CN107429243A - 改良型β‑呋喃果糖苷酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供能够抑制蔗果四糖的生成、高效生成蔗果三糖的改良型β‑呋喃果糖苷酶。一种改良型β‑呋喃果糖苷酶，其含有下述(a)或(b)的氨基酸序列：(a)对于序列号2所示的氨基酸序列导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列，i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；(b)含有在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列且具有β‑呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。

Description

改良型β-呋喃果糖苷酶
技术领域
本发明涉及改良型β-呋喃果糖苷酶，尤其涉及能够抑制蔗果四糖的生成、有效生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法和使用了它们的蔗果三糖的制造方法。
背景技术
β-呋喃果糖苷酶是对在末端含有果糖残基的糖质的果糖进行识别、水解的酶。β-呋喃果糖苷酶中还存在如下β-呋喃果糖苷酶：除了水解活性以外，还具有将因水解而产生的果糖转移至基质的果糖转移活性。根据这样的β-呋喃果糖苷酶，能够以蔗糖为基质，生成1分子葡萄糖和2分子果糖结合而成的三糖、即蔗果三糖。
已知的是，蔗果三糖中的1-蔗果三糖是与蔗糖(砂糖)相似的甜味物质，产生砂糖的三分之一程度的甜度但能量仅为砂糖大约一半、即使摄取也不会使血糖值上升、发挥过敏抑制功能(专利文献1)等，因此是有用的寡糖。作为生成1-蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶，例如公开了在来自黑曲霉(Aspergillus niger)的β-呋喃果糖苷酶及其氨基酸序列中导入了氨基酸变异的变异体β-呋喃果糖苷酶(专利文献2和专利文献3)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第4162147号公报
专利文献2：日本专利第3628336号公报
专利文献3：国际公开第2005/085447号
发明内容
发明要解决的课题
当以蔗糖基质、使用β-呋喃果糖苷酶制造蔗果三糖时，通常作为副产物而生成作为四糖的蔗果四糖。如后述的实施例1(1)所示，在糖液中以一定的比例以上存在的蔗果四糖妨碍晶析工序中蔗果三糖的结晶化。此外，如后述的实施例1(2)所示，蔗果四糖在色谱中难以与蔗果三糖分离，即使利用色谱进行分离纯化工序也难以使其含有比例降低。由于这些原因，为了高效地制造蔗果三糖晶体，需要在利用β-呋喃果糖苷酶的酶反应的反应液中提高蔗果三糖的生成量以及蔗果三糖的含有比例、并且充分降低蔗果四糖的含有比例。因此，需要一种能够抑制蔗果四糖的生成并且高效地生成蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶。
本发明是为了解决这样的技术问题而作出的，目的在于，提供能够抑制蔗果四糖的生成并且有效生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶、含有其氨基酸序列的多肽、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA、含有该DNA的重组载体、将该DNA或该重组载体导入宿主而获得的转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法和蔗果三糖的制造方法。
用于解决课题的手段
本发明人等进行了深入研究，结果发现，通过对于来自Aspergillus kawachii(川地黑曲霉)NBRC 4308(以下简写为“A.kawachii”。)的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2；全长628氨基酸)，导入将氨基末端(N末端)起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异、或将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异，能够抑制蔗果四糖的生成并且高效地生成蔗果三糖，基于这些见解，完成了下述的各发明。
(1)本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：
(a)对于序列号2所示的氨基酸序列(全长628个氨基酸)导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列；
i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，
ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；
(b)由在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
(2)本发明的多肽含有(1)记载的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列。
(3)本发明的DNA编码(1)记载的改良型β-呋喃果糖苷酶。
(4)本发明的重组载体含有(3)记载的DNA。
(5)本发明的转化体是将(3)记载的DNA或(4)记载的重组载体导入宿主而获得的转化体。
(6)本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法具有：从培养(5)记载的转化体而获得的培养物取得改良型β-呋喃果糖苷酶的工序。
(7)本发明的蔗果三糖的制造方法具有：使(1)记载的改良型β-呋喃果糖苷酶、(5)记载的转化体或培养(5)记载的转化体而获得的培养物与蔗糖接触的工序。
发明效果
根据本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、本发明的转化体、本发明的蔗果三糖的制造方法，能够抑制蔗果四糖的生成、高效地制造蔗果三糖。此外，根据本发明的多肽、本发明的DNA、本发明的重组载体、本发明的转化体、本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法，能够获得可抑制蔗果四糖的生成比例、高效地生成蔗果三糖的改良型β-呋喃果糖苷酶。
具体实施方式
以下，对本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法和蔗果三糖的制造方法进行详细说明。
本发明中，“β-呋喃果糖苷酶”有时与“果糖基转移酶”、“蔗糖酶”、“β-D-呋喃果糖苷酶”、“转化酶”、“invertase”或“invertin”互换使用。此外，本发明中的“野生型β-呋喃果糖苷酶”是指含有未使用基因工程方法导入氨基酸变异的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶，“改良型β-呋喃果糖苷酶”是指含有对野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入了1个或2个以上的氨基酸变异的氨基酸序列的β-呋喃果糖苷酶。
本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶由下述(a)或(b)的氨基酸序列：
(a)对于序列号2所示的氨基酸序列(全长628个氨基酸)导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列，
i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，
ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；
(b)由在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
在此，“蛋白组成氨基酸”是指下述的表1揭示的物质(生化学事典第4版；东京化学同人公司发行，第57页，2007年12月)。它们之中，作为本发明的“甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸”，优选可列举芳香族氨基酸、杂环式氨基酸、酸性氨基酸和碱基性氨基酸，更优选可列举色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)谷氨酸(E)和精氨酸(R)。
[表1]
蛋白组成氨基酸的种类和简称
※1：组氨酸属于碱性氨基酸。酸性、碱性以外的氨基酸为中性氨基酸。
※2：有时也指包括杂环式氨基酸在内的芳香族氨基酸。
※3：Asx意思是Asp或Asn，用单字母表示则为B。
※4：Glx意思是Glu或Gln，用单字母表示则为Z。
上述(b)是与(a)的序列同源性高、具有与在(a)中导入的氨基酸变异相当的氨基酸变异、并且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
在此，作为(a)与(b)的同源性的值，例如可列举80～85％以上、85～90％以上、90～95％以上等。
即，(b)由例如“在与(a)的同源性的值不小于80～90％的范围内、在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列”构成。
因此，作为(b)的“缺失、置换、插入或附加的氨基酸”的个数，具体而言，可列举例如1～125个(与(a)的同源性为80％以上)、1～113个(与(a)的同源性为82％以上)、1～100个(与(a)的同源性为84％以上)、1～87个(与(a)的同源性为86％以上)、1～75个(与(a)的同源性为88％以上)、1～62个(与(a)的同源性为90％以上)、1～50个(与(a)的同源性为92％以上)、1～37个(与(a)的同源性为94％以上)、1～25个(与(a)的同源性为96％以上)、1～12个(与(a)的同源性为98％以上)等。
在此，氨基酸序列的同源性可以按照常规方法来确认，例如，可以使用FASTA(http：//www.genome.JP/tools/fasta/)、基本局部比对搜索工具(BLAST；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)、位点特异性迭代BLAST(PSI-BLAST；http：//www.ncbi.nlm.nih.gov.)等程序来确认。需要说明的是，“同源性”是指一致性，可以与“identity”互换使用。
本发明中，可以按照常规方法来确认某种蛋白质是否具有β-呋喃果糖苷酶活性，例如，如后述的实施例3(1)所示，将该蛋白质在含有蔗糖的反应液中孵育、或在含有蔗糖的反应液中培养表达该蛋白质的转化体，然后通过高效液相色谱(HPLC)等确认该反应液的含有物。如果其结果确认到存在葡萄糖、果糖等由于β-呋喃果糖苷酶的水解活性而产生的物质、蔗果三糖、蔗果四糖等由于β-呋喃果糖苷酶的果糖转移活性而产生的物质，则可以判断该蛋白质具有β-呋喃果糖苷酶活性。
本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶可以按照常规方法获得，作为这样的方法，可列举例如化学合成的方法、利用基因重组技术的方法。关于化学合成的方法，例如可以基于本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列信息利用Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法来合成本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶，此外还可以使用各种市售的肽合成机来合成。
此外，关于利用基因重组技术的方法，可以通过使本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶在合适的表达体系表达而获得本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶。即，将本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA导入合适的宿主，获得转化体。或者，如后述的实施例2所示，将本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA插入合适的载体而获得重组载体后，将该重组载体导入合适的宿主，获得转化体。然后，将获得的转化体进行培养，使其表达改良型β-呋喃果糖苷酶，从而可以获得本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶。
在此，本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA可以基于其碱基序列信息，使用市售的各种DNA合成机来合成，此外还可以以编码野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA、编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA为模板进行聚合酶链反应(PCR)，从而获得。
例如，在获得编码由导入有氨基酸变异的氨基酸序列构成的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA时，可以如后述的实施例2所示，首先设计编码所导入的氨基酸变异的DNA引物，使用该DNA引物，以编码野生型β-呋喃果糖苷酶或未导入该氨基酸变异的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA为模板进行PCR，从而获得编码由导入有该氨基酸变异的氨基酸序列构成的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA。
此外，编码上述(b)的由“在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列”构成的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA还可以通过PCR获得。即，首先设计编码与缺失、置换、插入或附加氨基酸的位置相当的氨基酸序列的DNA引物，使用该DNA引物，以编码(a)的DNA为模板进行PCR，从而能够得到编码在(a)中缺失、置换、插入或附加了该氨基酸的氨基酸序列的DNA。
此外，本发明提供含有改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的多肽。需要说明的是，在本发明的多肽部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶相同的或相当的构成，省略重复的说明。
本发明的多肽只要含有本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列即可，对其序列长度没有特别限定，可以仅含有本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列，也可以含有在本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的N末端和/或羧基末端(C末端)附加1个或多个氨基酸残基而成的氨基酸序列。此外，本发明的多肽可以通过与上述获得本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的方法同样的方法来获得。
其次，本发明提供编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA。在本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶及多肽相同的或相当的构成，省略重复的说明。
此外，本发明提供含有编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体。需要说明的是，本发明的重组载体中，上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽及DNA相同的或相当的构成，省略重复的说明。
本发明的重组载体可以通过例如将本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA插入载体而获得。DNA向载体的插入可以按照常规方法进行，例如，可以通过将DNA和线状化的载体的DNA片段连接而进行。在此，作为载体，可列举例如噬菌体载体、质粒载体、粘粒、噬菌粒等，可以根据宿主、操作性等适当选择。此外，本发明的重组载体中，除了本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA以外，还可以含有抗药性标记基因、营养需求标记基因等转化体的选择标记基因、改良型β-呋喃果糖苷酶的表达所需的启动子、转录起始信号、核糖体结合部位、翻译终止信号、转录终止信号等转录调节信号、翻译调节信号等。
此外，本发明还提供转化体。需要说明的是，在本发明的转化体部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA及重组载体相同的或相当的构成，省略重复的说明。
本发明的转化体可以通过将编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA或含有本发明的编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体导入宿主而获得。在此，作为宿主，可以列举例如大肠杆菌、枯草菌等细菌、酵母、丝状菌等，可以根据重组载体的种类、操作性等适当选择。DNA、重组载体向宿主的导入(转化)可以按照常规方法进行，例如，在使用质粒将重组载体导入大肠杆菌时，可以在大肠杆菌的感受态细胞中加入重组载体，在冰上静置30分钟，然后放入42℃的水浴中静置45秒后，在冰上静置2分钟，然后加入培养基并在37℃下振荡1小时，从而进行。此外，为了将目标DNA直接导入宿主的染色体，可以使用同源重组法等。
然后，本发明提供改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法。本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法具有下述工序：由将本发明的转化体培养而获得的培养物获得改良型β-呋喃果糖苷酶。需要说明的是，在本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体及转化体相同的或相当的构成，省略重复的说明。
在由将本发明的转化体培养而获得的培养物获得改良型β-呋喃果糖苷酶的工序中，可以根据转化体的状况等适当选择获得改良型β-呋喃果糖苷酶的方法。具体而言，可以直接获得培养转化体而获得的培养物作为改良型β-呋喃果糖苷酶，也可以从培养物中纯化改良型β-呋喃果糖苷酶而获得。
作为直接将培养转化体而获得的培养物作为改良型β-呋喃果糖苷酶而获得的方法，可以列举例如：在按照使改良型β-呋喃果糖苷酶在转化体的细胞表面或细胞内部表达的方式设计DNA或重组载体时，将培养物离心分离而回收转化体，直接将其作为改良型β呋喃果糖苷酶而获得的方法；将回收的转化体破碎，将其作为改良型β-呋喃果糖苷酶而获得的方法。
关于从培养物中纯化改良型β-呋喃果糖苷酶的方法，例如，在按照使改良型β-呋喃果糖苷酶分泌到转化体的外部的方式设计DNA或重组载体时，可以将培养物离心分离而回收培养上清，从而对改良型β-呋喃果糖苷酶进行纯化。此外，在使改良型β-呋喃果糖苷酶在转化体的内部表达时，可以将培养物离心分离并回收沉淀下来的转化体，将其在缓冲液中悬浮并进行冻融、超声波处理或磨碎等而将转化体破碎，然后进行离心分离回收上清，从而对改良型β-呋喃果糖苷酶进行纯化。此外，作为纯化方法，可以列举对培养物进行热处理、盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换色谱、亲和层析、疏水色谱、反相色谱、等电点电泳等方法。
最后，本发明提供蔗果三糖的制造方法。本发明的蔗果三糖的制造方法具有下述工序：使本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、本发明的转化体或培养本发明的转化体而获得的培养物与蔗糖接触。需要说明的是，在本发明的蔗果三糖的制造方法部分，关于与上述本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体及改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法相同的或相当的构成，省略重复的说明。
需要说明的是，蔗果三糖通常是果糖结合在蔗糖上而生成的，根据果糖所结合的位置可生成1-蔗果三糖、6-蔗果三糖及新蔗果三糖这3种。即，1-蔗果三糖是果糖与蔗糖中的果糖单元形成β(2→1)键而生成的，6-蔗果三糖是果糖与蔗糖中的果糖单元形成β(2→6)键而生成的，新蔗果三糖是果糖与蔗糖中的葡萄糖单元形成β(2→6)键而生成的。此外，蔗果四糖是果糖与1-蔗果三糖中的果糖单元形成β(2→1)键而生成的四糖。
本发明中的“蔗果三糖”是指1分子葡萄糖和2分子果糖结合而成的三糖，包括1-蔗果三糖、6-蔗果三糖及新蔗果三糖。
作为使本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶和蔗糖接触的方法，可以列举如下方法：例如，将改良型β-呋喃果糖苷酶添加到含有蔗糖的溶液中，在30℃～50℃下静置20小时左右。此外，作为使本发明的转化体与蔗糖接触的方法，可以列举如下方法：例如，在宿主为大肠杆菌时，将本发明的转化体添加到含有蔗糖的溶液中，在50℃振荡培养数天。
此外，作为使培养本发明的转化体而获得的培养物与蔗糖接触的方法，可以列举如下方法：例如，将培养本发明的转化体而获得的培养物添加到含有蔗糖的溶液中，在30℃～50℃下静置或振荡20小时左右。在此，培养物可以进行破碎、磨碎、在缓冲液中悬浮、冻融、超声波处理、离心分离、热处理、盐析、溶剂沉淀、透析、超滤、凝胶过滤、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、离子交换色谱、亲和层析、疏水色谱、反相色谱、等电点电泳等任意处理，也可以不进行处理。
在本发明的蔗果三糖的制造方法中，只要不损害本发明的蔗果三糖的制造方法的特征，则也可以含有其它工序，例如，可以含有利用色谱进行的蔗果三糖的分离工序、煎糖等结晶化工序、干燥工序、洗涤工序、过滤工序、杀菌工序、添加食品添加剂的工序等。
以下，对于本发明的改良型β-呋喃果糖苷酶、多肽、DNA、重组载体、转化体、改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法、蔗果三糖的制造方法和蔗果三糖的制造方法，基于各实施例进行说明。需要说明的是，本发明的技术范围不受这些实施例所示的特征限定。
实施例
<实施例1>蔗果四糖含有比例的影响的讨论
(1)结晶化试验
使用水溶液所含的糖中蔗果四糖的含有比例((w/w)％；以下称为“蔗果四糖含有比例，，)为5％左右和10％左右的原料糖液，制造蔗果三糖的晶体，对蔗果三糖的回收率和晶体尺寸进行确认，从而讨论制造蔗果三糖的晶体时蔗果四糖含有比例的影响。具体的程序示于以下。
首先，按照水溶液所含的糖中蔗果三糖的含有比例((w/w)％；以下称为“蔗果三糖含有比例”)为80％以上、并且糖浓度为60(w/w)％左右的方式，将蔗果三糖晶体和低聚果糖粉末(MEIOLIGO P；明治食品材料公司)溶解于水，制成No.1～4。在此，No.1和No.2调制为蔗果四糖含有比例5.2％，No.3和No.4调制为蔗果四糖含有比例10％。然后，用旋转蒸发器浓缩，将其作为原料糖液。另一方面，将蔗果三糖晶体磨碎，通过网筛而使粒度一致，作为晶种。
在1L容量的茄形烧瓶中，加入以糖的固体成分换算相当于400g的量的原料糖液，以真空度293hPa(220mmHg)减压浓缩。当糖液的温度达到78℃时加入晶种使其结晶，进行结晶化。关于晶种，在No.1和No.3中以成为2.5ppm的方式加入，在No.2中以成为1.2ppm的方式加入，在No.4中以成为1.1ppm的方式加入。结晶化的过程中，一边在60℃加温一边向茄形烧瓶内供给以糖的固体成分换算相当于200g的量的原料糖液。然后，测定糖液的Brix值和重量后，供于小型离心分离机(H-112；KOKUSAN公司)中，将晶体回收。回收的晶体在设定于80℃的干燥器中静置1小时左右，使其干燥。
测定干燥后的晶体的重量，按照下式1，计算通过结晶化的蔗果三糖的回收率。
式1：蔗果三糖的回收率＝{晶体重量/(供于小型离心分离机的糖液的重量×糖液的Brix值/100)}×100
此外，使用显微镜观察晶体尺寸。此外，将晶体和原料糖液按照下述的条件供于高效液相色谱(HPLC)，确认各糖(单糖：果糖；单糖：葡萄糖；二糖：蔗糖；三糖：蔗果三糖；四糖：蔗果四糖；和其他的糖)的含有比例。各糖的含有比例是作为检测到的各峰的面积相对于整个峰的面积的总和的比例，计算面积百分率。其结果示于表2。需要说明的是，表1中，“-”表示无法测定。
《HPLC的条件》
柱：SHODEX KS 802(8.0φ×300mm)2根
流动相：水
流速：1.0mL/分
注入量：20μL
温度：50℃
检测：差示折射率检测器(RID；昭和电工公司)(使用了峰面积的面积百分率)
[表2]
如表2所示，关于蔗果三糖的回收率，No.1和No.2中分别为40％和45％，与此相对，No.3为15％。此外，关于晶体尺寸，No.1和No.2中晶体尺寸都大，与此相对，No.3中晶体尺寸小。进一步，No.4中，生成的晶体小、晶体无法回收。此外，关于将晶种的添加量设为2.5ppm时结晶化所需的时间，No.1为8小时，与此相对，No.3为23小时。
即，明确了：当原料糖液中蔗果四糖含有比例为5.2％时，蔗果三糖的回收率高，晶体的尺寸也大，为了获得晶体所需的时间也短，与此相对，当原料糖液中蔗果四糖含有比例为10％时，蔗果三糖的回收率低，晶体的尺寸小，为了获得晶体所需的时间长。由这些结果明确了，为了高效地制造蔗果三糖的晶体，优选原料糖液中蔗果四糖含有比例小于10％。
(2)使用了色谱的蔗果三糖分离试验
以蔗糖为基质进行利用β-呋喃果糖苷酶的酶反应，获得以各种比例含有蔗果四糖、蔗果三糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的反应液，作为No.1～8。对此，为了将蔗果三糖含有比例提高到足以制造晶体的程度(蔗果三糖含有比例(蔗果三糖纯度)为约80％程度)，供于使用了离子交换树脂的色谱而进行蔗果三糖的分离纯化，获得蔗果三糖高纯度液。需要说明的是，色谱的条件在No.1～8的样品之间设为相同条件。反应液和蔗果三糖高纯度液中各糖的含有比例示于表3。
[表3]
反应液(利用色谱分离纯化前)
蔗果三糖高纯度液(利用色谱分离纯化后)
如表3所示，关于蔗果三糖含有比例，在反应液中，No.1～8分别为45.1％、45.8％、52.9％、53.7％、52.8％、46.0％、45.8％和48.4％，与此相对，在蔗果三糖高纯度液中，No.1～8分别为76.6％、78.1％、86.4％、88.3％、88.0％、78.7％、79.2％和78.6％。即，在No.1～8的任一个当中，在蔗果三糖高纯度液中蔗果三糖含有比例提高到足以制造晶体的程度(约80％程度)。
另一方面，关于蔗果四糖含有比例，在反应液中No.1～8分别为11.6％、10.6％、6.0％、4.7％、4.7％、10.2％、9.7％和11.3％，与此相对，在蔗果三糖高纯度液中，No.1～8分别为18.6％、17.0％、9.2％、7.3％、7.4％、16.4％、15.8％和17.3％。即，在No.1～8的任一个当中，在蔗果三糖高纯度液中的蔗果四糖含有比例相比于反应液高1.5倍左右。具体而言，关于蔗果四糖含有比例，当反应液中为5％左右时(No.3、No.4和No.5)，蔗果三糖高纯度液中也小于10％，而当反应液中为10％左右时，(No.1、No.2、No.6、No.7和No.8)，蔗果三糖高纯度液中为15％以上。认为这是因为，在色谱中蔗果四糖与蔗果三糖难以分离。
从该本实施例1(2)的结果和上述的本实施例1(1)的结果明确了，为了高效地制造蔗果三糖的晶体，利用β-呋喃果糖苷酶进行的酶反应后的反应液中蔗果四糖含有比例需要抑制为5％左右。
<实施例2>改良型β-呋喃果糖苷酶的制作
制作由对于来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)导入了如下的氨基酸变异的氨基酸序列构成的一重变异体和二重变异体的β-呋喃果糖苷酶，将它们作为改良型β-呋喃果糖苷酶，上述氨基酸变异为：将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为色氨酸(W)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)或精氨酸(R)的氨基酸变异(以下将氨基酸变异分别简写为“G85W”“G85F”“G85Y”“G85D”“G85E”“G85R”。)、和将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、天冬氨酸(D)、精氨酸(R)、酪氨酸(Y)、甘氨酸(G)或色氨酸(W)的氨基酸变异(以下将氨基酸变异分别简写为“H310K”“H310D”“H310R”“H310Y”“H310G”“H310W”。)。具体的程序示于以下。
(1)野生型β-呋喃果糖苷酶基因的取得和表达体系的构建
[1-1]DNA的取得
将编码来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶(GenBank：GAA88101.1)的DNA委托GenScript公司进行人工合成而取得。将编码来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA的全长的碱基序列示为序列号1，将由其编码的来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列示为序列号2。需要说明的是，序列号2中，信号序列对应于1～24号。
[1-2]β-呋喃果糖苷酶表达体系的构建
通过以下述的条件进行聚合酶链反应(PCR)，对编码枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)(IAM1026、ATCC9466)的PgsA锚定蛋白(GenBank：AB016245.1)的DNA进行扩增。将获得的PCR产物按照常规方法用限制酶NdeI和BglII消化，将其作为PgsA-DNA片段。此外，对于PgsA-DNA片段，按照常规方法测序，确认其碱基序列。将编码确认的PgsA锚定蛋白的DNA的碱基序列示为序列号3，将由其编码的PgsA锚定蛋白的氨基酸序列示为序列号4。
《编码PgsA锚定蛋白的DNA扩增用PCR的条件》
模板：枯草芽孢杆菌(IAM1026、ATCC9466)的基因组DNA
正向引物(下划线表示NdeI位点)：
5’-AAACATATGAAAAAAGAACTGAGCTTTCATG-3’(序列号5)
反向引物(下划线表示BglII位点)：
5’-AAAAGATCTTTTAGATTTTAGTTTGTCACTATG-3’(序列号6)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
此外，将pCDFDuet-1质粒(以下简写为“pCDF质粒”；Merck公司)按照常规方法用限制酶NdeI和BglII消化，获得pCDF质粒片段。接下来，使用DNA Ligation Kit Ver.2.1(宝生物公司)，按照所附的使用说明书将pCDF质粒片段与PgsA-DNA片段连接，构建pCDF-PgsA重组载体。
接下来，按照去除信号序列的方式设计引物，以下述的条件进行PCR，对编码来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA进行扩增，将其作为kawachii-DNA片段。
《编码来自A.kawachii的β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
主模板：实施例2(1)[1-1]的编码来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA
正向引物：5’-AAATCTAAAAGATCCTCCGTGGTCATCGACTAC-3’(序列号7)
反向引物：5’-TTTACCAGACTCGAGTCAATACTGACGATCCGGC-3’(序列号8)
PCR用酶：KOD-Plus-Neo(东洋纺公司)
此外，以述的条件将pCDF-PgsA重组载体作为模板进行PCR，将获得的PCR产物作为pCDF-PgsA-DNA片段。
《插入有编码PgsA蛋白质的DNA的来自pCDF质粒的DNA扩增用PCR的条件》
模板：pCDF-PgsA重组载体
正向引物：5’-CTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAA-3’(序列号9)
反向引物：5’-GGATCTTTTAGATTTTAGTTTGTCACTATGATCAA-3’(序列号10)
PCR用酶：KOD-Plus-Neo(东洋纺公司)
接下来，使用In-Fusion HD Cloning Kit(宝生物公司)，按照按照所附的使用说明书将kawaehii-DNA片段和pCDF-PgsA-DNA片段连接，将其作为kawachii(野生型)重组载体。
(2)改良型β-呋喃果糖苷酶基因的制作
[2-1]一重变异体
将本实施例2(1)[1-2]的kawachii(野生型)重组载体作为模板，使用KOD-Plus-NEO(东洋纺公司)作为PCR用酶，以下述的引物和反应条件进行PCR，从而将包含编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的DNA片段进行扩增。
《编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
“G85W”
正向引物：5’-TGGAGCGGCATCTCCAGTGCCACCA-3’(序列号11)
反向引物：5’-ATCGTGAAGGAAGCCGACGTGGAAGAGG-3’(序列号12)
“G85F”
正向引物：5’-TTCAGCGGCATCTCCAGTGCCACCA-3’(序列号13)
反向引物：5’-ATCGTGAAGGAAGCCGACGTGGAAGAGG-3’(序列号14)
“G85Y”
正向引物：5’-TATAGCGGCATCTCCAGTGCCACCA-3’(序列号15)
反向引物：5’-ATCGTGAAGGAAGCCGACGTGGAAGAGG-3’(序列号16)
“G85D”
正向引物：5’-GATAGCGGCATCTCCAGTGCCACCA-3’(序列号17)
反向引物：5’-ATCGTGAAGGAAGCCGACGTGGAAGAGG-3’(序列号18)
“G85E”
正向引物：5’-GAAAGCGGCATCTCCAGTGCCACCA-3’(序列号19)
反向引物：5’-ATCGTGAAGGAAGCCGACGTGGAAGAGG-3’(序列号20)
“G85R”
正向引物：5’-CGTAGCGGCATCTCCAGTGCCACCA-3’(序列号21)
反向引物：5’-ATCGTGAAGGAAGCCGACGTGGAAGAGG-3’(序列号22)
“H310K”
正向引物：5’-AAAGACATGCTCTGGGTGTCCGGTACAGTC-3’(序列号23)
反向引物：5’-GATGCTGGTGAGCTGGGGCACGACGGGCA-3’(序列号24)
“H310D”
正向引物：5’-GATGACATGCTCTGGGTGTCCGGTACAGTC-3’(序列号25)
反向引物：5’-GATGCTGGTGAGCTGGGGCACGACGGGCA-3’(序列号26)
“H310Y”
正向引物：5’-TATGACATGCTCTGGGTGTCCGGTACAGTC-3’(序列号27)
反向引物：5’-GATGCTGGTGAGCTGGGGCACGACGGGCA-3’(序列号28)
“H310R”
正向引物：5’-CGTGACATGCTCTGGGTGTCCGGTACAGTC-3’(序列号29)
反向引物：5’-GATGCTGGTGAGCTGGGGCACGACGGGCA-3’(序列号30)
“H310G”
正向引物：5’-GGCGACATGCTCTGGGTGTCCGGTACAGTC-3’(序列号31)
反向引物：5’-GATGCTGGTGAGCTGGGGCACGACGGGCA-3’(序列号32)
“H310W”
正向引物：5’-TGGGACATGCTCTGGGTGTCCGGTACA GTC-3’(序列号33)
反向引物：5’-GATGCTGGTGAGCTGGGGCACGACGGGCA-3’(序列号34)
接下来，向PCR产物中加入限制酶DpnI，在37℃消化1小时后，供于琼脂糖凝胶电泳，将凝胶切出，将DNA片段纯化。向其中加入Ligation high ver.2(东洋纺公司)和T4多核苷酸激酶(T4Polynucleotide Kinase，东洋纺公司)，在16℃静置1小时，从而进行DNA片段的自连接，制成插入有编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体。将插入了编码导入有“G85W”、“G85F”、“G85Y”、“G85D”、“G85E”、“G85R”、“H310K”、“H310D”、“H310Y”、“H310R”、“H310G”和“H310W”的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体分别作为kawachii(G85W)重组载体、kawachii(G85F)重组载体、kawachii(G85Y)重组载体、kawachii(G85D)重组载体、kawachii(G85E)重组载体、kawachii(G85R)重组载体、kawachii(H310K)重组载体、kawachii(H310D)重组载体、kawachii(H310Y)重组载体、kawachii(H310R)重组载体、kawachii(H310G)重组载体和kawachii(H310W)重组载体。
[2-2]二重变异体
以下述的条件进行PCR，将编码由导入有“G85W”和“H310K”的氨基酸序列构成的二重变异体的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA进行扩增。
《编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：本实施例2(2)[2-1]的kawachii(H310K)重组载体
正向引物：TGGAGCGGCATCTCCAGTGCCACCA-3’(序列号11)
反向引物：5’-ATCGTGAAGGAAGCCGACGTGGAAGAGG-3’(序列号12)
PCR用酶：KOD-Plus-NEO(东洋纺公司)
接下来，通过本实施例2(2)[2-1]记载的方法，进行PCR产物的纯化和自连接，制成插入有编码二重变异体的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体，将其作为kawachii(G85W/H310K)重组载体。
(3)转化和转化体的培养和回收
将本实施例2(1)[1-2]、(2)[2-1]和(2)[2-2]的各重组载体导入E.coli JM109感受态细胞(NIPPON GENE公司)，回收重组大肠杆菌。接下来，从重组大肠杆菌回收重组载体，将其导入E.coli BL21(DE3)感受态细胞(COMSO BIO公司)，获得作为转化体的重组大肠杆菌。将其在30℃平板培养一夜后，拾取重组大肠杆菌的菌落并接种到M9SEED培养基0.5mL中，在30℃、220rpm振荡培养20小时。接下来，将培养物中的5μL在M9Main培养基5mL中传代培养，在25℃、220rpm振荡培养24小时，获得培养物。M9SEED培养基和M9Main培养基的组成示于以下。
M9SEED培养基(合计100mL)：水72mL，5×M9盐20mL，20％酪蛋白氨基酸5mL，20％D-葡萄糖2mL，2mg/mL胸腺嘧啶1mL，50mM CaCl20.2mL，2.5M MgCl240μL，100mg/mL FeSO428μL，抗生物质(最终浓度50μg/mL链霉素硫酸盐)。
M9Main培养基(合计100mL)：水67mL，5×M9盐20mL，20％酪蛋白氨基酸5mL，2mg/mL胸腺嘧啶1mL，50mM CaCl20.2mL，100mg/mL FeSO428μL，Overnight Express AutoinductionSystem 1(O.N.E.；Merck公司)Sol.1 2mL，O.N.E.Sol.2 5mL，O.N.E.Sol.3 100μL，抗生物质(最终浓度50μg/mL链霉素硫酸盐)。
<实施例3>改良型β-呋喃果糖苷酶的活性确认
(1)β-呋喃果糖苷酶的酶反应
调制含有30(w/w)％蔗糖的0.04M的磷酸钠缓冲液(pH7.0)，将其作为30％蔗糖溶液。将实施例2(3)的重组大肠杆菌的培养物0.5mL供于离心分离，进行集菌，测定湿重(湿菌体重量)。向其中加入30％蔗糖溶液350μL，使其悬浮后，以30℃、200rpm振荡一定时间，从而进行β-呋喃果糖苷酶的酶反应，将其作为反应液。酶反应的时间设为3、9、32和48小时。
(2)酶反应生成物的确认
接下来，向反应液50μL加入水950μL从而进行稀释，在100℃加热10分钟。将其供于4℃、15000×g的10分钟离心分离，回收上清，然后用0.45μm孔过滤器过滤，将获得的滤液作为HPLC样品。将HPLC样品供于实施例1(1)记载的条件的HPLC，确认反应液所含的各糖的含有比例。此外，用酶反应开始时的反应液所含的蔗糖的质量乘以蔗果三糖和蔗果四糖各自的含有比例而计算，以除以湿菌体重量所得的值来表示反应液所含的蔗果三糖和蔗果四糖的量。其结果示于表4。需要说明的是，表4中“-”表示为检测限以下。
[表4]
如表4上数第1段所示，酶反应为3小时的情况中，关于相对于湿菌体重量的蔗果三糖的量，导入有kawachii(野生型)重组载体的重组大肠杆菌的反应液(对照)中为0.92mg，与此相对，导入有kawachii(G85W)重组载体、kawachii(G85F)重组载体、kawachii(G85Y)重组载体、kawachii(G85D)重组载体、kawachii(G85E)重组载体和kawachii(G85R)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为9.62mg、2.64mg、1.80mg、1.84mg、3.43mg和2.76mg。此外，关于相对于湿菌体重量的蔗果四糖的量，对照中为1.26mg，与此相对，导入有kawachii(G85W)重组载体、kawachii(G85F)重组载体、kawachii(G85Y)重组载体、kawachii(G85D)重组载体、kawachii(G85E)重组载体和kawachii(G85R)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为0.85mg、0.23mg、0.57mg、0.29mg、0.46mg和0.79mg。此外，关于蔗果四糖含有比例，对照中为29.64％，与此相对，导入有kawachii(G85W)重组载体、kawachii(G85F)重组载体、kawachii(G85Y)重组载体、kawachii(G85D)重组载体、kawachii(G85E)重组载体和kawachii(G85R)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为4.51％、3.46％、13.36％、7.36％、6.65％和12.78％。
即，在导入有kawachii(G85W)重组载体、kawachii(G85F)重组载体、kawachii(G85Y)重组载体、kawachii(G85D)重组载体、kawachii(G85E)重组载体和kawachii(G85R)重组载体的重组大肠杆菌的反应液的任一个之中，与对照相比，蔗果三糖的量和蔗果三糖含有比例增加，并且蔗果四糖的量和蔗果四糖含有比例显著减少。
接下来，如表4上数第2段所示，酶反应为9小时的情况中，关于相对于湿菌体重量的蔗果三糖的量，对照中为2.59mg，与此相对，导入有kawachii(H310K)重组载体、kawachii(H310D)重组载体、kawachii(H310R)重组载体、kawachii(H310Y)重组载体、kawachii(H310G)重组载体和kawachii(H310W)重组载体的重组大肠杆菌时分别为5.50mg、0.03mg、7.35mg、1.20mg、0.26mg和0.42mg。此外，关于相对于湿菌体重量的蔗果四糖的量，对照中为0.15mg，与此相对，导入有kawachii(H310K)重组载体、kawachii(H310D)重组载体、kawachii(H310R)重组载体、kawachii(H310Y)重组载体、kawachii(H310G)重组载体和kawachii(H310W)重组载体的重组大肠杆菌时分别为0.37mg、检测限以下、0.95mg、0.01mg、检测限以下和0.003mg。此外，关于蔗果四糖含有比例，对照中为1.23％，与此相对，导入有kawachii(H310K)重组载体、kawachii(H310D)重组载体、kawachii(H310R)重组载体、kawachii(H310Y)重组载体、kawachii(H310G)重组载体和kawachii(H310W)重组载体的重组大肠杆菌时分别为2.76％、检测限以下、4.96％、0.11％、检测限以下和0.02％。
即，在导入有kawachii(H310K)重组载体和kawachii(H310R)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中，与对照相比，蔗果三糖的量和蔗果三糖含有比例增加，并且蔗果四糖含有比例低至高效制造蔗果三糖的晶体所需的程度(5％以下)。
接下来，如表4上数第3段所示，酶反应为48小时的情况中，关于相对于湿菌体重量的蔗果三糖的量，对照中为1.99mg，与此相对，导入有kawachii(H310Y)重组载体的重组大肠杆菌时为3.86mg。此外，关于相对于湿菌体重量的蔗果四糖的量，对照中为3.89mg，与此相对，导入有kawachii(H310Y)重组载体的重组大肠杆菌时为0.16mg。此外，关于蔗果四糖含有比例，对照中为31.50％，与此相对，导入有kawachii(H310Y)重组载体的重组大肠杆菌时为1.36％。
即，在导入有kawachii(H310Y)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中，与对照相比，蔗果三糖的量和蔗果三糖含有比例增加，并且蔗果四糖的量和蔗果四糖含有比例显著减少。
最后，如表4最下段所示，酶反应为32小时的情况中，关于相对于湿菌体重量的蔗果三糖的量，对照中为0.82mg，导入有kawachii(G85W)重组载体的重组大肠杆菌时为1.30mg，导入有kawachii(H310K)重组载体的重组大肠杆菌时为5.79mg，与此相对，导入有kawachii(G85W/H310K)重组载体的重组大肠杆菌时为6.46mg。此外，关于相对于湿菌体重量的蔗果四糖的量，对照中为1.08mg，导入有kawachii(G85W)重组载体的重组大肠杆菌时为1.29mg，导入有kawachii(H310K)重组载体的重组大肠杆菌时为1.92mg，与此相对，导入有kawachii(G85W/H310K)重组载体的重组大肠杆菌时为0.40mg。此外，关于蔗果四糖含有比例，对照中为31.78％，导入有kawachii(G85W)重组载体的重组大肠杆菌时为25.14％，导入有kawachii(H310K)重组载体的重组大肠杆菌时为15.38％，与此相对，导入有kawachii(G85W/H310K)重组载体的重组大肠杆菌时为3.43％。
即，在导入有kawachii(G85W/H310K)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中，与导入有kawachii(G85W)重组载体和kawachii(H310K)重组载体的重组大肠杆菌的反应液和对照相比，蔗果三糖的量和蔗果三糖含有比例增加，并且蔗果四糖的量和蔗果四糖含有比例显著减少。由该结果明确了，通过对于来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)导入将G85W与H310K组合的二重变异，与分别导入一重变异的情况相比，能够更加抑制蔗果四糖的生成、并且高效地生成蔗果三糖。
由以上的表4的结果明确了，通过对来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)导入将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异、或将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异，能够抑制蔗果四糖的生成、并且高效地生成蔗果三糖。
<实施例4>与来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶相同的β-呋喃果糖苷酶中改良型β-呋喃果糖苷酶的制成和活性确认
(1)改良型β-呋喃果糖苷酶的制作
[1-1]比对
分别获得下述(I)作为由与来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶具有68％的同源性的氨基酸序列构成的β-呋喃果糖苷酶，获得下述(II)作为由与来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶具有60％的同源性的氨基酸序列构成的β-呋喃果糖苷酶。
(I)68％的同源性：米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40(以下简称为“A.oryzae”。)的β-呋喃果糖苷酶(XP_003190558)
(II)60％的同源性：土曲霉(Aspergillus terreus)NIH2624(以下简称为“A.terreus”。)的β-呋喃果糖苷酶(XP_001214174)
接下来，关于来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列(序列号2)，相对于(I)和(II)，通过ClustalW法(http：//www.genome.jp/tools/clustalw/)进行比对。其结果明确了，来自A.kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列中的N末端起第85位的甘氨酸(G)相当于(I)和(II)的N末端起第78位的甘氨酸(G)。
由此，制成含有对于来自A.oryzae的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列和来自A.terreus的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列导入有将N末端起第78位的甘氨酸(G)置换为色氨酸(W)的氨基酸变异(以下简写为“G78W”。)的氨基酸序列的一重变异体的β-呋喃果糖苷酶，将其作为改良型β-呋喃果糖苷酶。具体的程序示于以下的本实施例3(1)[1-2]和[1-3]。
[1-2]野生型β-呋喃果糖苷酶基因的取得
分别将A.oryzae和A.terreus的基因组DNA作为模板，通过下述的条件进行PCR，将编码来自A.oryzae的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA和来自A.terreus的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA进行扩增。需要说明的是，模板中的编码β-呋喃果糖苷酶的区域存在内含子，为了将其去除，分两次进行PCR。将通过该PCR获得的PCR产物分别作为A.oryzae野生型DNA片段-1、2和A.terreus野生型DNA片段-1、2。
此外，进行按照常规方法的测序，确认全长的碱基序列。将编码来自A.oryzae的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA的碱基序列示为序列号35，将由其编码的来自A.oryzae的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列示为序列号36，将编码来自A.terreus的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA的碱基序列示为序列号37，将由其编码的来自A.terreus的野生型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列示为序列号38。
《扩增A.oryzae野生型DNA片段-1的PCR的条件》
正向引物：
5’-ACATCACAGATAACATATGAAGCTCTCAACCGCGAGTGCCT-3’(序列号39)
反向引物：
5’-CCGAGCCCAAGTACTCAGGGCAAAACGTCC-3’(序列号40)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
《扩增A.oryzae野生型DNA片段-2的PCR的条件》
正向引物：
5’-AGTACTTGGGCTCGGTCCTGGTACAAGAACTCGACTGACATCAAG-3’(序列号41)
反向引物：
5’-GAGCAAGCTTCTCGAGTTAGACACGCTCAGGCCAGGCTTCA-3’(序列号42)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
《扩增A.terreus野生型DNA片段-1的PCR的条件》
正向引物：
5’-ACATCACAGATAACATATGAAATCCTCAGTGACACGGATGG-3’(序列号43)
反向引物：5’-CGAACCCAAGTAGAGAGCGCAAATCGCGAA-3’(序列号44)
PCR用酶：KOD-Plus-Neo(东洋纺公司)
《扩增A.terreus野生型DNA片段-2的PCR的条件》
正向引物：
5’-CTCTACTTGGGTTCGGCCTTGGTACAGTTATTCGAATGAGATTAG-3’(序列号45)
反向引物：
5’-GAGCAAGCTTCTCGAGTTACCTCTCGCGCTCGGGGTAAGCA-3’(序列号46)
PCR用酶：KOD-Plus-Neo(东洋纺公司)
接下来，使用In-Fusion HD Cloning Kit(宝生物公司)分别将A.oryzae野生型DNA片段-1和2、以及A.terreus野生型DNA片段-1和2连接，将前者作为A.oryzae野生型DNA片段-3，将后者作为A.terreus野生型DNA片段-3。接下来，设计去除信号序列的引物，按照下述的条件进行PCR，将编码来自A.oryzae的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA和编码来自A.terreus的野生型β-呋喃果糖苷酶的DNA进行扩增，将获得的PCR产物分别作为A.oryzae野生型DNA片段-4和A.terreus野生型DNA片段-4。
《扩增A.oryzae野生型DNA片段-4的PCR的条件》
模板：A.oryzae野生型DNA片段-3
正向引物：5’-AAATCTAAAAGATCCTCCGCCATCGATTACAACG-3’(序列号47)
反向引物：5’-TTTACCAGACTCGAGTTAGACACGCTCAGGCCA-3’(序列号48)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
《扩增A.terreus野生型DNA片段-4的PCR的条件》
模板：A.terreus野生型DNA片段-3
正向引物：5’-AAATCTAAAAGATCCGCAGCGCAGGACTACAAT-3’(序列号49)
反向引物：5’-TTTACCAGACTCGAGTTACCTCTCGCGCTCGGG-3’(序列号50)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
接下来，通过以下述的条件进行PCR，将插入有编码PgsA锚定蛋白的DNA的pCDF质粒的DNA进行扩增，将获得的PCR产物作为pCDF-PgsA-DNA片段。
《插入有编码PgsA锚定蛋白的DNA的pCDF质粒的DNA扩增用PCR的条件》
模板：实施例2(1)[1-1]的pCDF-PgsA重组载体
正向引物：5’-CTCGAGTCTGGTAAAGAAACCGCTGCTGCGAAA-3’(序列号51)
反向引物：5’-GGATCTTTTAGATTTTAGTTTGTCACTATGATCAA-3’(序列号52)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
接下来，使用In-Fusion HD Cloning Kit(宝生物公司)分别将A.oryzae野生型DNA片段-4和pCDF-PgsA-DNA片段、以及A.terreus野生型DNA片段-4和pCDF-PgsA-DNA片段连接从而获得重组载体，将前者作为oryzae(野生型)重组载体，将后者作为terreus(野生型)重组载体。
[1-3]改良型β-呋喃果糖苷酶基因的制作
通过以下述的条件进行PCR，将含有编码改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的DNA片段进行扩增。
《编码来自A.oryzae的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：本实施例4(1)[1-2]的oryzae(野生型)重组载体
正向引物：5’-TGGAGTGGTATCGCAGGCGCTAC-3’(序列号53)
反向引物：5’-ATTGTACAGGAAGCCAACGTGGAAC-3’(序列号54)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
《编码来自A.terreus的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA扩增用PCR的条件》
模板：本实施例4(1)[1-2]的terreus(野生型)重组载体
正向引物：5’-TGGACTGGGATTTCGGCTGTC-3’(序列号55)
反向引物：5’-ATTGTGTAGGAACCCGACATG-3’(序列号56)
PCR用酶：KOD-Plus-(东洋纺公司)
接下来，根据实施例2(2)[2-1]记载的方法，进行DNA片段的纯化和自连接，制成分别插入有编码来自A.oryzae的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA和编码来自A.terreus的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA的重组载体，将前者作为oryzae(G78W)重组载体，将后者作为terreus(G78W)重组载体。
[1-4]转化和转化体的培养和回收
针对本实施例4(1)[1-2]和[1-3]的各重组载体，按照实施例2(3)记载的方法进行转化和转化体的培养和回收，获得重组大肠杆菌。
(2)活性确认
使用本实施例4(1)[1-4]的重组大肠杆菌，按照实施例3(1)和(2)记载的方法，进行β-呋喃果糖苷酶的酶反应和酶反应生成物的确认。但是，酶反应的时间设为3小时。其结果示于表5。需要说明的是，表5中，为了进行比较，将表4所示结果中导入有kawachii(野生型)重组载体和kawachii(G85W)重组载体的重组大肠杆菌的结果一并示出。表5中，“-”表示为检测限以下。
[表5]
如表5所示，关于相对于湿菌体重量的蔗果三糖的量，导入有kawachii(野生型)重组载体、oryzae(野生型)重组载体和terreus(野生型)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为0.92mg、0.87mg和0.99mg，与此相对，导入有kawachii(G85W)重组载体、oryzae(G78W)重组载体和terreus(G78W)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为9.62mg、2.84mg和2.96mg。此外，关于相对于湿菌体重量的蔗果四糖的量，导入有kawachii(野生型)重组载体、oryzae(野生型)重组载体和terreus(野生型)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为1.26mg、1.66mg和1.17mg，与此相对，导入有kawachii(G85W)重组载体、oryzae(G78W)重组载体和terreus(G78W)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为0.85mg、1.56mg和1.62mg。此外，关于蔗果四糖含有比例，导入有kawachii(野生型)重组载体、oryzae(野生型)重组载体和terreus(野生型)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为29.64％、31.68％和15.42％，与此相对，导入有kawachii(G85W)重组载体、oryzae(G78W)重组载体和terreus(G78W)重组载体的重组大肠杆菌的反应液中分别为4.51％、20.86％和16.91％。
即，就导入有kawachii(G85W)重组载体的重组大肠杆菌的反应液而言，与导入有kawachii(野生型)重组载体的重组大肠杆菌的反应液相比，蔗果三糖的量增加，蔗果四糖的量减少，并且蔗果四糖含有比例显著减少，与此相对，就导入有oryzae(G78W)重组载体和terreus(G78W)重组载体的重组大肠杆菌的反应液而言，与导入有oryzae(野生型)重组载体和terreus(野生型)重组载体的重组大肠杆菌的反应液相比，蔗果三糖的量增加但没有确认到蔗果四糖的量和蔗果四糖含有比例的显著减少，特别是蔗果四糖含有比例成为比高效制造蔗果三糖的晶体所需的程度(5％以下)高的值。
由该结果明确了，为了获得能够抑制蔗果四糖的生成、并且高效地生成蔗果三糖的β-呋喃果糖苷酶，需要对于来自A.Kawachii的野生型β-呋喃果糖苷酶(序列号2)导入氨基酸变异。

Claims (7)

1.一种改良型β-呋喃果糖苷酶，其由下述(a)或(b)的氨基酸序列构成：
(a)对于序列号2所示的氨基酸序列导入了以下的i)和/或ii)的氨基酸变异的氨基酸序列，
i)将N末端起第85位的甘氨酸(G)置换为甘氨酸(G)以外的蛋白组成氨基酸的氨基酸变异，
ii)将N末端起第310位的组氨酸(H)置换为赖氨酸(K)、精氨酸(R)或酪氨酸(Y)的氨基酸变异；
(b)由在(a)中缺失、置换、插入或附加除了导入有氨基酸变异的氨基酸以外的一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成并且具有β-呋喃果糖苷酶活性的氨基酸序列。
2.含有权利要求1所述的改良型β-呋喃果糖苷酶的氨基酸序列的多肽。
3.编码权利要求1所述的改良型β-呋喃果糖苷酶的DNA。
4.含有权利要求3所述的DNA的重组载体。
5.将权利要求3所述的DNA或权利要求4所述的重组载体导入宿主而获得的转化体。
6.一种改良型β-呋喃果糖苷酶的制造方法，其具有：
从培养权利要求5所述的转化体而获得的培养物取得改良型β-呋喃果糖苷酶的工序。
7.一种蔗果三糖的制造方法，其具有：
使权利要求1所述的改良型β-呋喃果糖苷酶、权利要求5所述的转化体或培养权利要求5所述的转化体而获得的培养物与蔗糖接触的工序。
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