CN111024950A - 一种乙型肝炎表面抗原检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种乙型肝炎表面抗原检测方法，所述方法包括以下步骤：(1)制备血清样本：采集静脉血，分离得到血清，然后再将血清高速离心1‑2次，得到待检测血清样本；所述高速离心条件为：4‑10℃，10000‑15000rpm/min离心3‑8min；(2)加样：向包被有针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体的反应孔中加入待检测血清样本40‑50uL；所述单克隆抗体的克隆号为86C；(3)加酶标抗体：向反应孔中加入酶标抗体50±1uL，然后用封板膜覆盖反应板，将反应板置于37±1℃孵育35‑45min；(4)洗涤；(5)显色；(6)终止；(7)测定。上述检测方法能实现乙型肝炎表面抗原的准确检测，特别是针对高脂血症的人群的检测时，具有样本量需求少、反应孔体清晰干净，背景低的优点。
Description
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，具体涉及一种乙型肝炎表面抗原检测方法。
背景技术
乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)引起的以肝脏病变为 主的一种传染病。HBV基因组是双链、环形、不完全闭合DNA，由外壳与核心 两部分组成。病毒最外层是病毒的外膜或称衣膜(envelope)，只含病毒表面抗 原(HBsAg)，其内层为核心部分(core)，核蛋白即是核心抗原(HBcAg)。健康 体检是指通过医学手段和方法对受检者进行身体检查，了解受检者健康状况， 所以乙型肝炎在体检中起到至关重要的作用。目前常用的乙型肝炎病毒表面抗 原(HBsAg)检测方法为酶联免疫吸附法(ELISA)，但现有常用的酶联免疫吸 附法检测试剂盒的所用的血清样本的量为50uL-75uL，检测过程中孵育反应时间为2个小时。肥胖的人群和儿童(儿童配合度差)本来就不容易抽血，或者 肥胖的人群由于血液粘度高，导致抽血时的样本量偏少，如果一次体检抽血时 检测种类多，在乙肝检测项目时，就容易导致血清样本量不够，甚至需要再次 抽血补充样本量。本发明的发明人在实际应用中还发现，肥胖的人群(特别是 高脂血症的人群)的检测血清样本存在量少的情况，用常规的多种ELISA试剂 盒检测乙肝还容易存在检测背景不清晰，难判断的问题。
发明内容
基于此，本发明提供一种乙型肝炎表面抗原检测方法，所述检测方法能实 现血清样本中乙型肝炎表面抗原的准确检测，特别是针对高脂血症的人群的检 测时，具有样本量需求少、反应孔体清晰干净，背景低的优点。
具体技术方案为：
一种乙型肝炎表面抗原检测方法，包括以下步骤：
(1)制备血清样本：采集静脉血，分离得到血清，然后再将血清高速离心 1-2次，得到待检测血清样本；所述高速离心条件为：4-10℃，10000-15000rpm/min 离心3-8min；
(2)加样：向包被有针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体的反应孔中加入 步骤(1)获得的待检测血清样本40-50uL；所述单克隆抗体的克隆号为86C。
(3)加酶标抗体：向反应孔中加入酶标抗体50±1uL，然后用封板膜覆盖 反应板，将反应板置于37±1℃孵育35-45min；
(4)洗涤；
(5)显色；
(6)终止
(7)测定。
在其中一些实施例中，所述步骤(1)中分离血清的条件为：3000±50rpm/min 离心3-5min。
在其中一些实施例中，所述步骤(1)中高速离心条件为：4-10℃， 11000-13000rpm/min离心3-5min。通常，离心的时间长一点好，但建议不要超 过10分钟，经过大量样本检测发现，11000-13000rpm/min离心3-5min时就可以， 检测背景能达到比较清晰，而耗时不长。
在其中一些实施例中，所述步骤(2)中加入待检测血清样本45uL。
在其中一些实施例中，所述步骤(3)中的酶为辣根过氧化物酶。所述酶标 抗体为辣根过氧化物酶标记的乙型肝炎表面抗原的抗体。
在其中一些实施例中，其特征在于，所述步骤(4)中洗涤为：用洗涤液充 分洗涤反应孔3-5次，每次洗涤后扣干反应板。更优选为充分洗涤反应孔4次。 充分洗涤对于去除杂质和背景清晰有帮助，但是由于前面反应时间不是很长， 故固定洗涤不利于目的物的结合反应。
在其中一些实施例中，所述步骤(4)中每次洗涤时要保持30-60s的浸泡时 间。
在其中一些实施例中，所述步骤(5)中显色为：向反应孔中加入底物A、 B各50uL，混匀后于37℃避光反应15min。
在其中一些实施例中，所述步骤(6)中终止为：向反应孔中加入终止液50uL， 混匀。
在其中一些实施例中，所述步骤(7)中用酶标仪单波长450nm或双波长 450nm/630nm进行吸光值测定。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述检测方法对血清样本中乙型肝炎表面抗原阴性、弱阳性和阳性 结果均能准确检出。所述检测方法通过改变了血清样本的处理，以及从众多克 隆中选择适合克隆的乙肝表面抗原抗体，特别适合高脂血症的人群的血清样本 的检测，可以达到检测样本量少，检测背景清晰的效果，而且，经过优化的检 测方法，同时还达到检测时间短，能提高检测效率的优点。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述，以 下给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现， 并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内 容的理解更加透彻全面。应理解，下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常 用试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术 领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是 为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和 /或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例一种乙型肝炎表面抗原检测方法，包括以下步骤：
(1)制备血清样本：采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到血清， 然后再将血清高速离心1次，得到待检测血清样本；所述高速离心条件为：4℃， 12000rpm/min离心5min；
(2)加样：向包被有针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体的反应孔中分别 加入步骤(1)获得的待检测血清样本、阴性对照和阳性对照各45uL；所述单克 隆抗体的克隆号为86C。
(3)加酶标抗体：向每个反应孔中加入辣根过氧化物酶标记的乙型肝炎表 面抗原的抗体50uL，然后用封板膜覆盖反应板，将反应板置于37℃孵育45min；
(4)洗涤：用洗涤液充分洗涤反应孔4次，每次洗涤时要保持50s的浸泡 时间，洗涤后扣干反应板；
(5)显色：向每个反应孔中加入底物A、B各50uL，混匀后于37℃避光 反应15min；
(6)终止：向每个反应孔中加入终止液50uL，混匀；
(7)测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm进行吸光值测 定。
对比例1
本对比例一种乙型肝炎表面抗原检测方法，为现有常规检测乙型肝炎表面 抗原的酶联免疫吸附法，所述试剂盒购买于上海科华生物工程股份有限公司， 检测方法包括以下步骤：
(1)制备血清样本：采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到待检 测血清样本；
(2)加样：向包被有针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体的反应孔中分别 加入步骤(1)获得的待检测血清样本、阴性对照和阳性对照各75uL，37℃孵育 1h；
(3)加酶标抗体：向每个反应孔中加入辣根过氧化物酶标记的乙型肝炎表 面抗原的抗体50uL，然后用封板膜覆盖反应板，将反应板置于37℃孵育30min；
(4)洗涤：用洗涤液充分洗涤反应孔5次，每次洗涤时要保持50s的浸泡 时间，洗涤后扣干反应板；
(5)显色：向每个反应孔中加入底物A、B各50uL，混匀后于37℃避光 反应30min；
(6)终止：向每个反应孔中加入终止液50uL，混匀；
(7)测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm进行吸光值测 定。
对比例2
本对比例一种乙型肝炎表面抗原检测方法，除了制备血清样本时只进行3000rpm/min离心5min，不经过后续的高速离心处理外，其他均与实施例1相 同，具体包括以下步骤：
(1)制备血清样本：采集静脉血，3000rpm/min离心5min，分离得到待检 测血清样本；
(2)加样：向包被有针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体的反应孔中分别 加入步骤(1)获得的待检测血清样本、阴性对照和阳性对照各50uL；所述单克 隆抗体的克隆号为86C。
(3)加酶标抗体：向每个反应孔中加入辣根过氧化物酶标记的乙型肝炎表 面抗原的抗体50uL，然后用封板膜覆盖反应板，将反应板置于37℃孵育30min；
(4)洗涤：用洗涤液充分洗涤反应孔5次，每次洗涤时要保持50s的浸泡 时间，洗涤后扣干反应板；
(5)显色：向每个反应孔中加入底物A、B各50uL，混匀后于37℃避光 反应15min；
(6)终止：向每个反应孔中加入终止液50uL，混匀；
(7)测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm进行吸光值测 定。
利用上述实施例1和对比例1-2所述的检测方法对24例高脂血症人的血液 样本(实验检查高脂血症：血浆总胆固醇浓度>5.17mmol/L、LDL-C浓 度>130mg/dl)进行检测，具体结果如下：
表1检测结果
注：S/CO值小于1为阴性；S/CO值大于1小于4为弱阳性；S/CO值大于4为阳性。NC 代表阴性对照；PC代表阳性对照。
由表1可知，本发明提供的检测方法(实施例1)对血清样本的检测结果与 现有常规检测乙型肝炎表面抗原的酶联免疫吸附法(对比例1)的检测效果相当， 对血清样本中乙型肝炎表面抗原阴性、弱阳性和阳性结果均能准确检出。但是 与对比例1相比，实施例1中的方法还具有反应孔体清晰干净，背景效果好等 优点。此外，对比例1对血清样本的检测过程中需要2h的孵育反应时间，而本 发明方法只需要1h左右，有效缩短了检测时间，提高了检测效率。
与实施例1相比，对比例2中的检测方法在制备血清样本时只经过第一次 的离心(3000rpm/min离心5min)，没有进行后续的高速离心(4℃，12000rpm/min 离心5min)处理。结果显示，对比例2中的检测方法检测准确率下降，会造成 假阴性的结果：1号和17号样本假阴性，8号阳性样本检测为弱阳性。本发明 检测方法通过改变了血清样本的处理，以及从众多克隆中选择适合克隆的乙肝 表面抗原抗体，特别适合高脂血症的人群的血清样本的检测，可以在保证检测 结果准确性的同时达到检测样本量少，检测背景清晰的效果。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 以上实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但 并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。
Claims (10)
1.一种乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备血清样本：采集静脉血，分离得到血清，然后再将血清高速离心1-2次，得到待检测血清样本；所述高速离心条件为：4-10℃，10000-15000rpm/min离心3-8min；
(2)加样：向包被有针对乙型肝炎表面抗原的单克隆抗体的反应孔中加入步骤(1)获得的待检测血清样本40-50uL；所述单克隆抗体的克隆号为86C；
(3)加酶标抗体：向反应孔中加入酶标抗体50±1uL，然后用封板膜覆盖反应板，将反应板置于37±1℃孵育35-45min；
(4)洗涤；
(5)显色；
(6)终止；
(7)测定。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中分离血清的条件为：3000±50rpm/min离心3-5min。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中高速离心条件为：4-10℃，11000-13000rpm/min离心3-5min。
4.根据权利要求1-3任一项所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(2)中加入待检测血清样本45uL。
5.根据权利要求1-3任一项所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的酶为辣根过氧化物酶。
6.根据权利要求1-3任一项所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(4)中洗涤为：用洗涤液充分洗涤反应孔3-5次，每次洗涤后扣干反应板。
7.根据权利要求6所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，每次洗涤时要保持30-60s的浸泡时间。
8.根据权利要求1-3任一项所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中显色为：向反应孔中加入底物A、B各50uL，混匀后于37℃避光反应15min。
9.根据权利要求1-3任一项所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(6)中终止为：向反应孔中加入终止液50uL，混匀。
10.根据权利要求1-9任一项所述的乙型肝炎表面抗原检测方法，其特征在于，所述步骤(7)中用酶标仪单波长450nm或双波长450nm/630nm进行吸光值测定。
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