KR20170139002A - 개량형 β-프룩토프라노시다아제 - Google Patents

Abstract

(과제)니스토오스의 생성을 억제해서 케스토오스를 효율적으로 생성할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 제공한다.
(해결수단)하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제; (a)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열에 대하여, 이하의 ｉ) 및/또는 ｉｉ)의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열; ｉ)N말단으로부터 85번째의 글리신(G)을 글리신(G) 이외의 단백질구성 아미노산으로 치환하는 아미노산 변이, ｉｉ)N말단으로부터 310번째의 히스티딘(H)을 리신(K), 아르지닌(R) 또는 티로신(Y)으로 치환하는 아미노산 변이, (b)(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1 혹은 복수개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.

Description

개량형 β-프룩토프라노시다아제{IMPROVED β-FRUCTOFURANOSIDASE}

본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제에 관한 것으로서, 특히 니스토오스(nystose)의 생성을 억제하여 효율적으로 케스토오스(kestose)를 생성할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 그 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드(polypeptide), 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ, 당해 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector), 당해 ＤＮＡ 또는 당해 재조합 벡터를 숙주(宿主)에 도입해서 얻어지는 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법 및 그들을 사용한 케스토오스의 제조방법에 관한 것이다.

β-프룩토프라노시다아제는, 말단(末端)에 프룩토오스(fructose) 잔기(殘基)를 포함하는 당질(糖質)의 프룩토오스를 인식하여 가수분해하는 효소이다. β-프룩토프라노시다아제 중에는, 가수분해활성에 더하여, 가수분해에 의하여 발생한 프룩토오스를 기질(基質)에 전이(轉移)시키는 프룩토오스 전이활성을 구비하는 것도 존재한다. 그러한 β-프룩토프라노시다아제에 의하면, 수크로오스를 기질로 하여, 1분자의 글루코오스와 2분자의 프룩토오스가 결합한 3당인 케스토오스를 생성할 수 있다.

케스토오스 중에서도 1-케스토오스는, 수크로오스(설탕)와 비슷한 감미질(甘味質)로서, 설탕의 3분의 1 정도의 단맛이 나는 한편 설탕의 약 반 정도의 칼로리인 것, 섭취해도 혈당값을 상승시키기 어려운 것, 알레르기 억제 기능을 발휘하는 것(특허문헌1) 등 때문에, 유용한 올리고당인 것이 알려져 있다. 1-케스토오스를 생성하는 β-프룩토프라노시다아제로서는, 예를 들면 아스페르길루스·니거(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ) 유래의 β-프룩토프라노시다아제 및 그 아미노산 배열에 아미노산 변이를 도입한 변이체의 β-프룩토프라노시다아제가 개시되어 있다(특허문헌2 및 특허문헌3).

일본국 특허 제4162147호 공보 일본국 특허 제3628336호 공보 국제공개 제2005/085447호

수크로오스를 기질로 해서, β-프룩토프라노시다아제를 사용해서 케스토오스를 제조할 때에는, 보통 부생성물로서 4당의 니스토오스가 생성된다. 후술하는 실시예1(1)에 나타나 있는 바와 같이, 당액(糖液)중에 일정한 비율 이상으로 존재하는 니스토오스는, 정석공정(晶析工程;crystallization step)에서의 케스토오스의 결정화(結晶化)를 저해한다. 또한 후술하는 실시예1(2)에 나타나 있는 바와 같이, 니스토오스는 크로마토그래피에 있어서 케스토오스와의 분리가 곤란하여, 크로마토그래피에 의한 분리정제공정을 거쳐도 그 함유비율을 감소시키는 어렵다. 이러한 것들때문에, 케스토오스 결정을 효율적으로 제조하기 위해서는, β-프룩토프라노시다아제에 의한 효소반응의 반응액에 있어서, 케스토오스의 생성량 내지 케스토오스의 함유비율을 향상시킴과 아울러, 니스토오스의 함유비율을 충분하게 감소시키는 것이 필요하다. 따라서 니스토오스의 생성을 억제하면서 케스토오스를 효율적으로 생성할 수 있는 β-프룩토프라노시다아제가 요구되고 있다.

본 발명은, 이러한 문제점을 해결하기 위하여 이루어진 것으로서, 니스토오스의 생성을 억제하면서 효율적으로 케스토오스를 생성할 수 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 그 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ, 당해 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터, 당해 ＤＮＡ 또는 당해 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어지는 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법 및 그들을 사용한 케스토오스의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은, 예의 연구한 결과, Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｋａｗａｃｈｉｉ ＮＢＲＣ 4308(이하, 「Ａ. ｋａｗａｃｈｉｉ」라고 약기한다) 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2; 전장(全長(전체길이)) 628아미노산)에 대하여, 아미노 말단(N말단)으로부터 85번째의 글리신(G)을 글리신(G) 이외의 단백질구성 아미노산으로 치환하는 아미노산 변이, 또는 N말단으로부터 310번째의 히스티딘(H)을 리신(K), 아르지닌(R) 혹은 티로신(Y)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입함으로써, 니스토오스의 생성을 억제하면서 효율적으로 케스토오스를 생성할 수 있는 것을 찾아내어, 이들 지견에 의거하여 하기의 각 발명을 완성하였다.

(1)본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제는, 하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 배열로 이루어진다;

(a)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열(전장 628아미노산)에 대하여, 이하의 ｉ) 및/또는 ｉｉ)의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열；

ｉ)N말단으로부터 85번째의 글리신(G)을 글리신(G) 이외의 단백질구성 아미노산으로 치환하는 아미노산 변이,

ｉｉ)N말단으로부터 310번째의 히스티딘(H)을 리신(K), 아르지닌(R) 또는 티로신(Y)으로 치환하는 아미노산 변이,

(b)(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1 혹은 복수개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.

(2)본 발명에 관한 폴리펩티드는, (1)에 기재되어 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함한다.

(3)본 발명에 관한 ＤＮＡ는, (1)에 기재되어 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드한다.

(4)본 발명에 관한 재조합 벡터(recombinant vector)는, (3)에 기재되어 있는 ＤＮＡ를 포함한다.

(5)본 발명에 관한 형질전환체는, (3)에 기재되어 있는 ＤＮＡ 또는 (4)에 기재되어 있는 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어지는 형질전환체이다.

(6)본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법은, (5)에 기재되어 있는 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정을 구비한다.

(7)본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법은, (1)에 기재되어 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제, (5)에 기재되어 있는 형질전환체 또는 (5)에 기재되어 있는 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물과 수크로오스를 접촉시키는 공정을 구비한다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제나 본 발명에 관한 형질전환체, 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법에 의하면, 니스토오스의 생성을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 관한 폴리펩티드나 본 발명에 관한 ＤＮＡ, 본 발명에 관한 재조합 벡터, 본 발명에 관한 형질전환체, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법에 의하면, 니스토오스가 생성되는 비율을 억제하고 케스토오스를 효율적으로 생성하는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있다.

이하, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터, 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법 및 케스토오스의 제조방법에 대하여 상세하게 설명한다.

본 발명에 있어서, 「β-프룩토프라노시다아제」는, 「프룩토실트랜스퍼라아제」, 「사카라아제」, 「β-D-프룩토프라노시다아제」, 「인베르타아제(invertase)」 또는 「인베르틴(invertin)」과 교환 가능하게 사용되는 경우가 있다. 또한 본 발명에 있어서의 「야생형 β-프룩토프라노시다아제」란, 유전자공학의 방법을 사용해서 아미노산 변이를 도입하지 않고 있는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제를 말하고, 「개량형 β-프룩토프라노시다아제」란, 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여 1 또는 2 이상의 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제를 말한다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제는, 하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 배열로 이루어진다;

(a)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열(전장 628아미노산)에 대하여, 이하의 ｉ) 및/또는 ｉｉ)의 아미노산 변이(amino acid mutation)를 도입한 아미노산 배열；

ｉ)N말단으로부터 85번째의 글리신(G)을 글리신(G) 이외의 단백질구성 아미노산으로 치환하는 아미노산 변이,

ｉｉ)N말단으로부터 310번째의 히스티딘(H)을 리신(K), 아르지닌(R) 또는 티로신(Y)으로 치환하는 아미노산 변이,

(b)(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1 혹은 복수개의 아미노산을 결실(deleting), 치환(substituting), 삽입(inserting) 혹은 부가(adding)한 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.

여기에서 「단백질구성 아미노산」이란, 하기의 표1에 게재한 것을 말한다(생화학사전 제4판; 동경화학동인사(Tokyo-kagaku-dojin社) 발행, 제57쪽, 2007년 12월）. 이들 중에서, 본 발명에 관한 「글리신(G) 이외의 단백질구성 아미노산」으로서, 바람직하게는 방향족 아미노산, 복소환식 아미노산, 산성 아미노산 및 염기성 아미노산을, 더 바람직하게는 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 아스파르트산(D), 글루탐산(E) 및 아르지닌(R)을 들 수 있다.

상기 (b)는, (a)와 배열 동일성이 높고, (a)에 있어서 도입된 아미노산 변이에 상당하는 아미노산 변이를 구비하고, 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열이다.

여기에서 (a)와 (b)와의 동일성의 값으로서는, 예를 들면 80∼85%이상, 85∼90%이상, 90∼95%이상 등을 들 수 있다.

즉, (b)는, 예를 들면 「(a)와의 동일성의 값이 80∼90% 미만이 되지 않는 범위에서, (a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1 혹은 복수개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 아미노산 배열」로 이루어진다.

따라서 (b)의 「결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 아미노산」의 개수로서, 구체적으로는, 예를 들면 1∼125개((a)와의 동일성이 80%이상), 1∼113개((a)와의 동일성이 82%이상), 1∼100개((a)와의 동일성이 84%이상), 1∼87개((a)와의 동일성이 86%이상), 1∼75개((a)와의 동일성이 88%이상), 1∼62개((a)와의 동일성이 90%이상), 1∼50개((a)와의 동일성이 92%이상), 1∼37개((a)와의 동일성이 94%이상), 1∼25개((a)와의 동일성이 96%이상), 1∼12개((a)와의 동일성이 98%이상) 등을 들 수 있다.

여기에서 아미노산 배열의 동일성은, 보통의 방법에 따라서 확인할 수 있고, 예를 들면 ＦＡＳＴＡ(ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ＪＰ/ｔｏｏｌｓ/ｆａｓｔａ/), Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ(ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.), Ｐｏｓｉｔｉｏｎ-Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｉｔｅｒａｔｅｄ ＢＬＡＳＴ(ＰＳＩ-ＢＬＡＳＴ; ｈｔｔｐ://ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ.) 등의 프로그램을 사용해서 확인할 수 있다. 또 「동일성」이란 일치성을 가리키고, 「ｉｄｅｎｔｉｔｙ」와 교환 가능하게 사용된다.

본 발명에 있어서, 어떤 단백질이 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 것인가 아닌가는, 보통의 방법에 따라 확인할 수 있고, 예를 들면 후술하는 실시예3(1)에 나타나 있는 바와 같이, 당해 단백질을 수크로오스를 포함하는 반응액중에서 인큐베이트(incubate) 하고, 또는 당해 단백질을 발현시킨 형질전환체를 수크로오스를 포함하는 반응액중에서 배양한 후, 그 반응액의 함유물을 고속액체 크로마토그래피(ＨＰＬＣ) 등에 의해 확인한다. 그 결과, 글루코오스나 프룩토오스 등의 β-프룩토프라노시다아제의 가수분해활성에 의하여 발생한 물질이나, 케스토오스나 니스토오스 등의 β-프룩토프라노시다아제의 프룩토오스 전이활성에 의하여 발생한 물질의 존재가 확인되면, 당해 단백질은 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비한다고 판단할 수 있다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제는 보통의 방법에 따라서 얻을 수 있고, 그러한 방법으로서는, 예를 들면 화학합성하는 방법이나, 유전자 재조합 기술(gene recombination technique)에 의한 방법을 들 수 있다. 화학합성하는 방법에서는, 예를 들면 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열정보에 의거하여 Ｆｍｏｃ법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), ｔＢｏｃ법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학합성법에 따라 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 합성할 수 있는 것 외에, 각종 시판되는 펩티드 합성기를 이용해서 합성할 수도 있다.

또한 유전자 재조합 기술에 의한 방법에서는, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 적합한 발현계에서 발현시킴으로써, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있다. 즉 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 적당한 숙주에 도입해서 형질전환체를 얻는다. 또는 후술하는 실시예2에 나타나 있는 바와 같이, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 적당한 벡터에 삽입해서 재조합 벡터(recombinant vector)를 얻은 후, 그 재조합 벡터를 적당한 숙주에 도입해서 형질전환체를 얻는다. 그리고 얻어진 형질전환체를 배양해서 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 발현시킴으로써, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻을 수 있다.

여기에서 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ는, 그 염기배열 정보에 의거하여 시판되고 있는 다양한 ＤＮＡ합성기를 사용해서 합성할 수 있는 것 이외에, 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ나 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 주형(鑄型; template)으로 하여, 폴리머라아제 연쇄반응(ＰＣＲ)을 함으로써 얻을 수 있다.

예를 들면 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 얻는 경우에는, 후술하는 실시예2에 나타나 있는 바와 같이 우선 도입하는 아미노산 변이를 코드하는 ＤＮＡ 프라이머를 설계하고, 그 ＤＮＡ 프라이머를 사용하여, 야생형 β-프룩토프라노시다아제 또는 당해 아미노산 변이를 도입하지 않고 있는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 주형으로 하여 ＰＣＲ을 함으로써, 당해 아미노산 변이를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 얻을 수 있다.

또한 상기 (b)의, 「(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1 혹은 복수개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 아미노산 배열」로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ도 또한 ＰＣＲ에 의해 얻을 수 있다. 즉, 우선 아미노산을 결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 개소(個所; site)에 상당하는 아미노산 배열을 코드하는 ＤＮＡ 프라이머를 설계하고, 그 ＤＮＡ 프라이머를 사용하여, (a)를 코드하는 ＤＮＡ를 주형으로 하여 ＰＣＲ을 함으로써, (a)에 있어서, 당해 아미노산을 결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 아미노산 배열을 코드하는 ＤＮＡ를 얻을 수 있다.

또한 본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 또 본 발명에 관한 폴리펩티드에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 반복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 폴리펩티드는, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함하는 한, 그 배열길이는 특별하게 한정되지 않고, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열만으로 이루어지는 것이라도 좋고, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열의 N말단 및/또는 카르복실 말단(C말단)에, 1개 혹은 복수 개의 아미노산 잔기가 부가된 아미노산 배열로 이루어지는 것이라도 좋다. 또한 본 발명에 관한 폴리펩티드는, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 얻는 방법과 동일한 방법에 의해 얻을 수 있다.

그리고 본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 제공한다. 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제 및 폴리펩티드와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

또한 본 발명은, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 또 본 발명에 관한 재조합 벡터에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드 및 ＤＮＡ와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 재조합 벡터는, 예를 들면 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 벡터에 삽입함으로써 얻을 수 있다. ＤＮＡ의 벡터에의 삽입은, 보통의 방법에 따라 할 수 있고, 예를 들면 ＤＮＡ와 선상화(線狀化) 한 벡터의 ＤＮＡ 단편(斷片)과를 라이게이션(ligation) 함으로써 할 수 있다. 여기에서 벡터로서는, 예를 들면 파지 벡터(phage vector)나 플라스미드 벡터(plasmid vector), 코스미드(cosmid), 파지미드(phagemid) 등을 들 수 있고, 숙주나 조작성 등에 따라 적당하게 선택할 수 있다. 또한 본 발명에 관한 재조합 벡터는, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 이외에, 약제내성 마커 유전자(藥劑耐性 marker 遺傳子)나 영양요구 마커 유전자(榮養要求 marker 遺傳子) 등의 형질전환체의 선택 마커 유전자, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 발현에 필요한 프로모터(promoter), 전사개시신호, 리보솜 결합부위, 번역정지 시그널, 전사종결신호 등의 전사조절신호나 번역조절신호 등을 포함하는 것이더라도 좋다.

본 발명은 형질전환체도 제공한다. 또 본 발명에 관한 형질전환체에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ 및 재조합 벡터와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 형질전환체는, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 또는 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어진다. 여기에서 숙주로서는, 예를 들면 대장균(大腸菌)이나 고초균(枯草菌) 등의 세균, 효모, 곰팡이, 사상균(絲狀菌) 등을 들 수 있고, 재조합 벡터의 종류나 조작성 등에 따라 적당하게 선택할 수 있다. ＤＮＡ나 재조합 벡터의 숙주에의 도입(형질전환)은 보통의 방법에 따라 할 수 있고, 예를 들면 플라스미드를 사용한 재조합 벡터를 대장균에 도입하는 경우이면, 대장균의 컴피턴트 세포(competent cell)에 재조합 벡터를 가하여 빙상(氷上)에서 30분간 정치(靜置)하고, 계속하여 42℃의 워터 배스(water bath)에 넣어서 45초간 정치한 후, 빙상에서 2분간 정치하고, 그 후에 배지를 가하여 37℃에서 1시간 진탕(振蕩)함으로써 할 수 있다. 또한 숙주의 염색체에 직접 원하는 ＤＮＡ를 도입하기 위해서는, 상동재조합법(homologous recombination method) 등을 사용할 수 있다.

다음에 본 발명은 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법은, 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정을 구비한다. 또 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터 및 형질전환체와 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정에 있어서, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 방법은, 형질전환체의 태양 등에 따라 적당하게 선택할 수 있다. 구체적으로는, 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물을 그대로 개량형 β-프룩토프라노시다아제로서 취득하더라도 좋고, 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제해서 취득하더라도 좋다.

형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물을 그대로 개량형 β-프룩토프라노시다아제로서 취득하는 방법으로서는, 예를 들면 개량형 β-프룩토프라노시다아제가 형질전환체의 세포 표면 혹은 세포 내부에 발현되도록 ＤＮＡ 혹은 재조합 벡터를 설계하였을 경우에는, 배양물을 원심분리에 제공해서 형질전환체를 회수하고, 이것을 그대로 개량형 β프룩토프라노시다아제로서 취득하는 방법이나, 회수한 형질전환체를 파쇄하여 이것을 개량형 β-프룩토프라노시다아제로서 취득하는 방법을 들 수 있다.

배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제하는 방법으로서는, 예를 들면 개량형 β-프룩토프라노시다아제가 형질전환체의 외부에 분비되도록 ＤＮＡ 혹은 재조합 벡터를 설계하였을 경우에는, 배양물을 원심분리에 제공해서 배양 상청(上淸; 표면에 떠 있는 부분)을 회수함으로써 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제할 수 있다. 또한 개량형 β-프룩토프라노시다아제가 형질전환체의 내부에 발현되어지는 경우에는, 배양물을 원심분리에 제공해서 침전시킨 형질전환체를 회수하고, 이것을 완충액중에 현탁, 동결 융해, 초음파처리 또는 마쇄(磨碎)하는 등 해서 형질전환체를 파쇄한 후, 원심분리에 제공해서 상청을 회수함으로써 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 정제할 수 있다. 그 밖에 정제하는 방법으로서는, 배양물을 열처리, 염침전, 용매침전, 투석, 한외 여과, 겔 여과, ＳＤＳ-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 소수(疏水) 크로마토그래피, 역상(逆相) 크로마토그래피, 등전점전기영동 등에 제공하는 방법을 들 수 있다.

마지막으로, 본 발명은 케스토오스의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법은, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 본 발명에 관한 형질전환체 또는 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물과 수크로오스와를 접촉시키는 공정을 구비한다. 또 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법에 있어서, 상기한 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터, 형질전환체 및 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법과 같은 또는 상당하는 구성에 대해서는 중복 설명을 생략한다.

또 케스토오스는 보통 수크로오스에 프룩토오스가 결합해서 생성되며, 프룩토오스가 결합하는 위치에 따라 1-케스토오스, 6-케스토오스 및 네오케스토오스의 3종류가 발생할 수 있다. 즉, 1-케스토오스는 프룩토오스가 수크로오스중의 프룩토오스 단위에 β(2→1) 결합해서 생성되고, 6-케스토오스는 프룩토오스가 수크로오스중의 프룩토오스 단위에 β(2→6) 결합해서 생성되며, 네오케스토오스는 프룩토오스가 수크로오스중의 글루코오스 단위에 β(2→6) 결합해서 생성된다. 또한 니스토오스는, 프룩토오스가 1-케스토오스중의 프룩토오스 단위에 β(2→1) 결합해서 생성되는 4당이다.

본 발명에 있어서의 「케스토오스」란, 1분자의 글루코오스와 2분자의 프룩토오스가 결합한 3당을 의미하고, 1-케스토오스, 6-케스토오스 및 네오케스토오스를 포함한다.

본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제와 수크로오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 수크로오스를 포함하는 용액에 첨가하고 30℃∼50℃로 20시간 정도 정치하는 방법을 들 수 있다. 또한 본 발명에 관한 형질전환체와 수크로오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 숙주가 대장균인 경우에는, 본 발명에 관한 형질전환체를 수크로오스를 포함하는 용액에 첨가하고 50℃로 몇 일간 진탕배양(振蕩培養)하는 방법을 들 수 있다.

또한 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물과 수크로오스와를 접촉시키는 방법으로서는, 예를 들면 본 발명에 관한 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물을 수크로오스를 포함하는 용액에 첨가하고 30℃∼50℃로 20시간 정도 정치 혹은 진탕하는 방법을 들 수 있다. 여기에서 본 발명에 관한 배양물은, 파쇄, 마쇄, 완충액에의 현탁, 동결 융해, 초음파처리, 원심분리, 열처리, 염침전, 용매침전, 투석, 한외 여과, 겔 여과, ＳＤＳ-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 이온교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 등전점전기영동 등의 어떠한 처리에 제공한 것이더라도 좋고, 처리에 제공하지 않고 있는 것이더라도 좋다.

본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법에는, 본 발명에 관한 케스토오스의 제조방법의 특징을 손상하지 않는 한, 다른 공정을 구비하더라도 좋고, 예를 들면 크로마토그래피에 의한 케스토오스의 분리공정이나 전당(煎糖) 등의 결정화공정, 건조공정, 세정공정, 여과공정, 살균공정, 식품첨가물을 첨가하는 공정 등을 구비해도 좋다.

이하, 본 발명에 관한 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 폴리펩티드, ＤＮＡ, 재조합 벡터, 형질전환체, 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법, 케스토오스의 제조방법에 대해서, 각 실시예에 의거하여 설명한다. 또 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예에 의해 나타내지는 특징에 한정되지 않는다.

실시예

<실시예1>니스토오스 함유비율의 영향의 검토

(1)결정화 시험

수용액에 포함되는 당에 있어서의 니스토오스의 함유비율((w/w）%；이하, 「니스토오스 함유비율」이라고 한다)이 5%정도 및 10%정도인 원료당액을 사용하여 케스토오스의 결정을 제조하고, 케스토오스의 회수율 및 결정 사이즈의 확인을 함으로써, 케스토오스의 결정 제조시에 있어서의 니스토오스 함유비율의 영향을 검토하였다. 구체적인 순서를 이하에 나타낸다.

우선, 수용액에 포함되는 당에 있어서의 케스토오스의 함유비율((w/w）%； 이하, 「케스토오스 함유비율」이라고 한다)이 80%이상 또한 당농도가 60(w/w）%정도가 되도록, 케스토오스 결정 및 프락토올리고당 분말(메이올리고P; 메이지푸드마테리어사(Meiji Food Materia Co.,LTD.))을 물에 용해하고, Ｎｏ.1∼4로 하였다. 여기에서 Ｎｏ.1 및 2는 니스토오스 함유비율이 5.2%, Ｎｏ.3 및 4는 니스토오스 함유비율이 10%가 되도록 조제하였다. 그 후에 로터리 에바포레이터(rotary evaporator)를 사용하여 농축하고, 이것을 원료당액으로 하였다. 한편 케스토오스 결정을 갈아서 으깨고, 메시체(mesh sieve)를 통과시켜서 입도를 맞춘 것을 시드(seed)로 하였다.

1L용량의 가지형 플라스크(eggplant flask)에, 당의 고형분 환산으로 400g에 상당하는 양의 원료당액을 넣고, 진공도 293hPa(220ｍｍＨｇ)로 감압 농축하였다. 당액의 온도가 78℃에 도달한 시점에 시드를 가하여 기정(起晶; graining)시켜, 결정화(結晶化)를 하였다. 시드는, Ｎｏ.1 및 3에는 2.5ｐｐｍ, Ｎｏ.2에는 1.2ｐｐｍ, Ｎｏ.4에는 1.1ｐｐｍ이 되도록 가하였다. 결정화의 도중에, 당의 고형분 환산으로 200g에 상당하는 양의 원료당액을 60℃로 가온(加溫)하면서 가지형 플라스크내에 공급하였다. 그 후에 당액의 Ｂｒｉｘ값 및 중량을 측정한 후에, 소형원심분리기(H-112;고쿠산사사(KOKUSAN Co., Ltd.))에 제공하여 결정을 회수하였다.

회수한 결정은, 80℃로 설정한 건조기에 1시간 정도 정치해서 건조시켰다.

건조후의 결정의 중량을 측정하고, 다음 식1에 의하여 결정화에 의한 케스토오스의 회수율을 산출하였다.

식1; 케스토오스의 회수율 = {결정 중량/(소형원심분리기에 제공한 당액의 중량×당액의 Ｂｒｉｘ값/100)}×100

또한 현미경을 사용하여 결정 사이즈를 관찰하였다.

또한 결정 및 원료당액을 하기의 조건에 의하여 고속액체 크로마토그래피(ＨＰＬＣ)에 제공하고, 각 당(단당; 프룩토오스, 단당; 글루코오스, 2당; 수크로오스, 3당; 케스토오스, 4당; 니스토오스, 및 그 밖의 당)의 함유비율을 확인하였다. 각 당의 함유비율은, 검출된 전(全)피크의 면적의 총합계에 대한 각 피크의 면적의 비율로서, 면적백분율로 산출하였다. 그 결과를 표2에 나타낸다. 또 표 1중, 「-」는 측정 불가이었던 것을 나타낸다.

《ＨＰＬＣ의 조건》

칼럼; ＳＨＯＤＥＸ ＫＳ 802(8.0φ×300mm) 2개

이동상; 물

유속; 1.0ｍＬ/분

주입량; 20μL

온도; 50℃

검출; 시차굴절률검출기(ＲＩＤ; 쇼와전공사(Showa Denko K.K.))(피크면적을 사용한 면적백분율)

표2에 나타나 있는 바와 같이 케스토오스의 회수율은, Ｎｏ.1 및 2에서는, 각각 40% 및 45%이었던 것에 대해서, Ｎｏ.3에서는 15%이었다. 또한 결정 사이즈는, Ｎｏ.1 및 2에서는 모두 결정 사이즈가 컸던 것에 대해서, Ｎｏ.3에서는 결정 사이즈가 작았다. 또한 Ｎｏ.4에서는 생성된 결정이 작아, 결정을 회수할 수 없었다. 또한 시드의 첨가량을 2.5ｐｐｍ으로 하였을 경우의 결정화에 요한 시간은, Ｎｏ.1에서는 8시간이었던 것에 대해서, Ｎｏ.3에서는 23시간이었다.

즉, 원료당액에 있어서의 니스토오스 함유비율이 5.2%인 경우에는, 케스토오스의 회수율이 높고, 결정의 사이즈도 크고, 결정을 얻기 위해서 요하는 시간도 짧은 것에 대해서, 원료당액에 있어서의 니스토오스 함유비율이 10%인 경우에는, 케스토오스의 회수율이 낮고, 결정의 사이즈가 작고, 결정을 얻기 위해서 요한 시간이 긴 것이 밝혀졌다. 이들의 결과로부터, 케스토오스의 결정을 효율적으로 제조하기 위해서는, 원료당액에 있어서의 니스토오스 함유비율은 10%보다 작은 것이 바람직한 것이 밝혀졌다.

(2)크로마토그래피를 사용한 케스토오스 분리시험

수크로오스를 기질로 하여 β-프룩토프라노시다아제에 의한 효소반응을 실시하고, 다양한 비율로 니스토오스, 케스토오스, 수크로오스, 글루코오스 및 프룩토오스를 포함하는 반응액을 얻어, Ｎｏ.1∼8로 하였다. 이들에 대해서, 결정 제조에 충분한 정도까지 케스토오스 함유비율을 높이기(케스토오스 함유비율(케스토오스 순도)이 약 80%정도) 위해, 이온교환수지를 사용한 크로마토그래피에 제공해서 케스토오스의 분리정제를 하여, 케스토오스 고순도액을 얻었다. 또 크로마토그래피의 조건은 Ｎｏ.1∼8의 샘플간에 동일조건으로 하였다. 반응액 및 케스토오스 고순도액에 있어서의 각 당의 함유비율을 표3에 나타낸다.

표3에 나타나 있는 바와 같이, 케스토오스 함유비율은, 반응액에서는, Ｎｏ.1∼8에서 각각 45.1%, 45.8%, 52.9%, 53.7%, 52.8%, 46.0%, 45.8% 및 48.4%이었던 것에 대해서, 케스토오스 고순도액에서는, Ｎｏ.1∼8에서 각각 76.6%, 78.1%, 86.4%, 88.3%, 88.0%, 78.7%, 79.2% 및 78.6%이었다. 즉, Ｎｏ.1∼8의 어느 것에 있어서도, 케스토오스 고순도액에서는 결정 제조에 충분한 정도(약 80%정도)까지 케스토오스 함유비율이 높아졌다.

한편 니스토오스 함유비율은, 반응액에서는, Ｎｏ.1∼8에서 각각 11.6%, 10.6%, 6.0%, 4.7%, 4.7%, 10.2%, 9.7% 및 11.3%이었던 것에 대해서, 케스토오스 고순도액에서는, Ｎｏ.1∼8에서 각각 18.6%, 17.0%, 9.2%, 7.3%, 7.4%, 16.4%, 15.8% 및 17.3%이었다. 즉, Ｎｏ.1∼8의 어느 것에 있어서도 케스토오스 고순도액에서는, 반응액과 비교하여 니스토오스 함유비율이 1.5배 정도로 높아졌다. 구체적으로는, 니스토오스 함유비율은, 반응액에서 5%정도인 경우(Ｎｏ.3, 4 및 5)에는 케스토오스 고순도액에서도 10%미만에 그쳤지만, 반응액에서 10%정도의 경우(Ｎｏ.1, 2, 6, 7 및 8)에는 케스토오스 고순도액에서는 15%이상이 되었다. 이것은, 크로마토그래피에 있어서 니스토오스와 케스토오스의 분리가 곤란하기 때문이라고 생각된다.

이 본 실시예1(2)의 결과와 상기의 본 실시예1(1)의 결과로부터, 케스토오스의 결정을 효율적으로 제조하기 위해서는, β-프룩토프라노시다아제에 의한 효소반응후의 반응액에 있어서의 니스토오스 함유비율을 5%정도로 억제할 필요가 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예2>개량형 β-프룩토프라노시다아제의 작성

Ａ. ｋａｗａｃｈｉｉ 유래의 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 대하여, N말단으로부터 85번째의 글리신(G)을, 트립토판(W), 페닐알라닌(F), 티로신(Y), 아스파르트산(D), 글루탐산(E) 또는 아르지닌(R)으로 치환하는 아미노산 변이(이하, 각각의 아미노산 변이를 「G85W」, 「G85F」, 「G85Y」, 「G85D」, 「G85E」, 「G85R」이라고 약기한다), 및 N말단으로부터 310번째의 히스티딘(H)을, 리신(K), 아스파르트산(D), 아르지닌(R), 티로신(Y), 글리신(G) 또는 트립토판(W)으로 치환하는 아미노산 변이(이하, 각각의 아미노산 변이를 「H310K」, 「H310D」, 「H310R」, 「H310Y」, 「H310G」, 「H310W」라고 약기한다)를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 1중 변이체(single variants) 및 2중 변이체(double variants)의 β-프룩토프라노시다아제를 작성하고, 이들을 개량형 β-프룩토프라노시다아제로 하였다. 구체적인 순서를 이하에 나타낸다.

(1)야생형 β-프룩토프라노시다아제 유전자의 취득 및 발현계의 구축

[1-1]ＤＮＡ의 취득

Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제(ＧｅｎＢａｎｋ:ＧＡＡ88101.1)를 코드하는 ＤＮＡ를, 젠스크립트사(GenScript Japan Inc.)에 의뢰해서 인공합성해서 취득하였다. Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 전장의 염기배열을 배열번호1에, 그것에 코드되는 Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 배열번호2에, 각각 나타낸다. 또 배열번호2에 있어서, 시그널 배열은 1∼24번째에 상당한다.

[1-2]β-프룩토프라노시다아제 발현계의 구축

하기의 조건으로 폴리머라아제 연쇄반응(ＰＣＲ)을 함으로써, Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ(ＩＡＭ1026, ＡＴＣＣ9466)의 ＰｇｓＡ 앵커 단백질(ＧｅｎＢａｎｋ:ＡＢ016245.1)을 코드하는 ＤＮＡ를 증폭하였다. 얻어진 ＰＣＲ산물을 보통의 방법에 따라 제한효소 ＮｄｅＩ 및 ＢｇｌＩＩ로 소화하고, 이것을 ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편(斷片)이라고 하였다. 또한 ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편에 대해서, 보통의 방법에 따라 시퀀싱 하여 그 염기배열을 확인하였다. 확인한 ＰｇｓＡ 앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ의 염기배열을 배열번호 3에, 그것에 코드되는 ＰｇｓＡ 앵커 단백질의 아미노산 배열을 배열번호4에, 각각 나타낸다.

《ＰｇｓＡ 앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형; Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ(ＩＡＭ1026, ＡＴＣＣ9466)의 게놈ＤＮＡ

포워드 프라이머(밑줄은 ＮｄｅＩ 사이트를 나타낸다); 5'－ＡＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＣＴＧＡＧＣＴＴＴＣＡＴＧ-3'（배열번호5)

리버스 프라이머(밑줄은 ＢｇｌＩＩ 사이트를 나타낸다); 5'－ＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧ-3'（배열번호6)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사(Toyobo Co., Ltd.))

또한 ｐＣＤＦＤｕｅｔ-1플라스미드(이하, 「ｐＣＤＦ플라스미드」라고 약기한다; Ｍｅｒｃｋ사(Merck KGaA))를 보통의 방법에 따라 제한효소 ＮｄｅＩ 및 ＢｇｌＩＩ로 소화하여, ｐＣＤＦ플라스미드 단편을 얻었다. 계속하여 ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｖｅｒ．2.1(다카라바이오사(Takara Bio Inc.))을 사용하여 첨부의 사용서에 따라 ｐＣＤＦ플라스미드 단편과 ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편을 라이게이션 하여, ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ 재조합 벡터를 구축하였다.

다음에 시그널 배열을 제거하도록 프라이머를 설계하고, 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭하고, 이것을 ｋａｗａｃｈｉｉ-ＤＮＡ 단편이라고 하였다.

《Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

본 주형; 실시예2(1)[1-1]의 Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ

포워드 프라이머; 5'－ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＴＧＧＴＣＡＴＣＧＡＣＴＡＣ-3'（배열번호7)

리버스 프라이머; 5'－ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＡＣＴＧＡＣＧＡＴＣＣＧＧＣ-3'（배열번호8)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-Ｎｅｏ(도요보사)

또한 하기의 조건으로 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ 재조합 벡터를 주형으로 하여 ＰＣＲ을 하고, 얻어진 ＰＣＲ산물을 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편이라고 하였다.

《ＰｇｓＡ 단백질을 코드하는 ＤＮＡ가 삽입된 ｐＣＤＦ플라스미드 유래의 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형; ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ 재조합 벡터

포워드 프라이머; 5'－ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ-3'（배열번호9)

리버스 프라이머; 5'－ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ-3'（배열번호10)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-Ｎｅｏ(도요보사)

계속하여 Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ(다카라바이오사)를 사용하여 첨부의 사용서에 따라 ｋａｗａｃｈｉｉ-ＤＮＡ 단편 및 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편을 연결하고, 이것을 ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터라고 하였다.

(2)개량형 β-프룩토프라노시다아제 유전자의 작성

[2-1]1중 변이체

본 실시예2(1)[1-2]의 ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터를 주형으로 해서 ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-ＮＥＯ(도요보사)를 ＰＣＲ용 효소로서 사용하여, 하기의 프라이머 및 반응조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 포함한 ＤＮＡ 단편을 증폭하였다.

《개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

「G85W」

포워드 프라이머; 5'－ＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ-3'（배열번호11)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ-3'（배열번호12)

「G85F」

포워드 프라이머; 5'－ＴＴＣＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ-3'（배열번호13)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ-3'（배열번호14)

「G85Y」

포워드 프라이머; 5'－ＴＡＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ-3'（배열번호15)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ-3'（배열번호16)

「G85D」

포워드 프라이머; 5'－ＧＡＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ-3'（배열번호17)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ-3'（배열번호18)

「G85E」

포워드 프라이머; 5'－ＧＡＡＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ-3'（배열번호19)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ-3'（배열번호20)

「G85R」

포워드 프라이머; 5'－ＣＧＴＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ-3'（배열번호21)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ-3'（배열번호22)

「H310K」

포워드 프라이머; 5'－ＡＡＡＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ-3'（배열번호23)

리버스 프라이머; 5'-ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ-3'（배열번호24)

「H310D」

포워드 프라이머; 5'－ＧＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ-3'（배열번호25)

리버스 프라이머; 5'－ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ-3'（배열번호26)

「H310Y」

포워드 프라이머; 5'－ＴＡＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ-3'（배열번호27)

리버스 프라이머; 5'－ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ-3'（배열번호28)

「H310R」

포워드 프라이머; 5'－ＣＧＴＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ-3'（배열번호29)

리버스 프라이머; 5'－ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ-3'（배열번호30)

「H310G」

포워드 프라이머; 5'－ＧＧＣＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡＧＴＣ-3'（배열번호31)

리버스 프라이머; 5'－ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ-3'（배열번호32)

「H310W」

포워드 프라이머; 5'－ＴＧＧＧＡＣＡＴＧＣＴＣＴＧＧＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＣＡ ＧＴＣ-3'（배열번호33)

리버스 프라이머; 5'－ＧＡＴＧＣＴＧＧＴＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＡＣＧＡＣＧＧＧＣＡ-3'（배열번호34)

계속하여 ＰＣＲ산물에 제한효소 ＤｐｎＩ를 가하여 37℃에서 1시간 소화한 후에, 아가로스 겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)에 제공해서 겔을 잘라내어, ＤＮＡ 단편을 정제하였다. 여기에, Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｈｉｇｈ ｖｅｒ．2(도요보사) 및 Ｔ4 Ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｋｉｎａｓｅ(도요보사)를 가하여 16℃에서 1시간 정치함으로써 ＤＮＡ 단편의 셀프 라이게이션(self ligation)을 하여, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ가 삽입된 재조합 벡터를 작성하였다. 「G85W」, 「G85F」, 「G85Y」, 「G85D」, 「G85E」, 「G85R」, 「H310K」, 「H310D」, 「H310Y」, 「H310R」, 「H310G」 및 「H310W」를 도입한 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ가 삽입된 재조합 벡터를, 각각 ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85F)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85E)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85R)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310R)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310G)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(H310W)재조합 벡터라고 하였다.

[2-2]2중 변이체

하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, 「G85W」 및 「H310K」를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 2중 변이체의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭하였다.

《개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형; 본 실시예2(2)[2-1]의 ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터

포워드 프라이머; ＴＧＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＧＴＧＣＣＡＣＣＡ-3'（배열번호11)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＣＧＴＧＡＡＧＧＡＡＧＣＣＧＡＣＧＴＧＧＡＡＧＡＧＧ-3'（배열번호12)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-ＮＥＯ(도요보사)

계속하여 본 실시예2(2)[2-1]에 기재되어 있는 방법에 의하여 ＰＣＲ산물의 정제 및 셀프 라이게이션을 하여, 2중 변이체의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ가 삽입된 재조합 벡터를 작성하고, 이것을 ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W/H310K)재조합 벡터라고 하였다.

(3)형질전환 및 형질전환체의 배양과 회수

본 실시예2(1)[1-2], (2)[2-1] 및 (2)[2-2]의 각 재조합 벡터를, Ｅ.ｃｏｌｉ ＪＭ109 컴피턴트 세포(competent cell)(일본진사(NIPPON GENE CO., LTD.))에 도입하고 재조합 대장균을 회수하였다. 계속하여 재조합 대장균으로부터 재조합 벡터를 회수하고, 이것을 Ｅ.ｃｏｌｉ ＢＬ21(ＤＥ3) 컴피턴트 세포(코스모바이오사(Cosmo Bio Co., Ltd.))에 도입하여, 형질전환체로서 재조합 대장균을 얻었다. 이것을 30℃로 밤새 플레이트 배양한 후에, 재조합 대장균의 콜로니(colony)를 픽업해서 Ｍ9 ＳＥＥＤ배지 0.5ｍＬ에 식균(植菌)하고, 30℃, 220ｒｐｍ으로 20시간 진탕배양하였다. 계속하여 이 중 5μL를 Ｍ9 Ｍａｉｎ배지 5ｍＬ에 이어 심고, 25℃, 220ｒｐｍ으로 24시간 진탕배양하여 배양물을 얻었다. Ｍ9 ＳＥＥＤ배지 및 Ｍ9 Ｍａｉｎ배지의 조성을 이하에 나타낸다.

Ｍ9 ＳＥＥＤ배지(계 100ｍＬ); 물 72ｍＬ, 5×Ｍ9염 20ｍＬ, 20% 카사미노산(casamino acid) 5ｍＬ, 20% D-글루코오스 2ｍＬ, 2mg/ｍＬ 티민 1ｍＬ, 50ｍＭ ＣａＣｌ₂ 0.2ｍＬ, 2.5Ｍ ＭｇＣｌ₂ 40μL, 100mg/ｍＬ FｅＳＯ₄ 28μL, 항생물질(종농도(終濃度) 50μg/ｍＬ 스트렙토마이신 황산염).

Ｍ9 Ｍａｉｎ배지(계 100ｍＬ); 물 67ｍＬ, 5×Ｍ9염 20ｍＬ, 20% 카사미노산 5ｍＬ, 2mg/ｍＬ 티민 1ｍＬ, 50ｍＭ ＣａＣｌ₂ 0.2ｍＬ, 100mg/ｍＬ FｅＳＯ₄ 28μL, Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ 1(Ｏ.Ｎ.Ｅ.; Ｍｅｒｃｋ사) Ｓｏｌ．1을 2ｍＬ, Ｏ.Ｎ.Ｅ. Ｓｏｌ．2를 5ｍＬ, Ｏ.Ｎ.Ｅ. Ｓｏｌ．3을 100μL, 항생물질(종농도 50μg/ｍＬ 스트렙토마이신 황산염).

<실시예3>개량형 β-프룩토프라노시다아제의 활성확인

(1)β-프룩토프라노시다아제의 효소반응

30(w/w）%의 수크로오스를 포함하는 0.04M의 인산나트륨 버퍼(ｐＨ7.0)를 조제하고, 이것을 30% 수크로오스 용액으로 하였다. 실시예2(3)의 재조합 대장균의 배양물 0.5ｍＬ를 원심분리에 제공해서 집균하고, 습중량(濕重量)(습균체(濕菌體)중량)을 측정하였다. 여기에, 30% 수크로오스 용액 350μL를 가하여 현탁한 후에, 30℃, 200ｒｐｍ으로 일정시간 진탕함으로써 β-프룩토프라노시다아제의 효소반응을 시켜, 이것을 반응액으로 하였다. 효소반응의 시간은 3, 9, 32 및 48시간으로 하였다.

(2)효소반응생성물의 확인

계속하여 반응액 50μL에 물 950μL를 가함으로써 희석하고, 100℃로 10분간 가열하였다. 이것을 4℃, 15000×g로 10분간 원심분리에 제공해서 상청을 회수한 후에, 0.45μm 구멍 필터로 여과하여, 얻어진 여과액을 ＨＰＬＣ샘플로 하였다. ＨＰＬＣ샘플을 실시예1(1)에 기재되어 있는 조건으로 ＨＰＬＣ에 제공하고, 반응액에 포함되는 각 당의 함유비율을 확인하였다. 또한 반응액에 포함되는 케스토오스 및 니스토오스의 양을, 효소반응개시시의 반응액에 포함되어 있는 수크로오스의 질량에 케스토오스 및 니스토오스의 각각의 함유비율을 곱해서 산출하고, 습균체중량으로 나눈 값으로 나타냈다. 그 결과를 표4에 나타낸다. 또 표4중에서 「-」은 검출한계 이하이었던 것을 나타낸다.

표4의 위에서부터 1단째에 나타나 있는 바와 같이, 효소반응이 3시간인 경우에 있어서, 습균체중량당의 케스토오스의 양은, ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액(컨트롤)에서는 0.92mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85F)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85E)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(G85R)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는 각각 9.62mg, 2.64mg, 1.80mg, 1.84mg, 3.43mg 및 2.76mg이었다. 또한 습균체중량당의 니스토오스의 양은, 컨트롤에서는 1.26mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85F)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85E)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(G85R)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는 각각 0.85mg, 0.23mg, 0.57mg, 0.29mg, 0.46mg 및 0.79mg이었다. 또한 니스토오스 함유비율은, 컨트롤에서는 29.64%이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85F)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85E)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(G85R)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는 각각 4.51%, 3.46%, 13.36%, 7.36%, 6.65% 및 12.78%이었다.

즉, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85F)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85E)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(G85R)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액의 어느 것에 있어서도, 컨트롤과 비교하여 케스토오스의 양 및 케스토오스 함유비율이 증가하고, 또한 니스토오스의 양 및 니스토오스 함유비율이 현저하게 감소하였다.

다음에 표4의 위에서부터 2단째에 나타나 있는 바와 같이, 효소반응이 9시간인 경우에 있어서, 습균체중량당의 케스토오스의 양은, 컨트롤에서는 2.59mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310R)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310G)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(H310W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 각각 5.50mg, 0.03mg, 7.35ｍｇ, 1.20mg, 0.26mg 및 0.42mg이었다. 또한 습균체중량당의 니스토오스의 양은, 컨트롤에서는 0.15mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310R)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310G)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(H310W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 각각 0.37mg, 검출한계 이하, 0.95mg, 0.01mg, 검출한계 이하 및 0.003mg이었다. 또한 니스토오스 함유비율은, 컨트롤에서는 1.23%이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310D)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310R)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310G)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(H310W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 각각 2.76%, 검출한계 이하, 4.96%, 0.11%, 검출한계 이하 및 0.02%이었다.

즉, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(H310R)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에 있어서, 컨트롤과 비교하여 케스토오스의 양 및 케스토오스 함유비율이 증가하고, 또한 케스토오스의 결정의 효율적 제조에 필요한 정도(5%이하)로 니스토오스 함유비율이 낮았다.

다음에 표4의 위에서부터 3단째에 나타나 있는 바와 같이, 효소반응이 48시간인 경우에 있어서, 습균체중량당의 케스토오스의 양은, 컨트롤에서는 1.99mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 3.86mg이었다. 또한 습균체중량당의 니스토오스의 양은, 컨트롤에서는 3.89mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 0.16mg이었다. 또한 니스토오스 함유비율은, 컨트롤에서는 31.50%이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 1.36%이었다.

즉, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310Y)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에 있어서, 컨트롤과 비교하여 케스토오스의 양 및 케스토오스 함유비율이 증가하고, 또한 니스토오스의 양 및 니스토오스 함유비율이 현저하게 감소하였다.

마지막으로, 표4의 최하단에 나타나 있는 바와 같이, 효소반응이 32시간인 경우에 있어서, 습균체중량당의 케스토오스의 양은, 컨트롤에서는 0.82mg, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 1.30mg, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 5.79mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W/H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 6.46mg이었다. 또한 습균체중량당의 니스토오스의 양은, 컨트롤에서는 1.08mg, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 1.29mg, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 1.92mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W/H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 0.40mg이었다. 또한 니스토오스 함유비율은, 컨트롤에서는 31.78%, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 25.14%, ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 15.38%이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W/H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에서는 3.43%이었다.

즉, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W/H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에 있어서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(H310K)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액 및 컨트롤과 비교하여 케스토오스의 양 및 케스토오스 함유비율이 증가하고, 또한 니스토오스의 양 및 니스토오스 함유비율이 현저하게 감소하였다. 이 결과로부터, Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 대하여, G85W와 H310K를 조합시킨 2중 변이를 도입함으로써, 각각의 1중 변이를 도입하였을 경우와 비교하여 니스토오스의 생성을 더 억제하면서 케스토오스를 효율적으로 생성할 수 있는 것이 밝혀졌다.

이상의 표4의 결과로부터, Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 대하여, N말단으로부터 85번째의 글리신(G)을 글리신(G) 이외의 단백질구성 아미노산으로 치환하는 아미노산 변이, 또는 N말단으로부터 310번째의 히스티딘(H)을 리신(K), 아르지닌(R) 혹은 티로신(Y)으로 치환하는 아미노산 변이를 도입함으로써, 니스토오스의 생성을 억제하면서 케스토오스를 효율적으로 생성할 수 있는 것이 밝혀졌다.

<실시예4>Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 상동의 β-프룩토프라노시다아제에 있어서의 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 작성과 활성확인

(1)개량형 β-프룩토프라노시다아제의 작성

[1-1]얼라인먼트

Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 68%의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제로서 하기 (가)를, Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제와 60%의 동일성을 구비하는 아미노산 배열로 이루어지는 β-프룩토프라노시다아제로서 하기 (나)를, 각각 추출하였다.

(가)68%의 동일성: Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ ＲＩＢ40(이하, 「Ａ．ｏｒｙｚａｅ」라고 약기한다)의 β-프룩토프라노시다아제(ＸＰ_003190558)

(나)60%의 동일성: Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｅｒｒｅｕｓ ＮＩＨ2624(이하, 「Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ」라고 약기한다)의 β-프룩토프라노시다아제(ＸＰ_001214174)

다음에 Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열(배열번호2)에 대해서, (가) 및 (나)에 대하여 ＣｌｕｓｔａｌＷ법 (ｈｔｔｐ:/:/ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ．ｊｐ/ｔｏｏｌｓ/ｃｌｕｓｔａｌｗ/)으로 얼라인먼트를 하였다. 그 결과, Ａ．ｋａｗａｃｈｉｉ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 있어서의 N말단으로부터 85번째의 글리신(G)은, (가) 및 (나)에서는 N말단으로부터 78번째의 글리신(G)에 상당하는 것이 밝혀졌다.

그래서 Ａ．ｏｒｙｚａｅ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열에 대하여, N말단으로부터 78번째의 글리신(G)을 트립토판(W)으로 치환하는 아미노산 변이(이하, 「G78W」라고 약기한다)를 도입한 아미노산 배열로 이루어지는 1중 변이체의 β-프룩토프라노시다아제를 작성하고, 이들을 개량형 β-프룩토프라노시다아제라고 하였다. 구체적인 순서를 이하의 본 실시예3(1)[1-2] 및 [1-3]에 나타낸다.

[1-2]야생형 β-프룩토프라노시다아제 유전자의 취득

Ａ．ｏｒｙｚａｅ 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ의 게놈ＤＮＡ를 각각 주형으로 하여 하기의 조건에 의하여 ＰＣＲ을 하고, Ａ．ｏｒｙｚａｅ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭하였다. 또 주형에 있어서, β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 영역에 인트론(intron)이 존재하고 있어, 이것을 제외하기 위해서 ＰＣＲ은 2회에 나누어 하였다. 이 ＰＣＲ에 의하여 얻어진 ＰＣＲ산물을, 각각 Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-1, 2 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-1, 2라고 하였다.

또한 보통의 방법에 따라 시퀀싱을 하여 전장의 염기배열을 확인하였다. Ａ．ｏｒｙｚａｅ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 염기배열을 배열번호35에, 그것에 코드되는 Ａ．ｏｒｙｚａｅ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 배열번호36에, Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ의 염기배열을 배열번호37에, 그것에 코드되는 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 배열번호38에, 각각 나타낸다.

《Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-1을 증폭하는 ＰＣＲ의 조건》

포워드 프라이머; 5'－ＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＧＣＴＣＴＣＡＡＣＣＧＣＧＡＧＴＧＣＣT-3'（배열번호39)

리버스 프라이머; 5'－ＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＴＡＣＴＣＡＧＧＧＣＡＡＡＡＣＧＴＣＣ-3'（배열번호40)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

《Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-2를 증폭하는 ＰＣＲ의 조건》

포워드 프라이머; 5'－ＡＧＴＡＣＴＴＧＧＧＣＴＣＧＧＴＣＣＴＧＧＴＡＣＡＡＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧ-3'（배열번호41)

리버스 프라이머; 5'－ＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣA-3'（배열번호42)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-1을 증폭하는 ＰＣＲ의 조건》

포워드 프라이머; 5'－ＡＣＡＴＣＡＣＡＧＡＴＡＡＣＡＴＡＴＧＡＡＡＴＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＡＣＧＧＡＴＧG-3'（배열번호43)

리버스 프라이머; 5'－ＣＧＡＡＣＣＣＡＡＧＴＡＧＡＧＡＧＣＧＣＡＡＡＴＣＧＣＧＡＡ-3'（배열번호44)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-Ｎｅｏ(도요보사)

《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-2를 증폭하는 ＰＣＲ의 조건》

포워드 프라이머; 5'－ＣＴＣＴＡＣＴＴＧＧＧＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＧＴＡＣＡＧＴＴＡＴＴＣＧＡＡＴＧＡＧＡＴＴＡＧ-3'（배열번호45)

리버스 프라이머; 5'－ＧＡＧＣＡＡＧＣＴＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＴＣＧＣＧＣＴＣＧＧＧＧＴＡＡＧＣA-3'（배열번호46)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ-Ｎｅｏ(도요보사)

계속하여 Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-1 및 2, 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-1 및 2를, Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ(다카라바이오사)를 사용하여 각각 연결하고, 전자를 Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-3이라고 하고, 후자를 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-3이라고 하였다. 다음에 시그널 배열을 제거하도록 프라이머를 설계하고 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, Ａ．ｏｒｙｚａｅ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 유래 야생형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 증폭하고, 얻어진 ＰＣＲ산물을 각각 Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-4 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-4라고 하였다.

《Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-4를 증폭하는 ＰＣＲ의 조건》

주형; Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-3

포워드 프라이머; 5'－ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＴＣＧＡＴＴＡＣＡＡＣＧ-3'（배열번호47)

리버스 프라이머; 5'－ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＡＣＡＣＧＣＴＣＡＧＧＣＣＡ-3'（배열번호48)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-4를 증폭하는 ＰＣＲ의 조건》

주형; Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-3

포워드 프라이머; 5'－ＡＡＡＴＣＴＡＡＡＡＧＡＴＣＣＧＣＡＧＣＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＴ-3'（배열번호49)

리버스 프라이머; 5'－ＴＴＴＡＣＣＡＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＣＴＣＴＣＧＣＧＣＴＣＧＧＧ-3'（배열번호50)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

다음에 하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, ＰｇｓＡ 앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 ｐＣＤＦ플라스미드의 ＤＮＡ를 증폭하여, 얻어진 ＰＣＲ산물을 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편이라고 하였다.

《ＰｇｓＡ 앵커 단백질을 코드하는 ＤＮＡ를 삽입한 ｐＣＤＦ플라스미드의 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형; 실시예2(1)[1-1]의 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ 재조합 벡터

포워드 프라이머; 5'－ＣＴＣＧＡＧＴＣＴＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＡＡ-3'（배열번호51)

리버스 프라이머; 5'－ＧＧＡＴＣＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＴＡＧＴＴＴＧＴＣＡＣＴＡＴＧＡＴＣＡＡ-3'（배열번호52)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

계속하여 Ａ．ｏｒｙｚａｅ 야생형 ＤＮＡ 단편-4와 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편, 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 야생형 ＤＮＡ 단편-4와 ｐＣＤＦ-ＰｇｓＡ-ＤＮＡ 단편을, Ｉｎ-Ｆｕｓｉｏｎ ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ(다카라바이오사)를 사용하여 각각 연결함으로써 재조합 벡터를 얻고, 전자를 ｏｒｙｚａｅ(야생형)재조합 벡터라고 하고, 후자를 ｔｅｒｒｅｕｓ(야생형)재조합 벡터라고 하였다.

[1-3]개량형 β-프룩토프라노시다아제 유전자의 작성

하기의 조건으로 ＰＣＲ을 함으로써, 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ를 포함한 ＤＮＡ 단편을 증폭하였다.

《Ａ．ｏｒｙｚａｅ 유래의 개량형 β－프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형； 본 실시예４(1)[1-2]의 ｏｒｙｚａｅ（야생형）재조합 벡터

포워드 프라이머； ５'－ＴＧＧＡＧＴＧＧＴＡＴＣＧＣＡＧＧＣＧＣＴＡＣ－３'（배렬번호53）

리버스 프라이버； ５'－ＡＴＴＧＴＡＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＣ－３'（배렬번호54）

ＰＣＲ용 효소； ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（도요보사）

《Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 유래의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 증폭용 ＰＣＲ의 조건》

주형; 본 실시예4(1)[1-2]의 ｔｅｒｒｅｕｓ(야생형)재조합 벡터

포워드 프라이머; 5'－ＴＧＧＡＣＴＧＧＧＡＴＴＴＣＧＧＣＴＧＴＣ-3'（배열번호55)

리버스 프라이머; 5'－ＡＴＴＧＴＧＴＡＧＧＡＡＣＣＣＧＡＣＡＴＧ-3'（배열번호56)

ＰＣＲ용 효소; ＫＯＤ-Ｐｌｕｓ- (도요보사)

계속하여 실시예2(2)[2-1]에 기재되어 있는 방법에 의하여 ＤＮＡ 단편의 정제 및 셀프 라이게이션을 하여, Ａ．ｏｒｙｚａｅ 유래의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ 및 Ａ．ｔｅｒｒｅｕｓ 유래의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ가 각각 삽입된 재조합 벡터를 작성하고, 전자를 ｏｒｙｚａｅ(G78W)재조합 벡터, 후자를 ｔｅｒｒｅｕｓ(G78W)재조합 벡터라고 하였다.

[1-4]형질전환 및 형질전환체의 배양과 회수

본 실시예4(1)[1-2] 및 [1-3]의 각 재조합 벡터에 대해서, 실시예2(3)에 기재되어 있는 방법에 따라 형질전환 및 형질전환체의 배양과 회수를 하여, 재조합 대장균을 얻었다.

(2)활성확인

본 실시예4(1)[1-4]의 재조합 대장균을 사용하여 실시예3(1) 및 (2)에 기재되어 있는 방법에 의하여 β-프룩토프라노시다아제의 효소반응 및 효소반응생성물의 확인을 하였다. 단, 효소반응의 시간은 3시간으로 하였다. 그 결과를 표5에 나타낸다. 또 표5에는, 비교를 위하여, 표4에 나타내는 결과 중에서 ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터 및 ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균에 있어서의 결과를 함께 나타낸다. 표5중에서, 「-」은 검출한계 이하이었던 것을 나타낸다.

표5에 나타나 있는 바와 같이, 습균체중량당의 케스토오스의 양은, ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터, ｏｒｙｚａｅ(야생형)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(야생형)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, 각각 0.92mg, 0.87mg 및 0.99mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｏｒｙｚａｅ(G78W)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(G78W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, 각각 9.62mg, 2.84mg 및 2.96mg이었다. 또한 습균체중량당의 니스토오스의 양은, ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터, ｏｒｙｚａｅ(야생형)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(야생형)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, 각각 1.26mg, 1.66mg 및 1.17mg이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｏｒｙｚａｅ(G78W)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(G78W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, 각각 0.85mg, 1.56mg 및 1.62mg이었다. 또한 니스토오스 함유비율은, ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터, ｏｒｙｚａｅ(야생형)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(야생형)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, 각각 29.64%, 31.68% 및 15.42%이었던 것에 대해서, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터, ｏｒｙｚａｅ(G78W)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(G78W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, 각각 4.51%, 20.86% 및 16.91%이었다.

즉, ｋａｗａｃｈｉｉ(G85W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, ｋａｗａｃｈｉｉ(야생형)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액과 비교하여, 케스토오스의 양이 증가하고 니스토오스의 양이 감소하고 또한 니스토오스 함유비율이 현저하게 감소한 것에 대해서, ｏｒｙｚａｅ(G78W)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(G78W)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액에서는, ｏｒｙｚａｅ(야생형)재조합 벡터 및 ｔｅｒｒｅｕｓ(야생형)재조합 벡터를 도입한 재조합 대장균의 반응액과 비교하여, 케스토오스의 양이 증가했지만 니스토오스의 양 및 니스토오스 함유비율의 현저한 감소는 확인되지 않고, 특히 니스토오스 함유비율은 케스토오스의 결정의 효율적 제조에 필요한 정도(5%이하)보다도 높은 값이 되었다.

이 결과로부터, 니스토오스의 생성을 억제하면서 케스토오스를 효율적으로 생성할 수 있는 β-프룩토프라노시다아제를 얻기 위해서는, Ａ．Ｋａｗａｃｈｉｉ 유래의 야생형 β-프룩토프라노시다아제(배열번호2)에 대하여 아미노산 변이를 도입할 필요가 있는 것이 밝혀졌다.

<110> B Food Science Co., Ltd. MicroBiopharm Japan Co., Ltd. <120> Improved beta-fructofuranosidase <130> PCT0679 <150> JP2015-48789 <151> 2015-03-11 <160> 56 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1887 <212> DNA <213> Aspergillus kawachii <400> 1 atgaagcttc aaacggcttc cgtactgctc ggcagtgctg ctgctgcctc tccttcaatg 60 cagacgcggg cctccgtggt catcgactac aatgtcgctc ctccaaacct ctccaccctg 120 cccaatggct ccctcttcga aacatggcgg ccccgcgccc acgtcctgcc cccaaacggc 180 cagatcggtg atccctgcct gcattacacc gatcccgcca cgggcctctt ccacgtcggc 240 ttccttcacg atggcagcgg catctccagt gccaccaccg atgacctagc cacctaccaa 300 gacctcaacc aaggcaacca agtcattgtc cctgggggca tcaacgaccc cgtcgctgtc 360 ttcgacggct ccgtcatccc caacggcatc aacggcctcc ccaccctcct ctacacctcc 420 gtctcctacc tccccatcca ctggtcgatc ccctacaccc gcggcagtga gactcaatcc 480 ctcgccgtct cctccgacgg cggcagcaac ttcaccaagc tcgaccaggg ccccgtcatc 540 cctggccctc ccttcgccta caacgtcacc gcattccggg acccctacgt cttccaaaac 600 cccactcttg actccctcct ccacagcaag aacaacacct ggtacaccgt catctccggt 660 ggtctgcacg aaaagggccc cgctcaattc ctctaccgcc agtacgactc ggactttcag 720 tactgggagt acctcggcca atggtggcac gaacccacca actccacctg gggtaacggc 780 acctgggccg gccgctgggc cttcaacttt gagaccggca acgtcttcag tctcgacgag 840 tacggataca acccccacgg ccagatcttc accaccatcg gcactgaggg ctctgacctg 900 cccgtcgtgc cccagctcac cagcatccac gacatgctct gggtgtccgg tacagtctct 960 cgcaatggct ctgtctcgtt caaccccaac atggcgggct tcctcgactg gggcttctcc 1020 tcttacgctg ctgccggaaa ggttctcccc tcgacttctc tgccttccac gaagagcggc 1080 gccccggatc gcttcatctc ctacgtctgg ctgtccggtg acctgttcga acaggccgaa 1140 gggttcccca cgaaccagca gaattggacc ggtacgctgc tgcttccgcg tgagttgcgc 1200 gtgctgtata tccccaatgt ggtggacaat gctctggccc gggagtctgg tgcctcgtgg 1260 caggtcgtga gcagcgatgg cagtgcgggc accgtcgagc tgcagacgct gggtatctcc 1320 attgcccggg agaccaaggc cgcgttgctg tcgggaacgt cgttcactga gtccggccgc 1380 accctgaaca gcagtggtgt tgttccgttc aagcgctcgc catccgagaa gttcttcgtt 1440 ctgtccgcac agctgtcctt ccctgcttcg gctaggggat cgggacttaa gagtgggttc 1500 cagatcctct catcggagca cgagagtacc actgtgtact accagttctc gaatgagtcg 1560 attatcgtgg atcgtagcaa cactagtgct gcggcgcgca cgactgatgg tatcgatagc 1620 agtgcggaag ctggcaagtt gcgtctgttt gacgtgctga atggcggcga gcaggccatt 1680 gagacgctag atttgactct cgtggtggat aactccgtgt tggaggtgta tgccaatggt 1740 cggtttgcgt tgagtacctg ggttcgttcc tggtacgcca actccactaa catcagcttc 1800 ttccataatg gcgtgggtgg tgttgcgttc tccaaagtga ctgtgtccga gggcttgtat 1860 gatgcttggc cggatcgtca gtattga 1887 <210> 2 <211> 628 <212> PRT <213> Aspergillus kawachii <400> 2 Met Lys Leu Gln Thr Ala Ser Val Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ser Pro Ser Met Gln Thr Arg Ala Ser Val Val Ile Asp Tyr Asn Val 20 25 30 Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Glu Thr 35 40 45 Trp Arg Pro Arg Ala His Val Leu Pro Pro Asn Gly Gln Ile Gly Asp 50 55 60 Pro Cys Leu His Tyr Thr Asp Pro Ala Thr Gly Leu Phe His Val Gly 65 70 75 80 Phe Leu His Asp Gly Ser Gly Ile Ser Ser Ala Thr Thr Asp Asp Leu 85 90 95 Ala Thr Tyr Gln Asp Leu Asn Gln Gly Asn Gln Val Ile Val Pro Gly 100 105 110 Gly Ile Asn Asp Pro Val Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Asn 115 120 125 Gly Ile Asn Gly Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Tyr Leu 130 135 140 Pro Ile His Trp Ser Ile Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser 145 150 155 160 Leu Ala Val Ser Ser Asp Gly Gly Ser Asn Phe Thr Lys Leu Asp Gln 165 170 175 Gly Pro Val Ile Pro Gly Pro Pro Phe Ala Tyr Asn Val Thr Ala Phe 180 185 190 Arg Asp Pro Tyr Val Phe Gln Asn Pro Thr Leu Asp Ser Leu Leu His 195 200 205 Ser Lys Asn Asn Thr Trp Tyr Thr Val Ile Ser Gly Gly Leu His Glu 210 215 220 Lys Gly Pro Ala Gln Phe Leu Tyr Arg Gln Tyr Asp Ser Asp Phe Gln 225 230 235 240 Tyr Trp Glu Tyr Leu Gly Gln Trp Trp His Glu Pro Thr Asn Ser Thr 245 250 255 Trp Gly Asn Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Ala Phe Asn Phe Glu Thr 260 265 270 Gly Asn Val Phe Ser Leu Asp Glu Tyr Gly Tyr Asn Pro His Gly Gln 275 280 285 Ile Phe Thr Thr Ile Gly Thr Glu Gly Ser Asp Leu Pro Val Val Pro 290 295 300 Gln Leu Thr Ser Ile His Asp Met Leu Trp Val Ser Gly Thr Val Ser 305 310 315 320 Arg Asn Gly Ser Val Ser Phe Asn Pro Asn Met Ala Gly Phe Leu Asp 325 330 335 Trp Gly Phe Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ser Thr 340 345 350 Ser Leu Pro Ser Thr Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Tyr 355 360 365 Val Trp Leu Ser Gly Asp Leu Phe Glu Gln Ala Glu Gly Phe Pro Thr 370 375 380 Asn Gln Gln Asn Trp Thr Gly Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Arg 385 390 395 400 Val Leu Tyr Ile Pro Asn Val Val Asp Asn Ala Leu Ala Arg Glu Ser 405 410 415 Gly Ala Ser Trp Gln Val Val Ser Ser Asp Gly Ser Ala Gly Thr Val 420 425 430 Glu Leu Gln Thr Leu Gly Ile Ser Ile Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala 435 440 445 Leu Leu Ser Gly Thr Ser Phe Thr Glu Ser Gly Arg Thr Leu Asn Ser 450 455 460 Ser Gly Val Val Pro Phe Lys Arg Ser Pro Ser Glu Lys Phe Phe Val 465 470 475 480 Leu Ser Ala Gln Leu Ser Phe Pro Ala Ser Ala Arg Gly Ser Gly Leu 485 490 495 Lys Ser Gly Phe Gln Ile Leu Ser Ser Glu His Glu Ser Thr Thr Val 500 505 510 Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu Ser Ile Ile Val Asp Arg Ser Asn Thr 515 520 525 Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Asp Gly Ile Asp Ser Ser Ala Glu Ala 530 535 540 Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val Leu Asn Gly Gly Glu Gln Ala Ile 545 550 555 560 Glu Thr Leu Asp Leu Thr Leu Val Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Val 565 570 575 Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg Ser Trp Tyr 580 585 590 Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ser Phe Phe His Asn Gly Val Gly Gly Val 595 600 605 Ala Phe Ser Lys Val Thr Val Ser Glu Gly Leu Tyr Asp Ala Trp Pro 610 615 620 Asp Arg Gln Tyr 625 <210> 3 <211> 1143 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 3 atgaaaaaag aactgagctt tcatgaaaag ctgctaaagc tgacaaaaca gcaaaaaaag 60 aaaaccaata agcacgtatt tattgccatt ccgatcgttt ttgtccttat gttcgctttc 120 atgtgggcgg gaaaagcgga aacgccgaag gtcaaaacgt attctgacga cgtactctca 180 gcctcatttg taggcgatat tatgatggga cgctatgttg aaaaagtaac ggagcaaaaa 240 ggggcagaca gtatttttca atatgttgaa ccgatcttta gagcctcgga ttatgtagca 300 ggaaactttg aaaacccggt aacctatcaa aagaattata aacaagcaga taaagagatt 360 catctgcaga cgaataagga atcagtgaaa gtcttgaagg atatgaattt cacggttctc 420 aacagcgcca acaaccacgc aatggattac ggcgttcagg gcatgaaaga tacgcttgga 480 gaatttgcga agcaaaatct tgatatcgtt ggagcgggat acagcttaag tgatgcgaaa 540 aagaaaattt cgtaccagaa agtcaacggg gtaacgattg cgacgcttgg ctttaccgat 600 gtgtccggga aaggtttcgc ggctaaaaag aatacgccgg gcgtgctgcc cgcagatcct 660 gaaatcttca tccctatgat ttcagaagcg aaaaaacatg cggacattgt tgttgtgcag 720 tcacactggg gacaagagta tgacaatgat ccaaatgacc gccagcgcca gcttgcaaga 780 gccatgtctg atgcgggagc tgacatcatc gtcggccatc acccgcacgt cttagaaccg 840 attgaagtat ataacggaac cgtcattttc tacagcctcg gcaactttgt ctttgaccaa 900 ggctggacga gaacaagaga cagtgcactg gttcagtatc acctgaagaa aaatggaaca 960 ggacgctttg aagtgacacc gatcgatatc catgaagcga cacctgcgcc tgtgaaaaaa 1020 gacagcctta aacagaaaac cattattcgc gaactgacga aagactctaa tttcgcttgg 1080 aaagtagaag acggaaaact gacgtttgat attgatcata gtgacaaact aaaatctaaa 1140 taa 1143 <210> 4 <211> 380 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 4 Met Lys Lys Glu Leu Ser Phe His Glu Lys Leu Leu Lys Leu Thr Lys 1 5 10 15 Gln Gln Lys Lys Lys Thr Asn Lys His Val Phe Ile Ala Ile Pro Ile 20 25 30 Val Phe Val Leu Met Phe Ala Phe Met Trp Ala Gly Lys Ala Glu Thr 35 40 45 Pro Lys Val Lys Thr Tyr Ser Asp Asp Val Leu Ser Ala Ser Phe Val 50 55 60 Gly Asp Ile Met Met Gly Arg Tyr Val Glu Lys Val Thr Glu Gln Lys 65 70 75 80 Gly Ala Asp Ser Ile Phe Gln Tyr Val Glu Pro Ile Phe Arg Ala Ser 85 90 95 Asp Tyr Val Ala Gly Asn Phe Glu Asn Pro Val Thr Tyr Gln Lys Asn 100 105 110 Tyr Lys Gln Ala Asp Lys Glu Ile His Leu Gln Thr Asn Lys Glu Ser 115 120 125 Val Lys Val Leu Lys Asp Met Asn Phe Thr Val Leu Asn Ser Ala Asn 130 135 140 Asn His Ala Met Asp Tyr Gly Val Gln Gly Met Lys Asp Thr Leu Gly 145 150 155 160 Glu Phe Ala Lys Gln Asn Leu Asp Ile Val Gly Ala Gly Tyr Ser Leu 165 170 175 Ser Asp Ala Lys Lys Lys Ile Ser Tyr Gln Lys Val Asn Gly Val Thr 180 185 190 Ile Ala Thr Leu Gly Phe Thr Asp Val Ser Gly Lys Gly Phe Ala Ala 195 200 205 Lys Lys Asn Thr Pro Gly Val Leu Pro Ala Asp Pro Glu Ile Phe Ile 210 215 220 Pro Met Ile Ser Glu Ala Lys Lys His Ala Asp Ile Val Val Val Gln 225 230 235 240 Ser His Trp Gly Gln Glu Tyr Asp Asn Asp Pro Asn Asp Arg Gln Arg 245 250 255 Gln Leu Ala Arg Ala Met Ser Asp Ala Gly Ala Asp Ile Ile Val Gly 260 265 270 His His Pro His Val Leu Glu Pro Ile Glu Val Tyr Asn Gly Thr Val 275 280 285 Ile Phe Tyr Ser Leu Gly Asn Phe Val Phe Asp Gln Gly Trp Thr Arg 290 295 300 Thr Arg Asp Ser Ala Leu Val Gln Tyr His Leu Lys Lys Asn Gly Thr 305 310 315 320 Gly Arg Phe Glu Val Thr Pro Ile Asp Ile His Glu Ala Thr Pro Ala 325 330 335 Pro Val Lys Lys Asp Ser Leu Lys Gln Lys Thr Ile Ile Arg Glu Leu 340 345 350 Thr Lys Asp Ser Asn Phe Ala Trp Lys Val Glu Asp Gly Lys Leu Thr 355 360 365 Phe Asp Ile Asp His Ser Asp Lys Leu Lys Ser Lys 370 375 380 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 aaacatatga aaaaagaact gagctttcat g 31 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 aaaagatctt ttagatttta gtttgtcact atg 33 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 7 aaatctaaaa gatcctccgt ggtcatcgac tac 33 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 8 tttaccagac tcgagtcaat actgacgatc cggc 34 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 9 ctcgagtctg gtaaagaaac cgctgctgcg aaa 33 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 10 ggatctttta gattttagtt tgtcactatg atcaa 35 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 11 tggagcggca tctccagtgc cacca 25 <210> 12 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 12 atcgtgaagg aagccgacgt ggaagagg 28 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 13 ttcagcggca tctccagtgc cacca 25 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 14 atcgtgaagg aagccgacgt ggaagagg 28 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 15 tatagcggca tctccagtgc cacca 25 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 16 atcgtgaagg aagccgacgt ggaagagg 28 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 17 gatagcggca tctccagtgc cacca 25 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 18 atcgtgaagg aagccgacgt ggaagagg 28 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 19 gaaagcggca tctccagtgc cacca 25 <210> 20 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 20 atcgtgaagg aagccgacgt ggaagagg 28 <210> 21 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 21 cgtagcggca tctccagtgc cacca 25 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 22 atcgtgaagg aagccgacgt ggaagagg 28 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 23 aaagacatgc tctgggtgtc cggtacagtc 30 <210> 24 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 24 gatgctggtg agctggggca cgacgggca 29 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 25 gatgacatgc tctgggtgtc cggtacagtc 30 <210> 26 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 26 gatgctggtg agctggggca cgacgggca 29 <210> 27 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 27 tatgacatgc tctgggtgtc cggtacagtc 30 <210> 28 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 28 gatgctggtg agctggggca cgacgggca 29 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 29 cgtgacatgc tctgggtgtc cggtacagtc 30 <210> 30 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 30 gatgctggtg agctggggca cgacgggca 29 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 31 ggcgacatgc tctgggtgtc cggtacagtc 30 <210> 32 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 32 gatgctggtg agctggggca cgacgggca 29 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 33 tgggacatgc tctgggtgtc cggtacagtc 30 <210> 34 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 34 gatgctggtg agctggggca cgacgggca 29 <210> 35 <211> 1860 <212> DNA <213> Aspergillus oryzae <400> 35 atgaagctct caaccgcgag tgccttggtc accagccagg cggcctacgc tgcctccgcc 60 atcgattaca acgcagctcc cccaaacctt tcgactttgg ccaatggctc tctgtatgac 120 acgtggagac ctagagctca tatcctccca ccaaacggcc gaattggcga cccgtgtggt 180 cattacactg atcctgacac cggtttgttc cacgttggct tcctgtacaa tggcagtggt 240 atcgcaggcg ctacgaccga tgatatggtc agattccgtg atctgaatcc caacggaagt 300 caattcatca tgcctggtgg caagaatgat cctgtagcgg tctttgatgg ctctgtaatc 360 cctaagggaa ttgacggcaa gcccacccta ctctacacct ccgtcacatc actccctatc 420 cattggtcaa tcccctacaa cccaggagcc gaaacgcaat ccttggccgt cacatccaac 480 ggcggtcgca attttaccaa gctcgatcgt ccaccggtca ttcccctccc tccgtccgac 540 agcgatgtga ccgctttccg tgacccctac gctttccaaa gcccggagct ggacgctgcc 600 gcggacagcg ccccgggtac ctggtacaca gccatctctg gtggtgtcca cgaagatggc 660 cctggtcagt tcctctatcg tcaggaccag aaggaaatga gcctcgagag ctgggagtat 720 cttggcttgt ggtggcagga gaaggtcaac acgacctggg gtaacggcga ctgggcagga 780 ggatggggct tcaacttcga gaccggtaac gtcttcggtc tgaacgagga agggtacagc 840 gtcgatggtg agatgttcat gaccttgggt actgagggat ccggaactcc tattgtgtcc 900 caggtgtcat ccattcacga tatgctgtgg gctgctggca acgtctctaa caacggaaat 960 gtcactttca ccccaactat ggccggtgtc ttcgactggg gtgcttctgg ctatgctgcc 1020 gctggtcata ttctgcccgc aacttctcag gtgtccacaa agagtggcgc ccccgaccgt 1080 ttcatctcgt ttgtctggtt gaccggagac ttgttcgagc aggccaaggg ttaccccact 1140 tcgcaacaaa actgggttgg cacccttctg cttcctcgcg agctgcacat caagaccatc 1200 tcaaacgtgg ttgataatga gcttgcccgg gaagagggat catcttggcg cgtagagcgt 1260 ggccagtctg gcattgagct gaagaccctg ggaattgata ttgctcggga gacgcgtgaa 1320 gctctcatgt ctgggccgaa gatcactgag cccgagcgca catcgaagga ggctggcctc 1380 gtgcctttcc aggtctcccc gaccaccaag ttccacgtcc tgaccgccca gctgtctttc 1440 cctcgctctg cccgtaattc tgatctccag gccggattcc aagtgctgtc gtctgacctc 1500 gaaagcacca ctatctacta ccagttctcc aatgagtcaa tcatcgtcga ccgcagcaac 1560 accagtgctg ccgcgaagac caccaatgga atcgtcagca ccaatgagtc tggacgtctc 1620 cggttgttcg atttgcaggg cgatgcccag gaaattgaga ctctggacct cacggtcgtt 1680 gtggataact ctgtcctcga gatctatgcc aatggacgtt ttgccctgag tacttgggct 1740 cggtcctggt acaagaactc gactgacatc aagttcttcc acaacggtgc gggtgaagtg 1800 acattcagca atgttactgt ctccgagggc ctgtttgaag cctggcctga gcgtgtctaa 1860 1860 <210> 36 <211> 619 <212> PRT <213> Aspergillus oryzae <400> 36 Met Lys Leu Ser Thr Ala Ser Ala Leu Val Thr Ser Gln Ala Ala Tyr 1 5 10 15 Ala Ala Ser Ala Ile Asp Tyr Asn Ala Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr 20 25 30 Leu Ala Asn Gly Ser Leu Tyr Asp Thr Trp Arg Pro Arg Ala His Ile 35 40 45 Leu Pro Pro Asn Gly Arg Ile Gly Asp Pro Cys Gly His Tyr Thr Asp 50 55 60 Pro Asp Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu Tyr Asn Gly Ser Gly 65 70 75 80 Ile Ala Gly Ala Thr Thr Asp Asp Met Val Arg Phe Arg Asp Leu Asn 85 90 95 Pro Asn Gly Ser Gln Phe Ile Met Pro Gly Gly Lys Asn Asp Pro Val 100 105 110 Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Lys Gly Ile Asp Gly Lys Pro 115 120 125 Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Thr Ser Leu Pro Ile His Trp Ser Ile 130 135 140 Pro Tyr Asn Pro Gly Ala Glu Thr Gln Ser Leu Ala Val Thr Ser Asn 145 150 155 160 Gly Gly Arg Asn Phe Thr Lys Leu Asp Arg Pro Pro Val Ile Pro Leu 165 170 175 Pro Pro Ser Asp Ser Asp Val Thr Ala Phe Arg Asp Pro Tyr Ala Phe 180 185 190 Gln Ser Pro Glu Leu Asp Ala Ala Ala Asp Ser Ala Pro Gly Thr Trp 195 200 205 Tyr Thr Ala Ile Ser Gly Gly Val His Glu Asp Gly Pro Gly Gln Phe 210 215 220 Leu Tyr Arg Gln Asp Gln Lys Glu Met Ser Leu Glu Ser Trp Glu Tyr 225 230 235 240 Leu Gly Leu Trp Trp Gln Glu Lys Val Asn Thr Thr Trp Gly Asn Gly 245 250 255 Asp Trp Ala Gly Gly Trp Gly Phe Asn Phe Glu Thr Gly Asn Val Phe 260 265 270 Gly Leu Asn Glu Glu Gly Tyr Ser Val Asp Gly Glu Met Phe Met Thr 275 280 285 Leu Gly Thr Glu Gly Ser Gly Thr Pro Ile Val Ser Gln Val Ser Ser 290 295 300 Ile His Asp Met Leu Trp Ala Ala Gly Asn Val Ser Asn Asn Gly Asn 305 310 315 320 Val Thr Phe Thr Pro Thr Met Ala Gly Val Phe Asp Trp Gly Ala Ser 325 330 335 Gly Tyr Ala Ala Ala Gly His Ile Leu Pro Ala Thr Ser Gln Val Ser 340 345 350 Thr Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Phe Val Trp Leu Thr 355 360 365 Gly Asp Leu Phe Glu Gln Ala Lys Gly Tyr Pro Thr Ser Gln Gln Asn 370 375 380 Trp Val Gly Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu His Ile Lys Thr Ile 385 390 395 400 Ser Asn Val Val Asp Asn Glu Leu Ala Arg Glu Glu Gly Ser Ser Trp 405 410 415 Arg Val Glu Arg Gly Gln Ser Gly Ile Glu Leu Lys Thr Leu Gly Ile 420 425 430 Asp Ile Ala Arg Glu Thr Arg Glu Ala Leu Met Ser Gly Pro Lys Ile 435 440 445 Thr Glu Pro Glu Arg Thr Ser Lys Glu Ala Gly Leu Val Pro Phe Gln 450 455 460 Val Ser Pro Thr Thr Lys Phe His Val Leu Thr Ala Gln Leu Ser Phe 465 470 475 480 Pro Arg Ser Ala Arg Asn Ser Asp Leu Gln Ala Gly Phe Gln Val Leu 485 490 495 Ser Ser Asp Leu Glu Ser Thr Thr Ile Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu 500 505 510 Ser Ile Ile Val Asp Arg Ser Asn Thr Ser Ala Ala Ala Lys Thr Thr 515 520 525 Asn Gly Ile Val Ser Thr Asn Glu Ser Gly Arg Leu Arg Leu Phe Asp 530 535 540 Leu Gln Gly Asp Ala Gln Glu Ile Glu Thr Leu Asp Leu Thr Val Val 545 550 555 560 Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Ile Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu 565 570 575 Ser Thr Trp Ala Arg Ser Trp Tyr Lys Asn Ser Thr Asp Ile Lys Phe 580 585 590 Phe His Asn Gly Ala Gly Glu Val Thr Phe Ser Asn Val Thr Val Ser 595 600 605 Glu Gly Leu Phe Glu Ala Trp Pro Glu Arg Val 610 615 <210> 37 <211> 1929 <212> DNA <213> Aspergillus terreus <400> 37 atgaaatcct cagtgacacg gatgggctta gtcgccagtc tggtggccag cgccgcagcg 60 caggactaca atgagccacc accagacctg tccaccctcc ccagcggctc actgtttgag 120 acctggaggc ccaaaatcca tgtcctccca ccggctggac agattggcga tccttgtgca 180 catttccctg atcctgaaac cggcctgttt catgtcgggt tcctacacaa tggaactggg 240 atttcggctg tccagacggc cgacctggtt tactattacg atgtgaaccc gggaggtggc 300 tacaccatcg ttgctggggg tgccaatgac cccgtggcag tttttgatgg ctcggttatt 360 ccaattggcg tcgatgataa gcctacactg ttctatacct ctgtgtcctc actcccgatc 420 cattggacgc ttccctacac tcgtggcagc gagtcacaat ctctagctgt cacctacgac 480 caggggcaca gctttaccaa gttggatcag ccgcccgtca ttcccgaacc tcctgctggg 540 ttagatgtta ctggttttcg cgatccgtat gttttccaga gtggaccatt ggatagcact 600 ctcgacagcg ccgacgggac ttggtatgcg gtcgtctcgg ggggcgtcca tgatgtcggg 660 cccggagtgt tcctttaccg aaacgagaac cccgacttcg acgagtggga ctacctcggc 720 gagtggtggc aggagccagc taactcgacc tggggcgatg gctactgggc caagcgctgg 780 ggttacaact tcgagacggt gaacttttta ggtctcgatg aaatgggata taaccctgac 840 ggcgagactt tcgcgacact gggcgtggag ggtgcgtatg ctcctatcca accatcggtc 900 acttccatgc acgcccagtt gtgggcggca ggcagcatct caacaagcga tgacggcaat 960 gtgactttca ctccaagcat ggccggtgcc ttggattggg gtcaagcagc ctatgcgggg 1020 gcaggaaagg tcctgccgaa ggatacccag ccatcacagc agagtggcgc gccagaccgc 1080 ttcatctcat atatctggtt aaatcaggac gagttcggag cagcaacagg cttccctgat 1140 gcccagcagg gatggcacaa cgccctcctg ctcccacgcg agctgagtgt aaagatcatc 1200 ccggatgtgg tgaacaatga gctcgtgcaa gaagaggagg cttcctggct tgtaaaggac 1260 ggatctgatg gccactgtgt tgagctccag acgctcggga ttgacattgc gagagaaaca 1320 tacgcggcaa tgacgcagac tgattccttt actgaagatg agcgtacgct cgcagacttc 1380 gccattattc cctttgaaca gtcgccttct tccagattct tcgtcctcga ggcgcagctg 1440 tccttcccgt cgtcggcgcg agactcggaa cttcaatccg gcttccaaat cctgtcatct 1500 gatgaggagt atactacgat atactaccaa ttctcgaatg aatctattat tatcgatcgc 1560 agtcacacga gtgccgcatc tgaaactacg tctggaatgg gtacttcccc cgaagctgga 1620 cgtttgcggt tgttcgatat ttgtggcgag cattgcaaat gcaagcataa gaaatgctcc 1680 caccacgacg gcgaaaagtc ggatcatcat gatgagcata tggaaacgtt ggatctcact 1740 attgtggttg acaactccat gctcgaggtg tatgctaatt cgcgatttgc gctctctact 1800 tgggttcggc cttggtacag ttattcgaat gagattagct tcttccataa tggggaggaa 1860 gaggtgacgt tcagcaatat cagaatattt gatggtttgt atgatgctta ccccgagcgc 1920 gagaggtaa 1929 <210> 38 <211> 642 <212> PRT <213> Aspergillus terreus <400> 38 Met Lys Ser Ser Val Thr Arg Met Gly Leu Val Ala Ser Leu Val Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ala Ala Gln Asp Tyr Asn Glu Pro Pro Pro Asp Leu Ser Thr 20 25 30 Leu Pro Ser Gly Ser Leu Phe Glu Thr Trp Arg Pro Lys Ile His Val 35 40 45 Leu Pro Pro Ala Gly Gln Ile Gly Asp Pro Cys Ala His Phe Pro Asp 50 55 60 Pro Glu Thr Gly Leu Phe His Val Gly Phe Leu His Asn Gly Thr Gly 65 70 75 80 Ile Ser Ala Val Gln Thr Ala Asp Leu Val Tyr Tyr Tyr Asp Val Asn 85 90 95 Pro Gly Gly Gly Tyr Thr Ile Val Ala Gly Gly Ala Asn Asp Pro Val 100 105 110 Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ile Gly Val Asp Asp Lys Pro 115 120 125 Thr Leu Phe Tyr Thr Ser Val Ser Ser Leu Pro Ile His Trp Thr Leu 130 135 140 Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Ser Gln Ser Leu Ala Val Thr Tyr Asp 145 150 155 160 Gln Gly His Ser Phe Thr Lys Leu Asp Gln Pro Pro Val Ile Pro Glu 165 170 175 Pro Pro Ala Gly Leu Asp Val Thr Gly Phe Arg Asp Pro Tyr Val Phe 180 185 190 Gln Ser Gly Pro Leu Asp Ser Thr Leu Asp Ser Ala Asp Gly Thr Trp 195 200 205 Tyr Ala Val Val Ser Gly Gly Val His Asp Val Gly Pro Gly Val Phe 210 215 220 Leu Tyr Arg Asn Glu Asn Pro Asp Phe Asp Glu Trp Asp Tyr Leu Gly 225 230 235 240 Glu Trp Trp Gln Glu Pro Ala Asn Ser Thr Trp Gly Asp Gly Tyr Trp 245 250 255 Ala Lys Arg Trp Gly Tyr Asn Phe Glu Thr Val Asn Phe Leu Gly Leu 260 265 270 Asp Glu Met Gly Tyr Asn Pro Asp Gly Glu Thr Phe Ala Thr Leu Gly 275 280 285 Val Glu Gly Ala Tyr Ala Pro Ile Gln Pro Ser Val Thr Ser Met His 290 295 300 Ala Gln Leu Trp Ala Ala Gly Ser Ile Ser Thr Ser Asp Asp Gly Asn 305 310 315 320 Val Thr Phe Thr Pro Ser Met Ala Gly Ala Leu Asp Trp Gly Gln Ala 325 330 335 Ala Tyr Ala Gly Ala Gly Lys Val Leu Pro Lys Asp Thr Gln Pro Ser 340 345 350 Gln Gln Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Tyr Ile Trp Leu Asn 355 360 365 Gln Asp Glu Phe Gly Ala Ala Thr Gly Phe Pro Asp Ala Gln Gln Gly 370 375 380 Trp His Asn Ala Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Ser Val Lys Ile Ile 385 390 395 400 Pro Asp Val Val Asn Asn Glu Leu Val Gln Glu Glu Glu Ala Ser Trp 405 410 415 Leu Val Lys Asp Gly Ser Asp Gly His Cys Val Glu Leu Gln Thr Leu 420 425 430 Gly Ile Asp Ile Ala Arg Glu Thr Tyr Ala Ala Met Thr Gln Thr Asp 435 440 445 Ser Phe Thr Glu Asp Glu Arg Thr Leu Ala Asp Phe Ala Ile Ile Pro 450 455 460 Phe Glu Gln Ser Pro Ser Ser Arg Phe Phe Val Leu Glu Ala Gln Leu 465 470 475 480 Ser Phe Pro Ser Ser Ala Arg Asp Ser Glu Leu Gln Ser Gly Phe Gln 485 490 495 Ile Leu Ser Ser Asp Glu Glu Tyr Thr Thr Ile Tyr Tyr Gln Phe Ser 500 505 510 Asn Glu Ser Ile Ile Ile Asp Arg Ser His Thr Ser Ala Ala Ser Glu 515 520 525 Thr Thr Ser Gly Met Gly Thr Ser Pro Glu Ala Gly Arg Leu Arg Leu 530 535 540 Phe Asp Ile Cys Gly Glu His Cys Lys Cys Lys His Lys Lys Cys Ser 545 550 555 560 His His Asp Gly Glu Lys Ser Asp His His Asp Glu His Met Glu Thr 565 570 575 Leu Asp Leu Thr Ile Val Val Asp Asn Ser Met Leu Glu Val Tyr Ala 580 585 590 Asn Ser Arg Phe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg Pro Trp Tyr Ser Tyr 595 600 605 Ser Asn Glu Ile Ser Phe Phe His Asn Gly Glu Glu Glu Val Thr Phe 610 615 620 Ser Asn Ile Arg Ile Phe Asp Gly Leu Tyr Asp Ala Tyr Pro Glu Arg 625 630 635 640 Glu Arg <210> 39 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 39 acatcacaga taacatatga agctctcaac cgcgagtgcc t 41 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 40 ccgagcccaa gtactcaggg caaaacgtcc 30 <210> 41 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 41 agtacttggg ctcggtcctg gtacaagaac tcgactgaca tcaag 45 <210> 42 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 42 gagcaagctt ctcgagttag acacgctcag gccaggcttc a 41 <210> 43 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 43 acatcacaga taacatatga aatcctcagt gacacggatg g 41 <210> 44 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 44 cgaacccaag tagagagcgc aaatcgcgaa 30 <210> 45 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 45 ctctacttgg gttcggcctt ggtacagtta ttcgaatgag attag 45 <210> 46 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 46 gagcaagctt ctcgagttac ctctcgcgct cggggtaagc a 41 <210> 47 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 47 aaatctaaaa gatcctccgc catcgattac aacg 34 <210> 48 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 48 tttaccagac tcgagttaga cacgctcagg cca 33 <210> 49 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 49 aaatctaaaa gatccgcagc gcaggactac aat 33 <210> 50 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 50 tttaccagac tcgagttacc tctcgcgctc ggg 33 <210> 51 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 51 ctcgagtctg gtaaagaaac cgctgctgcg aaa 33 <210> 52 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 52 ggatctttta gattttagtt tgtcactatg atcaa 35 <210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 53 tggagtggta tcgcaggcgc tac 23 <210> 54 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 54 attgtacagg aagccaacgt ggaac 25 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> foward primer <400> 55 tggactggga tttcggctgt c 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 56 attgtgtagg aacccgacat g 21

Claims (7)

1. 하기 (a) 또는 (b)의 아미노산 배열로 이루어지는 개량형 β-프룩토프라노시다아제;
   (a)배열번호2로 나타내는 아미노산 배열에 대하여, 이하의 ｉ) 및/또는 ｉｉ)의 아미노산 변이(amino acid mutation)를 도입한 아미노산 배열；
   ｉ)N말단으로부터 85번째의 글리신(G)을 글리신(G) 이외의 단백질구성 아미노산으로 치환하는 아미노산 변이,
   ｉｉ)N말단으로부터 310번째의 히스티딘(H)을 리신(K), 아르지닌(R) 또는 티로신(Y)으로 치환하는 아미노산 변이,
   (b)(a)에 있어서, 아미노산 변이가 도입된 아미노산을 제외한 1 혹은 복수개의 아미노산을 결실, 치환, 삽입 혹은 부가한 아미노산 배열로 이루어지고 또한 β-프룩토프라노시다아제 활성을 구비하는 아미노산 배열.
   
2. 제1항의 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드(polypeptide).
   
3. 제1항의 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 코드하는 ＤＮＡ.
   
4. 제3항의 ＤＮＡ를 포함하는 재조합 벡터(recombinant vector).
   
5. 제3항의 ＤＮＡ 또는 제4항의 재조합 벡터를 숙주에 도입해서 얻어지는 형질전환체.
   
6. 제5항의 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물로부터 개량형 β-프룩토프라노시다아제를 취득하는 공정을 구비하는 개량형 β-프룩토프라노시다아제의 제조방법.
   
7. 제1항의 개량형 β-프룩토프라노시다아제, 제5항의 형질전환체 또는 제5항의 형질전환체를 배양해서 얻어지는 배양물과
   수크로오스를 접촉시키는 공정을 구비하는 케스토오스의 제조방법.