analyzer that is generally used can be used. Can be used.
  • the method of visually observing the degree of aggregation is usually a method in which a solution containing a specimen and a latex particle suspension is mixed on a determination plate, the mixture is shaken, and then the presence or absence of aggregation is determined. Can be used.
  • a method of photographing the aggregation state with a video camera or the like and performing image processing in addition to the visual method.
  • the present invention it is possible to provide purified serum albumin having a small lot difference and an immunological measurement method having high reactivity and less non-specific reaction using the purified serum albumin.
  • Example 1 Preparation of purified serum albumin
  • Commercially available bovine serum albumin (Cerological, Corn method FrV: hereinafter also referred to as “unpurified BSA”) was added to the binding solution (50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5)).
  • a 15% crude BSA solution was prepared.
  • 5 mL of the obtained 15% unpurified BSA solution was added to a commercially available anion exchange column (manufactured by GE Healthcare; HiPrep 16/10 DEAE FF) equilibrated with a binding solution, and BSA was added while flowing the binding solution at 4 mL / min. Adsorbed onto the column.
  • the eluate (2M sodium chloride) was flowed at 4 mL / min while mixing with the binding solution so that the sodium chloride concentration was 80 mM, and the albumin fraction eluted with the eluate having a salt concentration of 80 mM was obtained.
  • the obtained fraction solution was dialyzed with 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) and adjusted to 1% to obtain a purified serum albumin (hereinafter also referred to as “purified BSA (80 mM)”) solution. .
  • the obtained liquid was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes at 10 ° C., and the resulting precipitate was added to 4 mL of purified BSA solution (80 mM), and the latex was suspended to suspend the anti-treponema pallidum antigen.
  • a supported latex solution was prepared.
  • Example 2 An anti-treponema paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a purified BSA (100 mM) solution was obtained with a sodium chloride concentration at the time of BSA elution of 100 mM and this was used as a blocking agent.
  • Example 3 An anti-treponema paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a purified BSA (120 mM) solution was obtained with a sodium chloride concentration of 120 mM at the time of BSA elution and this was used as a blocking agent.
  • Example 4 An anti-treponema paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a purified BSA (140 mM) solution was obtained by setting the sodium chloride concentration at the time of BSA elution to 140 mM and using this as a blocking agent.
  • a purified BSA (140 mM) solution was obtained by setting the sodium chloride concentration at the time of BSA elution to 140 mM and using this as a blocking agent.
  • Example 2 An anti-treponema-paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a purified BSA (160 mM) solution was obtained with a sodium chloride concentration at the time of elution of BSA of 160 mM and this was used as a blocking agent.
  • Example 3 An anti-treponema paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Example 1 except that a purified BSA (200 mM) solution was obtained by setting the sodium chloride concentration at the time of BSA elution to 200 mM and using this as a blocking agent.
  • anti-treponema / paridum antibody standard solution As anti-treponema / paridum antibody standard solution, 15 ⁇ L of syphilis positive standard serum (Sekisui Medical Co., Ltd., 5 concentration) is collected, and sample dilution solution (containing 1% BSA) is collected. 150 ⁇ L of Lipidure (manufactured by NOF Corporation) 0.2% (w / v)%) was mixed with 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) and maintained at 37 ° C. as appropriate.
  • T. in Table 1 U. Is an abbreviation for TITER UNITS, which is a unit of anti-treponema antibody titer measured by Mediace TPLA (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.), which is a treponema antibody measurement kit.
  • WHO standard products TE INTERNATIONAL STANDARD for SYPHILITIC HUMAN SERUM [1st international standard preparation], established in 1958
  • 1T. U. 2 mIU.
  • Negative sample measurement Absorbance change was determined in the same manner as (1) except that physiological saline and negative samples 1 to 9 were used as samples, and prepared based on the standard product measurement results of (1) The antibody titer was calculated from the calibration curve. The results are shown in Table 2.
  • Example 5 Three kinds of commercially available bovine serum albumins (Lot83, Lot91, Lot77) were prepared. For each of these three lots of bovine serum albumin, an anti-treponema paridum antigen-supporting latex solution was prepared in the same manner as in Example 1.
  • Comparative Example 4 An anti-treponema paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Comparative Example 1 except that commercially available bovine serum albumin (Lot 83, Lot 91, Lot 77) from three lots was used unpurified.
  • syphilis positive standard serum (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd., 5 concentration) is collected as an anti-treponema / paridum antibody standard solution, and this is added to a sample diluent (100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% BSA).
  • sample diluent 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% BSA).
  • 150 ⁇ L of Lipidure (manufactured by NOF Corporation) with 0.2 (w / v)% added was mixed and kept at 37 ° C. in a timely manner.
  • Example 6 The purified BSA solution (80 mM) obtained in Example 1 was concentrated, added to a commercially available gel filtration column Sephacryl S-200HR (manufactured by GE Healthcare), and 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) as an eluent. Was used in the same manner as in Example 1 except that BSA consisting only of the monomer fraction was used to prepare an anti-treponema-paridum antigen-supported latex solution.
  • Example 7 For preparation of the anti-treponema / paridum antigen-supporting latex solution, BSA consisting only of the monomer fraction obtained by gel filtration purification of the purified BSA solution (80 mM) obtained in Example 1 was used in Example 1. An anti-treponema paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Example 6 except that the obtained purified BSA solution (80 mM) was used.
  • Example 8 The purified BSA solution (80 mM) obtained in Example 1 was used as a blocking agent only from the monomer fraction purified by gel filtration, and an unpurified BSA solution was used for the preparation of the anti-treponema / paridum antigen-carrying latex solution.
  • An anti-treponema-paridum antigen-carrying latex solution was prepared in the same manner as in Example 6 except that was used.
  • syphilis positive standard serum (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd., 5 concentration) is collected as an anti-treponema / paridum antibody standard solution, and this is added to a sample diluent (100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% BSA).
  • sample diluent 100 mM phosphate buffer (pH 7.4) containing 1% BSA).
  • 150 ⁇ L of Lipidure (manufactured by NOF Corporation) with 0.2 (w / v)% added was mixed and kept at 37 ° C. in a timely manner.
  • the present invention it is possible to provide purified serum albumin having a small lot difference and an immunological measurement method having high reactivity and less non-specific reaction using the purified serum albumin.

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Abstract

本発明は、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することを目的とする。 本発明は、免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度の溶出液で溶出されたアルブミン画分からなる精製血清アルブミンである。

Description

精製血清アルブミン及び免疫学的測定方法
本発明は、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法に関する。
血液、尿等に含まれる微量物質の測定方法として、免疫学的測定方法が採用されている。免疫学的測定方法は、抗原抗体反応の特異的な強い結合に基づくものであり、様々な物質が混在する試料からでも、目的物質を特異的に感度よく測定することが可能である。
しかし、近年、血液中の癌マーカー、ウイルス等の抗原、細菌やウイルスに対する抗体等の極微量成分を測定するニーズが高まってきており、免疫学的測定方法の更なる高感度化が強く求められるようになってきた。
免疫学的測定方法の高感度化を実現する試みは、例えば、測定試薬中に反応促進剤を添加する方法（特許文献１）、反応系中に不活性なタンパク質を多量に添加する方法（特許文献２）、不溶性担体に抗原又は抗体を固定化し免疫学的に不活性なタンパク質等でブロッキングする際に、ブロッキング剤を熱により変性させる方法（特許文献３）等が提案されている。
しかしながら、特許文献１に記載された反応促進剤を添加する方法では、非特異的な反応を誘発することがあるという問題がある。
一方、特許文献２、３に記載された方法では、非特異的な反応を防止するためのブロッキング剤として血清由来のアルブミンを用いることが一般的である。しかしながら、血清アルブミンは、ロット差により反応性が大きく異なったり、充分に効果が得られなかったりすることがあるという問題があった。
特開平４－１２２８５８号公報 特開２０００－４６８２８号公報 特開平１０－１９７５３０号公報
本発明は、上記現状に鑑み、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することを目的とする。
本発明は、免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度の溶出液で溶出されたアルブミン画分からなる精製血清アルブミンである。以下に本発明を詳述する。
本発明者らは、鋭意検討の結果、特定のアルブミン画分をブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いた場合には、ロット差がほとんどなく、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
この理由については現時点では定かではない。血液中での血清アルブミンは、通常はビリルビンや遊離脂肪酸等を吸着し、これらを運搬する役目を担っている。従来の血清アルブミンのロット差は、これらの吸着物の有無及び量比で起こっていたのではないかと考えられる。陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度で溶出されたアルブミン画分は、吸着物が極めて少ない画分であって、これを用いることにより反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定が実現されたのではないかと考えられる。
本発明の精製血清アルブミンは、陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度で溶出されたアルブミン画分からなる。
本発明の精製血清アルブミンの原料となる血清アルブミンは、動物血清由来のアルブミンであって、具体的には例えば、ヒト、牛、馬、羊等の大型哺乳動物の血清由来の血清アルブミンが好適である。なかでも、安価で大量に入手できることから、牛血清由来の血清アルブミンが特に好適である。
また、上記血清アルブミンは、陰イオン交換クロマトグラフィー精製を行う前に、コーン変法やヒートショック法等で粗精製されていることが好ましい。
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムの担体は特に限定されず、例えば、弱陰イオン性のＤＥＡＥ　Ｓｅｐａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、ＡＮＸ　Ｓｅｐａｒｏｓｅ　４Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗや、強陰イオン性のＱ　Ｓｅｐａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ、Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＸＬ等が挙げられる。
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムの担体の粒径の好ましい下限は１０μｍ、好ましい上限は２００μｍである。上記カラムの担体の粒径が１０μｍ未満であると、バックプレッシャーが上昇し、精製時の流速を遅くせざるを得なくなることがある。上記カラムの担体の粒径が２００μｍを超えると、分離能が悪くなることがある。上記カラムの担体の粒径のより好ましい下限は４５μｍ、より好ましい上限は１６５μｍである。
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いるカラムは、例えば、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＤＥＡＥ　ＦＦ、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＡＮＸ　ＦＦ（ｈｉｇｈ　ｓｕｂ）、ＨｉＰｒｅｐ１６／１０Ｑ　ＦＦ（いずれもＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）等の市販品を用いてもよい。
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製において血清アルブミンをカラム担体に結合させる際に用いられる緩衝液（以下、結合液ともいう）は特に限定されず、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等が挙げられる。
上記緩衝液の濃度は、通常５～１５０ｍＭの範囲で用いられる。
上記緩衝液のｐＨは４～９が好ましく、５～８がより好ましい。
上記陰イオン交換クロマトグラフィー精製に用いられる溶出液としては、塩濃度が１５０ｍＭ以下のものが挙げられ、例えば、リン酸緩衝液、グリシン緩衝液、トリス緩衝液等に塩濃度が１５０ｍＭ以下になるように塩が加えられたものが挙げられる。
上記塩は特に限定されず、例えば、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）等が挙げられる。
上記溶出液のｐＨは４～９が好ましく、５～８がより好ましい。
ただし、通常は、結合液と同じ緩衝液に塩が加えられたものが用いられる。
上記陰イオン交換クロマトグラフィーによる精製方法の好ましい１例を説明する。
まず、血清アルブミンを結合液（例えば、５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に添加した溶液を調製する。
次いで、該溶液を結合液で平衡化した陰イオン交換カラムに添加し、結合液を流しながら血清アルブミンを陰イオン交換カラムに吸着させる。
次いで、塩濃度が１５０ｍＭ以下である溶出液を流して血清アルブミンを溶出させ、精製血清アルブミンを得る。
このようにして得られた本発明の精製血清アルブミンは、更に、透析法やゲルろ過法等による精製を行ってもよい。
本発明の精製血清アルブミンは、ロット差が極めて少ないものである。
本発明の精製血清アルブミンを免疫学的測定方法におけるブロッキング剤又は不溶性担体の懸濁液として用いれば、反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定を行うことができる。
本発明の精製血清アルブミンを用いてなる免疫学的測定試薬もまた、本発明の１つである。
抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液として、本発明の精製血清アルブミンを用いる免疫学的測定方法もまた、本発明の１つである。
本発明の精製血清アルブミンを主成分とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬もまた、本発明の１つである。
本発明の精製血清アルブミンをゲルろ過によって精製した単量体は、更に免疫学的測定試薬の反応性を向上するために用いられる。
本発明の免疫学的測定法について更に詳しく説明する。
本発明の免疫学的測定法の対象とする被測定物質は、例えば、生体試料中の抗原又は抗体が挙げられる。具体的には例えば、肝炎（Ｂ型、Ｃ型）由来抗原又は抗体、ＨＩＶ抗原又は抗体、梅毒由来抗体、α－フェトプロテイン等の癌マーカー、インシュリン等のホルモン、オータコイド等が挙げられる。
なかでも、梅毒由来抗原である抗トレポネーマ・パリダム抗体を被測定物質としたときに特に効果的である。
上記抗トレポネーマ・パリダム抗体測定系に用いる抗原は、菌体破砕物であってもよく、精製物であってもよい。また、遺伝子組み換え技術により人工的に合成されたものを１種又はそれ以上組み合わせたものでもよい。
本発明の免疫学的測定法は特に限定されないが、不溶性担体に抗原又は抗体を担持させたものを用いる方法が好適である。
上記不溶性担体は特に限定されず、例えば、有機高分子粉末、微生物、血球、細胞膜片等が挙げられる。なかでも有機高分子粉末が好適である。
上記有機高分子粉末は特に限定されず、例えば、天然高分子粉末、合成高分子粉末等が挙げられる。
上記天然高分子粉末は特に限定されず、例えば、不溶性アガロース、セルロース、不溶性デキストラン等が挙げられる。
上記合成高分子粉末は特に限定されず、例えば、ポリスチレン、スチレン－スルホン酸（塩）共重合体、スチレン－メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル－ブタジエン－スチレン共重合体、塩化ビニル－アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル－アクリル酸エステル共重合体等が挙げられる。
また、上記不溶性担体は、表面にスルホン酸基やカルボキシル基等を導入したものも用いることができる。
上記不溶性担体は、合成高分子粉末を均一に懸濁させたラテックス粒子が特に好適である。
上記ラテックス粒子の粒径は特に限定されないが、好ましい下限は０．０５μｍ、好ましい上限は１．５μｍである。上記ラテックス粒子の粒径が０．０５μｍ未満であると、凝集による光学的変化量が小さく、測定に必要な高い感度が得られないことがある。上記ラテックス粒子の粒径が１．５μｍを超えると、ラテックス粒子の凝集による光学的変化量が測定可能域を超えてしまい、測定範囲が小さくなることがある。上記ラテックス粒子の粒径のより好ましい下限は０．１μｍ、より好ましい上限は０．８μｍである。
不溶性担体に抗原又は抗体を担持させる方法は特に限定されず、物理的、化学的結合により担持させる従来公知の方法を用いることができる。
本発明の免疫学的測定法においては、本発明の精製血清アルブミンを上記不溶性担体（ラテックス粒子）に抗原又は抗体を担持させたものに対してブロッキング剤として用いたり、上記不溶性担体に抗原又は抗体を担持させたものの懸濁液として用いたりする。
このようにして得られた抗原又は抗体を担持させたラテックス粒子懸濁液に対して、検体を添加し、一定時間反応させる。反応後にラテックス粒子に担持された抗原又は抗体と検体中の被測定物質との抗原抗体反応により生じる凝集の度合いを光学的に測定又は目視にて観察することにより、検体中の被測定物質を測定することができる。
上記凝集の度合いを光学的に測定する方法は特に限定されず、用いる不溶性担体の粒子の大きさ、濃度の選択、反応時間の設定により、散乱光強度、吸収光度、透過光強度等の増減を測定する。また、これらの方法を併用することも可能である。
上記測定を行う際の光の波長は、３００～９００ｎｍが好ましい。
上記の光学的測定方法に用いる装置は、散乱光強度、透過光強度、吸光度等を検出できる光学機器が挙げられ、一般的に使用されている生化学自動分析機であればいずれのものであっても用いることができる。
上記凝集の度合いを目視にて観察する方法は、通常、検体とラテックス粒子懸濁液とを含む溶液を判定板上で混合し、混合液を揺り動かした後、凝集の有無を判定する方法等を用いることができる。なお、凝集の度合いの観察には、目視による方法以外に、凝集状態をビデオカメラ等で撮影し、画像処理を施す方法を用いることも可能である。
本発明によれば、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することができる。
以下に実施例を挙げて本発明の態様を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例にのみ限定されるものではない。
（実施例１）
（１）精製血清アルブミンの調製
市販の牛血清アルブミン（セロロジカル社製、コーン法ＦｒＶ：以下、「未精製ＢＳＡ」ともいう）を結合液（５０ｍＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５））に添加し、１５％未精製ＢＳＡ溶液を調製した。
得られた１５％未精製ＢＳＡ溶液５ｍＬを、結合液で平衡化した市販の陰イオン交換カラム（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製；ＨｉＰｒｅｐ１６／１０ＤＥＡＥ　ＦＦ）に添加し、結合液を４ｍＬ／ｍｉｎで流しながらＢＳＡをカラムに吸着させた。
次いで、溶出液（２Ｍの塩化ナトリウム）を塩化ナトリウム濃度が８０ｍＭになるように結合液に混和しながら、４ｍＬ／ｍｉｎで流し、８０ｍＭの塩濃度の溶出液で溶出されたアルブミン画分を得た。
得られた画分溶液を１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で透析し、１％となるように調整して精製血清アルブミン（以下、「精製ＢＳＡ（８０ｍＭ）」ともいう）溶液を得た。
（２）抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製
１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に１５０μｇ／ｍＬの蛋白濃度で溶解した抗トレポネーマ・パリダム抗原液４００μＬを平均粒径０．４μｍのポリスチレンラテックス（固形分１０（ｗ／ｖ）％、積水化学工業社製）１００μＬに添加し、４℃にて１時間攪拌した。
次いで、精製ＢＳＡ（８０ｍＭ）溶液２ｍＬを添加し、１時間攪拌した。得られた液体を１０℃にて１０分間、１３，０００ｒｐｍで遠心分離し、得られた沈殿物を、精製ＢＳＡ溶液（８０ｍＭ）４ｍＬに添加し、ラテックスを懸濁させることにより抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（実施例２）
ＢＳＡ溶出時の塩化ナトリウム濃度を１００ｍＭにして精製ＢＳＡ（１００ｍＭ）溶液得て、これをブロッキング剤として用いた以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（実施例３）
ＢＳＡ溶出時の塩化ナトリウム濃度を１２０ｍＭにして精製ＢＳＡ（１２０ｍＭ）溶液得て、これをブロッキング剤として用いた以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（実施例４）
ＢＳＡ溶出時の塩化ナトリウム濃度を１４０ｍＭにして精製ＢＳＡ（１４０ｍＭ）溶液得て、これをブロッキング剤として用いた以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（比較例１）
未精製ＢＳＡ溶液を用いた以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（比較例２）
ＢＳＡ溶出時の塩化ナトリウム濃度を１６０ｍＭにして精製ＢＳＡ（１６０ｍＭ）溶液得て、これをブロッキング剤として用いた以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（比較例３）
ＢＳＡ溶出時の塩化ナトリウム濃度を２００ｍＭにして精製ＢＳＡ（２００ｍＭ）溶液得て、これをブロッキング剤として用いた以外は、実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（評価）
実施例１～４、比較例１～３にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
（１）抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液の測定
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表１に示した。
表１中のＴ．Ｕ．はトレポネーマ抗体測定キットであるメディエースＴＰＬＡ（積水メディカル社製）により測定される抗トレポネーマ抗体価の単位であるＴＩＴＥＲ　ＵＮＩＴＳの略称である。ＷＨＯ標準品（ＴＨＥ　ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＳＴＡＮＤＡＲＤ　ｆｏｒ　ＳＹＰＨＩＬＩＴＩＣ　ＨＵＭＡＮ　ＳＥＲＵＭ［１ｓｔ　ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ］、ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｉｎ　１９５８）を測定した場合、１Ｔ．Ｕ．＝２ｍＩＵとなる。また、１０Ｔ．Ｕ．以上を示すものを陽性とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）陰性検体測定
生理食塩水及び陰性検体１～９を検体とした以外は（１）と同様にして吸光度変化量（ΔＡｂｓ）を求め、（１）の標準品測定結果に基づいて作成した検量線から抗体価を算出した。結果を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
表１、２より、実施例で調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いた場合には、比較例で調製したものを用いた場合に比べて反応性が高く、かつ、非特異反応が少ないことがわかった。
（実施例５）
市販の牛血清アルブミンとして３種のロットのもの（Ｌｏｔ８３、Ｌｏｔ９１、Ｌｏｔ７７）を準備した。これらの３種のロットの牛血清アルブミンの各々について実施例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（比較例４）
市販の牛血清アルブミンとして３種のロットのもの（Ｌｏｔ８３、Ｌｏｔ９１、Ｌｏｔ７７）を未精製のまま用いた以外は、比較例１と同様にして抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（評価）
実施例５、比較例４にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（実施例６）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（８０ｍＭ）を濃縮し、市販のゲルろ過カラムＳｅｐｈａｃｒｙｌ　Ｓ－２００ＨＲ（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）に添加し、溶離液として１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）を用いてゲルろ過精製し、その単量体画分のみからなるＢＳＡを用いた以外は実施例１と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（実施例７）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（８０ｍＭ）をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるＢＳＡをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（８０ｍＭ）を用いた以外は実施例６と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（実施例８）
実施例１で得られた精製ＢＳＡ溶液（８０ｍＭ）をゲルろ過精製した単量体画分のみからなるＢＳＡをブロッキング剤としてのみ用い、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液の調製には未精製ＢＳＡ溶液を用いた以外は実施例６と同様にして、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を調製した。
（評価）
実施例６～８にて調製した抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液を用いて、下記の方法により評価を行った。
抗トレポネーマ・パリダム抗体標準液として、梅毒陽性標準血清（積水メディカル社製、５濃度）１５μＬを採取し、これに検体希釈液（ＢＳＡを１％含有する１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）にＬｉｐｉｄｕｒｅ（日油社製）を０．２（ｗ／ｖ）％添加したもの）１５０μＬを混和し、３７℃で適時保持した。これに、抗トレポネーマ・パリダム抗原担持ラテックス液５０μＬを添加、撹拌した後、約８０秒から３００秒までの間の波長７００ｎｍでの吸光度の変化量を測定し、吸光度変化量（ΔＡｂｓ）とした。なお、測定は自動分析装置日立７１７０形を使用した。
結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
本発明によれば、ロット差が少ない精製血清アルブミン、及び、該精製血清アルブミンを用いた反応性が高く、非特異反応の少ない免疫学的測定方法を提供することができる。

Claims (4)

  1. 免疫学的測定方法においてブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に用いる血清アルブミンであって、
    陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度の溶出液で溶出されたアルブミン画分からなる
    ことを特徴とする精製血清アルブミン。
  2. 陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度で溶出されたアルブミン画分からなる精製血清アルブミンを用いてなることを特徴とする免疫学的測定試薬。
  3. 抗原抗体反応を利用した免疫学的測定方法において、ブロッキング剤及び／又は不溶性担体の懸濁液に、陰イオン交換クロマトグラフィー精製において１５０ｍＭ以下の塩濃度で溶出されたアルブミン画分からなる精製血清アルブミンを用いることを特徴とする免疫学的測定方法。
  4. 請求項１記載の精製血清アルブミンを主成分とすることを特徴とする免疫学的測定に用いる固相調製用試薬。
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