CN1745095A

CN1745095A - 一种生产hiv－1的gag病毒样颗粒的方法

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Publication number: CN1745095A
Application number: CNA2003801093840A
Authority: CN
Inventors: 安·贾弗雷; 安娜·利塞·威廉森; 爱德华·彼得·雷比茨基
Original assignee: University of Cape Town; Medical Research Council of South Africa
Current assignee: University of Cape Town; Medical Research Council of South Africa
Priority date: 2002-12-04
Filing date: 2003-12-04
Publication date: 2006-03-08
Also published as: AU2003286295A1; AP2005003338A0; EP1572731A2; WO2004050691A2; US20060210585A1; AU2003286295A8; WO2004050691A3; ZA200505346B

Abstract

本发明描述了一种含编码HIV Gag多肽的核苷酸序列的载体，该载体用于制备HIV－1 Gag病毒样颗粒。该载体可以是一种植物载体，例如，一种如pBSG1057载体的烟草花叶病毒载体或一种烟草蚀刻病毒载体。该载体还可以是一种含T源质粒结构的根癌农杆菌。或者，该载体可以是一种昆虫载体，如杆状病毒载体。本发明还描述了HIV－1 Gag病毒样颗粒，该病毒样颗粒在治疗或预防哺乳动物感染HIV的疫苗中的应用，该疫苗包括基本如上所述的蛋白质或多肽的病毒样颗粒。

Description

一种生产HIV-1的GAG病毒样颗粒的方法

技术领域

本发明涉及一种生产HIV-1 Gag病毒样颗粒的方法、由该方法制得的病毒样颗粒以及该病毒样颗粒在疫苗中的应用。

背景技术

HIV基因组包括三个主要的开放阅读框架(open reading frame)。gag开放阅读框架(图1)编码一分子量为55kDa的前体蛋白质(Pr55^Gag)，该前体蛋白质在病毒体成熟过程中被一种编码HIV的蛋白酶进一步分解为三个主要的结构蛋白质、一个调节区和两个间隔肽(spacerpeptides)(Luciw，1996)。该结构蛋白质包括基质(MA)蛋白质(P17-AA1至AA132)，衣壳(CA)蛋白质(P24-AAl33至AA363)及核衣壳(NC)蛋白质(P9-AA377至AA432)。该调节区(P6)跨越AA449-AA500，而该间隔区P1和P2分别位于AA433至AA448和AA364至AA376(von Schwedler等，1998)。

Pol开放阅读框架从AA430处与gag的开放阅读框架重叠，并且通过一种在翻译过程中、以5-10％的频率发生的核糖体移码现象(ribosomal frame-shifting event)而产生一种分子量为160kDa的Gag-Pol前体蛋白质(Pr160)(Jacks等，1988)。该pol基因编码若干开放阅读框架，包括HIV-1的蛋白酶、逆转录酶、核糖核酸酶H及整合酶。Env开放阅读框架位于pol的下游并且编码一种分子为160kDa、病毒包膜蛋白质gp41和gpl20的前体蛋白质(gpl60)(Luciw，1996)。

感染了宿主细胞后，HIV-1的RNA就会逆转录成DNA，该DNA随后整合到宿主的基因组中(前病毒期)。该Gag前体和Gag-Pol前体被从细胞液中被转录的HIV-1前病毒RNA翻译并导向该宿主细胞膜。该Gag前体与两份病毒RNA结合并且与Gag-Pol前体相互作用，以形成沿宿主细胞膜排列的颗粒样结构。他们以这样的方式聚集以诱导膜弯曲及随后的芽形成，在此期间，病毒Env蛋白质也参与颗粒的形成。在该颗粒从膜上脱离(pinch off)之后，该HIV-1颗粒成熟，同时蛋白质酶将Gag和Gag-Pol分解为成熟的结构蛋白质和功能蛋白质，使得核浓缩及由此产生一成熟的传染性病毒。

在哺乳动物和昆虫细胞中，在没有任何其它编码HIV基因的情况下，Pr55 Gag曾被显示组装入病毒样颗粒(VLPs)中。这些颗粒与未成熟的HIV病毒的形态非常相似并且是非传染性的(Overton等，1989；Gheysen等，1989；Royer等，1991；Royer等，1992；Shioda和Shibuta，1990；Vernon等，1991；Mergener等，1992)。人们发现许多的Gag区在驱使该颗粒的装配过程中具有重要作用，并且，事实上约80％的这种前体蛋白质可以被缺失或被异源序列置换而不会明显影响VLP的产生(Accola等，2000)。关于各个含有Gag的蛋白质的功能，将下在面讨论这些重要的区域。

MA蛋白质(p17)

Gag的MA区(图2)包括132个氨基酸，并且负责将Gag蛋白质导向质膜及病毒样颗粒的装配。位于MA的N端的M区(逆转录酶病毒膜联区(membrane-binding domain))主要担负此功能。MA具有一N端甘氨酸残基，该残基被发现是将Gag导向宿主细胞膜和便于颗粒装配所必须的(Gheysen等，1989)。为了实现上述功能，该甘氨酸残基必须经过十四烷基化(myristylated)。Gag的N端上发生十四烷基化的氨基酸识别序列是gly-x-x-x-ser/thr。

已证明在宿主细胞膜上，经过十四烷基化的HIV-1 Gag前体的导向和积累发生在感染杆状病毒(baculovirus-infected)的酵母细胞、昆虫细胞及哺乳动物细胞内(Jacobs等，1989；Gheysen等，1989；Bryant和Ratner，1990)。甘氨酸残基的取代会破坏(erradicated)颗粒的形成，甘氨酸残基的互补会恢复VLP的生产，并且当使用myr^-突变株时，人们发现Gag前体在感染细胞的胞质中积累，但并不与宿主细胞膜相连。因此，该十四烷基部分是稳定地结合膜和颗粒所必需的。只有完全抑制Gag的十四烷基化，才能防止VLP出芽(Morikawa等，1996)，也就是说，仅仅少数十四烷基化的Gag分子就足以完成质膜的导向和出芽。

Spearman(1997)曾指出豆蔻酸是Gag-宿主细胞膜稳定的主要决定因素，因此对于颗粒装配具有重要作用。Paillart和Gttlinger(1999)曾提出一种模型，其结果显示Gag的N端对于插入宿主细胞膜是至关重要的。

除了该十四烷基化信号，有资料表明MA的其他区域对于将Gag导向宿主细胞膜及随后的颗粒装配是重要的。Fcke等(1993)提出MA的大部分缺失(AA16-99)会导致颗粒形态的显著改变，从而使得在内质网中产生未成熟颗粒。对于将包膜蛋白正确地装配入病毒，MA是必需的。

Yuan等(1993)指出各种MA缺失和置换导致病毒颗粒的产生显著降低。他们证明MA的多碱区(polybasic region)(AA20-32)作为到膜的Gag转运信号的一部分是可能的。

Zhou等(1994)进一步研究了该多碱区，并且指出该高碱性残基形成一个带正电荷表面，该带正电荷表面与胞质的脂双层的内表面上的带负电荷的磷脂相互作用。Ono和Freed(1999)曾指出MA的一个单突变(AA6从V至R)可以严重地削弱膜结合而不影响十四烷基化。

衣壳(CA)蛋白质(p24)

CA区(图3)编码一个长度约为230个氨基酸的蛋白质，并且具有若干个可能对颗粒装配起重要作用的区域，其中的第一个区为主要的同源区(MHR)。从CA下游的N端延伸到MHR的区域对于颗粒的形成不是必要的，但任何进一步延伸至MHR的进一步缺失都会削弱颗粒的生产(Borsetti等，1998)。Zhao等，(1994)也提出包括一个AA140-150的10个氨基酸缺失和一个AA250-260的间隔缺失的HIV-1 CA的杆状病毒结构可导致在昆虫细胞的细胞膜上积累病毒蛋白质。然而，没有颗粒装配或胞外出芽表明CA的这两个区至少，必须在正常的颗粒形成中扮演某种角色。

另一方面，Borsetti等(1998)指出在MA(除了该十四烷基锚以外)和该CA区的N端都不存在的情况下，可以形成有效的颗粒，因此，可推定在十四烷基锚和MHR之间没有明显的区域对于有效颗粒的释放或装配是绝对必要的。他们推定Gag的C端一半(C-terminal half of Gag)包括蛋白质-蛋白质相互作用区，该区对于有效颗粒的装配是必要的。

似乎该C端序列是蛋白质-蛋白质相互作用所必需的，但不是球形颗粒的形成所必需的，该球形是由CA区上的N端延伸的存在决定的。

人们(Gheysen、Shioda和Shibuta)报导过该颗粒中存在RNA(大小不均一且是病毒及细胞源的)。

还有关于截断P2间隔区以破坏颗粒的形成的报导。

间隔区2(p2)

Borsetti等于1998年指出，p2的存在或缺乏分别决定将Gag蛋白质装配到球形颗粒或圆柱状颗粒。Morikawa等(2000)也证实了该区对于VLP的生产是必需的，因为如果该区被以任何方式截断，VLP的生产就被破坏了。

核衣壳(NC)蛋白质(p7)

已证实该NC区(图4)包括两个高度保守的Cys-His盒，该盒类似于经常出现在DNA结合蛋白质中的锌指基序(zinc finger motifs)。该盒被认为在RNA结合和衣壳化中起作用，但是也影响颗粒装配的其他方面。有两个高碱性区在这两个锌指基序的侧面，这两个锌指基序被提出对体外的RNA结合有影响并且，如果其被突变，则会影响RNA衣壳化进入病毒体。Jowett等(1992)指出该第二Cys-His盒的缺失并不影响颗粒形成，但显著降低了RNA结合。然而，他们还指出两个Cys-His盒的缺失促进大颗粒的形成和RNA结合的降低。Cys-His盒上游序列的缺失使得颗粒形成能力完全被破坏。

Dawson和Yu(1998)提出该NC区对于HIV-1的有效装配是必要的，而且对于生产野生型浓度(wildtype density)颗粒是必要的。

除该Cys-His盒外，人们还发现靠近NC的N端的一个I区(相互作用区或装配区)，其负责Gag蛋白质复合体的形成，也负责质膜Gag蛋白质的点状转化灶(punctate foci)的形成。有两个带有正电荷的碱性精氨酸残基(AA380和AA384)已被指出对于该N端I区(相互作用区或装配区)的功能是至关重要的。Sandefur等(2000)曾提出I区-缺陷型突变株阻断出芽VLP的形成。

间隔区1(p1)

CA和NC被一个短的间隔区SP1分隔，该间隔区SP1为蛋白酶剪切位点。Wiegers等(1998)曾指出当从NC处剪切SP1被阻断，颗粒的成熟就会被延迟，并且该核糖核蛋白核心具有一不规则结构。然而，当从CA处剪切SP1被阻断，产生了核糖核蛋白核心的正常凝聚，但是衣壳凝聚被抑制了。他们因此推定HIV成熟是一个连续过程，该过程由在单独位点处的剪切率所控制。

P6蛋白质

在Gag的C端区(P6)(图5)内具有控制颗粒大小的重要因素，因为有资料表明该区的各种缺失和置换诱导非常大的颗粒的形成(Garnier等，1998)。在P6中，一个被称为晚(L)区的特定间隔区已被确定对于病毒-细胞分离步骤具有重要作用。该区有一PTAPP氨基酸序列。人们认为，P6中该区的下游序列对于病毒释放是不必要的。

Gag景响VLP形成的其他特征

Buck等(2001)最近发现HIV-1 Gag开放阅读框架的mRNA显示了启动Gag翻译起始、生产40kDa Gag蛋白质的内部核糖体插入位点(IRES)的活性。该IRES位于靠近CA的N端的一个内部AUG密码子处。由于翻译的起始被认为是在与该mRNA帽结构无关的其他宿主细胞因子的参与下，被核糖体的直接结合启动的，因此，当Gag在体外系统中表达时，就会产生结果。

VLP装配和释放所需的最小HIV-1 Gag序列

尽管有人已报道了Gag的许多区在Gag VLP装配和释放中具有独特的功能，但Gag的缺失突变株显示其中多个区不是必要的，并且有人已提出VLP的装配对于Gag蛋白质的重要修饰有令人惊讶的耐受性(Wang等，1998；Accola等，2000；Wilk等，2001)。Wang等(1998)制备了系列C端截短型突变体，并用之检测生产VLP的能力。缺乏大部分的C端Gag的截短型Gag前体被装配到颗粒中并被从哺乳动物细胞中释放出来。缺失大部分的MA和整个P6区的突变体仍然产生颗粒，尽管所产生的颗粒少于野生型颗粒。能够进行VLP装配的最小Gag是一个28kDa的蛋白质，该蛋白质由少量MA氨基酸和CA-p2区组成。当大部分的MA区缺少时，CA的N端部分似乎是至关重要的，意味着需要一完整的CA区装配和释放颗粒。Accola等(2000)提出80％的Gag可缺失或被异源性序列置换而不会显著地破坏VLP的产生。该仍能有效地形成VLP的最小嵌合分子为16kDa。该结构含有一酵母转录因子GCN4的亮氨酸锌区以取代核壳体的装配功能，其后还有一PPPPY基序以提供L区功能，并且该结构仅保留该十四烷基化信号和Gag的C端CA-p2区。

Gag引起免疫反应的能力

对付AIDS流行的长期办法是通过用一种适当的疫苗进行免疫，并且有目前用于开发疫苗的大量的HIV-1基因和抗原表位。尽管到目前为止没有使用Gag疫苗，但是许多的研究已表明在感染HIV-1的病人及被新疫苗攻击的动物中，该蛋白质诱导一种免疫反应(Friedman等2000；Revskaya和Frankel，2001)。有文章表明该反应在某些情况下是体液和细胞共同介导的(Qui等，1999；Leung等，2000；Qui等，2000；Montefiori等，2001；Kazanji等，2001)。

Goulder等(2000)已研究确定该抗原表位决定被全球流行病冲击最严重的族群和年龄群中的CTL反应。他们集中在Gag上，因为许多的Gag特异性反应被发现是与HIV感染中的保护反应有关(Nixon和McMichael，1991；Riviere等，1995)。该优势免疫Gag-特异CTL反应似乎集中在3个高度免疫原区，该3个区横跨Gag p17和Gag p24蛋白质全长的16％，但其却表现出所检测到的三分之二的占优势的Gag-特异CTL反应。该结果表明Gag是疫苗设计的一个理想的候选物。

植物作为疫苗源

有许多的使用植物作为外源蛋白来源的例子，并且这些植物被认为是大规模蛋白质生产的可行的且有竞争力的表达系统(Doran，2000)。赞成使用其的理由包括具有大规模、低成本生物量生产的潜能、被哺乳动物病毒和其他动物病原体污染的风险较小、植物细胞正确地折叠和组装多亚基蛋白质的能力，以及对植物食品或饲料中蛋白质口服给药的低处理要求。因此，他们考虑一个可行的选择，以生产外源蛋白质，该蛋白质可用作疫苗。

许多潜在有用的疫苗候选者是在植物中生产而在动物中检验。一种有用的用于将外源基因导入植物的技术是通过病毒载体传递的。

由于在外壳蛋白基因上的融合，Usha等(1993)曾使用豇豆花叶病毒(CPMV)颗粒表达在其外壳蛋白上的口蹄疫病毒(FMDV)的抗原表位。

Koo等(1999)通过将来自鼠肝炎病毒(MHV)的短抗原表位融合到烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白上，随后使其在烟草植物中繁殖，从而得到烟草花叶病毒的杂种。

Fernández-Fernández等(2001)曾经开发了一种用于表达外源蛋白质的李痘疫病毒载体。他们用其表达一种兔出血症病毒(RHDV)的抗原性结构蛋白，制备嵌合病毒颗粒，当该嵌合病毒颗粒被接种到兔体内，会产生一种抗RHDV的免疫反应。

还有其他许多方法用于在植物中生产疫苗候选者。McCormick等(1999)表明对TMV载体进行修饰使得该载体不仅在植物中产生单链Fv片段，而且将该片段分泌到质外体中。这就使得产物的收获比不得不从叶提取物中分离该外源蛋白简单了许多。人们还尝试用转基因植物生产用作疫苗候选者的外源蛋白。Mason等(1996)曾用转基因烟草和马铃薯成功地生产诺沃克病毒衣壳蛋白，该蛋白在鼠中表现出免疫原性。Wigdorowitz等(1999)用转基因紫花苜蓿植物表达一种抗FMDV的抗原蛋白，并且表明经纯化后的抗原免疫的动物显示抗病毒的免疫原性。

还有几种在植物中生产抗HIV-1的候选疫苗的尝试。Yusibov等(1997)曾将苜蓿花叶病毒的衣壳蛋白作为载体分子以表达来自HIV-1(V3环)的抗原肽。带有编码该抗原肽序列的重组病毒的体外转录是从DNA结构合成的，并且被用于接种烟草植物。该重组病毒颗粒被生产、纯化并用于老鼠的免疫。该抗原在被免疫的老鼠体内产生特异性病毒中和抗体。Zhang等(2000)将一番茄丛矮病毒(TBSV)用作一种HIV-1p24蛋白质的表达载体。该基因作为一与TBSV外壳蛋白ORF的5′端部分的框架内融合(in-frame fusion)被导入到该TBSV基因组中。导入植物导致接种叶片内的p24融合蛋白的积累。

到目前为止，还没有关于GAG VLPs在植物中正确装配的能力的文献报导。尽管曾有报导说一些蛋白质，甚至是一些HIV蛋白质在植物和昆虫体内被装配到VLPs中，但是许多其他的蛋白质根本没有或不能正确地装配到植物或昆虫中，并且对哺乳动物的研究也不能准确地表明VLPs是否同样可以在植物或昆虫中产生。

发明内容

根据本发明的第一实施方式，本发明提供一种含有编码一种HIVGag多肽的核苷酸序列的载体，其中，该编码Gag多肽的核苷酸序列包括一个与SEQ ID NO：1所述序列具有至少90％的序列一致性的序列。

根据本发明的第二实施方式，本发明提供一种含有编码一种HIVGag多肽的核苷酸序列的载体，其中，该编码Gag多肽的核苷酸序列包括一个与SEQ ID NO：2所述序列具有至少90％同源性的序列。

上述两种实施方式中的载体可以是一种植物病毒载体，例如，一种如pBSG1057载体的烟草花叶病毒源(tobacco mosaic virus-derived)cDNA克隆载体，或是一种马铃薯Y病毒属源(potyvirus-derived)cDNA，如烟草蚀刻病毒(tobacco etch virus)(TEV)或芜菁花叶病毒(turnipmosaic virus)(TuMV)。该载体还可以是一种含有一T源质粒结构(T-derived plasmid construct)的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

或者，该载体可以是一种杆状病毒(baculovirus)载体，如杆粒(bacmid)载体。

根据本发明的第三实施方式，本发明提供一种包括基本如上述载体的细胞，其中该核苷酸序列可操作地与适于该细胞表达的控制元件相连。

该细胞可以是一种植物细胞或昆虫细胞。例如，该细胞可以是一种本塞姆氏烟草(N.benthamiana)植物细胞或一种Sf 21细胞、Sf 9细胞或类似的细胞。

根据本发明的第四实施方式，本发明提供一种生产一种HIV-1免疫原蛋白质或相关多肽的方法，该方法包括如下步骤：

将一载体或载体系统导入宿主细胞中，该载体或载体系统含有一编码HIV-1免疫原蛋白质或通过取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸，和/或其一端或两端的延伸或截短而衍生得到的相关多肽的核酸序列，该核酸序列具有与SEQ ID NO：1所述序列至少90％的一致性；

在宿主细胞中表达该核酸序列；及

回收在该宿主细胞中所生产的HIV-1免疫原蛋白质或相关多肽。

根据本发明的第五实施方式，本发明提供一种生产一种HIV-1免疫原蛋白质或相关多肽的方法，该方法包括如下步骤：

将一载体或载体系统导入宿主细胞中，该载体或载体系统含有一编码HIV-1免疫原蛋白质或通过取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸，和/或其一端或两端的延伸或截短而衍生得到的相关多肽的核酸序列，该核酸序列具有与SEQ ID NO：2所述序列至少90％的一致性；

在宿主细胞中表达该核酸序列；及

该载体和宿主细胞可以是基本如上所述的载体和宿主细胞。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种基本如上述方法生产的HIV-1蛋白质或多肽。

该蛋白质可以是一种HIV-1 Pr55 Gag蛋白质，且可以被装配成病毒样颗粒(VLPs)的形式。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供一种用于治疗或预防哺乳动物感染HIV的疫苗，该疫苗包括基本如上所述的蛋白质或多肽的病毒样颗粒。

该疫苗可诱导一种针对适当易感宿主中病毒样颗粒的免疫反应。

该疫苗可包括一种药学上的赋形剂和/或辅料，以及一种治疗上的有效剂量的病毒样颗粒。

附图说明

图1所示为HIV-1基因组的gag的开放阅读框架；

图2所示为图1的gag基因的基质(MA)蛋白(p24)区；

图3所示为图1的gag基因的衣壳(CA)蛋白(p24)区；

图4所示为图1的gag基因的核衣壳(NC)蛋白(p7)区；

图5所示为图1的gag基因的p6蛋白质区的区；

图6所示为用于克隆至pBSG1057(SEQ ID NO：1)中的Du422 gag序列的DNA序列。粗体下划线表示该gag基因，虚线下划线表示部分pol框；

图7所示为pBSG1057的质粒图；

图8所示为pBSGgag6的质粒图；

图9所示为pBSGgagpot11的质粒图；

图10所示为天然的Du422 gag序列(SEQ ID NO：2)的DNA序列；

图11所示为通过使用anti-p17单克隆抗体(Chemicon公司)免疫截留(immunotrapped)到碳包网(carbon-coated grids)上的由于gagopt表达产生的HIV-1亚型C Pr55 Gag VLPs(该条形表示100纳米)。

图12所示为(a)在转染Sf21细胞中产生的HIV-1亚型C Gag VLP和(b)从Sf21质膜出芽进入细胞外介质的Gag VLP(条形代表100纳米)；

图13所示为图6的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)；及

图14所示为图10的核苷酸序列的氨基酸序列(SEQ ID NO：4)。

具体实施方式

现参照本发明的具体实施方式，对本发明进行更详细的描述。

将Gag克隆到TMV载体pBSG1057

通过使用大规模生物技术公司(Large Scale Biology Corporation)的载体质粒pBSG1057，可在烟草中获得瞬时表达。当在体外被转录成RNA时，该载体提供一种表达天然或植物密码子优化的Du422 Pr 55 Gag的易感工程烟草花叶病毒。

该Gag基因来自HIV-1分离DU422株(得自南非性工作者组，在欧洲细胞培养物保藏中心的临时保藏号为01032114)(图6)。该Gag基因包括整个Gag基因序列和pol基因序列的前57个碱基(SEQ ID NO：2)。该Gag基因被克隆到一个大肠杆菌载体pGEM-T easy^TM的EcoRI和SalI限制性酶位点内。该基因两端通过PCR扩增进行修饰，使得PacI和XhoI限制性酶位点就分别与5′和3′端连接，以便于克隆到TMV载体pBSG1057内(图7)。扩增的产物被重新克隆到pGEM-Teasy^TM内并且进行测序以验证该限制性酶位点和gag序列的完整性。

通过PacI和XhoI限制性酶消化，将该绿色荧光蛋白(GFP)基因序列从pBSG1057上切割下来，并且将gag在这2个位点处克隆到TMV载体中以生产该克隆pBSGgag6(图8)。

可以得知，该同样的gag结构可以被框内(in frame)克隆到马铃薯Y病毒属源cDNA克隆中，被衍生自马铃薯Y病毒属蛋白组的、适当的内切蛋白酶识别序列侧翼包围(flank)，用于通过体外转录的易感重组马铃薯Y病毒属RNA的表达。对于来自任何植物病毒的载体，结果是相同的。

还可以得知，可以通过用一种根癌农杆菌悬浮液渗透烟草叶的方式实现在烟草中的大规模瞬时表达。使用该方法，可以转化许多细胞，并且可躯体地(somatically)产生该蛋白质，而不是首先必须产生愈合组织，然后产生转基因植物(Kapila等，1997)。该载体可以是含有一种T源质粒结构的根癌农杆菌。

烟草蚀刻病毒，例如可从大规模生物公司获得的这类病毒，也可用于本发明。

烟草gag基因的密码子优化

采取另一种策略进行烟草gag基因密码子优化，合成该基因，并且使用与上述相似的策略将该基因克隆到pBSG1057 TMV载体，以希望当该基因被导入本塞姆氏烟草中时，可以加强Gag蛋白质的表达。该密码子优化的gag基因序列(SEQ ID NO：1)在被去除了GFP后，被克隆到pBSG1057的PacI和XhoI限制性酶位点内。所得的克隆被称为pBSGgagopt11(图9)。

pBSGgaq6、PBsGgagopt11和pBSG1057的转录

使用Ribomax转录/翻译试剂盒(Promega公司)制备pBSGgag6、pBSGgagopt11和pBSG1057的mRNA。每个反应使用10微克的各种质粒。

用重组TMV mRNA感染本塞姆氏烟草

将pBSGgag6和pBSGgagopt11克隆的mRNA转录物以及前述的含有GFP(pBSG1057)的TMV载体接种到本塞姆氏烟草植物中。以水接种的(Water-inoculated)植物作为阴性对照。

用药棉棒将该mRNA(50μl)擦到一个六周龄本塞姆氏烟草植物的开展的叶子上。该植物在植物室的正常的生长条件下生长，并且每天用UV灯监控采用pBSG1057 mRNA转录物接种的对照植物的接种后的叶子和上面的叶子中绿色荧光点(GFP)的出现，并且监控在接种的pBSGgag6、接种的pBSGgagopt11及接种的pBSG1057植物中的TMV症状。以GFP的系统散布作为TMV重组体系统散布的指示剂，以叶子为样品，用于使用蛋白质印迹法(Western blotting)、EM分析法和酶联免疫吸附分析(ELISA)检测Gag蛋白质。

TMV症状和GFP荧光：

接种后(dpi)第4天，就可以在UV灯下看到在那些感染有pBSG1057 mRNA转录物的接种后叶子上有绿色荧光点。接种后10天，就可以看到绿色荧光点扩散到上面的叶子上。接种后第17天，在接种pBSG1057的植物的新生长部分可看到有TWV症状，并且接种后第24天，在接种pBSGgag6和接种pBSGgagopt11的植物的新生长部分可看到有TWV症状。

检测Gag蛋白质

粗蛋白质的制备是通过用研钵和研杵将叶子粉碎，用粗棉布(cheesecloth)过滤剩余的固体物质，并加入上样缓冲液完成的。

蛋白质印迹法

将该样品煮沸5分钟，跑10％SDS聚丙烯酰胺凝胶以分离该蛋白质。已解析的蛋白质(resolved proteins)被从该SDS聚丙烯酰胺凝胶上转移(transblotted)到硝化纤维膜上。用一种稀释为1∶200的抗鼠p17单克隆抗体(Chemicon公司)检测(probe)该膜。

与杆状病毒产生的、突出存在一种55kD蛋白质的gag(见下述内容)相比，含有从接种pBSGgag6和接种pBSGgagopt11的叶子中制得的粗蛋白质的泳道(lane)并未产生任何积极的结果。

EM分析Gag VLPs(免疫截留的)

在PBS(pH7.4)中，将粗顶端(crude apical)叶提取物(35dpi)磨碎，然后低速离心成残留有未磨过组织的粒状沉淀。将少量的叶提取物在铜网格上干燥，并被一种稀释为1∶200的抗鼠p17单克隆抗体(Chemicon公司)免疫截留。将该网格用乙酸铀酰复染色，并用透射电子显微镜进行观察。

有非常少量的植物材料出现在接种pBSG1057的样品(无大小为100至120纳米的颗粒)和非常少量的TMV颗粒中。

在来自本塞姆氏烟草植物的浓缩提取物中可检测到明显的病毒样颗粒，该颗粒在形态学上与杆状病毒表达的Gag Pr55 VLPs(图12)一致。在该接种pBSGgag6的样品中，有大量的100-110纳米大小的VLPs，以及少量的TMV亚单位大小的颗粒(25纳米)。在该接种pBSGgagopt11的样品中，具有形似于、但少于在该接种pBSGgag6的样品中所看到的100-110纳米大小颗粒的颗粒。

ELISA

将粗叶提取物低速离心成残留有未磨过组织的粒状沉淀。将少量该粒状沉淀稀释于1×PBS中，并通过使用Vironostika^ p24 HIV-1抗原ELISA试剂盒检测p24抗原。

酶联免疫吸附分析蛋白质粗制备物的初步结果表明，接种pBSGgagopt11的叶子中的gag蛋白质是以每毫升粗制备蛋白质溶液含有460微微克的水平存在。在经适当载体系统感染的本塞姆氏烟草植物中，gagopt基因的表达显著地高于天然的gag基因。

HIV-1亚型C gag VLPs的杆状病毒表达

使用Bac-to-Bac^杆状病毒表达系统(生命技术公司)制备HIV-1亚型C Gag VLPs。它们提供一种相应的阳性对照用于进一步的蛋白质(Gag)检测试验，并且可被用于产生针对HIV-1亚型C Gag的特异性抗体。

将该来自南非的HIV Du422分离株(Williamson等，2003)(SEQID NO：2)的HIV-1亚型C Gag基因克隆到pFastBacl的多克隆位点，然后转移到感受态(competent)大肠杆菌DH10Bac细胞中，然后筛选以成功移置到杆状病毒穿梭载体(杆粒)中。

根据生产商协议(Gibco生命科学公司)，通过重组体杆状病毒表达该全长十四烷基化的Pr55Gag前体蛋白，在草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(Sf21)细胞中生产Gag VLPs。在28℃条件下，将该细胞在补充有胎牛血清的TC100培养基(Gibco生命科学公司)中培养84小时。

由于该克隆的gag基因包括一个N端甘氨酸残基序列，所以人们期望该重组蛋白质被靶向至该宿主质膜。因此，所形成的VLPs随后就从细胞表面芽生到昆虫细胞培养基中。将被转染的Sf21细胞与通过在3000g的离心过滤而与芽生到培养基的VLPs分离。如上所述，Nermut等(1994)将推定的Pr55Gag VLPs从蔗糖密度梯度培养液中纯化出来。将纯化后的VLPs在4℃的1×磷酸盐缓冲盐液(PBS)中透析16小时，并在10％凝胶上SDS-PAGE后，通过使用稀释为1∶1000的1×PBS(pH7.4)的HIV-1 p17的抗血清(ARP431，NIBSC)，采用蛋白质印迹法检测Gag的含量和完整性。

可以通过透射电子显微镜(TEM)观察到Sf21细胞生产VLP的过程。通过将细胞按序固定到1倍的PBS(pH7.4)中的2.5％戊二醛和1％的四氧化锇中，将重组感染病毒的细胞制备成超薄切片(ultrathinsectioning)。在1×PBS和水中清洗固定的细胞，然后使之在梯度乙醇溶液和100％丙酮中脱水，然后将其包埋在斯扑(Spurrs)树脂中并被截短。用2％乙酸铀酰和雷诺兹(Reynolds)柠檬酸铅对该切片部分进行染色，并用放大率为12000×至100000′，加速电压为80千伏的ZeissS1109电子显微镜进行观察。

通过将该细胞外介质中收获的Gag VLP吸附到碳包铜网格上，用2％乙酸铀酰或2％甲胺钨酸盐对进行染色后，进行TEM观察(图12)。

在该电子显微镜下，可观察到直径约为110-120纳米的VLPs，从而验证了成功地生产了gag VLP。使用蛋白质印迹法分析，可以观察到解析到SDS page胶的样品中有一个单个的分子量为55kD的蛋白质带，并且可以看到gag P17蛋白质的单克隆抗体和多克隆抗体活跃地反应。使用蛋白质印迹法分析，随后还检测到两个另外的抗杆状病毒源VLPs的gag P24蛋白质的单克隆抗体，并且积极地反应。

疫苗开发

如上所述，在植物细胞和昆虫细胞内制得的免疫原VLPs可被用于制备一种用于治疗或预防哺乳动物感染HIV的疫苗。该疫苗被期望可以在该哺乳动物体内诱导产生一种对该病毒样颗粒的免疫反应。除了含有一种治疗上的有效剂量的病毒样颗粒外，该疫苗还包括一种药学上的赋形剂和/或辅料。

尽管上述对本发明的描述是通过参照具体的实施方式进行的，但并非意在用上述内容限制本发明。

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序列表

<110>开普敦大学

南非医学研究会

<120>一种生产HIV-1的GAG病毒样颗粒的方法

<130>PA132610/PCT

<140>PCT/IB03/

<141>2003-12-04

<160>4

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1549

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus type 1)

<400>1

gaattcatgg gtgcgagagc gtcaatatta agaggggaaa aattagataa atgggaaaag 60

attaggttaa ggccaggggg aaagaaacat tatatgttaa aacacatagt atgggcgagc 120

agggagctgg aaagatttgc acttaaccct ggccttttag aaacatcaga aggatgtaaa 180

caaataatga aacagctaca accagctctc cagacaggaa cagaggaact taaatcatta 240

tacaacacag tagcaactct ctattgtgta catgaaaaga tagaagtacg agacaccaag 300

gaagccttag ataagataga ggaagaacaa aacaaatgtc agcaaaaaac gcagcaggca 360

aaagcggctg acgggaaagt cagtcaaaat tatcctatag tgcagaatct ccaagggcaa 420

atggtacatc aagccatatc acctagaacc ttgaatgcat gggtaaaagt aatagaagaa 480

aaggctttta gcccagaggt aatacccatg tttacagcat tatcagaagg agccacccca 540

caagatttaa acaccatgtt aaatacagtg gggggacacc aagcagccat gcaaatgtta 600

aaagatacta ttaatgaaga ggctgcagaa tgggatagat tacatccagt ccatgcgggg 660

cctattgcac caggccagat gagagaacca aggggaagtg acatagcagg aactactagt 720

acccttcagg aacaaatagc atggatgaca agtaacccac ctattccagt gggagacatc 780

tataaaagat ggataattct ggggttaaat aaaatagtga gaatgtatag cccggtcagc 840

attttggaca taagacaagg gccaaaggaa ccctttcgag actatgtaga tcggttcttt 900

aaaactttaa gagctgaaca agctacacaa gaagtaaaaa attggatgac agacaccttg 960

ttagtccaaa atgcgaaccc agattgtaag accattttga gagcattagg accaggggct 1020

acattagaag aaatgatgac agcatgtcaa ggggtgggag gacctggcca caaagcaaga 1080

gtattggctg aggcaatgag tcaaacaaac agtggaaaca taatgatgca gagaagcaat 1140

tttaaaggcc ctagaagaat tgttaaatgt tttaactgtg gcaaggaagg gcacatagcc 1200

agaaattgca gagcccctag gaaaaaaggc tgttggaaat gtggaaaaga aggacaccaa 1260

atgaaagact gcactgagag gcaggctaat tttttaggga aaatttggcc ttcccacaag 1320

gggaggccag ggaatttcct tcagaacaga ccagagccaa cagccccacc agcagagagc 1380

ttcaggttcg aagagacaac ccccgctccg aaacaggagc cgatagaaag ggaaccctta 1440

acttccctca aatcactctt tggcagcgac cccttgtctc aataaaagta gggggccaga 1500

caagggaggc tctcttagac acaggagcag atgatacagt attgtcgac 1549

<210>2

<211>1479

<212>DNA

<213>人免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus type 1)

<400>2

atgggtgcga gagcgtcaat attaagaggg gaaaaattag ataaatggga aaagattagg 60

ttaaggccag ggggaaagaa acattatatg ttaaaacaca tagtatgggc gagcagggag 120

ctggaaagat ttgcacttaa ccctggcctt ttagaaacat cagaaggatg taaacaaata 180

atgaaacagc tacaaccagc tctccagaca ggaacagagg aacttaaatc attatacaac 240

acagtagcaa ctctctattg tgtacatgaa aagatagaag tacgagacac caaggaagcc 300

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ttaaacacca tgttaaatac agtgggggga caccaagcag ccatgcaaat gttaaaagat 600

actattaatg aagaggctgc agaatgggat agattacatc cagtccatgc ggggcctatt 660

gcaccaggcc agatgagaga accaagggga agtgacatag caggaactac tagtaccctt 720

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agatggataa ttctggggtt aaataaaata gtgagaatgt atagcccggt cagcattttg 840

gacataagac aagggccaaa ggaacccttt cgagactatg tagatcggtt ctttaaaact 900

ttaagagctg aacaagctac acaagaagta aaaaattgga tgacagacac cttgttagtc 960

caaaatgcga acccagattg taagaccatt ttgagagcat taggaccagg ggctacatta 1020

gaagaaatga tgacagcatg tcaaggggtg ggaggacctg gccacaaagc aagagtattg 1080

gctgaggcaa tgagtcaaac aaacagtgga aacataatga tgcagagaag caattttaaa 1140

ggccctagaa gaattgttaa atgttttaac tgtggcaagg aagggcacat agccagaaat 1200

tgcagagccc ctaggaaaaa aggctgttgg aaatgtggaa aagaaggaca ccaaatgaaa 1260

gactgcactg agaggcaggc taatttttta gggaaaattt ggccttccca caaggggagg 1320

ccagggaatt tccttcagaa cagaccagag ccaacagccc caccagcaga gagcttcagg 1380

ttcgaagaga caacccccgc tccgaaacag gagccgatag aaagggaacc cttaacttcc 1440

ctcaaatcac tctttggcag cgaccccttg tctcaataa 1479

<210>3

<211>513

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus type 1)

<400>3

Glu Phe Met Gly Ala Arg Ala Ser Ile Leu Arg Gly Glu Lys Leu Asp

1 5 10 15

Lys Trp Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys His Tyr Met

20 25 30

Leu Lys His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu

35 40 45

Asn Pro Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Met Lys

50 55 60

Gln Leu Gln Pro Ala Leu Gln Thr Gly Thr Glu Glu Leu Lys Ser Leu

65 70 75 80

Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys Ile Glu Val

85 90 95

Arg Asp Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys

100 105 110

Cys Gln Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gly Lys Val Ser

115 120 125

Gln Asn Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln

130 135 140

Ala Ile Ser Pro Arg Thr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu

145 150 155 160

Lys Ala Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Thr Ala Leu Ser Glu

165 170 175

Gly Ala Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly

180 185 190

His Gln Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala

195 200 205

Ala Glu Trp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro

210 215 220

Gly Gln Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser

225 230 235 240

Thr Leu Gln Glu Gln Ile Ala Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro

245 250 255

Val Gly Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Ile Leu Gly Leu Asn Lys Ile

260 265 270

Val Arg Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro

275 280 285

Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg

290 295 300

Ala Glu Gln Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Asp Thr Leu

305 310 315 320

Leu Val Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Ile Leu Arg Ala Leu

325 330 335

Gly Pro Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val

340 345 350

Gly Gly Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln

355 360 365

Thr Asn Ser Gly Asn Ile Met Met Gln Arg Ser Asn Phe Lys Gly Pro

370 375 380

Arg Arg Ile Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala

385 390 395 400

Arg Asn Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys

405 410 415

Glu Gly His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu

420 425 430

Gly Lys Tle Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln

435 440 445

Asn Arg Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ser Phe Arg Phe Glu

450 455 460

Glu Thr Thr Pro Ala Pro Lys Gln Glu Pro Ile Glu Arg Glu Pro Leu

465 470 475 480

Thr Ser Leu Lys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Leu Ser Gln Lys Gly

485 490 495

Ala Arg Gln Gly Arg Leu Ser Thr Gln Glu Gln Met Ile Gln Tyr Cys

500 505 510

Arg

<210>4

<211>492

<212>PRT

<213>人免疫缺陷病毒1型(Human immunodeficiency virus type 1)

<400>4

Met Gly Ala Arg Ala Ser Ile Leu Arg Gly Glu Lys Leu Asp Lys Trp

1 5 10 15

Glu Lys Ile Arg Leu Arg Pro Gly Gly Lys Lys His Tyr Met Leu Lys

20 25 30

His Ile Val Trp Ala Ser Arg Glu Leu Glu Arg Phe Ala Leu Asn Pro

35 40 45

Gly Leu Leu Glu Thr Ser Glu Gly Cys Lys Gln Ile Met Lys Gln Leu

50 55 60

Gln Pro Ala Leu Gln Thr Gly Thr Glu Glu Leu Lys Ser Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Thr Val Ala Thr Leu Tyr Cys Val His Glu Lys Tle Glu Val Arg Asp

85 90 95

Thr Lys Glu Ala Leu Asp Lys Ile Glu Glu Glu Gln Asn Lys Cys Gln

100 105 110

Gln Lys Thr Gln Gln Ala Lys Ala Ala Asp Gly Lys Val Ser Gln Asn

115 120 125

Tyr Pro Ile Val Gln Asn Leu Gln Gly Gln Met Val His Gln Ala Ile

130 135 140

Ser Pro Arg Ihr Leu Asn Ala Trp Val Lys Val Ile Glu Glu Lys Ala

145 150 155 160

Phe Ser Pro Glu Val Ile Pro Met Phe Thr Ala Leu Ser Glu Gly Ala

165 170 175

Thr Pro Gln Asp Leu Asn Thr Met Leu Asn Thr Val Gly Gly His Gln

180 185 190

Ala Ala Met Gln Met Leu Lys Asp Thr Ile Asn Glu Glu Ala Ala Glu

195 200 205

rrp Asp Arg Leu His Pro Val His Ala Gly Pro Ile Ala Pro Gly Gln

210 215 220

Met Arg Glu Pro Arg Gly Ser Asp Ile Ala Gly Thr Thr Ser Thr Leu

225 230 235 240

Gln Glu Gln Ile Ala Trp Met Thr Ser Asn Pro Pro Ile Pro Val Gly

245 250 255

Asp Ile Tyr Lys Arg Trp Ile Tle Leu Gly Leu Asn Lys Ile Val Arg

260 265 270

Met Tyr Ser Pro Val Ser Ile Leu Asp Ile Arg Gln Gly Pro Lys Glu

275 280 285

Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Phe Lys Thr Leu Arg Ala Glu

290 295 300

Gln Ala Thr Gln Glu Val Lys Asn Trp Met Thr Asp Thr Leu Leu Val

305 310 315 320

Gln Asn Ala Asn Pro Asp Cys Lys Thr Tle Leu Arg Ala Leu Gly Pro

325 330 335

Gly Ala Thr Leu Glu Glu Met Met Thr Ala Cys Gln Gly Val Gly Gly

340 345 350

Pro Gly His Lys Ala Arg Val Leu Ala Glu Ala Met Ser Gln Thr Asn

355 360 365

Ser Gly Asn Ile Met Met Gln Arg Ser Asn Phe Lys Gly Pro Arg Arg

370 375 380

Tle Val Lys Cys Phe Asn Cys Gly Lys Glu Gly His Ile Ala Arg Asn

385 390 395 400

Cys Arg Ala Pro Arg Lys Lys Gly Cys Trp Lys Cys Gly Lys Glu Gly

405 410 415

His Gln Met Lys Asp Cys Thr Glu Arg Gln Ala Asn Phe Leu Gly Lys

420 425 430

Ile Trp Pro Ser His Lys Gly Arg Pro Gly Asn Phe Leu Gln Asn Arg

435 440 445

Pro Glu Pro Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ser Phe Arg Phe Glu Glu Thr

450 455 460

Thr Pro Ala Pro Lys Gln Glu Pro Ile Glu Arg Glu Pro Leu Thr Ser

465 470 475 480

Leu Lys Ser Leu Phe Gly Ser Asp Pro Leu Ser Gln

485 490

Claims

1.一种含有编码一种HIV Gag多肽的核苷酸序列的载体，其特征在于，该编码Gag多肽的核苷酸序列包括一个与SEQ ID NO：1所述序列具有至少90％的序列一致性的序列。

2.一种含有编码一种HIV Gag多肽的核苷酸序列的载体，其特征在于，该编码Gag多肽的核苷酸序列包括一个与SEQ ID NO：2所述序列具有至少90％同源性的序列。

3.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于，该载体是一种植物载体。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，该载体是一种烟草花叶病毒载体。

5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，该载体是一种含一T源质粒结构的根癌农杆菌。

6.如权利要求1或2所述的载体，其特征在于，该载体是一种杆状病毒载体。

7.一种含有如权利要求1-6中任一项所述载体的细胞，其特征在于，该核苷酸序列与适于该细胞内表达的控制元件可操作地连接。

8.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，该细胞是一种植物细胞。

9.如权利要求8所述的细胞，其特征在于，该细胞是一种本塞姆氏烟草植物细胞。

10.如权利要求7所述的细胞，其特征在于，该细胞是一种昆虫细胞。

11.如权利要求10所述的细胞，其特征在于，该细胞是一种Sf 21或Sf 9细胞。

12.一种生产一种HIV-1免疫原蛋白质或一种相关多肽的方法，该方法包括如下步骤：

(a)将一载体或载体系统导入宿主细胞中，该载体或载体系统含有一编码HIV-1免疫原蛋白质或通过取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸，和/或其一端或两端的延伸或截短而衍生得到的相关多肽的核酸序列，该核酸序列具有与SEQ ID NO：1所述序列至少90％的一致性；

(b)在该宿主细胞中表达该核酸序列；及

(c)回收在该宿主细胞中所生产的HIV-1免疫原蛋白质或相关多肽。

13.一种生产一种HIV-1免疫原蛋白质或一种相关多肽的方法，该方法包括如下步骤：

(a)将一载体或载体系统导入宿主细胞中，该载体或载体系统含有一编码HIV-1免疫原蛋白质或通过取代、缺失和/或插入一个或多个核苷酸，和/或其一端或两端的延伸或截短而衍生得到的相关多肽的核酸序列，该核酸序列具有与SEQ ID NO：2所述序列至少90％的一致性；

(b)在该宿主细胞中表达该核酸序列；及

14.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，该载体是一种植物载体。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该载体是一种烟草花叶病毒载体。

16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，该载体是一种含有一T源质粒结构的根癌农杆菌。

17.如权利要求12或13所述的方法，其特征在于，该载体是一种杆状病毒载体。

18.如权利要求12-16中任一项所述的方法，其特征在于，该宿主细胞是一种植物细胞。

19.如权利要求18所述的方法，其特征在于，该植物细胞是一种本塞姆氏烟草植物细胞。

20.如权利要求12、13或17中任一项所述的方法，其特征在于，该宿主细胞是一种昆虫细胞。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，该昆虫细胞是一种Sf 21或Sf 9细胞。

22.一种如权利要求12-21中任一项所述方法生产的HIV-1蛋白质或多肽。

23.如权利要求22所述的蛋白质或多肽，其特征在于，该蛋白质或多肽是一种HIV-1 Pr55 Gag蛋白质。

24.如权利要求22或23所述的蛋白质或多肽，其特征在于，该蛋白质或多肽被装配成病毒样颗粒(VLPs)的形式。

25.一种用于治疗或预防哺乳动物感染HIV的疫苗，该疫苗包括如权利要求22-24中任一项所述蛋白质或多肽的病毒样颗粒。

26.如权利要求25所述的疫苗，其特征在于，该疫苗诱导一种针对适当易感宿主中的病毒样颗粒的免疫反应。

27.如权利要求25或26所述的疫苗，其特征在于，该疫苗包括一种药学上的赋形剂和/或辅料以及一种治疗上的有效剂量的该病毒样颗粒。