CN106906190B - 一组亮氨酸脱氢酶及其编码基因和应用 - Google Patents

一组亮氨酸脱氢酶及其编码基因和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一组亮氨酸脱氢酶及其编码基因和应用。本发明首先提供了一组突变体蛋白，为如下(a1)至(a8)中的任意一种：(a1)突变体蛋白3，如序列5所示；(a2)突变体蛋白11，如序列7所示；(a3)突变体蛋白14，如序列9所示；(a4)突变体蛋白15，如序列11所示；(a5)突变体蛋白19，如序列13所示；(a6)突变体蛋白20，如序列15所示；(a7)突变体蛋白25，如序列17所示；(a8)突变体蛋白26，如序列19所示。本发明提供的突变体蛋白，催化效率显著高于现有的亮氨酸脱氢酶，TMP消耗率＝99％时的反应时间短于现有的亮氨酸脱氢酶，特别是突变体蛋白3。本发明对于L‑叔亮氨酸的生产具有重大的应用价值，将产生非常可观的经济效益。

Description

一组亮氨酸脱氢酶及其编码基因和应用
技术领域
本发明涉及一组亮氨酸脱氢酶及其编码基因和应用。
背景技术
L-叔亮氨酸是一种具有广泛应用前景的手性非蛋白质源氨基酸，可应用于不对称合成以及手性药物合成等。随着L-叔亮氨酸应用领域的不断研究，用亮氨酸脱氢酶来生产L-叔亮氨酸的研究一直没有中断过。为了提高L-叔亮氨酸的生产效率，降低生产成本，我国已在此方面进行了大量的研究，但是对于工业用酶的改造还存在许多尚待完善的地方。因此，加速工业用L-叔亮氨酸生产酶系已势在必行。
在L-叔亮氨酸的工业化生物合成过程中涉及到两种酶：亮氨酸脱氢酶和NADH辅酶再生酶。NADH再生酶可以选择甲酸脱氢酶或者葡萄糖脱氢酶。亮氨酸脱氢酶(leucinedehydrogenase，简称LeuDH)是L-叔亮氨酸生产的关键酶，工业上使用的亮氨酸脱氢酶多来源于芽胞杆菌。
酶法生产L-叔亮氨酸，产品的生产效率取决于亮氨酸脱氢酶转化底物三甲基丙酮酸的速度。三甲基丙酮酸是亮氨酸脱氢酶的底物之一，天然的亮氨酸脱氢酶对三甲基丙酮酸的催化能力低于亮氨酸脱氢酶的天然底物α-酮异己酸。并且三甲基丙酮酸对亮氨酸脱氢酶有毒害作用，高浓度的底物会影响L-叔亮氨酸的转化效率。
发明内容
本发明的目的是提供一组亮氨酸脱氢酶及其编码基因和应用。
本发明首先提供了一组突变体蛋白，为如下(a1)至(a30)中的任意一种：
(a1)突变体蛋白3，其氨基酸序列如序列表的序列5所示；
(a2)突变体蛋白11，其氨基酸序列如序列表的序列7所示；
(a3)突变体蛋白14，其氨基酸序列如序列表的序列9所示；
(a4)突变体蛋白15，其氨基酸序列如序列表的序列11所示；
(a5)突变体蛋白19，其氨基酸序列如序列表的序列13所示；
(a6)突变体蛋白20，其氨基酸序列如序列表的序列15所示；
(a7)突变体蛋白25，其氨基酸序列如序列表的序列17所示；
(a8)突变体蛋白26，其氨基酸序列如序列表的序列19所示；
(a9)突变体蛋白1，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V；
(a10)突变体蛋白2，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第340位氨基酸残基由E突变为V；
(a11)突变体蛋白4，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第238位氨基酸残基由A突变为V；
(a12)突变体蛋白5，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第43位氨基酸残基由A突变为V，第76位氨基酸残基由L突变为V，第111位氨基酸残基由I突变为V，第124位氨基酸残基由D突变为E；
(a13)突变体蛋白6，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第225位氨基酸残基由E突变为I，第240位氨基酸残基由G突变为L，第261位氨基酸残基由N突变为I；
(a14)突变体蛋白7，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第287位氨基酸残基由N突变为I，第358位氨基酸残基由K突变为R；
(a15)突变体蛋白8，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第334位氨基酸残基由A突变为V；
(a16)突变体蛋白9，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第329位氨基酸残基由I突变为V；
(a17)突变体蛋白10，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第42位氨基酸残基由G突变为F，第44位氨基酸残基由R突变为L，第75位氨基酸残基由N突变为D，第288位氨基酸残基由A突变为E；
(a18)突变体蛋白12，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第261位氨基酸残基由N突变为M，第265位氨基酸残基由Q突变为L；
(a19)突变体蛋白13，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第146位氨基酸残基由P突变为A，第240位氨基酸残基由G突变为A；
(a20)突变体蛋白16，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第94位氨基酸残基由E突变为R，第180位氨基酸残基由G突变为A；
(a21)突变体蛋白17，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第160位氨基酸残基由A突变为V，第259位氨基酸残基由S突变为A；
(a22)突变体蛋白18，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第42位氨基酸残基由G突变为A，第41位氨基酸残基由G突变为V，第261位氨基酸残基由N突变为I；
(a23)突变体蛋白21，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第53位氨基酸残基由N突变为G，第148位氨基酸残基由P突变为L；
(a24)突变体蛋白22，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第182位氨基酸残基由G突变为A，第202位氨基酸残基由T突变为S；
(a25)突变体蛋白23，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第240位氨基酸残基由G突变为A，第261位氨基酸残基由N突变为A；
(a26)突变体蛋白24，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第297位氨基酸残基由E突变为G，第300位氨基酸残基由G突变为A；
(a27)突变体蛋白27，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第183位氨基酸残基由N突变为I，第216位氨基酸残基由F突变为I，第304位氨基酸残基由E突变为V；
(a28)突变体蛋白28，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第71位氨基酸残基由A突变为I，第357位氨基酸残基由E突变为A；
(a29)突变体蛋白29，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第258位氨基酸残基由G突变为A，第280位氨基酸残基由Y突变为A；
(a30)由序列表的序列3所示的蛋白质衍生的，具有上述任一所述突变位点或具有上述任意两个以上突变位点的蛋白质。
编码上述各个突变体蛋白的基因也属于本发明的保护范围。
所述基因具体可为如下(b1)至(b30)中的任意一种：
(b1)编码所述突变体蛋白3的基因，如序列表的序列6所示；
(b2)编码所述突变体蛋白11的基因，如序列表的序列8所示；
(b3)编码所述突变体蛋白14的基因，如序列表的序列10所示；
(b4)编码所述突变体蛋白15的基因，如序列表的序列12所示；
(b5)编码所述突变体蛋白19的基因，如序列表的序列14所示；
(b6)编码所述突变体蛋白20的基因，如序列表的序列16所示；
(b7)编码所述突变体蛋白25的基因，如序列表的序列18所示；
(b8)编码所述突变体蛋白26的基因，如序列表的序列20所示；
(b9)编码所述突变体蛋白1的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T；
(b10)编码所述突变体蛋白2的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第1019位核苷酸由A突变为T；
(b11)编码所述突变体蛋白4的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第713位核苷酸由C突变为T；
(b12)编码所述突变体蛋白5的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第128位核苷酸由C突变为T，第226位核苷酸由C突变为G，第331位核苷酸由A突变为G，第372位核苷酸由T突变为A；
(b13)编码所述突变体蛋白6的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第674位核苷酸由A突变为T，第675位核苷酸由A突变为G，第719位核苷酸由G突变为C，第782位核苷酸由A突变为T；
(b14)编码所述突变体蛋白7的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第860位核苷酸由A突变为T，第1073位核苷酸由A突变为G；
(b15)编码所述突变体蛋白8的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第1001位核苷酸由C突变为T；
(b16)编码所述突变体蛋白9的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第985位核苷酸由A突变为G；
(b17)编码所述突变体蛋白10的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第124位核苷酸由G突变为T，第125位核苷酸由G突变为T，第131位核苷酸由G突变为T，第223位核苷酸由A突变为G，第863位核苷酸由C突变为A。；
(b18)编码所述突变体蛋白12的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第782位核苷酸由A突变为T，第783位核苷酸由T突变为G，第794位核苷酸由A突变为T；
(b19)编码所述突变体蛋白13的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第436位核苷酸由C突变为G，第719位核苷酸由G突变为C；
(b20)编码所述突变体蛋白16的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第280位核苷酸由G突变为A，第281位核苷酸由A突变为G，第539位核苷酸由G突变为C；
(b21)编码所述突变体蛋白17的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第479位核苷酸由C突变为T，第775位核苷酸由T突变为G；
(b22)编码所述突变体蛋白18的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第125位核苷酸由G突变为C，第122位核苷酸由G突变为T，第782位核苷酸由A突变为T；
(b23)编码所述突变体蛋白21的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第157位核苷酸由A突变为G，第158位核苷酸由A突变为G，第443位核苷酸由C突变为T；
(b24)编码所述突变体蛋白22的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第545位核苷酸由G突变为C，第605位核苷酸由C突变为G，第606位核苷酸由A突变为C；
(b25)编码所述突变体蛋白23的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第719位核苷酸由G突变为C，第781位核苷酸由A突变为G，第782位核苷酸由A突变为C；
(b26)编码所述突变体蛋白24的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第890位核苷酸由A突变为G，第899位核苷酸由G突变为C；
(b27)编码所述突变体蛋白27的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第548位核苷酸由A突变为T，第646位核苷酸由T突变为A，第911位核苷酸由A突变为T；
(b28)编码所述突变体蛋白28的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第211位核苷酸由G突变为A，第212位核苷酸由C突变为T，第1070位核苷酸由A突变为C；
(b29)编码所述突变体蛋白29的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第773位核苷酸由G突变为C，第838位核苷酸由T突变为G，第839位核苷酸由A突变为C；
(b30)与上述任一所述DNA分子具有90％以上同源性的DNA分子。
本发明还保护一种融合蛋白，包括以上任一所述突变体蛋白和His6标签。
含有所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌均属于本发明的保护范围。
所述重组载体具体可为将所述基因插入pET-28a(+)载体的多克隆位点(例如BamHI和XhoI酶切位点之间)得到的重组质粒。
所述重组菌具体可为将所述重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。
所述融合蛋白的制备方法包括如下步骤：
(c1)培养所述重组菌至OD600nm＝0.6时加入IPTG并使其浓度为1mM，然后30℃、250rpm振荡培养16小时；
(c2)取(c1)得到的整个培养体系，离心(离心参数具体可为：4℃、2500g离心10分钟)收集菌体；
(c3)取步骤(c2)得到的菌体，悬浮于5mL磷酸钾缓冲液(pH8.0、100mM)中，进行超声破碎(超声参数具体可为：超声功率200W，总时间5分钟，每工作5秒停5秒)，然后4℃、10000g离心10分钟，收集上清液。
所述制备方法还可包括如下步骤：
(c4)取步骤(c3)得到的上清液，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。
(c5)取步骤(c4)得到的滤液，进行镍离子纯化柱纯化。
所述镍离子纯化柱纯化的参数具体如下：
GE Histrap HP 1.6×2.5cm(1ml)柱子(GE，code no:17-5247-01)，预装有NiSepharose High Performance；
纯化过程：(1)先用1ml 10mM咪唑溶液(溶剂为pH8.0Tris-HCl缓冲液)平衡柱子；(2)上样步骤(c4)得到的滤液；(3)用5ml 20mM咪唑溶液(溶剂为pH8.0Tris-HCl缓冲液)洗涤以去除杂蛋白；(4)用10ml 250mM咪唑溶液(溶剂为pH8.0Tris-HCl缓冲液)洗脱以收集目的蛋白，收集洗脱过程中保留体积为第4-6ml的过柱后溶液。
所述制备方法还可包括如下步骤：
(c6)将步骤(c5)收集的过柱后溶液转移至透析袋中，在PBS缓冲液(pH8.0、100mM)中4℃透析16小时。
本发明还保护所述突变体蛋白或所述融合蛋白作为亮氨酸脱氢酶的应用。
本发明还保护所述突变体蛋白或所述融合蛋白在制备亮氨酸脱氢酶中的应用。
本发明还保护所述突变体蛋白或所述融合蛋白在制备L-叔亮氨酸中的应用。
本发明提供的突变体蛋白，其催化效率显著高于现有的亮氨酸脱氢酶，TMP消耗率＝99％时的反应时间均短于现有的亮氨酸脱氢酶，特别是突变体蛋白3。本发明对于L-叔亮氨酸的生产具有重大的应用价值，将产生非常可观的经济效益。
附图说明
图1为实施例4中的催化效率结果。
图2为实施例5中TMP消耗率＝99％时的反应时间结果。
图3为实施例5中L-叔亮氨酸定量的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
pET-28a(+)载体：NOVOGEN；Cat.No.69864-3。大肠杆菌BL21(DE3)：TAKARA；CodeNo.9126。大肠杆菌MC1061：武汉淼灵生物科技有限公司；货号ML2054。TMP：北京精华耀邦医药科技有限公司；货号JHYB008416。NADH：Roche；货号10128023001。
球形赖氨酸芽孢杆菌(Lysinibacillus sphaericus)：CGMCC，编号1.1677(http://www.cgmcc.net/directory/mulu.php？number＝1.1677&genus＝&species＝& yiming＝&p＝1)。
pDHK29载体：参考文献：Phillips GJ,Park SK,Huber D(2000)High copy numberplasmids compatible with commonly used cloning vectors.Biotechniques 28:400-402,404,406passim.。
L-叔亮氨酸的定量方法采用氨基酸的经典定量方法：FDAA衍生法定量氨基酸。参考文献：[1]Bhushan R,Bruckner H(2004)Marfey's reagent for chiral amino acidanalysis:A review.Amino Acids 27:231-247.；[2]Hess S,Gustafson KR,MilanowskiDJ,Alvira E,Lipton MA,Pannell LK(2004)Chirality determination of unusualamino acids using precolumn derivatization and liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry.J Chromatogr A 1035:211-219.。
实施例1、葡萄糖脱氢酶的制备
一、构建重组质粒
1、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
2、以步骤1合成的双链DNA分子为模板，采用g1和g2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
g1：5’-CCGGAATTCATGTATCCGGATTTAAAAG-3’；
g2：5’-CCGCTCGAG TTAACCGCGGCCTGCCTGGA-3’。
经测序，PCR扩增产物中具有序列表的序列2所示的双链DNA分子。序列表的序列2所示的双链DNA分子编码序列表的序列1所示的蛋白质。序列表的序列1所示的蛋白质为现有的葡萄糖脱氢酶。
3、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
4、用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切pET-28a(+)载体，回收约5300bp的载体骨架。
5、将步骤3的酶切产物与步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒pET28-a-gdh。根据测序结果，对重组质粒pET28-a-gdh进行结构描述如下：在pET-28a(+)载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的双链DNA分子。
二、制备葡萄糖脱氢酶
1、将重组质粒pET28-a-gdh导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
2、将步骤1得到的重组菌接种于LB液体培养基，37℃、250rpm振荡培养，得到OD600nm＝2.0的菌液。
3、取3ml步骤2得到的菌液，接种至100mlLB液体培养基，先37℃、250rpm振荡培养2小时，然后加入IPTG并使其浓度为1mM，然后30℃、250rpm振荡培养12小时，然后4℃、2500g离心10分钟，收集菌体。
4、取步骤3得到的全部菌体，悬浮于10mL磷酸钾缓冲液(pH8.0、100mM)中，进行超声破碎(超声功率200W，总时间5分钟，每工作5秒停5秒)，然后4℃、10000g离心10分钟，收集上清液(即为葡萄糖脱氢酶粗酶液)。
步骤4得到的上清液中的总蛋白浓度为0.2mg/ml。
实施例2、各个突变体蛋白的发现
一、构建表达野生型亮氨酸脱氢酶的重组质粒
1、以球形赖氨酸芽孢杆菌的基因组DNA为模板，采用L1和L2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
L1：5’-GGCTCTAGACATGGAAATCTTCAAGTATAT-3’；
L2：5’-ACGGAATTCTTAACGGCCGTTCAAAATAT-3’。
经测序，PCR扩增产物中具有序列表的序列4所示的双链DNA分子。序列表的序列4所示的双链DNA分子编码序列表的序列3所示的蛋白质。序列表的序列3所示的蛋白质为现有的亮氨酸脱氢酶。
2、用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。
3、用限制性内切酶XbaI和EcoRI双酶切pDHK29载体，回收约4200bp的载体骨架。
4、将步骤2的酶切产物与步骤3的载体骨架连接，得到重组质粒pDHK29-leudh。经测序，对重组质粒pDHK29-leudh进行结构描述如下：在pDHK29载体的XbaI和EcoRI酶切位点之间插入了序列表的序列4所示的双链DNA分子。
二、亮氨酸脱氢酶的随机突变
1、以重组质粒pDHK29-leudh为模板，以序列4所示的LeuDH基因为靶点进行随机突变，得到突变体质粒库。
2、分别将突变体质粒库中的各个质粒导入大肠杆菌MC1061，得到突变体重组菌库。
3、分别取突变体重组菌库中的各个重组菌单菌落，接种到96深孔板培养板中，30℃培养16小时，离心收集菌体，在每个孔板中加入300μL溶菌缓冲液(即含有1％溶菌酶的pH8.0、100mM磷酸钾缓冲液)并37℃反应1小时，然后4℃、3600g离心10分钟，收集上清液(即亮氨酸脱氢酶粗酶液)。
4、取50μL亮氨酸脱氢酶粗酶液，转移至96深孔板培养板中，加入100μL底物溶液(溶剂为pH8.0、100mM磷酸钾缓冲液；溶质及其浓度如下：0.1mM NAD+、73mM TMP、900mM葡萄糖、体积百分含量为70％的实施例1制备的葡萄糖脱氢酶粗酶液和560mM NH4Cl)，37℃培养30分钟，然后加入10μL的18％HCl溶液以终止反应，4℃、1800g离心10min，收集上清液。
5、取10μL步骤4得到的上清液，转移到新的96浅孔板培养板中，加入50μL的0.0375％DNP溶液，室温静置5分钟，然后加入100μL 100mM KOH溶液，检测在540nm下的光吸收值，选择吸光值较亲本低的突变体。
基于上述步骤，发现了一系列突变体蛋白。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白1的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白1的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白2的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第340位氨基酸残基由E突变为V。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白2的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第1019位核苷酸由A突变为T。
突变体蛋白3的氨基酸序列如序列表的序列5所示，其编码基因如序列表的序列6所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白3的差异如下：第40位氨基酸残基由L突变为V，第41位氨基酸残基由G突变为V，第290位氨基酸残基由G突变为I，第334位氨基酸残基由A突变为V。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白3的编码基因的差异如下：第118位核苷酸由T突变为G，第122位核苷酸由G突变为T，第868位核苷酸由G突变为A，第869位核苷酸由G突变为T，第1001位核苷酸由C突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白4的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第238位氨基酸残基由A突变为V。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白4的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第713位核苷酸由C突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白5的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第76位氨基酸残基由L突变为V，第111位氨基酸残基由I突变为V，第124位氨基酸残基由D突变为E。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白5的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第226位核苷酸由C突变为G，第331位核苷酸由A突变为G，第372位核苷酸由T突变为A。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白6的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第43位氨基酸残基由A突变为V，第225位氨基酸残基由E突变为I，第240位氨基酸残基由G突变为L，第261位氨基酸残基由N突变为I。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白6的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第674位核苷酸由A突变为T，第675位核苷酸由A突变为G，第719位核苷酸由G突变为C，第782位核苷酸由A突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白7的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第287位氨基酸残基由N突变为I，第358位氨基酸残基由K突变为R。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白7的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第860位核苷酸由A突变为T，第1073位核苷酸由A突变为G。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白8的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第334位氨基酸残基由A突变为V。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白8的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第1001位核苷酸由C突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白9的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第329位氨基酸残基由I突变为V。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白9的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第985位核苷酸由A突变为G。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白10的差异如下：第42位氨基酸残基由G突变为F，第41位氨基酸残基由G突变为V，第44位氨基酸残基由R突变为L，第75位氨基酸残基由N突变为D，第288位氨基酸残基由A突变为E。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白10的编码基因的差异如下：第124位核苷酸由G突变为T，第125位核苷酸由G突变为T，第122位核苷酸由G突变为T，第131位核苷酸由G突变为T，第223位核苷酸由A突变为G，第863位核苷酸由C突变为A。
突变体蛋白11的氨基酸序列如序列表的序列7所示，其编码基因如序列表的序列8所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白11的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第134位氨基酸残基由T突变为A，第297位氨基酸残基由E突变为G。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白11的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第400位核苷酸由A突变为G，第890位核苷酸由A突变为G。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白12的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第261位氨基酸残基由N突变为M，第265位氨基酸残基由Q突变为L。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白12的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第782位核苷酸由A突变为T，第783位核苷酸由T突变为G，第794位核苷酸由A突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白13的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第146位氨基酸残基由P突变为A，第240位氨基酸残基由G突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白13的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第436位核苷酸由C突变为G，第719位核苷酸由G突变为C。
突变体蛋白14的氨基酸序列如序列表的序列9所示，其编码基因如序列表的序列10所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白14的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第112位氨基酸残基由T突变为A，第134位氨基酸残基由T突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白14的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第334位核苷酸由A突变为G，第400位核苷酸由A突变为G。
突变体蛋白15的氨基酸序列如序列表的序列11所示，其编码基因如序列表的序列12所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白15的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第78位氨基酸残基由G突变为D，第362位氨基酸残基由N突变为I。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白15的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第233位核苷酸由G突变为A，第1085位核苷酸由A突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白16的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第94位氨基酸残基由E突变为R，第180位氨基酸残基由G突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白16的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第280位核苷酸由G突变为A，第281位核苷酸由A突变为G，第539位核苷酸由G突变为C。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白17的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第160位氨基酸残基由A突变为V，第259位氨基酸残基由S突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白17的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第479位核苷酸由C突变为T，第775位核苷酸由T突变为G。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白18的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第42位氨基酸残基由G突变为A，第261位氨基酸残基由N突变为I。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白18的编码基因的差异如下：第125位核苷酸由G突变为C，第122位核苷酸由G突变为T，第782位核苷酸由A突变为T。
突变体蛋白19的氨基酸序列如序列表的序列13所示，其编码基因如序列表的序列14所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白19的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第295位氨基酸残基由A突变为I，第303位氨基酸残基由R突变为H。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白19的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第884位核苷酸由C突变为T，第908位核苷酸由G突变为A。
突变体蛋白20的氨基酸序列如序列表的序列15所示，其编码基因如序列表的序列16所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白20的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第57位氨基酸残基由D突变为I，第296位氨基酸残基由D突变为R。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白20的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第169位核苷酸由G突变为A，第170位核苷酸由A突变为T，第886位核苷酸由G突变为C，第887位核苷酸由A突变为G。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白21的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第53位氨基酸残基由N突变为G，第148位氨基酸残基由P突变为L。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白21的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第157位核苷酸由A突变为G，第158位核苷酸由A突变为G，第443位核苷酸由C突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白22的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第182位氨基酸残基由G突变为A，第202位氨基酸残基由T突变为S。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白22的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第545位核苷酸由G突变为C，第605位核苷酸由C突变为G，第606位核苷酸由A突变为C。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白23的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第240位氨基酸残基由G突变为A，第261位氨基酸残基由N突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白23的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第719位核苷酸由G突变为C，第781位核苷酸由A突变为G，第782位核苷酸由A突变为C。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白24的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第297位氨基酸残基由E突变为G，第300位氨基酸残基由G突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白24的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第890位核苷酸由A突变为G，第899位核苷酸由G突变为C。
突变体蛋白25的氨基酸序列如序列表的序列17所示，其编码基因如序列表的序列18所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白25的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第65位氨基酸残基由M突变为I，第118位氨基酸残基由T突变为I。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白25的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第195位核苷酸由G突变为T，第353位核苷酸由C突变为T。
突变体蛋白26的氨基酸序列如序列表的序列19所示，其编码基因如序列表的序列20所示。与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白26的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第140位氨基酸残基由F突变为I，第146位氨基酸残基由P突变为I，第351位氨基酸残基由S突变为D。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白26的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第418位核苷酸由T突变为A，第436位核苷酸由C突变为A，第437位核苷酸由C突变为T，第1051位核苷酸由A突变为G，第1052位核苷酸由G突变为A。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白27的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第183位氨基酸残基由N突变为I，第216位氨基酸残基由F突变为I，第304位氨基酸残基由E突变为V。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白27的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第548位核苷酸由A突变为T，第646位核苷酸由T突变为A，第911位核苷酸由A突变为T。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白28的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第71位氨基酸残基由A突变为I，第357位氨基酸残基由E突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白28的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第211位核苷酸由G突变为A，第212位核苷酸由C突变为T，第1070位核苷酸由A突变为C。
与序列表的序列3所示的现有亮氨酸脱氢酶相比，突变体蛋白29的差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第258位氨基酸残基由G突变为A，第280位氨基酸残基由Y突变为A。与序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因相比，突变体蛋白29的编码基因的差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第773位核苷酸由G突变为C，第838位核苷酸由T突变为G，第839位核苷酸由A突变为C。
实施例3、突变体蛋白的制备与纯化
一、制备突变体蛋白3
1、将突变体蛋白3的编码基因(序列表的序列6所述的双链DNA分子)插入pET-28a(+)载体的BamHI和XhoI酶切位点之间，得到重组质粒。
重组质粒中，序列表的序列6所述的双链DNA分子与插入位点上游的His6标签(由连续6个组氨酸残基组成)的编码序列融合，表达N末端具有His6标签的突变体蛋白3。
2、将步骤1得到的重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌。
3、将步骤2得到的重组菌接种于50mlLB液体培养基，37℃、250rpm振荡培养至OD600nm＝0.6时加入IPTG并使其浓度为1mM，然后30℃、250rpm振荡培养16小时。
4、取步骤3得到的整个培养体系，4℃、2500g离心10分钟，收集菌体。
5、取步骤4得到的菌体，悬浮于5mL磷酸钾缓冲液(pH8.0、100mM)中，进行超声破碎(超声功率200W，总时间5分钟，每工作5秒停5秒)，然后4℃、10000g离心10分钟，收集上清液(即为突变体蛋白3粗酶液，其中的总蛋白浓度为7.5mg/mL)。
6、取步骤5得到的上清液，用0.22μm滤膜过滤，收集滤液。
7、将步骤6得到的滤液进行镍离子纯化柱纯化。
镍离子纯化柱纯化的参数如下：
GE Histrap HP 1.6×2.5cm(1ml)柱子(GE，code no:17-5247-01)，预装有NiSepharose High Performance；
纯化过程：(1)先用1ml 10mM咪唑溶液(溶剂为pH8.0Tris-HCl缓冲液)平衡柱子；(2)上样步骤6得到的滤液；(3)用5ml 20mM咪唑溶液(溶剂为pH8.0Tris-HCl缓冲液)洗涤以去除杂蛋白；(4)用10ml250mM咪唑溶液(溶剂为pH8.0Tris-HCl缓冲液)洗脱以收集目的蛋白，收集洗脱过程中保留体积为第4-6ml的过柱后溶液。
8、将步骤7得到的过柱后溶液转移至透析袋中，在PBS缓冲液(pH8.0、100mM)中4℃透析16小时。
9、完成步骤8后，取透析袋中的溶液，即为突变体蛋白3蛋白溶液(蛋白浓度为3mg/ml)。
二、制备其它突变体蛋白
将突变体蛋白3的编码基因分别替换为突变体蛋白1的编码基因、突变体蛋白2的编码基因、突变体蛋白4的编码基因、突变体蛋白5的编码基因、突变体蛋白6的编码基因、突变体蛋白7的编码基因、突变体蛋白8的编码基因、突变体蛋白9的编码基因、突变体蛋白10的编码基因、突变体蛋白11的编码基因、突变体蛋白12的编码基因、突变体蛋白13的编码基因、突变体蛋白14的编码基因、突变体蛋白15的编码基因、突变体蛋白16的编码基因、突变体蛋白17的编码基因、突变体蛋白18的编码基因、突变体蛋白19的编码基因、突变体蛋白20的编码基因、突变体蛋白21的编码基因、突变体蛋白22的编码基因、突变体蛋白23的编码基因、突变体蛋白24的编码基因、突变体蛋白25的编码基因、突变体蛋白26的编码基因、突变体蛋白27的编码基因、突变体蛋白28的编码基因或突变体蛋白29的编码基因，其它同步骤一。
得到突变体蛋白1粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白1蛋白溶液(蛋白浓度为4.1mg/ml)。得到突变体蛋白2粗酶液(总蛋白浓度为7.2mg/ml)和突变体蛋白2蛋白溶液(蛋白浓度为3.6mg/ml)。得到突变体蛋白4粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白4蛋白溶液(蛋白浓度为3.3mg/ml)。得到突变体蛋白5粗酶液(总蛋白浓度为7.6mg/ml)和突变体蛋白5蛋白溶液(蛋白浓度为4.2mg/ml)。得到突变体蛋白6粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白6蛋白溶液(蛋白浓度为3.1mg/ml)。得到突变体蛋白7粗酶液(总蛋白浓度为7.7mg/ml)和突变体蛋白7蛋白溶液(蛋白浓度为4.4mg/ml)。得到突变体蛋白8粗酶液(总蛋白浓度为7.7mg/ml)和突变体蛋白8蛋白溶液(蛋白浓度为4.6mg/ml)。得到突变体蛋白9粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白9蛋白溶液(蛋白浓度为3.4mg/ml)。得到突变体蛋白10粗酶液(总蛋白浓度为7.4mg/ml)和突变体蛋白10蛋白溶液(蛋白浓度为4.4mg/ml)。得到突变体蛋白11粗酶液(总蛋白浓度为7.6mg/ml)和突变体蛋白11蛋白溶液(蛋白浓度为4.7mg/ml)。得到突变体蛋白12粗酶液(总蛋白浓度为7.6mg/ml)和突变体蛋白12蛋白溶液(蛋白浓度为3.2mg/ml)。得到突变体蛋白13粗酶液(总蛋白浓度为7.7mg/ml)和突变体蛋白13蛋白溶液(蛋白浓度为4.2mg/ml)。得到突变体蛋白14粗酶液(总蛋白浓度为7.7mg/ml)和突变体蛋白14蛋白溶液(蛋白浓度为4.2mg/ml)。得到突变体蛋白15粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白15蛋白溶液(蛋白浓度为4.8mg/ml)。得到突变体蛋白16粗酶液(总蛋白浓度为7.7mg/ml)和突变体蛋白16蛋白溶液(蛋白浓度为3.4mg/ml)。得到突变体蛋白17粗酶液(总蛋白浓度为7.6mg/ml)和突变体蛋白17蛋白溶液(蛋白浓度为3.8mg/ml)。得到突变体蛋白18粗酶液(总蛋白浓度为7.7mg/ml)和突变体蛋白18蛋白溶液(蛋白浓度为4.3mg/ml)。得到突变体蛋白19粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白19蛋白溶液(蛋白浓度为4.4mg/ml)。得到突变体蛋白20粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白20蛋白溶液(蛋白浓度为4.9mg/ml)。得到突变体蛋白21粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白21蛋白溶液(蛋白浓度为4.5mg/ml)。得到突变体蛋白22粗酶液(总蛋白浓度为7.6mg/ml)和突变体蛋白22蛋白溶液(蛋白浓度为4.5mg/ml)。得到突变体蛋白23粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白23蛋白溶液(蛋白浓度为3.9mg/ml)。得到突变体蛋白24粗酶液(总蛋白浓度为7.6mg/ml)和突变体蛋白24蛋白溶液(蛋白浓度为4.4mg/ml)。得到突变体蛋白25粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白25蛋白溶液(蛋白浓度为4.3mg/ml)。得到突变体蛋白26粗酶液(总蛋白浓度为7.6mg/ml)和突变体蛋白26蛋白溶液(蛋白浓度为3.4mg/ml)。得到突变体蛋白27粗酶液(总蛋白浓度为7.7mg/ml)和突变体蛋白27蛋白溶液(蛋白浓度为4.2mg/ml)。得到突变体蛋白28粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/m)和突变体蛋白28蛋白溶液(蛋白浓度为3.7mg/ml)。得到突变体蛋白29粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和突变体蛋白29蛋白溶液(蛋白浓度为4.4mg/ml)。
三、制备现有的亮氨酸脱氢酶
将突变体蛋白3的编码基因替换为序列表的序列4所示的现有亮氨酸脱氢酶基因，其它同步骤一。
得到亮氨酸脱氢酶粗酶液(总蛋白浓度为7.5mg/ml)和亮氨酸脱氢酶蛋白溶液(蛋白浓度为7.5mg/ml)。
实施例4、现有亮氨酸脱氢酶以及各个突变体蛋白的酶学性质
原理阐述：TMP+NADH+NH4 +＝L-叔亮氨酸+NAD++H2O，其中NADH在340nm下有最高吸收值，NAD在260nm下有最高吸收值，检测340nm下吸收值的降低量即可以计算出NADH消耗量(需要预先用NADH标准品制作标准品浓度与吸收值的标准曲线)，1mol NADH消耗量对应1molTMP消耗量。酶活单位定义(1U)：每分钟消耗1molTMP的酶量。
将实施例3制备的各个突变体蛋白蛋白溶液或亮氨酸脱氢酶蛋白溶液作为待测蛋白溶液，分别进行如下操作：
反应体系：10μL待测蛋白溶液，190μL含TMP和NADH的NH4OH-NH4Cl缓冲液(pH10.0、2M)。反应体系中，TMP的初始浓度为1-30mM，NADH的初始浓度为0.4mM。
反应条件：30℃、静置。
反应第1至5分钟，用酶标仪记录340nm处吸光值的变化。计算各个待测蛋白溶液的酶活。进一步计算酶反应速度，做双倒数曲线，计算各个蛋白作为亮氨酸脱氢酶对TMP的酶学参数Km、Vmax，计算出Kcat(催化效率)。
催化效率结果见图1(CK代表现有亮氨酸脱氢酶，L1至L29依次代表突变体蛋白1至突变体蛋白29)。各个突变体蛋白的催化效率均高于现有亮氨酸脱氢酶，其中突变体蛋白3的催化效率最高，约为现有亮氨酸脱氢酶的六倍。
实施例5、现有亮氨酸脱氢酶以及各个突变体蛋白对L-叔亮氨酸的生物转化能力
将实施例3制备的各个突变体蛋白粗酶液或亮氨酸脱氢酶粗酶液作为待测粗酶液，分别进行如下操作：
初始反应体系：将NAD+(NAD+由NAD钠盐提供)、3ml底物混合液、3ml待测粗酶液(蛋白浓度为7.5mg/ml，用PBS缓冲液调整蛋白浓度)和4ml实施例1制备的葡萄糖脱氢酶粗酶液(蛋白浓度为7.6mg/ml)混合。NAD+在反应体系中的初始浓度为0.2mM。
反应过程：当反应进行至5分钟、10分钟、17分钟和25分钟时在反应体系中各加入1mL底物混合液，当反应进行至40分钟时在反应体系中加入1mlNH4OH/NH4Cl缓冲液(pH10.0、2M)。
底物混合液：含1.9M葡萄糖、3.2M NH4Cl和1.07M TMP的磷酸钾缓冲液(pH8.0、100mM)。
反应条件：30℃、200rpm振荡反应160分钟。
反应过程中，用酶标仪记录340nm处吸光值的变化，计算TMP消耗率＝99％时的反应时间。结果见图2。采用各个突变体蛋白时，TMP消耗率＝99％时的反应时间均短于采用现有亮氨酸脱氢酶时，其中突变体蛋白3的反应时间最短，约为现有亮氨酸脱氢酶的57％。
在反应的不同时间点取样，检测OD540nm吸光值，进行L-叔亮氨酸的定量。采用突变体蛋白3粗酶液或亮氨酸脱氢酶粗酶液时的结果见图3(纵坐标为某一时刻反应体系中的L-叔亮氨酸浓度)。突变体蛋白3在80分钟内已经完成反应实现了最大产量，而现有亮氨酸脱氢酶140分钟才完成了反应。在专利所述条件下，使用突变体蛋白3，使L-叔亮氨酸的生产效率可以达到1165.8克每升每天，而野生型亮氨酸脱氢酶的生产效率只有665.8克每升每天。

Claims (9)

1.一组突变体蛋白，为如下(a1)至(a29)中的任意一种：
(a1)突变体蛋白3，其氨基酸序列如序列表的序列5所示；
(a2)突变体蛋白11，其氨基酸序列如序列表的序列7所示；
(a3)突变体蛋白14，其氨基酸序列如序列表的序列9所示；
(a4)突变体蛋白15，其氨基酸序列如序列表的序列11所示；
(a5)突变体蛋白19，其氨基酸序列如序列表的序列13所示；
(a6)突变体蛋白20，其氨基酸序列如序列表的序列15所示；
(a7)突变体蛋白25，其氨基酸序列如序列表的序列17所示；
(a8)突变体蛋白26，其氨基酸序列如序列表的序列19所示；
(a9)突变体蛋白1，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V；
(a10)突变体蛋白2，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第340位氨基酸残基由E突变为V；
(a11)突变体蛋白4，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第238位氨基酸残基由A突变为V；
(a12)突变体蛋白5，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第43位氨基酸残基由A突变为V，第76位氨基酸残基由L突变为V，第111位氨基酸残基由I突变为V，第124位氨基酸残基由D突变为E；
(a13)突变体蛋白6，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第225位氨基酸残基由E突变为I，第240位氨基酸残基由G突变为L，第261位氨基酸残基由N突变为I；
(a14)突变体蛋白7，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第287位氨基酸残基由N突变为I，第358位氨基酸残基由K突变为R；
(a15)突变体蛋白8，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第43位氨基酸残基由A突变为V，第334位氨基酸残基由A突变为V；
(a16)突变体蛋白9，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第329位氨基酸残基由I突变为V；
(a17)突变体蛋白10，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第42位氨基酸残基由G突变为F，第41位氨基酸残基由G突变为V，第44位氨基酸残基由R突变为L，第75位氨基酸残基由N突变为D，第288位氨基酸残基由A突变为E；
(a18)突变体蛋白12，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第261位氨基酸残基由N突变为M，第265位氨基酸残基由Q突变为L；
(a19)突变体蛋白13，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第146位氨基酸残基由P突变为A，第240位氨基酸残基由G突变为A；
(a20)突变体蛋白16，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第94位氨基酸残基由E突变为R，第180位氨基酸残基由G突变为A；
(a21)突变体蛋白17，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第160位氨基酸残基由A突变为V，第259位氨基酸残基由S突变为A；
(a22)突变体蛋白18，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第42位氨基酸残基由G突变为A，第261位氨基酸残基由N突变为I；
(a23)突变体蛋白21，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第53位氨基酸残基由N突变为G，第148位氨基酸残基由P突变为L；
(a24)突变体蛋白22，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第182位氨基酸残基由G突变为A，第202位氨基酸残基由T突变为S；
(a25)突变体蛋白23，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第240位氨基酸残基由G突变为A，第261位氨基酸残基由N突变为A；
(a26)突变体蛋白24，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第297位氨基酸残基由E突变为G，第300位氨基酸残基由G突变为A；
(a27)突变体蛋白27，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第183位氨基酸残基由N突变为I，第216位氨基酸残基由F突变为I，第304位氨基酸残基由E突变为V；
(a28)突变体蛋白28，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第71位氨基酸残基由A突变为I，第357位氨基酸残基由E突变为A；
(a29)突变体蛋白29，与序列表的序列3所示的亮氨酸脱氢酶相比差异如下：第41位氨基酸残基由G突变为V，第258位氨基酸残基由G突变为A，第280位氨基酸残基由Y突变为A。
2.编码权利要求1所述蛋白质的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于：所述基因为如下(b1)至(b29)中的任意一种：
(b1)编码所述突变体蛋白3的基因，如序列表的序列6所示；
(b2)编码所述突变体蛋白11的基因，如序列表的序列8所示；
(b3)编码所述突变体蛋白14的基因，如序列表的序列10所示；
(b4)编码所述突变体蛋白15的基因，如序列表的序列12所示；
(b5)编码所述突变体蛋白19的基因，如序列表的序列14所示；
(b6)编码所述突变体蛋白20的基因，如序列表的序列16所示；
(b7)编码所述突变体蛋白25的基因，如序列表的序列18所示；
(b8)编码所述突变体蛋白26的基因，如序列表的序列20所示；
(b9)编码所述突变体蛋白1的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T；
(b10)编码所述突变体蛋白2的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第118位核苷酸由T突变为G，第122位核苷酸由G突变为T；
(b11)编码所述突变体蛋白4的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第1019位核苷酸由A突变为T；
(b12)编码所述突变体蛋白5的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第128位核苷酸由C突变为T，第226位核苷酸由C突变为G，第331位核苷酸由A突变为G，第372位核苷酸由T突变为A；
(b13)编码所述突变体蛋白6的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第674位核苷酸由A突变为T，第675位核苷酸由A突变为G，第719位核苷酸由G突变为C，第782位核苷酸由A突变为T；
(b14)编码所述突变体蛋白7的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第860位核苷酸由A突变为T，第1073位核苷酸由A突变为G；
(b15)编码所述突变体蛋白8的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第1001位核苷酸由C突变为T；
(b16)编码所述突变体蛋白9的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第985位核苷酸由A突变为G；
(b17)编码所述突变体蛋白10的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第124位核苷酸由G突变为T，第125位核苷酸由G突变为T，第122位核苷酸由G突变为T，第131位核苷酸由G突变为T，第223位核苷酸由A突变为G，第863位核苷酸由C突变为A；
(b18)编码所述突变体蛋白12的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第782位核苷酸由A突变为T，第783位核苷酸由T突变为G，第794位核苷酸由A突变为T；
(b19)编码所述突变体蛋白13的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第436位核苷酸由C突变为G，第719位核苷酸由G突变为C；
(b20)编码所述突变体蛋白16的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第280位核苷酸由G突变为A，第281位核苷酸由A突变为G，第539位核苷酸由G突变为C；
(b21)编码所述突变体蛋白17的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第479位核苷酸由C突变为T，第775位核苷酸由T突变为G；
(b22)编码所述突变体蛋白18的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第125位核苷酸由G突变为C，第122位核苷酸由G突变为T，第782位核苷酸由A突变为T；
(b23)编码所述突变体蛋白21的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第157位核苷酸由A突变为G，第158位核苷酸由A突变为G，第443位核苷酸由C突变为T；
(b24)编码所述突变体蛋白22的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第545位核苷酸由G突变为C，第605位核苷酸由C突变为G，第606位核苷酸由A突变为C；
(b25)编码所述突变体蛋白23的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第719位核苷酸由G突变为C，第781位核苷酸由A突变为G，第782位核苷酸由A突变为C；
(b26)编码所述突变体蛋白24的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第890位核苷酸由A突变为G，第899位核苷酸由G突变为C；
(b27)编码所述突变体蛋白27的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第548位核苷酸由A突变为T，第646位核苷酸由T突变为A，第911位核苷酸由A突变为T；
(b28)编码所述突变体蛋白28的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第211位核苷酸由G突变为A，第212位核苷酸由C突变为T，第1070位核苷酸由A突变为C；
(b29)编码所述突变体蛋白29的基因，与序列表的序列4所示的亮氨酸脱氢酶基因相比差异如下：第122位核苷酸由G突变为T，第773位核苷酸由G突变为C，第838位核苷酸由T突变为G，第839位核苷酸由A突变为C。
4.一种融合蛋白，包括权利要求1所述突变体蛋白和His6标签。
5.含有权利要求2或3所述基因的表达盒、重组载体、转基因细胞系或重组菌。
6.如权利要求5所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求2或3所述基因插入pET-28a(+)载体的多克隆位点得到的重组质粒。
7.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求6所述重组载体导入大肠杆菌BL21(DE3)得到的重组菌。
8.权利要求1所述突变体蛋白或权利要求4所述融合蛋白作为亮氨酸脱氢酶的应用。
9.权利要求1所述突变体蛋白或权利要求4所述融合蛋白在制备L-叔亮氨酸中的应用。
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GenBank: AB103119.1;Katoh,R. et al.;《NCBI》;20040213;第1-2页 *
亮氨酸脱氢酶的基因发掘、催化性能及其应用研究;李静;《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》;20140915(第09期);第A006-62页 *

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