CN1212401C

CN1212401C - 植物病毒卫星DNAβ分子、侵染性克隆及表达载体制备方法

Info

Publication number: CN1212401C
Application number: CN 02159874
Authority: CN
Inventors: 周雪平; 谢艳; 崔晓峰; 陶小荣; 李正和
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2002-12-24
Filing date: 2002-12-24
Publication date: 2005-07-27
Anticipated expiration: 2022-12-24
Also published as: CN1425678A

Abstract

本发明公开了一种植物病毒卫星DNAβ分子、侵染性克隆及表达载体制备方法。该植物病毒卫星DNA分子即赛葵黄脉病毒卫星DNAβ，全序列长1348bp，与双生病毒DNA-A序列无同源性，含有一段约115nt的保守区域，一个118aa的开放阅读框(即C1)及一段长度不一的A富含区。本发明还涉及赛葵黄脉病毒的侵染性克隆，可以利用该侵染性克隆进行病毒功能基因组研究。本发明还提供了利用该卫星DNAβ的构建表达载体及其制备方法。

Description

植物病毒卫星DNAβ分子、侵染性克隆及表达载体制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地，本发明涉及一种植物病毒卫星DNAβ分子、侵染性克隆及表达载体制备方法。更具体地说，本发明涉及一类粉虱传双生病毒赛葵黄脉病毒(Malvastrum coromandelisnum yellow vein virus，MYVV)卫星DNAβ及其全基因组序列。本发明还涉及一种新型的植物DNA侵染性克隆，具体地说，涉及粉虱传双生病毒赛葵黄脉病毒的侵染性克隆，本发明还涉及利用该侵染性克隆进行病毒功能基因组研究的方法。本发明还涉及一种植物DNA病毒的表达载体及其制备方法，具体地说，涉及粉虱传双生病毒赛葵黄脉病毒卫星DNAβ的表达载体及其制备方法。

背景技术

粉虱传双生病毒(whitefly-transmitted geminivirus，WTG)是世界范围内广泛发生的一类植物单链DNA病毒，近年来已在热带、亚热带地区多种作物上引起严重危害，给作物生产造成了严重损失。WTG在分类上属于双生病毒科(Geminiviridae)中的菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)病毒，包括100多个独立种。在自然条件下，WTG均由烟粉虱(Bemisia tabaci)传播，其病毒粒子形态为孪生颗粒状，大小18×30nm，基因组为单链环状DNA，大小2.5-3.0kb。大多WTG病毒包含2个大小相近的DNA组份，称DNA-A和DNA-B。DNA-A和DNA-B大部分序列不同，但在非编码区中有约200个核苷酸序列几乎相同(同源性大于95％)，称为共同区(common region，CR)，共同区包含病毒复制、转录起始和包装所需的序列，并有茎环结构。DNA-A编码病毒复制所必须的复制相关蛋白(Rep)、复制增强蛋白(Ren)、外壳蛋白(CP)和控制晚期基因表达的转录激活蛋白(TrAP)，与病毒的复制和介体传播有关；DNA-B编码一个核穿梭蛋白(NSP)和一个运动蛋白(MP)，与病毒在植物体内的运输和病毒的寄主范围有关。少数WTG病毒，基因组只含单条DNA分子，即DNA-A，长为2.8kb，编码6个ORFs。一般，单组份WTG病毒如胜红蓟黄脉病毒(AYVV)，单单DNA-A接种寄主胜红蓟，不能形成典型的黄脉症状，若与发现的新型DNAβ分子共同接种，才能引起典型的黄脉症状。DNAβ是一种包裹在双生病毒粒子中、可由烟粉虱传播的单链环状DNA分子，大小为DNA-A的一半，除茎环结构SEQ ID NO.1外，与病毒基因组DNA-A和DNA-B序列均无同源性，其复制、包装、移动、介体传播等都依赖DNA-A，但与病状形成相关。本发明在单组份中国赛葵黄脉病毒上发现了一种新型的DNA卫星分子。

植物病毒侵染性载体的获得是研究病毒功能基因组的前提，在分子生物学水平上研究病毒基因组结构与功能以及寄主与病毒之间的互作，必须先要获得病毒的侵染性克隆，进而利用DNA重组技术进行突变，缺失，插入，置换以及互补实验对病毒基因组进行功能区域的定位和研究。该技术是深入研究病毒的基因功能以及病毒与寄主植物互作的有效手段。植物DNA病毒的侵染性克隆是1982年在番茄金花叶病毒(TGMV)上首先构建成功的。虽然该技术产生较晚，但是发展却极为迅速，现已广泛应用于病毒的遗传表达和复制分析。本发明在获得新型卫星DNAβ分子的基础上，构建了该卫星DNAβ分子的侵染性克隆，以应用于病毒的功能基因组研究。

以植物病毒的基因组为载体表达外源基因，这是一种具有广泛应用前景的植物生物反应器。植物具有合成、折叠、翻译后修饰及装配蛋白的机制，外源蛋白在植物体内可以大量繁殖，因此可以利用植物进行大量地、廉价地生产重要药用蛋白(特别是疫苗)。利用植物生产药物主要有两种方法：(1)外源基因暂时存在于植物细胞中(如利用植物病毒载体)，植物可表达由外源基因编码的蛋白质；(2)外源基因长期存在于植物细胞中，即导入的外源基因将成为植物基因组的一部分，然后持续不断地产生由外源基因编码的蛋白质。转基因植物中外源基因的表达量都比较低，一般在可溶性蛋白的1％以下，而且基因转化和植株再生过程费力费时，这在很大程度上影响了利用转基因植物生产药用蛋白的全面产业化进程。植物病毒一般都具有很强的繁殖能力，基于植物病毒的这一特性，从80年代起，世界各地的研究人员就开始探索利用植物病毒载体高效表达外源基因的可行性，并成功地表达了多种蛋白。本发明在构建好的侵染性克隆的基础上，构建了一种利用植物DNA病毒的表达载体。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种植物病毒卫星DNAβ分子，该卫星DNA分子是与单组份双生病毒相伴随的卫星分子。

本发明的另一个目的是提供一种植物病毒及其卫星的侵染性克隆。

本发明的另一个目的是提供一种持续、稳定、高效的植物表达载体制备方法。

本发明的一个方面是提供一种新型植物病毒卫星DNAβ分子，它是一种单链环状DNA分子，全序列大小为SEQ ID NO.1 1348bp，互补链编码一个功能未知蛋白，还含SEQ ID NO.2的九核苷酸序列TAATATTAC。

本发明的另一个方面是提供一种侵染性克隆，即赛葵黄脉病毒的侵染性克隆，该侵染性克隆接种寄主植物，DNA-A能够系统侵染，但只有DNA-A加上DNAβ才能引发典型的症状。

本发明的另一个方面是提供一种以植物为生物反应器的表达载体，它以赛葵黄脉病毒卫星DNAβ作为外源基因的表达载体，通过构建含外源基因的重组卫星DNA，接种植物并表达外源基因，或接种植物组织、植物细胞培养物，在组织培养条件下表达外源基因。

本发明的再一个方面是提供一种根据赛葵黄脉病毒卫星DNAβ分子构建的表达载体制备方法，该方法包括：

a.将1.4个拷贝正向重复的DNA-A构建至植物表达载体；

b.将两个拷贝正向重复的DNAβ构建至植物表达载体；

c.把a和b中构建的载体导入农杆菌宿主；

d.将c中构建的农杆菌注射接种寄主植物；

e.观察症状及分子水平的检测。

本发明的优点：

1)植物病毒只侵染植物不感染动物和人，相对安全；

2)双生病毒增殖速度快，在植株体内拷贝数高，能快速高效地表达外源基因，通常在接种2周后外源基因就可达到最大量的积累；

3)双生病毒为DNA病毒，且基因组小，可直接在体外进行遗传操作，即便利又降低了成本；

4)该表达载体中卫星不会破坏辅助病毒的复制体系的完整性，且卫星与辅助病毒DNA序列无同源性，不会因同源重组而导致外源基因的丢失，可持续高效地表达不同的外源蛋白。

5)该表达载体进入植物细胞中，只作瞬间的基因表达，病毒DNA不能整合到宿主细胞组中，因而不会产生类似转基因植物可能产生的安全性问题；

6)该表达载体采用农杆菌针刺接种植物，对设备要求低，而发病率可达100％，因而简便高效；

7)该表达系统为真核表达系统，能对真核蛋白质进行准确的翻译后加工修饰。

具体实施方式

实施例1赛葵黄脉病毒DNAβ组分基因组全序列的克隆和测定

1.植物总DNA的抽提

称取0.5-1g叶片，加液氮研磨至粉末状，加入15ml抽提缓冲液(100mMTris·HCL pH8.0，50mM EDTA pH8.0，500mM NaCl，临用前加入β-巯基乙醇2.3μl/ml)，继续研磨，转移至50ml离心管，所有样品保持在4℃。加入1ml 20％SDS，温和地颠倒混匀，65℃温浴10min.加入5ml 5M KAC，温和地颠倒混匀，冰上放置20分钟，4000rpm离心30分钟，上清液经纱布过滤倒入预冷的15ml异丙醇的50ml离心管中，混匀，-20℃放置30min(或-80℃放置10min)，13000rpm离心15min，弃上清，沉淀用0.75ml TE溶解(50mMTris-Cl pH8.0，10mM EDTA)，并转移至1.5ml离心管，加入15μl 1μg/ml的Rnase，37℃温浴30min，14000rpm离心10min，上清液倒入含0.75ml预冷异丙醇的1.5ml离心管中，加入75μl 3MNaAC pH5.2，-20℃放置30min(或-80℃放置10min)，13000rpm离心15min，用70％乙醇洗沉淀，待酒精完全挥发后，溶于300μl TE。

2.PCR扩增、克隆以及全基因组序列测定和分析

以赛葵黄脉病毒总DNA为模板，以SEQ ID NO.3(5’- GGTACCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’，含KpnI位点)与SEQ ID NO.4(5’- GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’，含KpnI位点)为引物，对DNAβ组分进行扩增。PCR反应体系：50μl反应液中含1μl总DNA，20umol引物，0.2mmol/L4×dNTPs，1.5mmol/L MgCL₂，50mmol/L KCL，1mmol/L Tris·HCL(pH8.0)，1.2个单位的Taq DNA聚合酶。反应条件：94℃1min，50℃1min，72℃1.5min，循环35次后，72℃延伸10min。PCR产物克隆至pGEM-T Easy Vector，获得一个全长序列的克隆pGEM-T-β(1)。用pGEM-T Easy Vector上的通用引物T7和Sp6进行序列测定，再根据测出的序列设计测序引物SEQ ID NO.5(5’-AAGTCGAATGGAATGAGCA-3’)以测通全长，从而获得DNAβ的全长基因组序列1348bp。中国赛葵黄脉病毒DNAβ全序列如SEQ ID NO.1。

中国赛葵黄脉病毒DNAβ全长1348bp(基因库登录号AJ421482)，推测共编码8个ORFs，在1249～15位核苷酸之间含一个长为115nt的所有DNAβ分子都高度同源的保守区(conserved region，CR)(SEQ ID NO.6)，CR区含有与赛葵黄脉病毒DNA-A共享的九核苷酸序列TAATATTAC，推测该区是DNA-A编码的复制蛋白识别及互作位点。赛葵黄脉病毒DNAβ在767～971位核苷酸之间含A-rich区(SEQ ID NO.7)，核苷酸含量高达60.5％A，认为A-rich区是与DNAβ分子包装过程中的尺寸要求相关联的。赛葵黄脉病毒DNAβ的互补链上编码一个长为118aa的C1蛋白(SEQ ID NO.8)，将C1 ORF起始密码子ATG突变后，病毒致病率下降，因而认为C1是具有功能的蛋白。

实施例2赛葵黄脉病毒DNAβ与已报道其它DNAβ分子的全序列同源性比较

用本发明的赛葵黄脉病毒DNAβ与GenBank上已报道的胜红蓟黄脉病毒(Ageratum yellow vein virus，AYVVβ，AJ252072)，秋葵黄脉花叶病毒(Bhendi yellow vein mosaic virus，BYVMVβ，AJ308425)，Multan棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMVβ01，AJ292769；CLCuMVβ02，AJ298903)，Rajasthan棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Rajasthan virus，CLCuRVβ，AY083590)，烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus，TCSVY2β，AJ421485)，中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNVY10β，AJ421621)进行全序列比较。

上述DNA序列用DNAStar软件(Madison，Wis.，USA)及DNAMAN version4.0(Lynnon Biosoft，Quebe，Canada)进行处理、分析。多序列比较采用DNAMAN的邻近相连法(Neighbor-joining)。

结果发现，赛葵黄脉病毒DNAβ全序列与Multan棉花曲叶病毒CLCuMVβ01和CLCuMVβ02同源性最高，分别为66.7％和67％；与Rajasthan棉花曲叶病毒CLCuRVβ同源性次之，为61.8％；与秋葵黄脉花叶病毒BYVMVβ的同源性为46％；与胜红蓟黄脉病毒AYVVβ、中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNVY10β及烟草曲茎病毒TCSVY2β的同源性分别只有40.6％、40.4％和40.2％。说明DNAβ之间的同源性都很低。

实施例3赛葵黄脉病毒DNAβ与已报道其它DNAβ分子的CR区核苷酸同源性比较

用本发明的赛葵黄脉病毒DNAβ与GenBank上已报道的胜红蓟黄脉病毒(Ageratum yellow vein virus，AYVVβ，AJ252072)，秋葵黄脉花叶病毒(Bhendi yellow vein mosaic virus，BYVMVβ，AJ308425)，Multan棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Multan virus，CLCuMVβ01，AJ292769；CLCuMVβ02，AJ298903)，Rajasthan棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl Rajasthan virus，CLCuRVβ，AY083590)，烟草曲茎病毒(Tobacco curly shoot virus，TCSVY2β，AJ421485)，中国番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus，TYLCCNVY10β，AJ421621)CR区进行核苷酸比较。

结果发现，赛葵黄脉病毒DNAβ与上述七个DNAβ分子的CR区核苷酸序列同源性均很高，达93.9％以上。具体地，与Multan棉花曲叶病毒CLCuMVβ01和CLCuMVβ02同源性分别为96.5％和97.4％；与Rajasthan棉花曲叶病毒CLCuRVβ同源性为94.8％；与秋葵黄脉花叶病毒BYVMVβ的同源性为97.4％；与胜红蓟黄脉病毒AYVVβ的同源性为93.9％，与中国番茄黄化曲叶病毒TYLCCNVY10β的同源性为94.8％，及烟草曲茎病毒TCSVY2β的同源性为93.9％。

所有DNAβ分子都在相似位置含一个长为115nt的CR区，且CR区核苷酸序列高度保守(同源性均在93.9％以上)，CR区含有双生病毒DNA-A共享的九核苷酸序列TAATATTAC，推测该区是DNA-A编码的复制蛋白识别及互作位点。

实施例4赛葵黄脉病毒DNAβ侵染性克隆的构建

以植物总DNA为模板，以SEQ ID NO.9(5’-GGTCACTACGCTACGCAGCAGCC-3’，不含Kpn I位点)与SEQ ID NO.3(5’- GGTACCTACCCTCCCAGGGGTACAC-3’，含Kpn I位点)进行扩增，PCR产物插入pGEM-T Easy Vector，获得克隆另一个全长基因组拷贝的pGEM-T-β(2)。用Kpn I对pGEM-T-β(1)酶切得到1.3kb全长基因组片段插入pGEM-T-β(2)的相应位点，获得pGEM-T-2β，再利用pGEM-TEasy Vector两头的EcoR I位点切下两个copy的DNAβ，插入农杆菌载体pBINplus的EcoR I位点，并转化感受态细胞DH5α，从而获得DNAβ的侵染性克隆pBINplus-2β。

实施例5赛葵黄脉病毒DNA-A侵染性克隆的构建

1.赛葵黄脉病毒DNA-A基因组全序列的获得

以赛葵黄脉病毒总DNA为模板，以简并引物PA：5’-TAATATTACCKGWKGVCCSC-3’和PB：5’-TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA-3’对DNA A组分进行PCR扩增，反应参数为：94℃2min；94℃45sec，55℃45sec，72℃2min，34个循环；最后72℃延伸10min。PCR产物经QiaGen胶纯化Kit回收后克隆至pGEM-T Easy Vector(Promega公司产品)，阳性克隆经PCR或酶切鉴定进行序列测定和分析，在序列测定的基础上设计另一对全长abutting引物VYF：5’-ACAGGATGTACAGAAGTCCTGA-3’和VYR：5’-TTTGCGGTTCATGGGCCTGTTCG-3’进行扩增，PCR产物为约2.7kb的条带，经QIAGen胶纯化Kit回收后克隆至pGEM-T Easy Vector，获得阳性克隆pGEM-T DNA A。用pGEM-T Easy Vector上的通用引物T7和Sp6进行序列测定，再根据测出的序列设计测序引物Y6R2：5’-GGAAGCCAGTTCAAATTAAAGG-3’；Y6R2W1：5’-CATTCTTGAGAGCCCAATC-3’和YT7W1：5’-AGCTTTCAGCGCGTCATA-3’测通全长，获得中国赛葵黄脉病毒DNA-A全基因组序列共2731bp。

2.赛葵黄脉病毒DNA-A侵染性克隆的构建

双生病毒的农杆菌接种的侵染性克隆需要1.3-2.0个拷贝，必须包括共同区。利用EcoR I和Hind III双酶切以及EcoR I单酶切pGEM-T-DNA A，分别获得0.4和1拷贝的DNA A，凝胶电泳后回收酶切片断，将前者与EcoR I和HindIII双酶切的植物表达载体pBINplus连接，获得插入0.4个拷贝的DNA A的植物表达载体pBINplus 0.4A，EcoR I切开pBINplus 0.4A，并插入1拷贝的DNAA，筛现正向串联重复的阳性克隆，即获得插入1.4个拷贝的DNA A的植物表达载体pBINplus 1.4A。

实施例6赛葵黄脉病毒卫星DNAβ分子的表达载体的构建

1.多克隆位点置换C1的缺失型DNAβ表达载体的构建

SEQ ID NO.10(AAT GGATCC GATATC AAGCTT CTCGAG CCCGGGCTTGCTTGTGTGATGGAAGT，引入BamH I、EcoR V、HindIII、Xho I和XmalI多克隆位点)和SEQ ID NO.9(不带Kpn I位点)扩增一条800bp条带；SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.11(CGC GGATCCTTTCAAATAACAGATCATCA.引入BamHI位点)扩增一条200bp条带。两者BamH I酶切、连接后再与pGEM-T EasyVector连接，筛选阳性克隆得到一端引入Kpn I位点、缺失C1、C1处引入多克隆位点的pGEM-β(3)。

SEQ ID NO.12(ACT GGATCCCTTGCTTGTGTGATGGAAGT，引入BamH I)和SEQ IDNO.3(带Kpn I位点)扩增一条800bp条带；SEQ ID NO.2和SEQ ID.NO.11(引入BamH I位点)扩增一条200bp条带。两者BamH I酶切、连接后再与pGEM-T EasyVector连接，筛选阳性克隆得到两端都引入Kpn I位点且缺失C1的pGEM-β(4)。

Kpn I酶切pGEM-β(4)得到一条1kb但缺失C1的DNAβ条带(decβ)，插入也用Kpn I切开的pGEM-β(3)，筛选得到C1缺失、引入多克隆位点的pGEM-2decDNAβ。再利用pGEM-T Easy Vector两头的EcoR I位点切下2decβ，插入农杆菌载体pBINplus的EcoR I位点，并转化感受态细胞DH5α，从而获得侵染性克隆pBINplus-2decβ(1)。

2.外源基因插入pBINplus-2decβ(1)的多克隆位点，获得pBINplus-2decβ(2)

实施例7.农杆菌转化

植物表达载体的转化是通过三亲交配的方法进入农杆菌宿主细胞，植物表达载体pBINplus需要通过辅助质粒pROK2013的介导才能进入农杆菌EHA105。pBINplus载体接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养；EHA105接种5ml含Sm(50mg/ml)YEP液体培养基，28℃下200rpm培养48小时；辅助质粒pROK2013接种5ml含Km(50mg/ml)LB液体培养基，37℃条件下200rpm过夜培养。各取400μl pBINplus载体，EHA105，pROK2013菌液，颠倒混匀后，6000rpm 30秒收集菌液，收集的菌体用200μl ddH₂O悬浮，用玻璃涂棒涂布于没有抗性的YEP固体培养基平板进行三亲交配，28℃培养24小时后，用玻璃涂棒在生长出来的菌斑上蘸一下，随即连续涂布三块含有Km(50mg/ml)和Sm(50mg/ml)的YEP固体培养基平板，以此得到含有pBINplus载体的EHA105的单菌落，长出单菌落后用特异性引物对其进行PCR鉴定，获得重组农杆菌pBINplus载体(EHA105)。

实施例8.农杆菌注射接种

pBINplus载体(EHA105)接种5ml含Km(50mg/ml)和Sm(50mg/ml)的YEP液体培养基，28℃下200rpm振荡培养48小时。接种植株选用4-6叶充分展开苗龄期为宜。具体接种方法如下，取一支1ml的一次性注射器，吸取菌液，在距离根部1-2cm处取三点进行韧皮部注射，或在植株叶柄处取三点进行韧皮部注射，或在上部嫩叶背部用带有菌液的针头划数下，接种植株置于25℃隔离温室培养。

实施例9.双生病毒侵染性克隆的侵染性测定

接种植株进行症状观察，以及EILSA和PCR检测，如果PCR也为阳性，则进一步进行Southern Blot检测。症状观察表明，在本氏烟上(Nicotiana.benthamiana)、心叶烟(N.glutinosa)、三生烟(N.tabacum Samsun)、普通烟(N.tabacum)、单DNA-A接种的植株几乎没有症状，而Southern Blot在上部叶片上能够检测到病毒基因组，说明单DNA-A接种能够系统侵染，但是并不引发典型的在田间观察到的曲叶症状。单DNAβ接种的植株没有出现症状，上部叶片也没有检测到DNAβ，说明DNAβ并不能独立复制。当DNA-A与DNAβ两个组分一起接种的时候，10dpi后，上部叶片开始出现黄脉，25-30dpi症状发展到顶峰，；用Southern Blot检测表明DNA-A+DNAβ病毒的基因组浓度比单DNA-A接种的DNA浓度明显增加，表明DNA-A与DNAβ是相互依赖的，DNAβ的复制依赖DNA-A，而DNAβ则能大大加强DNA-A的基因组DNA含量，并且DNAβ对于病毒的致病性是必需的，没有DNAβ的存在就不能引发典型的曲叶症状。

SEQ ID NO.1信息：

(i)序列特征：

(A)长度：1348碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO.1：

accgtgggcg agcggtgacc gatggctctt ggtgggtccc actgactgcc ttgactggat 60

ttgacttcta tttgggccat atgaattgga tctaatgtga ttgggccttt gaaagtggcc 120

tgttgggtgt taggtccgtt tatgttgttg attatagtaa ggcttattat ctacttgatg 180

atctgttatt tgaaattaaa cggtgaatgt tttattgaat acataaggct cgattacatc 240

catgcccata atctcatggt tttcgagtac aaatatatcc agccgttcga ctatgtctac 300

gatgtcgatc ttttctattt ttgccccgtt gtaggcgaat aagaaattgg cgatgatgtt 360

ggtctcgaat ccgttgaagt cgaatggaat gagcaggtct ccgtatgtgt acttgacgat 420

cccctcatac ttgatgatcg ctggtgtcct ggtggatact agtttcatgt gaatgaagag 480

cctcatgcct tccatgatgc gtacgtcgac tgtgaaccgg actccttgag tgttgatgcc 540

gcttctagcc atcttgcttg tgtgatggaa gtgtgtgtga tacatgcatt tataggacta 600

actgtgagat atttggtgtt gttgtgtggt tgtgagtgat ttatccctta atatgtgatt 660

gtggatcaat actttaaaga tatgatggag atgtattaca tgtgtggtga agtggagttg 720

aaatcctaat acatggggtg tgtacgtata tatacgtaca catgagaaca agaaaaagga 780

taagaaaaac gtagactgaa ctgaaaagga aagaaaacga aaacaaagaa agaactataa 840

tccaagaaag aaaatgggag cgcagcgact cgaaacaaag aagcccagaa aagaaaagaa 900

aaaagtaaaa aaaaaataaa actcgaaaac gatgtcgttt gagatagaag aaaaaaagaa 960

aaaaataata atggggacct tgaacggtga cgtttttaag gtgagtatgg tttttaccat 1020

ttatcgcgcg gtaaatggta aatgggtgaa aggagataaa aaacctgtct ccaataggta 1080

aaattgtccc caatatatcg ggtcctcatt tggggacaaa taaagacttt ccaaaaatac 1140

ccccgtgttt gtgtctgtta ggcgcgtcgg agtgcgccga aaaagttaac attctctctc 1200

ctgttttggg ctctaatgca atttcccggt gatcggagtc gaattttccg acacgcgcgg 1260

cggtgtgtac ccctgggagg gtagaaacca ctacgctacg cagcagcctt agctacgccg 1320

gagcatagct cgcccacgtt ctaatatt 1348

SEQ ID NO.2信息：

(i)序列特征：

(A)长度：9碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明；是双生病毒科病毒保守九核苷酸序列

(xi)序列描述：SEQ ID NO.2：

taatattac 9

SEQ ID NO.3信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明：PCR引物，5’端引入Kpn I位点

(xi)序列描述：SEQ ID NO.3：

ggtaccacta cgctacgcag cagcc 25

SEQ ID NO.4信息：

(i)序列特征：

(A)长度：25碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明：PCR引物，5’端引入Kpn I位点

(xi)序列描述：SEQ ID NO.4：

ggtacctacc ctcccagggg tacac 25

SEQ ID NO.5信息：

(i)序列特征：

(A)长度：19碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明：测序引物

(xi)序列描述：SEQ ID NO.5：

aagtcgaatg gaatgagca 19

SEQ ID NO.6信息：

(i)序列特征：

(A)长度：115碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(A)位置：SEQ ID NO.1的1249-15

(xi)序列描述：SEQ ID NO.6：

cgacacgcgc ggcggtgtgt acccctggga gggtagaaac cactacgcta cgcagcagcc 60

ttagctacgc cggagcatag ctcgcccacg ttctaatatt accgtgggcg agcgg 115

SEQ ID NO.7信息：

(i)序列特征：

(A)长度：205碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：DNA

(A)位置：SEQ ID NO.1的767-971

(xi)序列描述：SEQ ID NO.7：

aacaagaaaa aggataagaa aaacgtagac tgaactgaaa aggaaagaaa acgaaaacaa 60

agaaagaact ataatccaag aaagaaaatg ggagcgcagc gactcgaaac aaagaagccc 120

agaaaagaaa agaaaaaagt aaaaaaaaaa taaaactcga aaacgatgtc gtttgagata 180

gaagaaaaaa agaaaaaaat aataa 205

SEQ ID NO.8信息：

(i)序列特征：

(A)长度：118个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)拓扑结构：线性

(ii)分子型：PRT

(xi)序列描述：SEQ ID NO.8：

Met Ala Arg Ser Gly Ile Asn Thr Gln Gly Val Arg Phe Thr Val 1

Asp Val Arg Ile MET Glu Gly Met Arg Leu Phe Ile His MET Lys 16

Leu Val Ser Thr Arg Thr Pro Ala Ile Ile Lys Tyr Glu Gly Ile 31

Val Lys Tyr Thr Tyr Gly Asp Leu Leu Ile Pro Phe Asp Phe Asn 46

Gly Phe Glu Thr Asn Ile Ile Ala Asn Phe Leu Phe Ala Tyr Ash 61

Gly Ala Lys Ile Glu Lys Ile Asp Ile Val Asp Ile Val Glu Arg 76

Leu Asp Ile Phe Val Leu Glu Asn His Glu Ile Met Gly Met Asp 91

Val Ile Glu Pro Tyr Val Phe Asn Lys Thr Phe Thr Val 106

SEQ ID NO.9信息：

(i)序列特征：

(A)长度：23碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明：PCR引物

(xi)序列描述：SEQ ID NO.9：

ggtcactacg ctacgcagca gcc 23

SEQ ID NO.10信息：

(i)序列特征：

(A)长度：53碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明：PCR引物，引入BamH I、EcoRV、HindIII、Xho I和Xmal I多克隆位点

(B)位置：SEQ ID NO.9的553-572

(xi)序列描述：SEQ ID NO.10：

aatggatccg atatcaagct tctcgagccc gggcttgctt gtgtgatgga agt 53

SEQ ID NO.11信息：

(i)序列特征：

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明：PCR引物，引入BamH I位点

(B)位置：SEQ ID NO.9的195-176

(xi)序列描述：SEQ ID NO.11：

cgcggatcct ttcaaataac agatcatca 29

SEQ ID NO.12信息：

(i)序列特征：

(A)长度：29碱基

(B)类型：核酸

(C)链性：单链

(D)拓扑：线性

(ii)分子型：寡核苷酸

(A)说明：PCR引物，引入BamH I位点

(B)位置：SEQ ID NO.9的553-572

(xi)序列描述：SEQ ID NO.12：

actggatccc ttgcttgtgt gatggaagt 29

Claims

1.一种植物病毒卫星DNAβ分子，其特征在于，它是一种单链环状DNA分子，序列如SEQ ID NO.1所示，大小为1348bp。

2.如权利要求1所述的DNAβ分子，其特征在于，该卫星DNA分子与单组份双生病毒赛葵黄脉病毒DNA-A相伴随，且由赛葵黄脉病毒的外壳蛋白包装，由烟粉虱传播，其复制、移动、包装、介体传播都依赖伴随的双生病毒。

3.一种赛葵黄脉病毒的侵染性克隆，其特征在于，该侵染性克隆是将1.4个拷贝正向重复的DNA-A和2个拷贝正向重复的如权利要求1所述的DNAβ分别构建至植物表达载体后导入农杆菌，接种寄主植物，DNA-A能够系统侵染，但只有DNA-A加上如权利要求1所述的DNAβ才能引发典型的症状。

4.一种以植物为生物反应器的表达载体，其特征在于：

a.它以赛葵黄脉病毒卫星如权利要求1所述的DNAβ作为外源基因的表达载体，通过构建含外源基因的重组卫星DNA，接种植物并表达外源基因，或接种植物组织、植物细胞培养物，在组织培养条件下表达外源基因；

b.它所含两个拷贝正向重复的如权利要求1所述的DNAβ均缺失C1的序列，并在其中一个缺失C1处引入多克隆位点；

c.在其中一个缺失C1处引入的多克隆位点处可以插入外源基因。

5.一种以植物为生物反应器的表达载体制备方法，其特征在于，该方法包括：

a.将1.4个拷贝正向重复的DNA-A构建至植物表达载体；

b.将两个拷贝正向重复的如权利要求1所述的DNAβ构建至植物表达载体；

c.把a和b中构建的载体导入农杆菌宿主；

d.将c中构建的农杆菌注射接种寄主植物；

e.观察症状及分子水平的检测。