JP2524101B2 - Ｂ型肝炎に対する共通決定因子抗体の検出のための免疫決定法 - Google Patents
Ｂ型肝炎に対する共通決定因子抗体の検出のための免疫決定法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 急性Ｂ型肝炎ウイルス感染（HBV）の患者の血清はウ
イルス表面からのＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）の免疫化
学的測定可能量の存在によって特徴づけられる。
イルス表面からのＢ型肝炎表面抗原（HBsAg）の免疫化
学的測定可能量の存在によって特徴づけられる。
若干の患者は慢性肝炎もしくは保菌者の状態により血
清中にHBsAgを保持しているが、大多数の患者は回復す
る。HBV感染から回復した患者の血清はHBsAgの消失およ
びＢ型肝炎表面抗原に対する抗体（抗HBs）の出現によ
って特徴づけられる。従って、血清中の測定可能な抗HB
sの存在は回復の指標であり、また次のHBV再感染の免疫
の指標でもある。
清中にHBsAgを保持しているが、大多数の患者は回復す
る。HBV感染から回復した患者の血清はHBsAgの消失およ
びＢ型肝炎表面抗原に対する抗体（抗HBs）の出現によ
って特徴づけられる。従って、血清中の測定可能な抗HB
sの存在は回復の指標であり、また次のHBV再感染の免疫
の指標でもある。
HBsAgには数種の菌株があり、それらはその表面上の
抗原決定基によって特徴づけられる。５種類の主要な抗
原決定基はHBsAgのサブタイプａ，ｄ，ｙ，ｗ，および
ｒである。HBsAgのサブタイプａの抗原決定基はHBVのす
べての菌株に対して共通であるが、ｄおよびｙは同じHB
V分子上で互いに排他的であり、ｗおよびｒ決定基も同
様である。それ故、HBsAgには４種の主要なサブタイプ
の決定基があり、それらはadw，ayw，adrおよびayrであ
る。これらの抗原はHBsAgに対する体液抗体応答を誘因
する原因となり、そして抗−HBs抗体は実際にａ，ｄ，
ｙ抗原決定基に対して、およびより低い程度のｗおよび
ｒ抗原決定基に対する多数の抗体である。
抗原決定基によって特徴づけられる。５種類の主要な抗
原決定基はHBsAgのサブタイプａ，ｄ，ｙ，ｗ，および
ｒである。HBsAgのサブタイプａの抗原決定基はHBVのす
べての菌株に対して共通であるが、ｄおよびｙは同じHB
V分子上で互いに排他的であり、ｗおよびｒ決定基も同
様である。それ故、HBsAgには４種の主要なサブタイプ
の決定基があり、それらはadw，ayw，adrおよびayrであ
る。これらの抗原はHBsAgに対する体液抗体応答を誘因
する原因となり、そして抗−HBs抗体は実際にａ，ｄ，
ｙ抗原決定基に対して、およびより低い程度のｗおよび
ｒ抗原決定基に対する多数の抗体である。
HBsAgにさらさせることによって誘発される主要な抗
体応答はHBsAgのサブタイプａ，ｄおよびｙに対する抗
体（抗−HBsのサブタイプａ，ｄ，およびｙ）の産生で
ある。ａなる抗原決定基はすべてのHBV菌株に見出され
るので、抗−HBsのサブタイプａはすべてのHBV菌株に対
する完全な免疫を与える唯一の抗体であると信ぜられ
る。
体応答はHBsAgのサブタイプａ，ｄおよびｙに対する抗
体（抗−HBsのサブタイプａ，ｄ，およびｙ）の産生で
ある。ａなる抗原決定基はすべてのHBV菌株に見出され
るので、抗−HBsのサブタイプａはすべてのHBV菌株に対
する完全な免疫を与える唯一の抗体であると信ぜられ
る。
以下の記述のために、HBsAgの主要な抗原サブタイプ
をHBsAgのサブタイプadおよびHBsAgのサブタイプayと呼
ぶが、これらのサブタイプは少ない抗原決定基ｒまたは
ｗを含むことを理解するべきである。
をHBsAgのサブタイプadおよびHBsAgのサブタイプayと呼
ぶが、これらのサブタイプは少ない抗原決定基ｒまたは
ｗを含むことを理解するべきである。
最近、HBVのワクチンがウイルスに対する免疫を作る
ために開発された。これらのワクチンのほとんどは主と
して１つのHBsAgサブタイプすなわちHBsAgのサブタイプ
adまたはHBsAgのサプタイプayから製造される。これら
のワクチンに伴う問題は、ワクチン接種後にその患者の
血清中に見出される大部分のパーセンテージの抗−HBs
が抗−HBsのサブタイプａではなくてむしろ抗−HBsのサ
ブタイプｄまたは抗−HBsのサブタイプｙであるため、
これらの免疫化患者は依然としてHBVに感染しやすいと
いうことであった。それ故に、ワクチンを受けた患者ま
たはHBV感染から回復しつつある患者における抗−HBsの
サプタイプａの存在を検出する試験がすべてのHBsAgサ
ブタイプに対する免疫を測定するために望ましい。
ために開発された。これらのワクチンのほとんどは主と
して１つのHBsAgサブタイプすなわちHBsAgのサブタイプ
adまたはHBsAgのサプタイプayから製造される。これら
のワクチンに伴う問題は、ワクチン接種後にその患者の
血清中に見出される大部分のパーセンテージの抗−HBs
が抗−HBsのサブタイプａではなくてむしろ抗−HBsのサ
ブタイプｄまたは抗−HBsのサブタイプｙであるため、
これらの免疫化患者は依然としてHBVに感染しやすいと
いうことであった。それ故に、ワクチンを受けた患者ま
たはHBV感染から回復しつつある患者における抗−HBsの
サプタイプａの存在を検出する試験がすべてのHBsAgサ
ブタイプに対する免疫を測定するために望ましい。
抗−HBsの産業的に利用しうるほとんどの免疫分析は
数種の抗体サブタイプ間の識別を行っていない。その代
りに、これらの分析は直接分析法であって、HBsAgのサ
ブタイプadとHBsAgのサブタイプayとの混合物から成る
抗原をポリスチレンビーズのような固相上に固定もしく
は被覆する。試験試料はこの試料をHBsAg被覆固相と接
触させることによって抗−HBsの存在について試験され
る。試料中に存在しうる抗−HBsサブタイプすなわち抗
−HBsのサブタイプａ，ｙまたはｄの任意のものがHBsAg
被覆固相と反応する。次いで固相は洗浄して非結合物質
が除かれ、そして酵素、放射性または螢光の標識を付け
たHBsAgのサブタイプadとHBsAgのサブタイプayとの混合
物から成る標識HBsAgが固相に加えられて抗原−抗体−
抗原のサンドイッチ構造を形成する。次いでこの標識を
試料中に存在する抗体の量の指標として測定する。固相
上のHBsAgおよび標識付きHBsAgは共に多重抗原決定基を
もっているので、これらの分析は試験試料中に存在する
任意の及びすべての抗−HBsサブタイプを検出し、従っ
てこれらの間に区別をつけることができない。
数種の抗体サブタイプ間の識別を行っていない。その代
りに、これらの分析は直接分析法であって、HBsAgのサ
ブタイプadとHBsAgのサブタイプayとの混合物から成る
抗原をポリスチレンビーズのような固相上に固定もしく
は被覆する。試験試料はこの試料をHBsAg被覆固相と接
触させることによって抗−HBsの存在について試験され
る。試料中に存在しうる抗−HBsサブタイプすなわち抗
−HBsのサブタイプａ，ｙまたはｄの任意のものがHBsAg
被覆固相と反応する。次いで固相は洗浄して非結合物質
が除かれ、そして酵素、放射性または螢光の標識を付け
たHBsAgのサブタイプadとHBsAgのサブタイプayとの混合
物から成る標識HBsAgが固相に加えられて抗原−抗体−
抗原のサンドイッチ構造を形成する。次いでこの標識を
試料中に存在する抗体の量の指標として測定する。固相
上のHBsAgおよび標識付きHBsAgは共に多重抗原決定基を
もっているので、これらの分析は試験試料中に存在する
任意の及びすべての抗−HBsサブタイプを検出し、従っ
てこれらの間に区別をつけることができない。
フーフナゲルらはガストロエンテロロジー（Gastroen
terology）72:290−296（1977）において中和法によるH
BsAgサブタイプおよび抗−HBsサブタイプの検出法を述
べており、そこでは試験試料を通常の技術（米国イリノ
イ州ノースシカゴのアボット・ラボラトリーズのオーサ
ブラジオイミノアセイ）によって分析する前に該試料に
異なった抗原菌株のHBsAgまたは抗−HBsを混合してい
る。抗原および抗体の中和パターンを次いで解釈して試
験試料中の抗原サブタイプまたは抗体サブタイプの量を
求める。
terology）72:290−296（1977）において中和法によるH
BsAgサブタイプおよび抗−HBsサブタイプの検出法を述
べており、そこでは試験試料を通常の技術（米国イリノ
イ州ノースシカゴのアボット・ラボラトリーズのオーサ
ブラジオイミノアセイ）によって分析する前に該試料に
異なった抗原菌株のHBsAgまたは抗−HBsを混合してい
る。抗原および抗体の中和パターンを次いで解釈して試
験試料中の抗原サブタイプまたは抗体サブタイプの量を
求める。
レグラーらのDevelop.Biol.Std.,54:179−189（198
3）およびジリーらのJ.Med.Virol.,13:171−178（198
4）には、抗−HBsサブタイプを検出するための更に別の
方法が記載されており、そこでは特定の抗原サブタイプ
即ちHBsAgのサブタイプadまたはHBsAgのサブタイプayで
被覆した一連の固相で試料を選別し、そして異なった固
相抗体との反応能力を比較している。この方法および前
記フーフナゲルらの方法は、同一試料についての数回の
試験決定および少なくとも２つの試験結果の間の定量的
比較を必要としている。
3）およびジリーらのJ.Med.Virol.,13:171−178（198
4）には、抗−HBsサブタイプを検出するための更に別の
方法が記載されており、そこでは特定の抗原サブタイプ
即ちHBsAgのサブタイプadまたはHBsAgのサブタイプayで
被覆した一連の固相で試料を選別し、そして異なった固
相抗体との反応能力を比較している。この方法および前
記フーフナゲルらの方法は、同一試料についての数回の
試験決定および少なくとも２つの試験結果の間の定量的
比較を必要としている。
ここに使用する「試験試料」なる用語はヒトの血清、
血漿または尿のようなヒトの生物学的流体を包含する生
物学的流体を意味する。ここに使用する「試剤」なる用
語は抗原または標識抗原を被覆した固相のような、免疫
分析工程に加えるべき全ての成分を意味する。
血漿または尿のようなヒトの生物学的流体を包含する生
物学的流体を意味する。ここに使用する「試剤」なる用
語は抗原または標識抗原を被覆した固相のような、免疫
分析工程に加えるべき全ての成分を意味する。
「異種抗原サブタイプ」なる用語は同一分子上で互い
に排他的あるいは異なる抗原サブタイプ種を意味する。
Ｂ型肝炎表面抗原についての異種抗原サブタイプの例は
HBsAgのサブタイプadおよびHBsAgのサブタイプayであ
る。
に排他的あるいは異なる抗原サブタイプ種を意味する。
Ｂ型肝炎表面抗原についての異種抗原サブタイプの例は
HBsAgのサブタイプadおよびHBsAgのサブタイプayであ
る。
本発明は、（ａ）Ｂ型肝炎表面抗原のサブタイプadま
たはayを固相上に固定化し； （ｂ）該固相を試験試料と接触させ； （ｃ）該固相をマーカーで標識化したＢ型肝炎表面抗原
のサブタイプayまたはadと接触させ、該標識化した抗原
のサブタイプは固相上に固定化した抗原のサブタイプと
異種であり； （ｄ）該固相から未反応試薬を分離し； （ｅ）該固相上のマーカーの存在または未反応試薬中の
マーカーの存在を測定し、試料中に存在する抗−Ｂ型肝
炎表面抗原のサブタイプａの存在または量を検出するこ
とからなるＢ型肝炎表面抗原のサブタイプａに対する抗
体を検出するための免疫検定法を提供する。
たはayを固相上に固定化し； （ｂ）該固相を試験試料と接触させ； （ｃ）該固相をマーカーで標識化したＢ型肝炎表面抗原
のサブタイプayまたはadと接触させ、該標識化した抗原
のサブタイプは固相上に固定化した抗原のサブタイプと
異種であり； （ｄ）該固相から未反応試薬を分離し； （ｅ）該固相上のマーカーの存在または未反応試薬中の
マーカーの存在を測定し、試料中に存在する抗−Ｂ型肝
炎表面抗原のサブタイプａの存在または量を検出するこ
とからなるＢ型肝炎表面抗原のサブタイプａに対する抗
体を検出するための免疫検定法を提供する。
本発明によれば、単一の固相を使用してＢ型肝炎表面
抗原のサブタイプａに対する抗体を検出する直接分析法
が提供される。この直接分析法はHBsAgの１つの特定の
抗原サブタイプ即ち、HBsAgのサブタイプadまたはHBsAg
のサブタイプayをビーズ、試験管、微滴定板、ニトロセ
ルロースシートまたは誘導体化ペーパーのような固相に
固定させる工程を含む。次いでこの固相を試験試料（た
とえば未知量の抗−HBs抗体を含むヒトの血清、血漿ま
たは尿）と反応させる。次にこの固相を、この固相上の
抗原とは異種の、適当な標識（マーカー）を結合させた
HBsAgの他の抗原サブタイプと反応させる。好適な標識
の例として酵素、放射性同位元素、および測定可能な比
色活性または螢光活性あるいは放射能を与えるその他の
試剤があげられる。分析の固相および未反応試剤を分離
して固相中の又は未反応試剤中の標識の存在を測定す
る。酵素を標識として使用するときは、酵素用の可溶性
基質を加え、無色前駆体から着色生成物への酵素の転換
を分光光度計で測定する。
抗原のサブタイプａに対する抗体を検出する直接分析法
が提供される。この直接分析法はHBsAgの１つの特定の
抗原サブタイプ即ち、HBsAgのサブタイプadまたはHBsAg
のサブタイプayをビーズ、試験管、微滴定板、ニトロセ
ルロースシートまたは誘導体化ペーパーのような固相に
固定させる工程を含む。次いでこの固相を試験試料（た
とえば未知量の抗−HBs抗体を含むヒトの血清、血漿ま
たは尿）と反応させる。次にこの固相を、この固相上の
抗原とは異種の、適当な標識（マーカー）を結合させた
HBsAgの他の抗原サブタイプと反応させる。好適な標識
の例として酵素、放射性同位元素、および測定可能な比
色活性または螢光活性あるいは放射能を与えるその他の
試剤があげられる。分析の固相および未反応試剤を分離
して固相中の又は未反応試剤中の標識の存在を測定す
る。酵素を標識として使用するときは、酵素用の可溶性
基質を加え、無色前駆体から着色生成物への酵素の転換
を分光光度計で測定する。
本発明の免疫分析は２工程法または１工程法で行うこ
とができる。２工程法において、第１の工程はHBsAgの
サブタイプadまたはHBsAgのサブタイプayのような１種
のHBsAgサブタイプを被覆した固相を未知量の抗−HBsの
サブタイプａを含む試験試料と共に培養することから成
る。固相を洗浄し、そして第２工程において固相を、こ
の固相上の抗原とは異種のHBsAgのサブタイプayまたはH
BsAgのサブタイプadのようなHBsAgサブタイプであって
好適な標識を付けたものと共に培養する。固相と未反応
試剤を分離し、固相中の又は未反応試剤中の標識の存在
を試料中に存在する抗−HBsのサブタイプａの存在また
は量を決定として測定する。
とができる。２工程法において、第１の工程はHBsAgの
サブタイプadまたはHBsAgのサブタイプayのような１種
のHBsAgサブタイプを被覆した固相を未知量の抗−HBsの
サブタイプａを含む試験試料と共に培養することから成
る。固相を洗浄し、そして第２工程において固相を、こ
の固相上の抗原とは異種のHBsAgのサブタイプayまたはH
BsAgのサブタイプadのようなHBsAgサブタイプであって
好適な標識を付けたものと共に培養する。固相と未反応
試剤を分離し、固相中の又は未反応試剤中の標識の存在
を試料中に存在する抗−HBsのサブタイプａの存在また
は量を決定として測定する。
１工程法は１種のHBsAgサブタイプを被覆したビーズ
に、試験試料および固相上の抗原とは異種のHBsAgサブ
タイプであって好適な標識を付けたものを同時に加える
ことから成る。一定の培養期間後に、固相と未反応試剤
を分離し、標識を２工程法について既に述べたようにし
て測定する。
に、試験試料および固相上の抗原とは異種のHBsAgサブ
タイプであって好適な標識を付けたものを同時に加える
ことから成る。一定の培養期間後に、固相と未反応試剤
を分離し、標識を２工程法について既に述べたようにし
て測定する。
この分析法において、抗原サブタイプすなわちHBsAg
のサブタイプａの間の共通の場のみが反応して抗原−抗
体−抗原のサントイッチ構造を形成する。本発明の分析
法はサブタイプ抗体である抗−HBsのサブタイプｄ，
ｙ，ｗ，またはｒを検出しない。
のサブタイプａの間の共通の場のみが反応して抗原−抗
体−抗原のサントイッチ構造を形成する。本発明の分析
法はサブタイプ抗体である抗−HBsのサブタイプｄ，
ｙ，ｗ，またはｒを検出しない。
次の実施例によって本発明を更に具体的に説明するが
これらの実施例は本発明の範囲または精神を限定するも
のではない。
これらの実施例は本発明の範囲または精神を限定するも
のではない。
実施例１ この実施例は本発明により行われる、放射能標識を使
用する抗−HBsのサブタイプａの検出の２工程直接分析
法を説明するものである。放射能標識はGreenwoodらの
J.Bichem.,89:114−123（1963）に記載の方法により製
造される。
用する抗−HBsのサブタイプａの検出の２工程直接分析
法を説明するものである。放射能標識はGreenwoodらの
J.Bichem.,89:114−123（1963）に記載の方法により製
造される。
ポリスチレンビーズ（1/4インチ）に0.01Mのトリス−
ヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）緩衝液（pH
7）中の２μg/ml濃度のHBsAgのサブタイプay抗原を室温
で一夜被覆する。次いで、未知量の抗−HBsのサブタイ
プａを含むヒト血清試料200μｌをこのビーズに加えて
約25〜45℃で約２〜12時間、好ましくは40℃で４時間培
養する。このビーズを5mlの脱イオン水で２回洗浄す
る。125Iで標識したHBsAgのサブタイプad抗原200μｌを
洗浄ビースに加えて25〜45℃で１〜４時間好ましくは40
℃で２時間培養する。このビーズを5mlの脱イオン水で
２回目洗浄して試験管に移し、ANSRガンマ・カウンター
（米国イリノイ州ノースシカゴのアボット・ラボラトリ
ーズ製作）のようなガンマ・シンチレーション・カウン
ター上で放射能のカウントを行う。血清試料中に存在す
る抗−HBsのサブタイプａの量が多いほど放射能の量も
多い。
ヒドロキシメチルアミノメタン（トリス）緩衝液（pH
7）中の２μg/ml濃度のHBsAgのサブタイプay抗原を室温
で一夜被覆する。次いで、未知量の抗−HBsのサブタイ
プａを含むヒト血清試料200μｌをこのビーズに加えて
約25〜45℃で約２〜12時間、好ましくは40℃で４時間培
養する。このビーズを5mlの脱イオン水で２回洗浄す
る。125Iで標識したHBsAgのサブタイプad抗原200μｌを
洗浄ビースに加えて25〜45℃で１〜４時間好ましくは40
℃で２時間培養する。このビーズを5mlの脱イオン水で
２回目洗浄して試験管に移し、ANSRガンマ・カウンター
（米国イリノイ州ノースシカゴのアボット・ラボラトリ
ーズ製作）のようなガンマ・シンチレーション・カウン
ター上で放射能のカウントを行う。血清試料中に存在す
る抗−HBsのサブタイプａの量が多いほど放射能の量も
多い。
上記の分析はHBsAgのサブタイプad抗原を被覆したポ
リスチレンビーズを使用しても行うことができる。この
分析では125Iで標識したHBsAgのサブタイプay抗原を使
用する。ビーズを被覆するのに使用する抗原サブタイプ
と標識付きのHBsAgの抗原サブタイプとが異種起源のも
のである限り、両方の分析が抗HBsのサブタイプａの検
出のために均等に遂行できる。
リスチレンビーズを使用しても行うことができる。この
分析では125Iで標識したHBsAgのサブタイプay抗原を使
用する。ビーズを被覆するのに使用する抗原サブタイプ
と標識付きのHBsAgの抗原サブタイプとが異種起源のも
のである限り、両方の分析が抗HBsのサブタイプａの検
出のために均等に遂行できる。
実施例２ この実施例は酵素を使用する抗−HBsのサブタイプａ
の２工程直接免疫分析である。ホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼ標識の抗原をNakaneらのJ.Histochem.Cy
tochem.,22:1084−1091（1974）に記載の方法により製
造する。
の２工程直接免疫分析である。ホースラディッシュ・パ
ーオキシダーゼ標識の抗原をNakaneらのJ.Histochem.Cy
tochem.,22:1084−1091（1974）に記載の方法により製
造する。
ポリスチレンビーズに実施例１のようにしてHBsAgの
サブタイプayを被覆する。200μｌのヒト血清をこのビ
ーズに加えてレベル表面で25〜45℃で２〜12時間好まし
くは40℃で４時間培養する。次いでビーズを5mlの脱イ
オン水で２回洗浄する。次にホースラディッシュ・パー
オキシダーゼで標識したHBsAgのサブタイプad 200μｌ
をこのビースに加え、約25〜45℃で約１〜４時間好まし
くは40℃で２時間培養する。このビースを5mlの脱イオ
ン水で２回洗浄し、そしてビーズを試験管に移して着色
を進行させる。300μｌのｏ−フェニレンジアミン（OP
D）基質溶液（0.02％過酸化水素含有のクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液中に希釈したｏ−フェニレンジアミン−2H
Clの12.8mg錠剤）を試験管中のビーズを加えて室温で30
分間培養する。次に1N−硫酸1.0mlを試験管に加える。
着色を約492nmの波長で測定の吸収により分光光度計上
で読む。試料中の抗−HBsのサブタイプａの量が多いほ
ど吸収値は高い。
サブタイプayを被覆する。200μｌのヒト血清をこのビ
ーズに加えてレベル表面で25〜45℃で２〜12時間好まし
くは40℃で４時間培養する。次いでビーズを5mlの脱イ
オン水で２回洗浄する。次にホースラディッシュ・パー
オキシダーゼで標識したHBsAgのサブタイプad 200μｌ
をこのビースに加え、約25〜45℃で約１〜４時間好まし
くは40℃で２時間培養する。このビースを5mlの脱イオ
ン水で２回洗浄し、そしてビーズを試験管に移して着色
を進行させる。300μｌのｏ−フェニレンジアミン（OP
D）基質溶液（0.02％過酸化水素含有のクエン酸塩−リ
ン酸塩緩衝液中に希釈したｏ−フェニレンジアミン−2H
Clの12.8mg錠剤）を試験管中のビーズを加えて室温で30
分間培養する。次に1N−硫酸1.0mlを試験管に加える。
着色を約492nmの波長で測定の吸収により分光光度計上
で読む。試料中の抗−HBsのサブタイプａの量が多いほ
ど吸収値は高い。
実施例１で述べたように、この方法は一方の抗原が他
方の抗原と異種のものである限りビーズ用にえらんだHB
sAgサブタイプと標識にえらんだHBsAgサブタイプを逆に
して実施できる。
方の抗原と異種のものである限りビーズ用にえらんだHB
sAgサブタイプと標識にえらんだHBsAgサブタイプを逆に
して実施できる。
実施例３ この実施例は本発明による１段階分析を放射性標識ま
たは酵素標識のいずれかを使用して行う方法を説明する
ものである。
たは酵素標識のいずれかを使用して行う方法を説明する
ものである。
実施例１のようにしてポリスチレンビースにHBsAgの
サブタイプayを被覆する。100μｌのヒト血清試料、お
よび125Iまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼ
のいずれかで標識したHBsAgのサブタイプadの100μｌを
上記のビースに加え、約25〜45℃で約２〜12時間好まし
くは40℃で４時間培養する。次いでこのビースを5mlの
脱イオン水で２回洗浄し、試験管に移して放射能をカウ
ントする（実施例１）か又は着色を発達させて吸収を測
定（実施例２）する。
サブタイプayを被覆する。100μｌのヒト血清試料、お
よび125Iまたはホースラディッシュ・パーオキシダーゼ
のいずれかで標識したHBsAgのサブタイプadの100μｌを
上記のビースに加え、約25〜45℃で約２〜12時間好まし
くは40℃で４時間培養する。次いでこのビースを5mlの
脱イオン水で２回洗浄し、試験管に移して放射能をカウ
ントする（実施例１）か又は着色を発達させて吸収を測
定（実施例２）する。
実施例４ この実施例は後に固相に被覆するのに使用する又は放
射能もしくは酵素の標識のような標識に結合させるのに
使用するHBsAgのサブタイプadまたはHBsAgのサブタイプ
ayの製造法を説明するものである。
射能もしくは酵素の標識のような標識に結合させるのに
使用するHBsAgのサブタイプadまたはHBsAgのサブタイプ
ayの製造法を説明するものである。
HBsAg保菌者であるヒト給血者から集めた血清もしく
は血漿単位からHBsAgのサブタイプadおよびHBsAgのサブ
タイプayを得る。個々の給血者の血清もしくは血漿単位
のHBsAgサブタイプの次のようにして決定する。
は血漿単位からHBsAgのサブタイプadおよびHBsAgのサブ
タイプayを得る。個々の給血者の血清もしくは血漿単位
のHBsAgサブタイプの次のようにして決定する。
（１） 200μｌのHBsAg陽性血清をマイクロプレートの
２つのウエルに加える。
２つのウエルに加える。
（２） １個の抗HBs被覆ビーズ（米国イリノイ州ノー
スシカゴのアボット・ラボラトリーズのAusria Radioi
mmunoassay）をそれぞれのウエルに加える。
スシカゴのアボット・ラボラトリーズのAusria Radioi
mmunoassay）をそれぞれのウエルに加える。
（３） ビーズおよび血清を室温で一夜培養してから5m
lの脱イオン水で２回洗浄する。
lの脱イオン水で２回洗浄する。
（４） 200μｌの単一特異性抗−ｄ抗体を１個のビー
スに加え、200μｌの単一特異性抗−ｙ抗体を他の１個
のビーズに加え、45℃で１時間培養する。この単一特異
性抗−ｄおよび抗−ｙはLingらのScience、180:203−20
5に記載の方法により産生する。次いでこれらのビーズ
を5mlの脱イオン水で洗浄する。
スに加え、200μｌの単一特異性抗−ｙ抗体を他の１個
のビーズに加え、45℃で１時間培養する。この単一特異
性抗−ｄおよび抗−ｙはLingらのScience、180:203−20
5に記載の方法により産生する。次いでこれらのビーズ
を5mlの脱イオン水で洗浄する。
（５） ビーズを試験管に移し、ガンマ−シンチレーシ
ョン・カウンター上で放射能をカウントする。HBsAgの
サブタイプad血清は抗−ｄ試験で高い放射能をもち、抗
−ｙ試験で低い放射能をもつ。その逆に、HBsAgのサブ
タイプay血清は抗−ｙ試験で高い放射能をもち、抗−ｄ
試験で放射能をもつ。
ョン・カウンター上で放射能をカウントする。HBsAgの
サブタイプad血清は抗−ｄ試験で高い放射能をもち、抗
−ｙ試験で低い放射能をもつ。その逆に、HBsAgのサブ
タイプay血清は抗−ｙ試験で高い放射能をもち、抗−ｄ
試験で放射能をもつ。
HBsAgのサブタイプadに陽性の血清または血漿単位を
他のHBsAgのサブタイプad陽性単位と一緒に集め、HBsAg
のサブタイプay陽性単位を他のHBsAgのサブタイプay陽
性単位と一緒に集める。集めたHBsAgのサブタイプadも
しくはHBsAgのサブタイプayの血清または血漿をGerinら
のJ.Virol.,4:763−768（1969）に記載の方法により交
互アイソピクニック・バンディングおよび塩化セシウム
／サクロース密度沈降によって精製する。
他のHBsAgのサブタイプad陽性単位と一緒に集め、HBsAg
のサブタイプay陽性単位を他のHBsAgのサブタイプay陽
性単位と一緒に集める。集めたHBsAgのサブタイプadも
しくはHBsAgのサブタイプayの血清または血漿をGerinら
のJ.Virol.,4:763−768（1969）に記載の方法により交
互アイソピクニック・バンディングおよび塩化セシウム
／サクロース密度沈降によって精製する。
これらのHBsAgのサブタイプadおよびHBsAgのサブタイ
プayの調剤は当業者に周知の定量的免疫拡散技術によっ
て測定してほぼ95％純度である。
プayの調剤は当業者に周知の定量的免疫拡散技術によっ
て測定してほぼ95％純度である。
このａ特異性抗−HBs分析には多くの利点がある。第
１に、この免疫分析は任意およびすべてのサブタイプ抗
体を検出する従来の抗−HBs分析よりも感度がよく特異
性が高い。第２にこの分析はHBVの感染または再感染に
対する最も保護的な抗体であると信じられている、HBV
に対する共通種抗体である抗−ａのみを検出する。第３
に、この分析は実施が簡単である。当業者に明らかな他
の利点がなお存在する。
１に、この免疫分析は任意およびすべてのサブタイプ抗
体を検出する従来の抗−HBs分析よりも感度がよく特異
性が高い。第２にこの分析はHBVの感染または再感染に
対する最も保護的な抗体であると信じられている、HBV
に対する共通種抗体である抗−ａのみを検出する。第３
に、この分析は実施が簡単である。当業者に明らかな他
の利点がなお存在する。
本発明を特定の実施例について具体的に述べたけれど
も、その詳細は限定条件と解釈すべきではない。本発明
の精神および範囲を逸脱することなしに種々の均等な変
化と変形が行いうることは明らかであるからである。そ
れ故、このような均等な実施態様は本発明に包含される
ことが理解されるであろう。
も、その詳細は限定条件と解釈すべきではない。本発明
の精神および範囲を逸脱することなしに種々の均等な変
化と変形が行いうることは明らかであるからである。そ
れ故、このような均等な実施態様は本発明に包含される
ことが理解されるであろう。
フロントページの続き (56)参考文献 Ａ．Ｊ，ズッカーマン著「肝炎とウイ ルス」1981年10月１日発行講談社 Ｐ. 60〜65
Claims (8)
- 【請求項１】次の（ａ）〜（ｅ）の工程からなるＢ型肝
炎表面抗原のサブタイプａに対する抗体を検出するため
の免疫検定法であり： （ａ）Ｂ型肝炎表面抗原のサブタイプadまたはayを固相
上に固定化し； （ｂ）該固相を試験試料と接触させ； （ｃ）該固相をマーカーで標識化したＢ型肝炎表面抗原
のサブタイプayまたはadと接触させ、該標識化した抗原
のサブタイプは固相上に固定化した抗原のサブタイプと
異種であり； （ｄ）該固相から未反応試薬を分離し； （ｅ）該固相上のマーカーの存在または未反応試薬中の
マーカーの存在を測定し、試料中に存在する抗−Ｂ型肝
炎表面抗原のサブタイプａの存在または量を検出するこ
とを特徴とするＢ型肝炎表面抗原のサブタイプａに対す
る抗体を検出するための免疫検定法。 - 【請求項２】マーカーが酵素である特許請求の範囲第１
項記載の免疫検定法。 - 【請求項３】マーカーが放射性同位体である特許請求の
範囲第１項記載の免疫検定法。 - 【請求項４】工程（ｂ）および（ｃ）を同時に行う特許
請求の範囲第１項記載の免疫検定法。 - 【請求項５】次の（ａ）〜（ｉ）の工程からなるＢ型肝
炎表面抗原のサブタイプａに体する抗体を検出するため
の方法であり： （ａ）ポリスチレンビーズをＢ型肝炎表面抗原のサブタ
イプadまたはayで被覆し； （ｂ）ヒト血清試薬を該被覆ビーズに加え、 （ｃ）25〜45℃で２〜12時間保温し、 （ｄ）該ビーズを脱イオン水で洗い、 （ｅ）該ビーズにマーカーで標識化したＢ型肝炎表面抗
原のサブタイプayまたはadを加え、該標識化した抗原の
サブタイプはビーズ上に被覆した抗原のサブタイプと異
種であり； （ｆ）25〜45℃で１〜４時間保温し、 （ｇ）該ビーズを脱イオン水で洗い、 （ｈ）該ビーズから未反応試薬を分離し、 （ｉ）未反応試薬中のマーカーの存在またはビーズ上の
マーカーの存在を測定することを特徴とするＢ型肝炎表
面抗原のサブタイプａに対する抗体を検出するための方
法。 - 【請求項６】マーカーが125Iである特許請求の範囲第５
項記載の方法。 - 【請求項７】マーカーがホースラディッシュ・パーオキ
シダーゼである特許請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項８】工程（ｃ）が40℃で４時間の保温からな
り、そして工程（ｆ）が40℃で２時間の保温からなる特
許請求の範囲第５項記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US63103284A | 1984-07-16 | 1984-07-16 | |
| US631032 | 1984-07-16 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6144356A JPS6144356A (ja) | 1986-03-04 |
| JP2524101B2 true JP2524101B2 (ja) | 1996-08-14 |
Family
ID=24529507
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60155279A Expired - Lifetime JP2524101B2 (ja) | 1984-07-16 | 1985-07-16 | Ｂ型肝炎に対する共通決定因子抗体の検出のための免疫決定法 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0168689B1 (ja) |
| JP (1) | JP2524101B2 (ja) |
| AT (1) | ATE57020T1 (ja) |
| AU (1) | AU590203B2 (ja) |
| CA (1) | CA1261740A (ja) |
| DE (1) | DE3579856D1 (ja) |
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| ES (2) | ES8609724A1 (ja) |
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| NO881239L (no) * | 1987-03-23 | 1988-09-26 | Ortho Pharma Corp | Analyse for detektering av hepatitt-antigener og aids-antistoffer. |
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| US4956302A (en) * | 1987-09-11 | 1990-09-11 | Abbott Laboratories | Lateral flow chromatographic binding assay device |
| DE3837616A1 (de) * | 1988-11-05 | 1990-05-10 | Behringwerke Ag | Einschritt-immuntest zur bestimmung von antigen-spezifischen antikoerpern aller immunglobulin-klassen und dazu geeignetes mittel |
| JPH02247565A (ja) * | 1989-03-20 | 1990-10-03 | Nippon Seiyaku Kk | ペルオキシダーゼ標識ＨＢ↓ｓ抗原複合体、及びこの複合体を用いたＨＢ↓ｓ抗体の検出法 |
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| US6303325B1 (en) | 1998-05-29 | 2001-10-16 | Dade Behring Inc. | Method for detecting analytes |
| KR100368756B1 (ko) * | 2000-02-01 | 2003-01-24 | 주식회사 엘지생명과학 | 비형 간염 표면 항원에 대한 항체 진단 시약의 제조방법,이를 이용하여 수득되는 비형 간염 항원에 대한 항체 진단시약 및 비형 간염 바이러스 항체 진단 시약 |
| KR101646830B1 (ko) * | 2013-05-31 | 2016-08-08 | (주)셀트리온 | Ｂ형 간염 바이러스를 중화시킬 수 있는 결합 분자 |
| CN111024950A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-17 | 吉林金域医学检验所有限公司 | 一种乙型肝炎表面抗原检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
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-
1985
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- 1985-06-25 CA CA000485111A patent/CA1261740A/en not_active Expired
- 1985-06-26 ZA ZA854839A patent/ZA854839B/xx unknown
- 1985-06-26 IL IL75644A patent/IL75644A/xx not_active IP Right Cessation
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- 1985-06-28 DE DE8585107944T patent/DE3579856D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1985-06-28 AT AT85107944T patent/ATE57020T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-07-08 DK DK311285A patent/DK162467C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-07-09 GR GR851705A patent/GR851705B/el unknown
- 1985-07-10 AU AU44752/85A patent/AU590203B2/en not_active Ceased
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- 1985-07-15 ES ES545205A patent/ES8609724A1/es not_active Expired
- 1985-07-16 JP JP60155279A patent/JP2524101B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-01-22 ES ES551132A patent/ES8802406A1/es not_active Expired
Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Ａ．Ｊ，ズッカーマン著「肝炎とウイルス」１９８１年１０月１日発行講談社Ｐ．６０〜６５ |
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| IL75644A (en) | 1989-08-15 |
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| GR851705B (ja) | 1985-11-26 |
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