CN1547587A - 筛选hiv-1亚型c分离物的方法、所筛选的hiv-1亚型分离物、其基因和修饰物及其衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于筛选HIV－1亚型(clade)C分离物的方法、所筛选出的HIV－1亚型C分离物、以及其基因和修饰物及其衍生物，它们用于预防性和治疗性疫苗中，以便生产用于诱导预防HIV感染或疾病的蛋白和多肽。筛选HIV亚型分离物的方法包括以下步骤：从最近受感染的对象体内分离病毒；通过确定所分离的病毒中的最常见的密码子或氨基酸制备至少一种HIV基因的至少一部分的共有序列；并筛选与所述共有序列有高度序列相同性的分离的病毒。同时提供了被命名为Du422、Du151和Du179(欧洲细胞培养物保藏中心确定的保藏号分别为01032114，00072724和00072725)的HIV－1亚型C分离物。

Description

筛选HIV-1亚型C分离物的方法、所筛选的HIV-1亚型分离物、 其基因和修饰物及其衍生物

发明背景

本发明涉及筛选用于筛选HIV-1亚型(clade)C分离物的方法，所筛选的HIV-1亚型C分离物，其基因和修饰物及其衍生物，它们用于预防性和治疗性疫苗中，以便生产用于诱导预防HIV感染或疾病的蛋白和多肽。

获得性免疫缺陷综合症疾病(AIDS)是由人的免疫缺陷病毒(HIV)引起的。估计世界上有超过三千四百万人是带着HIV/AIDS生活的，超过90％的受感染人群生活在发展中国家(UNAIDS，1999)。据估计，有两千四百万受感染的人居住在次撒哈拉非洲，而南部非洲目前具有世界上增长最快的HIV-1流行病。在1999年底，参加南非政府的产前临床培训的孕妇中超过22％是HIV阳性的(卫生部，2000)。从长远角度来看，预防性疫苗被认为是控制这种流行病的唯一可行方法。

HIV具有显著的遗传学多样性，它妨碍了疫苗的开发。波动的分子基础取决于病毒酶——逆转录酶，它不仅在每一轮复制中导入一个错误，而且还促进了病毒RNAs之间的重组。根据对序列的系统发育分析，业已将HIV划分成多种类型：M型(主要类型)，它包括亚型A-H和K，O型(异常型)和N型(非M、非O型)。业已更经常地鉴定到新的重组病毒，并且有多种这样的病毒已经明显扩散，并且形成了流行病(循环重组形式或CRF)，如西部非洲的亚型A/G重组体，和泰国的CRF A/E重组体(Robertson等，2000)。

在包括博茨瓦纳、津巴布韦、赞比亚、马拉维、莫桑比克和南非在内的南部非洲地区亚型C占主导地位。另外，在坦桑尼亚南部检测到亚型C感染的数量正日益增加。这种亚型同样在埃塞俄比亚和印度占主导地位，并且在中国正变得越来越重要。

疫苗开发的可能遇到的另一个障碍是，随着疾病的发展，HIV改变生物学特性。HIV感染细胞需要两种受体，CD4和共同受体，其中CCR5和CXCR4是HIV-1菌株使用的主要共同受体。最常传染的表型是非合胞体诱导(NSI)巨嗜细胞嗜性病毒，该病毒利用CCR5共同受体进入(R5病毒)。人们认为粘膜中的朗氏细胞能在进入门户选择性地挑选R5变体，并且将其转运到淋巴节，在这里它们进行复制和扩增。随着感染的发展，病毒也进化成具有加强了的在T细胞系中复制的能力和生长的能力。所述合胞体诱导(SI)T-嗜性病毒组合使用CXCR4和CCR5或优选使用CCR5，并且在某些场合下，还使用其他次要共同受体(Connor等，1997，Richman& Bozzette，1994)。不过，HIV-1亚型C病毒似乎不平常，表现在它们不能方便地进行这种表型转换，因为R5病毒在AIDS晚期患者体内同样占主导地位(Bjornal等，1999，Peeters等，1999，Ping等，1999，Tscherning等，1998，Scarlatti等，1997)。

发明概述

根据本发明的一个方面，一种筛选用于开发预防性和治疗性药用组合物的HIV亚型分离物的方法包括以下步骤：

从新感染的对象体内分离病毒；

通过在所分离的病毒中鉴定沿着有关基因的至少一部分的每一个位点上的最常见的密码子或氨基酸，制备至少一种HIV基因的至少一部分的共有序列；和

筛选与所述共有序列具有高度序列相同性的分离的病毒，它是与特定HIV亚型传染相关的一种表型。

所分离的病毒可以具有与类似的攻击菌株相同的亚型。

所述HIV亚型优选是HIV-1亚型C。

对于HIV-1亚型C来说，所述与传染相关的表型通常是使用CCR5共同受体，并且是非合胞体诱导的(NSI)。

根据本发明的另一方面，提供了一种被命名为Du422的HIV-1亚型C分离物，欧洲细胞培养物保藏中心所确定的临时保藏号为01032114。

根据本发明的另一方面，提供了一种被命名为Du151的HIV-1亚型C分离物，欧洲细胞培养物保藏中心所确定的临时保藏号为00072724。

根据本发明的另一方面，提供了一种被命名为Du179的HIV-1亚型C分离物，欧洲细胞培养物保藏中心所确定的临时保藏号为00072725。

根据本发明的另一方面，提供了一种分子，该分子具有：

(i)在序列I.D.No.1所示序列中示出的核苷酸序列；

(ii)相当于序列I.D.No.1所示核苷酸序列的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.1所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.1所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任一项的序列修饰或衍生的序列。

所述的修饰的序列优选在序列I.D.No.7中所示的修饰序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种分子，该分子具有：

(i)序列I.D.No.3所示核苷酸序列；

(ii)与序列I.D.No.3所示核苷酸序列相应的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.3所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.3所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任-项的序列修饰或衍生的序列。

所述的修饰的序列优选在序列I.D.No.9中所示的修饰序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种分子，该分子具有：

(i)序列I.D.No.5所示核苷酸序列；

(ii)与序列I.D.No.5所示核苷酸序列相应的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.5所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.5所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任一项的序列修饰或衍生的序列。

所述的修饰的序列优选在序列I.D.No.11中所示的修饰序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种分子，该分子具有：

(i)序列I.D.No.13所示核苷酸序列；

(ii)与序列I.D.No.13所示核苷酸序列相应的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.13所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.13所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任一项的序列修饰或衍生的序列。

所述修饰序列优选具有与序列I.D.No.11所示分离物Du151的env基因序列相似或相同的修饰。

根据本发明的另一方面，提供了一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.2所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.2所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

所述的修饰的序列优选在序列I.D.No.8中所示的修饰序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.4所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.4所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

所述的修饰的序列优选在序列I.D.No.10中所示的修饰序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.6所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.6所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

所述的修饰的序列优选在序列I.D.No.12中所示的修饰序列。

根据本发明的另一方面，提供了一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.14所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.14所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

所述修饰序列优选具有与序列I.D.No.12所示分离物Du151的env基因的氨基酸序列相似或相同的修饰。

根据本发明的另一方面，HIV-1亚型C的部分gag基因的共有氨基酸序列如下：

GEKLDKWEKI RLRPGGKKHY MLKHLVWASR ELERFALNPG LLETSEGCKQ⁵⁰

IMKQLQPALQ TGTEELRSLY NTVATLYCVH EKIEVRDTKE ALDKIEEEQN¹⁰⁰

KSQQ-CQQKT QQAKAADGG- KVSQNYPIVQ NLQGQMVHQA ISPRTLNAWV¹⁵⁰

EEKAFSP    EVIPMFTALS EGATPQDLNT MLNTVGGHQA AMQMLKDTIN²⁰⁰

EFAAEWDRLH PVHAGPIAPG QMREPRGSDI AGTTSTLQEQ IAWMTSNPPI²⁵⁰

PVGDIYKRWI ILGLNKIVRM YSPVSILDIK QGPKEPFRDY VDRFFKTLRA³⁰⁰

EQATQDVKNW MTD³¹³

根据本发明的另一方面，HIV-1亚型C的部分pol基因的共有氨基酸序列如下：

LTEEKIKALT AICEEMEKEG KITKIGPENP YNTPVFAIKK KDSTKWRKL-⁵⁰

VDFRELNKRT QDFWEVQLGI PHPAGLKKKK SVTVLDVGDA YFSVPLDEGF¹⁰⁰

RKYTAFTIPS INNETPGIRY QYNVLPQGWK GSPAIFQSSM TKILEPFRAK¹⁵⁰

NPEIVIYQYM DDLYVGSDLE IGQHRAKIEE LREHLLKWGF TTPDKKHQKE²⁰⁰

PPFLWMGYEL HPDKWTVQPI QLPEKDSWTV NDIQKLVGKL NWASQIYPGI²⁵⁰

KVRQLCKLLR GAKALTDIVP LTEEAELE ²⁷⁸

根据本发明的另一方面，HIV-1亚型C的部分env基因的共有氨基酸序列如下：

YCAPAGYAIL KCNNKTFNGT GPCNNVSTVQ CTHGIKPVVS TQLLLNGSLA⁵⁰

EEEIIIRSEN LTNNAKTIIV HLNESVEIVC TRPNNNTRKS IRIGPGOTFY¹⁰⁰

ATGDIIGDIR QAHCNISEGK WNKTLQKVKK KLKEELYKYK VVEIKPLGIA¹⁵⁰

PTEAKRRVVE REKRAVGIGA VFLGFLGAAG STMGAASITL TVQARQLLSG²⁰⁰

IVQQQSNLLR AIEAQQHMLQ LTVVVGIKQL²²⁹

附图的简要说明

图1表示HIV-1基因组的示意图，并且说明进行过测序的重叠片段的定位，所述片段是通过逆转录酶制备的，然后进行聚合酶链式反应，以便制备南非共有序列；

图2表示基于各种分离物的gag基因的(部分)序列的各种HIV-1亚型C分离物的核酸序列的系统发育树，包括多种共有序列和本发明的南非共有序列，以及本发明的筛选的分离物Du422；

图3表示基于各种分离物的pol基因的(部分)序列的各种HIV-1亚型C分离物的核酸序列的系统发育树，包括多种共有序列和本发明的南非共有序列，以及本发明的筛选的分离物pu151；

图4表示基于各种分离物的env基因的(部分)序列的各种HIV-1亚型C分离物的核酸序列的系统发育树，包括多种共有序列和本发明的南非共有序列，以及本发明的筛选的分离物Du151；

图5表示多种分离物的每一种的gag基因的序列如何从所述南非共有序列改变成本发明所开发的gag基因；

图6表示多种分离物的每一种的gag基因的序列如何从所述南非共有序列改变成本发明所开发的pol基因；

图7表示多种分离物的每一种的gag基因的序列如何从所述南非共有序列改变成本发明所开发的env基因；

图8表示基于各种分离物的gag基因的(部分)序列的各种HIV-1亚型C分离物的氨基酸序列的系统发育树，包括多种共有序列和本发明的南非共有序列，以及本发明的筛选的分离物Du422；

图9表示基于各种分离物的pol基因的(部分)序列的各种HIV-1亚型C分离物的氨基酸序列的系统发育树，并且包括Cpol共有序列和本发明的南非共有序列，以及本发明的筛选的分离物Du151；

图10表示基于各种分离物的env基因的(部分)序列的各种HIV-1亚型C分离物的氨基酸序列的系统发育树，并且包括Cenv共有序列和本发明的南非共有序列，以及本发明的筛选的分离物Du151；

图11表示各种分离物的测序的gag基因彼此之间相对所述gag克隆以及相对所述南非共有序列的gag基因的百分氨基酸序列相同性，并且是基于所述分离物的gag基因的成对的比较；

图12表示各种分离物的测序的pol基因彼此之间相对所述pol克隆以及相对所述南非共有序列的pol基因的百分氨基酸序列相同性，并且是基于所述分离物的pol基因的成对的比较；

图13表示各种分离物的测序的env基因彼此之间相对所述env克隆以及相对所述南非共有序列的env基因的百分氨基酸序列相同性，并且是基于所述分离物的env基因的成对的比较；

图14表示基于各种分离物的gag基因的完整序列的各种HIV-1亚型C分离物(或疫苗菌株)的核酸序列的系统发育树分析，并且对照示出了来自本发明的筛选的分离物Du422的gag基因与其他亚型C序列；

图15表示基于各种分离物的gag基因的完整序列的各种HIV-1亚型C分离物(或疫苗菌株)的核酸序列的系统发育树分析，并且对照示出了来自本发明的筛选的分离物Du151的pol基因与其他亚型C序列；

图16表示基于各种分离物的gag基因的完整序列的各种HIV-1亚型C分离物(或疫苗菌株)的核酸序列的系统发育树分析，并且对照示出了来自本发明的筛选的分离物Du151的env基因与其他亚型C序列；和

序列表

序列I.D.No.1      表示分离物Du422的测序gag基因的核酸序列

                  (cDNA)；

序列I.D.No.2      表示由所述核酸序列衍生的所述分离物Du422

                  的测序gag基因的氨基酸序列

序列I.D.No.3      表示分离物Du151的测序pol基因的核酸序列

                  (cDNA)；

序列I.D.No.4      表示由所述核酸序列衍生的所述分离物Du151

                  的测序pol基因的氨基酸序列

序列I.D.No.5      表示分离物Du151的测序env基因的核酸序列

                  (cDNA)；

序列I.D.No.6      表示由所述核酸序列衍生的所述分离物Du151

                  的测序env基因的氨基酸序列

序列I.D.No.7      表示分离物Du422的测序的gag基因重新合成

                  的核酸序列(DNA)，为了增强表达，该序列被

                  修饰成能体现人类密码子使用；

序列I.D.No.8      表示分离物Du422的测序的gag基因重新合成

                  的氨基酸序列(DNA)，为了增强表达，该序列

                  被修饰成能体现人类密码子的使用；

序列I.D.No.9      表示分离物Du151的测序的pol基因重新合成

                  的核酸序列(DNA)，为了增强表达，该序列被

                  修饰成能体现人类密码子的使用；

序列I.D.No.10     表示分离物Du151的测序的pol基因重新合成

                  的氨基酸序列(DNA)，为了增强表达，该序列

                  被修饰成能体现人类密码子的使用；

序列I.D.No.11     表示分离物Du151的测序的env基因重新合成

                  的核酸序列(DNA)，为了增强表达，该序列被

                  修饰成能体现人类密码子的使用；

序列I.D.No.12     表示分离物Du151的测序的env基因重新合成

                  的氨基酸序列(DNA)，为了增强表达，该序列

                  被修饰成能体现人类密码子的使用；

序列I.D.No.13     表示分离物Du179的测序env基因的核酸序列

                  (cDNA)；

序列I.D.No.14     表示分离物Du179的测序env基因的氨基酸序

                  列(cDNA)。

发明详叙

本发明涉及筛选HIV-1亚型C分离物，并且将其基因及其修饰物和衍生物用于制备预防性和治疗性药用组合物和制剂，特别是制备抗HIV-1亚型C的疫苗。因此，所述组合物可以预防性地用于预防感染，或治疗性地用于预防或治疗疾病。在开发HIV疫苗时必须考虑多种因素，而本发明的一个方面涉及用于筛选适用于疫苗开发的HIV分离物的方法。

本申请人预计，按照上述方法开发的疫苗，可用于除了HIV-1亚型C以外的一种或多种HIV亚型。

HIV疫苗的目的是诱导CD8+细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫反应，以及中和抗体反应。很多现有的疫苗途径主要集中在诱导CTL反应。人们认为CTL反应可能更重要一些，因为它与感染之后病毒复制的最初控制、以及在发病期间复制的控制相关，并且与疾病的发展负相关(Koup等，1994，Ogg等，1999，Schmitz等，1999)。CTL在保护人体免受感染发病方面的重要性，表现在它在高危血清反应为阴性的个体诸如妓女中的存在(Rowland-Jones等，1998)。

对遗传多样性的了解，与以诱导细胞毒性T-淋巴细胞(CTL)反应为目的的疫苗设计密切相关。在病毒之间存在很多共同的CTL表位，特别是在基因组的gag和pol区(HIV分子免疫学数据库，1998)。另外，很多研究现在已经证实，存在交叉反应性CTL反应：以亚型B为基础的疫苗接种的个体能裂解用多种类型的分离物感染的自身目标(Ferrari等，1997)；而来自非B感染个体的CTLs能够连接亚型B-诱导的目标(Betts等，1997；Durali等，1998)。比较HIV-1序列数据库中的CTL表位发现，在不同亚型之间，大约40％的gp41和84％的p24表位是相同的或者仅具有一个氨基酸的差异。尽管这是一项非常粗略的分析，并且没有考虑到特定表位的群体或显性反应。不过，该分析表明，与不同的亚型相比，细胞毒性T表位在一种亚型内具有更高的保守性，并且如果攻击病毒与疫苗菌株属于相同亚型的话，出现CTL反应的几率更大。

遗传多样性在诱导综合抗体反应方面的重要性似乎不太关键。一般，综合血清型与遗传亚型无关。某些个体能诱导可以中和多种病毒的抗体，包括不同亚型的病毒，而其他个体根本就不能诱导有效的中和抗体(Wyatt和Sodroski，1998；Kostrikis等，1996；Moore等，1996)。由于中和抗体在很大程度上是与所述病毒的基本上保守的功能结构域相关，HIV-1遗传多样性可能与生产被设计用于诱导中和抗体的疫苗无关。

用于疫苗设计的病毒菌株必须通过基因型分析证实是典型的循环菌株，而不是异常的或另类的菌株。另外，重要的是，疫苗菌株同样具有最近传播的病毒的表型，该病毒是NSI型的，并且使用CCR5共同受体。

开发了一种用于鉴定用来开发HIV-1亚型C疫苗的合适菌株的方法。采集了来自急性感染个体的病毒分离物。对所述分离物的env、gag和pol区进行测序，并且比较了所述分离物的env、gag和pol基因的氨基酸序列。然后通过筛选每一个部位的最常出现的氨基酸，生产了一种共有序列——南非共有序列。HIV-1亚型C的gag、pol和env基因的每一种的共有序列构成了本发明的一个方面。然后通过与所述共有序列比较并对其进行表型表征，筛选适合疫苗开发的菌株。所述分离物同样构成了本发明的一个方面。

为了筛选使用CCR5共同受体的NSI菌株，将已经确定的妓女人群用于鉴定所述合适的菌株。从急性感染的个体体内鉴定合适菌株，包括将其与业已形成的共有序列进行比较。对来自15个急性感染个体的病毒分离物的env、gag和pol进行测序，并进行表型表征。对所述序列与来自其他地区的15个无症状个体的具有超过500个CD4细胞的病毒分离物进行比对，并且与Los Alamos数据库( http：//www.hiv-web.lanl.gov/)中的公开的亚型C序列进行比对。

选择被命名为Du151、Du422和Du179的三种潜在疫苗菌株。选择Du151和Du422，是因为所有三个基因区env、gag和pol中与所述共有序列的氨基酸同源性，CCR5嗜性和在组织培养物中生长和复制的能力。Du179是R5×4病毒，选择这种病毒是因为在发现这种菌株的患者体内出现了高含量的中和抗体。以上三种分离物的三个基因区的核苷酸和氨基酸序列及其修饰和衍生物也是本发明的组成方面。

本发明的疫苗可以用多种不同的载体以多种不同方式制备。包括将来自所述病毒的RNA或转录的DNA序列胶囊化于多种不同载体中。所述疫苗可以包括来自本发明的Du422分离物的gag基因的至少一部分，和来自本发明的Du151分离物的pol和env基因的至少一部分和/或来自本发明的Du179分离物的env基因的至少一部分或其衍生物或修饰。

业已重新合成了用于DNA疫苗的基因，以便体现人类密码子使用。设计gag Du422基因，以便除去十四烷基化位点和抑制序列。DNA疫苗可以表达类似的重新合成的gp160(由gp120和gp41构成的完整的env基因)和pol基因。业已按上述方法将gp160基因换成了gag基因，以便体现人类密码子使用，并且除去了rev反应因子。对蛋白酶、激活的逆转录酶和来自Du151pol的RNAse H基因的起始部分进行优化，以便增强表达，并且在一个插入的Bg11位点与gag结合。保留gag-pol移码，以便gag和pol蛋白表达的天然平衡。

另一种疫苗包括由来自Du422分离物的gag基因的RNA转录的DNA和来自Du151分离物的pol和env基因的RNA和/或来自Du179分离物的env基因的RNA转录的DNA。所述基因还能够表达为寡聚的外被糖蛋白复合体(Progenics，USA)，披露于J.Virol 2000，1月；74，(2)：627-43，(Binley，J.L.等)，腺相关病毒(AAV)(Target Genetics)和Venezuelan马脑炎病毒(美国专利申请USSN 60/216,995号，该申请的有关内容在此声明收作本文参考)。

用于疫苗设计的病毒菌株的分离和筛选

将以下标准用于筛选适合包含在用于南非的HIV-1疫苗中的菌株：

该菌株是循环菌株的基因型典范；

该菌株不是异常菌株；

该菌株尽可能地接近按照本发明方法开发的HIV-1亚型C的env、gag和pol基因的共有氨基酸序列；

该菌株具有R5表型，即与传染相关的表型，以便筛选要包含的env区的RNA或cDNA；和

所述疫苗能够在组织培养物中生长。

在选择用于设计疫苗的病毒菌株时，采用以下方法。将南非KwazuluNatal的业已确定的妓女用于鉴定用在HIV疫苗中的合适菌株。对来自15个急性感染个体的病毒分离物的env、gag和pol进行测序，并且进行分离和表型表征。将所述序列与来自南非Gauteng地区的无症状个体的类似采集物以及其他公开的亚型C序列进行比对。

患者

HIV感染个体是从南非的4个地区招募的。从来自Kwazulu Natal的新感染的妓女体内获得血液样品(n＝13)。新感染被定义为以前是血清阴性的，并且在以前的一年内变成血清阳性的个体。还从以下个体体内采集了样品：出现在开普敦门诊诊所中的个体(n＝2)，出现在约翰内斯堡产前诊所中的女性(n＝7)和出现在约翰内斯堡郊外金矿上的STD诊所中的男性(n＝8)。后两组在临床上是稳定的，并且被划分为无症状感染。将血液样品采集到EDTA中，并且用于测定CD4 T细胞数量，并对病毒进行遗传学分析。对于新的感染来说，进行支链(bDNA)测定(手性子)，以便测定血浆病毒负荷，并且分离所述病毒。通过ELISA测定血清症状。确定所述妓女的CD4 T细胞数量和病毒负荷的结果，并且在下面的表1中提供了有关在血清转变日期的临床状态、CD4、和有关共同受体使用数据的信息。

病毒分离

使用标准的共培养技术和促细胞分裂剂激活的供体PBMC，从外周血单核细胞(PBMC)中分离HIV。将患者的2×10⁶个PBMC与2×10⁶个供体PBMC一起放在12孔平板上培养，使用含有20％FCS、抗生素和5％IL-2(Boehringer)的2毫升RPMI 1640。每周用新的含有IL-2的培养基补充培养物两次，用5×10⁵毫升/供体PBMC补充1次。每周1次用商用p24抗原测定仪(Coulter)监测病毒生长。扩增抗原阳性培养物，并且再培养2周，以便获得40毫升含有病毒的上清液，将该上清液在-70℃下保存待用。在下面的表1中还示出了来自商业性妓女的病毒分离的结果。

病毒表型

将含有病毒的上清液用于评估病毒分离物在MT-2和共受体转染的细胞系上的生物学表型。对于MT-2测定来说，将500微升上清液与5×10⁴MT-2细胞一起放在含有10％FCS和抗生素的PRMI中培养。在为期6天的时间内，每天监测培养物的合胞体形成。在含有10％FCS、抗生素、50微克/毫升G418和1微克/毫升嘌呤霉素的DMEM中生长能表达CCR5或CXCR4共同受体的U87.CD4细胞。在含有10％FCS、500微克/毫升G418、1微克/毫升嘌呤霉素和100微克/毫升潮霉素的DMEM中生长能表达微量共同受体的血影细胞。通过胰蛋白酶化，每周将细胞系传代两次。共同受体测定是在12孔平板上进行的；将5×10⁴个细胞铺平板到每一个孔中，并且让这些细胞贴壁过夜。次日，添加500微升含有病毒的上清液，并且培养过夜，以便病毒结合并感染，并且在次日洗涤3次。在第4、8和12天监测培养物的合胞体形成和p4抗原生产。表现出合胞体和浓度提高的p24抗原的证据的培养物被认为是病毒生长阳性的。在表1中还示出了来自职业妓女的病毒的共同受体使用的结果。

表1-用于筛选疫苗候选物的急性感染人群

样品编号	血清转化日期	取样日期	感染时间	CD4数量	病毒负荷	共培养物的p24阳性	MT-2测定	生物类型
									Du115	98年5月15日	99年5月20日	1年	437*	7,597*		无分离物	-
Du123	98年8月17日	98年11月17日	3个月	841	19,331	D6(50pg)	NSI	R5
									Du151	98年10月12日	98年11月24日	1.5个月	367	＞500,000	D6(＞1ng)	NSI	R5
Du156	98年11月16日	98年11月17日	＜1个月	404	22,122	D6(＞1ng)	NSI	R5
									Du172	98年10月16日	98年11月17日	1个月	793	1,916	D6(＜50pg)	NSI	R5
Du174	97年10月6日	99年5月25日	19.5个月	634*	9,454	D14(＞1ng)	NSI	R5
									Du179	97年8月13日	99年5月20日	21个月	394*	1,359	D7(＜50pg)	SI	R5×4
Du204	98年5月20日	99年5月20日	1年	633*	8,734	D7(＜50pg)	NSI	R5
									Du258	98年6月3日	99年6月22日	1年	433*	9,114	-	无分离物	-
Du281	98年7月24日	98年11月17日	4个月	594	24,689	D6(1ng)	NSI	R5
									Du285	98年10月2日	-	-	560*	161*	-	无分离物	-
Du368	98年4月8日	98年11月24日	7.5个月	670	13,993	D6(300pg)	NSI	R5
									Du422	98年10月2日	99年1月28日	4个月	397	17,118*	D6(600pg)	NSI	R5
Du457	98年8月17日	98年11月17日	3个月	665	6,658	-	无分离物	-
									Du467	98年8月26日	-	-	671	19,268	-	无分离物	-

-来自98年11月的数据

测序

从血浆中分离RNA，并且使用逆转录酶由RNA扩增所述基因片段，以便制备cDNA，然后通过PCR制备扩增的DNA片段。PCR引物的位置如下，将每个引物对的第二个引物用作cDNA合成步骤的逆转录酶引物(使用HIV-1HXBr序列进行编号)：gag1(790-813，1282-1303)，gag2(1232-1253，1797-1820)，pol1(2546-2573，3012-3041)，pol2(2932-2957，3492-3515)，env1(6815-6838，7322-7349)，env2(7626-7653，7963-7986)。使用QIAQUICK PCR纯化试剂盒(Qiagen，德国)纯化扩增的DNA片段。然后用上游PCR引物作为测序引物，对所述DNA片段进行测序。测序是用Sanger双脱氧终止子方法进行的，将荧光染料结合在双脱氧核苷酸上。序列测定是使用ABI377测序仪通过电泳完成的。在图1中示出了按上述方法测序的显示pol、gag和env区的HIV-1原病毒基因组的作图说明。如图1所示，对以下区域进行测序(按照HXBr编号，Los Alamos数据库)：813-1282(gag1)；1253-1797(gag2)；2583-3012(pol1)；2957-3515(pol2)；6938-7322(env1)；7653-7963(env2)。

基因型表征

为了筛选疫苗分离物，对包括三个主要HIV基因gag(313个连续密码子，939个碱基)，pol(278个连续密码子，834个碱基)，和env(存在于两个不连续片段上的229个连续密码子，687个碱基)的部分进行检查(图1)。图1的图谱表示5个长的末端重复，结构基因和功能基因(gag、pol和env)，以及调控和辅助蛋白(vif、tat、rev、nef、vpr和vpu)。gag开放读框表示编码p17基质蛋白和p24核心蛋白以及p7和p6核壳蛋白的区域。Pol开放读框表示蛋白酶(PR)p15、逆转录酶(RT)p66和Rnase H整合酶p51。env开放读框表示编码gp120的区域和编码gp41的区域。

在总共31种分离物中，有14种来自德班人群(DU)，15种来自约翰内斯堡人群(GG和RB)，有2种来自开普敦人群(CT)。其中的30种分离物在gag区进行测序，26种在pol区进行测序，27种在env区进行测序。进行测序的分离物如表2所示。

表2-分离物和基因测序区清单

分离物	Gag序列	Pol序列	Env序列
				CTSC1	√	√	-
CTSC2	√	√	-
				DU115	√	√	√
DU123	√	-	√
				DU151	-	√	√
DU156	√	√	√
				DU172	√	√	√
DU174	√	√	√
				DU179	√	√	√
DU204	√	√	√
				DU258	√	√	√
DU281	√	-	√
				DU368	√	√	√
DU422	√	√	√
				DU457	√	√	√
DU467	√	-	√
				GG1	√	-	-
GG10	√	√	√
				GG3	√	√	√
GG4	√	√	√
				GG5	√	√	√
GG6	√	√	√
				RB12	√	-	√
RB13	√	√	√
				RB14	√	√	√
RB15	√	√	-
				RB18	√	√	√
RB21	√	√	√
				RB22	√	√	√
RB27	√	√	√
				RB28	√	√	√

将来自德班(DU)、来自约翰内斯堡(GG和RB)、和来自开普敦(CT)人群的核酸序列，与包括来自其他南部非洲国家的序列在内的所有现有的公开亚型C序列(从Los Alamos HIV数据库获得)以及来自Los AlamosHIV序列数据库的所有亚型C共有序列进行系统发育比较。进行这种比较，是为了确保所筛选的疫苗分离物与所述南非序列相比在系统发育上不是异常的，并且在图2、图3和图4中示出了比较的结果。图2-4表明来自南非的序列是趋异的，而印度序列构成了一种独特的、不同于所述非洲序列的集群。所述南非序列不是独特的，并且一般彼此之间的相关性和它们与来自南非的其他序列的相关性相同。总之，这一结果表明，印度序列不同于南非亚型C序列，并且，在南非我们还没有克隆流行病，相反，南非病毒体现了亚型C病毒在南部非洲地区的多样性。

共有序列的测定

氨基酸序列源于表2所示序列，并将其用于测定南非共有序列。选择每一个位点上出现次数最多的氨基酸作为该位点上的共有氨基酸。这样，沿着每一个测序基因片段(gag、pol和env基因片段)的线性长度方向测定了其共有序列。用Genetics Computer Group(GCG)程序(Pileup和Pretty)进行比对，该程序以这种方式产生了一种共有序列。由此得到了每一个基因区的共有序列，在图5、6和7中示出了所述氨基酸和所得到的共有 序列的对比。

在图8、9和10中示出了比较南非序列的氨基酸的系统发育树。疫苗克隆包括ES2 gag S，它是克隆的Du422 gag基因的序列，Du151 pol(克隆号)8，它是克隆的Du151 pol基因的序列，和Du151 env(克隆号)25，它是克隆的Du151 env基因的序列。从图8、9和10可以看出，它们与原始分离物相同。这些系统发育树比较了HIV蛋白之间的关系。将南非分离物与亚型A、B、C和D共有序列进行比较，并且与源于所述南非序列的南非共有序列(Sagagcon)、源于马拉维序列的马拉维共有序列(Malgagcon)以及源于Los Alamos数据库的所有亚型C序列的所有共有序列(Cgagcon、Cpolcon和Cenvocon)进行比较。

根据特定分离物的gag、env和pol基因的序列与来自上述来源的南非共有序列的相似性，以及具有表1所示的良好复制动力学的R5分离物的可利用性，决定最终选择使用哪一种或几种分离物。

疫苗分离物的筛选

根据上述考虑和方法，选择来自急性感染人群的三种菌株作为疫苗菌株。第一种菌株是用于gag基因的Du422，第二种菌株是用于pol和env基因的Du151，而第三种菌株是Du179，它是env基因的可能的替代物。选择这三种菌株是出于以下原因：

1.在获得样品时，Du151业已感染了6周时间，并且CD4数量为367个细胞/微升血液，病毒负荷高于500,000拷贝/毫升血浆。由于具有高的病毒负荷，以及从感染开始的记录时间，所述个体有可能仍然处在由免疫系统控制HIV复制之前的病毒血症的初期阶段。

2.在获得样品时Du422业已感染了4个月，CD4数量为397个细胞/微升血液，病毒负荷高于17,118拷贝/毫升血浆。与Du151不同，该个体在控制到一定程度的条件下进行了病毒复制。

3.在获得样品时Du179业已感染了21个月，CD4数量为394个细胞/微升血液，病毒负荷为1,359拷贝/毫升血浆。

根据图8所示的表示完整长度gp120序列和其他分离物之间的关系的系统发育树分析，以及图11所示的氨基酸成对比较，发现Du422 gag序列与图2和5所示的南非共有序列最为相似。它与所述共有序列具有98％的氨基酸序列相同性。另外，Du422 gag序列和来自所述血清转化体的其他序列之间的平均成对距离(它是DNA序列之间的百分比差异)是在来自该人群的任何序列中是最高的，为93.5％，并且几乎与所述分离物和SA共有序列之间的平均距离(94.2％)一样高。对Du422 gag基因进行克隆，并且特定的克隆能提供非常类似于原始分离物的值：与SA共有序列的成对相同性值为98％，并且几乎与诸如Du422分离物的其他分离物的平均相同性值一样高(93.3％)。因此，原始Du422分离物序列和制备的克隆都具有类似于其他分离物的最高的成对百分相似性，最低值都高于90％。

在成对比较时，pol序列表现出最高值。根据图9所示的系统发育树的分析，以及图12所示的与SA共有序列的成对相同性得分(98.9％)，我们选择Du151分离物作为pol基因的来源。导致作出这种决定的其他因素有，它是被选择用作env基因来源的同一种分离物，并且它是在体外具有良好生长特性的分离物。来自Du151分离物的实际pol基因克隆与SA共有序列的差异更大(97.8％)，并且与其他分离物相比具有较小的平均相同性(95.1％)。不过，我们认为在这种其他方面保存良好的HIV-1基因上，与所述共有序列的距离的小的增加是不显著的，因此，选择Du151pol基因用于进一步开发。最近的血清转换序列中只有一种与Du151 pol基因片段的相同性低于93％。

Env基因表现出最大的序列多样性。根据图10所示的系统发育树的分析，我们选择了Du151 env基因。Du151 env基因片段与其他分离物表现出87.2％的平均成对比较得分，克隆的得分略高一些(84.9％)。Du151分离物基因片段与SA共有序列的成对相同性得分为92.6％，而Du151克隆的得分为91.3％。最后，如图13所示，与其他最近的血清转化者相比，Du151分离物序列或克隆的所有成对相同性得分都高于83％。这种成对的得分使得Du151序列类似于该序列库中的最佳得分，并且将所述相似性水平与具有良好细胞培养复制动力学的R5组合。

通过PCR制备代表上述每一种病毒基因的完整长度基因的克隆。将存在于用单一分离物感染的细胞中的病毒DNA用于pol和env克隆，而将通过RT-PCR从血浆中直接得到的DNA用于gag克隆。用QIAGEN DNeasyTissue试剂盒从受感染的细胞沉淀中提取总DNA。将该DNA用于PCR反应，在嵌套PCR扩增方法中，使用以下引物(HXBR编号，Los Alamos数据库)：

gag：外部，623-640和2391-2408。内部，789-810和2330-2350。

Pol：外部，2050-2073和5119-5148。内部，2085-2108，和5068-5094。

env：外部，6195-6218和8807-8830。内部，6225-6245，和8758-8795。

使用Novagen pT7Blue Blunt试剂盒将PCR产物平端克隆到pT7Blue中。通过克隆PCR来表征插入片段，以便鉴定具有基因插入片段的克隆。通过对所述插入片段的两股链进行测序，并且将该序列与原始序列进行比较，证实所述插入片段的身份。

克隆的修饰

如图23-28所示，将若干种修饰导入克隆的基因中。为了提高蛋白的表达水平，重新合成了所述DNA序列，并且进行了如下修饰：

-为了增强表达，改变密码子使用，以便体现人类密码子使用；和

-同样除去了所述抑制和rev响应因子。

对Du422的gag基因序列的修饰如序列I.D.No.7和8所示。

对于所述DNA、修饰过的痘苗ankara(MVA)和BCG疫苗来说，将pol基因截短，以便只有pol基因的蛋白酶、逆转录酶和RNAse H区能够表达。另外，所述活性位点氨基酸基序YMDD业已突变成YMAA，以便所表达的逆转录酶被催化失活。对Du151的pol基因的修饰如序列I.D.No.9和10所示。

合成基因

重新合成完整的gag和env基因，以便优化其密码子，用于在人类细胞中表达，同样如序列I.D.No.9-12所示。在此期间，除去了所述抑制序列(INS)和rev反应因子(RRE)。据报导，这样会导致表达增强。如上文所述，以及如序列I.D.No.7和8所示，gag基因十四烷基化信号发生了突变。

业已将以下材料交由欧洲细胞培养物保藏中心，应用微生物学和研究中心，Salisbury，Wiltshire SP4 OJG，英国(ECACC)保藏。

保藏物

材料	ECACC保藏号	保藏日期
			HIV-1病毒分离物Du151	保藏号00072724	2000年7月27日
HIV-1病毒分离物Du179	保藏号00072725	2000年7月27日
			HIV-1病毒分离物Du422	临时保藏号00072726临时保藏号01032114	2000年7月27日2001年3月22日

所述保藏是按照布达佩斯条约有关用于专利方法目的的微生物保藏的国际认可和管理的规定进行的(布达佩斯条约)。

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                              序列表

序列I.D.No：7：Du422的合成的gag基因

1      GGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAATCACGACGT

61     TGTAAAACGACAGCCAATGAATTGAAGCTTATGGCTGCTCGCGCATCTATCCTCAGAGGC

121    GAAAAGTTGGATAAGTGGGAAAAAATCAGACTCAGGCCAGGAGGTAAAAAACACTACATG

181    CTGAAGCATATCGTGTGGGCATCTAGGGAGTTGGAGAGATTTGCACTGAACCCCGGACTG

241    CTGGAAACCTCAGAGGGCTGTAAGCAAATCATGAAACAGCTCCAACCAGCCTTGCAGACC

301    GGAACAGAAGAGCTGAAGTCCCTTTACAATACCGTGGCAACCCTCTATTGCGTCCACGAG

361    AAGATCGAGGTGAGAGACACAAAGGAGGCCCTGGACAAAATCGAGGAGGAGCAGAATAAG

421    TGCCAGCAGAAGACCCAGCAGGCAAAGGCTGCTGACGGAAAGGTCTCTCAGAACTATCCT

481    ATCGTTCAGAACCTTCAGGGGCAGATGGTGCACCAAGCAATCAGCCCTAGAACCCTGAAC

541    GCATGGGTGAAGGTGATCGAGGAGAAAGCCTTTTCTCCCGAGGTTATCCCCATGTTTACC

601    GCCCTGAGCGAAGGCGCCACTCCTCAAGACCTGAACACTATGCTGAACACAGTGGGAGGA

661    CACCAGGCCGCTATGCAGATGTTGAAGGATACCATCAACGAGGAGGCAGCCGAATGGGAC

721    CGCCTCCACCCCGTGCACGCCGGACCTATCGCCCCCGGACAAATGAGAGAACCTCGCGGA

781    AGTGATATTGCCGGTACTACCAGCACCCTTCAAGAGCAGATTGCTTGGATGACCAGCAAC

841    CCACCCATCCCAGTGGGCGATATTTACAAAAGGTGGATTATTCTGGGGCTGAACAAAATT

901    GTGAGAATGTACTCCCCCGTCTCCATCCTCGACATCCGCCAAGGACCCAAGGAGCCTTTT

961    AGGGATTACGTGGACAGATTCTTCAAAACCCTTAGAGCTGAGCAAGCCACTCAGGAGGTT

1021   AAGAACTGGATGACAGATACTCTGCTCGTGCAAAACGCTAACCCCGATTGCAAAACCATC

1081   TTGAGAGCTCTCGGTCCAGGTGCCACCCTTGAGGAAATGATGACAGCATGTCAAGGCGTG

1141   GGAGGACCTGGGCACAAGGCCAGAGTTCTCGCTGAGGCCATGAGCCAGACAAACTCAGGC

1201   AATATCATGATGCAGAGGAGTAACTTTAAGGGTCCCAGGAGAATCGTCAAGTGCTTCAAT

1261   TGTGGCAAGGAGGGTCACATTGCCAGGAACTGCCGCGCCCCCAGGAAGAAAGGCTGCTGG

1321   AAGTGTGGCAAAGAGGGCCACCAGATGAAGGATTGCACCGAGCGCCAAGCAAACTTCCTG

1381   GGAAAGATTTGGCCCAGTCATAAGGGCCGCCCTGGCAACTTCCTTCAAAACAGACCCGAG

1441   CCTACCGCCCCCCCCGCTGAGTCTTTCAGATTTGAGGAGACCACCCCCGCTCCAAAGCAG

1501   GAGCCAATTGAGAGAGAGCCTCTCACCAGTCTCAAAAGCCTCTTTGGTAGCGACCCCCTC

1561   AGCCAATAAGAATTCTAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG

1621   TTATCAGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGA

1681   TGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAGTTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC

1741   GGGAAACCTGTCGTGCCAGCTCCATTAGTGAATCGTCCAACGCACGGGGAGAGGCGGTTT

1801   GCGTATTGGGCGCACTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGTTCGTTCGGCT

1861   GCGGCGAGCCGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATC

序列I.D.No：8：Du422的合成的gag蛋白质

1      GGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAATCACGACGT

1       G  G  C  A  A  R  R  L  S  W  V  T  P  G  F  S  Q  S  R  R

61     TGTAAAACGACAGCCAATGAATTGAAGCTTATGGCTGCTCGCGCATCTATCCTCAGAGGC

21      C  K  T  T  A  N  E  L  K  L  M  A  A  R  A  S  I  L  R  G

121    GAAAAGTTGGATAAGTGGGAAAAAATCAGACTCAGGCCAGGAGGTAAAAAACACTACATG

41      E  K  L  D  K  W  E  K  I  R  L  R  P  G  G  K  K  H  Y  M

181    CTGAAGCATATCGTGTGGGCATCTAGGGAGTTGGAGAGATTTGCACTGAACCCCGGACTG

61      L  K  H  I  V  W  A  S  R  E  L  E  R  F  A  L  N  P  G  L

241    CTGGAAACCTCAGAGGGCTGTAAGCAAATCATGAAACAGCTCCAACCAGCCTTGCAGACC

81      L  E  T  S  E  G  C  K  Q  I  M  K  Q  L  Q  P  A  L  Q  T

301    GGAACAGAAGAGCTGAAGTCCCTTTACAATACCGTGGCAACCCTCTATTGCGTCCACGAG

101     G  T  E  E  L  K  S  L  Y  N  T  V  A  T  L  Y  C  V  H  E

361    AAGATCGAGGTGAGACACACAAAGGAGGCCCTGGACAAAATCGAGGAGGAGCAGAATAAG

121     K  I  E  V  R  D  T  K  E  A  L  D  K  I  E  E  E  Q  N  K

421    TGCCAGCAGAAGACCCAGCAGGCAAAGGCTGCTGACGGAAAGGTCTCTCAGAACTATCCT

141     C  Q  Q  K  T  Q  Q  A  K  A  A  D  G  K  V  S  Q  N  Y  P

481    ATCGTTCAGAACCTTCAGGGGCAGATGGTGCACCAAGCAATCAGCCCTAGAACCCTGAAC

161     I  V  Q  N  L  Q  G  Q  M  V  H  Q  A  I  S  P  R  T  L  N

541    GCATGGGTGAAGGTGATCGAGGAGAAAGCCTTTTCTCCCGAGGTTATCCCCATGTTTACC

181     A  W  V  K  V  I  E  E  K  A  F  S  P  E  V  I  P  M  F  T

601    GCCCTGAGCGAAGGCGCCACTCCTCAAGACCTGAACACTATGCTGAACACAGTGGGAGGA

201     A  L  S  E  G  A  T  P  Q  D  L  N  T  M  L  N  T  V  G  G

661    CACCAGGCCGCTATGCAGATGTTGAAGGATACCATCAACGAGGAGGCAGCCGAATGGGAC

221     H  Q  A  A  M  Q  M  L  K  D  T  I  N  E  E  A  A  E  W  D

721    CGCCTCCACCCCGTGCACGCCGGACCTATCGCCCCCGGACAAATGAGAGAACCTCGCGGA

241     R  L  H  P  V  H  A  G  P  I  A  P  G  Q  M  R  E  P  R  G

781    AGTGATATTGCCGGTACTACCAGCACCCTTCAAGAGCAGATTGCTTGGATGACCAGCAAC

261     S  D  I  A  G  T  T  S  T  L  Q  E  Q  I  A  W  M  T  S  N

841    CCACCCATCCCAGTGGGCGATATTTACAAAAGGTGGATTATTCTGGGGCTGAACAAAATT

281     P  P  I  P  V  G  D  I  Y  K  R  W  I  I  L  G  L  N  K  I

901    GTGAGAATGTACTCCCCCGTCTCCATCCTCGACATCCGCCAAGGACCCAAGGAGCCTTTT

301     V  R  M  Y  S  P  V  S  I  L  D  I  R  Q  G  P  K  E  P  F

961    AGGGATTACGTGGACAGATTCTTCAAAACCCTTAGAGCTGAGCAAGCCACTCAGGAGGTT

321     R  D  Y  V  D  R  F  F  K  T  L  R  A  E  Q  A  T  Q  E  V

1021   AAGAACTGGATGACAGATACTCTGCTCGTGCAAAACGCTAACCCCGATTGCAAAACCATC

341     K  N  W  M  T  D  T  L  L  V  Q  N  A  N  P  D  C  K  T  I

1081   TTGAGAGCTCTCGGTCCAGGTGCCACCCTTGAGGAAATGATGACAGCATGTCAAGGCGTG

361     L  R  A  L  G  P  G  A  T  L  E  E  M  M  T  A  C  Q  G  V

1141   GGAGGACCTGGGCACAAGGCCAGAGTTCTCGCTGAGGCCATGAGCCAGACAAACTCAGGC

381     G  G  P  G  H  K  A  R  V  L  A  E  A  M  S  Q  T  N  S  G

1201   AATATCATGATGCAGAGGAGTAACTTTAAGGGTCCCAGGAGAATCGTCAAGTGCTTCAAT

401     N  I  M  M  Q  R  S  N  F  K  G  P  R  R  I  V  K  C  F  N

1261   TGTGGCAAGGAGGGTCACATTGCCAGGAACTGCCGCGCCCCCAGGAAGAAAGGCTGCTGG

421     C  G  K  E  G  H  I  A  R  N  C  R  A  P  R  K  K  G  C  W

1321   AAGTGTGGCAAAGAGGGCCACCAGATGAAGGATTGCACCGAGCGCCAAGCAAACTTCCTG

441     K  C  G  K  E  G  H  Q  M  K  D  C  T  E  R  Q  A  N  F  L

1381   GGAAAGATTTGGCCCAGTCATAAGGGCCGCCCTGGCAACTTCCTTCAAAACAGACCCGAG

461     G  K  I  W  P  S  H  K  G  R  P  G  N  F  L  Q  N  R  P  E

1441   CCTACCGCCCCCCCCGCTGAGTCTTTCAGATTTGAGGAGACCACCCCCGCTCCAAAGCAG

481     P  T  A  P  P  A  E  S  F  R  F  E  E  T  T  P  A  P  K  Q

1501   GAGCCAATTGAGAGAGAGCCTCTCACCAGTCTCAAAAGCCTCTTTGGTAGCGACCCCCTC

501     E  P  I  E  R  E  P  L  T  S  L  K  S  L  F  G  S  D  P  L

1561   AGCCAATAAGAATTCTAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTG

521     S  Q  *  E  F  *  L  G  V  I  M  V  I  A  V  S  C  V  K  L

1621   TTATCAGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGA

541     L  S  A  H  N  S  T  Q  H  T  S  R  K  H  K  V  *  S  L  G

1681   TGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAGTTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTC

561     C  L  M  S  E  L  T  H  I  S  C  V  A  L  T  A  R  F  P  V

1741   GGGAAACCTGTCGTGCCAGCTCCATTAGTGAATCGTCCAACGCACGGGGAGAGGCGGTTT

581     G  K  P  V  V  P  A  P  L  V  N  R  P  T  H  G  E  R  R  F

1801   GCGTATTGGGCGCACTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGTTCGTTCGGCT

601     A  Y  W  A  H  F  R  F  L  A  H  *  L  A  A  L  V  R  S  A

1861   GCGGCGAGCCGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATC

621     A  A  S  R  I  S  S  L  K  G  G  N  T  V  I

序列I.D.No：9：Du151合成的pol基因

1      TCGCGCGTTT CGGTGATGAC GGTGAAAACC TCTGACACAT GCAGCTCCCG

51     GAGACGGTCA CAGCTTGTCT GTAAGCGGAT GCCGGGAGCA GACAAGCCCG

101    TCAGGGCGCG TCAGCGGGTG TTGGCGGGTG TCGGGGCTGG CTTAACTATG

151    CGGCATCAGA GCAGATTGTA CTGAGAGTGC ACCATATGCG GTGTGAAATA

201    CCGCACAGAT GCGTAAGGAG AAAATACCGC ATCAGGCGCC ATTCGCCATT

251    CAGGCTGCGC AACTGTTGGG AAGGGCGATC GGTGCGGGCC TCTTCGCTAT

301    TACGCCAGCT GGCGAAAGGG GGATGTGCTG CAAGGCGATT AAGTTGGGTA

351    ACGCCAGGGT TTTCCCAGTC ACGACGTTGT AAAACGACGG CCAGTGCCAA

401    GCTTGCATGC CTGCAGGTCG ACTCTAGAGG ATCCCCGGGT ACCGAGCTCC

                      BglI(加入至Gag-pol的Gag中去)

                   ~~~~~~~~~~~~

451    TTCCCACAAG GGCCGGCCAG GCAATTTCCT TCAGAACAGA CCAGAGCCAA

501    CAGCCCCACC AGCAGAGAGC TTCAGGTTCG AAGAGACAAC CCCCGCTCCG

551    AAACAGGAGC CGAGAGAAAG GGAACCCTTA ACTTCCCTCA AATCACTCTT

601    TGGCAGCGAC CCCTTGTCTC AATAAAAATC GGCGGCCAGA CCCGGGAGGC

651    CCTGCTGGAC ACCGGCGCCG ACGACACCGT GCTGGAGGAC ATCAACCTGC

701    CCGGCAAGTG GAAGCCCAAG ATGATCGGCG GCATCGGCGG CTTCATCAAG

751    GTGCGGCAGT ACGACCAGAT CCTGATCGAG ATCTGCGGCA AGAAGGCCAT

801    CGGCACCGTG CTGGTGGGCC CCACCCCCGT GAACATCATC GGCCGGAACA

851    TGCTGACCCA GCTGGGCTGC ACCCTGAACT TCCCCATCAG CCCCATCGAG

901    ACCGTGCCCG TGAAGCTGAA GCCCGGCATG GACGGCCCCA AGGTGAAGCA

951    GTGGCCCCTG ACCGAGGTGA AGATCAAGGC CCTGACCGCC ATCTGCGAGG

1001   AGATGGAGAA GGAGGGCAAG ATCACCAAGA TCGGCCCCGA GAACCCCTAC

1051   AACACCCCCA TCTTCGCCAT CAAGAAGGAG GACAGCACCA AGTGGCGGAA

1101   GCTGGTGGAC TTCCGGGAGC TGAACAAGCG GACCCAGGAC TTCTGGGAGG

1151   TGCAGCTGGG CATCCCCCAC CCCGCCGGCC TGAAGAAGAA GAAGAGCGTG

1201   ACCGTGCTGG ACGTGGGCGA CGCCTACTTC AGCGTGCCCC TGGACGAGGG

1251   CTTCCGGAAG TACACCGCCT TCACCATCCC CAGCATCAAC AACGAGACCC

1301   CCGGCATCCG GTACCAGTAC AACGTGCTGC CCCAGGGCTG GAAGGGCAGC

1351   CCCGCCATCT TCCAGGCCAG CATGACCAAG ATCCTGGAGC CCTTCCGGGC

1401   CAAGAACCCC GAGATCGTGA TCTACCAGTA CATGGCCGCC CTGTACGTGG

1451   GCAGCGACCT GGAGATCGGC CAGCACCGGG CCAAGATCGA GGAGCTGCGG

1501   GAGCACCTGC TGAAGTGGGG CTTCACCACC CCCGACAAGA AGCACCAGAA

1551   GGAGCCCCCC TTCCTGTGGA TGGGCTACGA GCTGCACCCC GACAAGTGGA

1601   CCGTGCAGCC CATCCAGCTG CCCGAGAAGG ACAGCTGGAC CGTGAACGAC

1651   ATCCAGAAGC TGGTGGGCAA GCTGAACTGG ACCAGCCAGA TCTACCCCGG

1701   CATCAAGGTG CGGCAGCTGT GCAAGCTGCT GCGGGGCACC AAGGCCCTGA

1751   CCGACATCGT GCCCCTGACC GAGGAGGCCG AGCTGGAGCT GGCCGAGAAC

1801   CGGGAGATCC TGAAGGAGCC CGTGCACGGC GTGTACTACG ACCCCAGCAA

1851   GGACCTGATC GCCGAGATCC AGAAGCAGGG CGACGACCAG TGGACCTACC

1901   AGATCTACCA GGAGCCCTTC AAGAACCTGA AAACCGGCAA GTACGCCAAG

1951   CGGCGGACCA CCCACACCAA CGACGTGAAG CAGCTGACCG AGGCCGTGCA

2001   GAAGATCAGC CTGGAGAGCA TCGTGACCTG GGGCAAGACC CCCAAGTTCC

2051   GGCTGCCCAT CCAGAAGGAG ACCTGGGAGA TCTGGTGGAC CGACTACTGG

2101   CAGGCCACCT GGATCCCCGA GTGGGAGTTC GTGAACACCC CCCCCCTGGT

2151   GAAGCTGTGG TACCAGCTGG AGAAGGAGCC CATCGCCGGC GCCGAGACCT

2201   TCTACGTGGA CGGCGCCGCC AACCGGGAGA CCAAGATCGG CAAGGCCGGC

2251   TACGTGACCG ACCGGGGCCG GCAGAAGATC GTGACCCTGA GCGAGACCAC

2301   CAACCAGAAA ACCGAGCTGC AGGCCATCCA GCTGGCCCTG CAGGACAGCG

2351   AGAGCGAGGT GAACATCGTG ACCGACAGCC AGTACGCCCT GGGCATCATC

2401   CAGGCCCAGC CCGACCGGAG CGAGAGCGAG CTGGTGAACC AGATCATCGA

2451   GCAGCTGATC AAGAAGGAGC GGGCCTACCT GAGCTGGGTG CCCGCCCACA

2501   AGGGCATCGG CGGCGACGAG CAGGTGGACA AGCTGGTGAG CAGCGGCATC

2551   CGGAAGGTGC TGTGATCTAG AGAATTC

序列I.D.No：10：Du151合成的Pol蛋白质

1      SRVSVMTVKT SDTCSSRRRS QLVCKRMPGA DKPVRARQRV LAGVGAGLTM RHQSRLY*EC

61     TICGVKYRTD A*GENTASGA IRHSGCATVG KGDRCGPLRY YASWRKGDVL QGD*VG*RQG

121    FPSHDVVKRR PVPSLHACRS TLEDPRVPSS FPQGPARQFP SEQTRANSPT SRELQVRRDN

181    PRSETGAERK GTLNFPQITL WQRPLVSIKI GGQTREALLD TGADDTVLEDINLPGKWKPK

241    MIGGIGGFIK VRQYDQILIE ICGKKAIGTV LVGPTPVNII GRNMLTQLGC TLNFPISPIE

301    TVPVKLKPGM DGPKVKQWPL TEVKIKALTA ICEEMEKEGK ITKIGPENPY NTPIFAIKKE

361    DSTKWRKLVD FRELNKRTQD FWEVQLGIPH PAGLKKKKSV TVLDVGDAYF SVPLDEGFRK

421    YTAFTIPSIN NETPGIRYQY NVLPQGWKGS PAIFQASMTK ILEPFRAKNP EIVIYQYMAA

481    LYVGSDLEIG QHRAKIEELR EHLLKWGFTT PDKKHQKEPP FLWMGYELHP DKWTVQPIQL

541    PEKDSWTVND IQKLVGKLNW TSQIYPGIKV RQLCKLLRGT KALTDIVPLT EEAELELAEN

601    REILKEPVHG VYYDPSKDLI AEIQKQGDDQ WTYQIYQEPF KNLKTGKYAK RRTTHTNDVK

661    QLTEAVQKIS LESIVTWGKT PKFRLPIQKE TWEIWWTDYW QATWIPEWEF VNTPPLVKLW

721    YQLEKEPIAG AETFYVDGAA NRETKIGKAG YVTDRGRQKI VTLSETTNQK TELQAIQLAL

781    QDSESEVNIV TDSQYALGII QAQPDRSESE LVNQIIEQLI KKERAYLSWV PAHKGIGGDE

841    QVDKLVSSGI RKVL*

序列I.D.No：11：Du151合成的env基因

1      AAGCTTATGA GGGTTATGGG GATTCAGAGA AACTGGCCTC AGTGGTGGAT TTGGGGGACA

61     TTGGGATTTT GGATGATCAT CATCTGTCGC GTCGTGGGCA ACCTGAACCT GTGGGTCACT

121    GTCTACTATG GAGTGCCAGT TTGGAAGGAA GCCAAGACAA CTCTGTTTTG CGCCAGCGAC

181    GCCAAGGCTT ATGACAAGGA AGTCCACAAC GTGTGGGCCA CCCACGCATG TGTCCCAACC

241    GACCCCAACC CACGCGAAAT CGTGCTGGAA AACGTCACAG AAAATTTCAA CATGTGGAAA

301    AACGATATGG TGGATCAGAT GCATGAGGAT ATTATTAGCC TCTGGGACCA GTCTCTGAAG

361    CCATGTGTGA AGTTGACACC TCTCTGTGTG ACCCTTAACT GTACTAACGC CCCCGCCTAT

421    AACAACTCTA TGCACGGGGA GATGAAAAAC TGTTCCTTCA ACACCACCAC CGAAATCAGG

481    GACAGAAAAC AGAAAGCCTA TGCCCTGTTC TATAAGCCCG ATGTGGTGCC ACTTAACCGC

541    CGCGAAGAAA ATAATGGTAC TGGCGAATAT ATTCTGATTA ACTGTAACAG CTCTACAATT

601    ACTCAGGCTT GCCCTAAAGT CACCTTTGAC CCAATCCCAA TCCACTACTG CGCCCCTGCA

661    GGATACGCTA TCCTGAAATG CAATAATAAG ACCTTCAACG GAACTGGACC CTGCAATAAC

721    GTGTCTACAG TGCAATGTAC CCACGGCATT ATGCCCGTCG TCTCCACCCA ACTGCTGCTC

781    AATGGCAGCT TGGCAGAAGA GGAGATCATT ATTAGGAGCG AAAACCTCAC CAACAATATC

841    AAGACAATCA TCGTGCACCT GAACAAGTCT GTGGAAATTG TGTGTACCAG GCCCAATAAC

901    AACACCAGGA AGAGCATCCG CATCGGACCT GGACAAACTT TCTACGCCAC CGGCGAAATC

961    ATCGGGAACA TTAGAGAAGC CCACTGCAAC ATCTCTAAGA GCAATTGGAC ATCTACATTG

1021   GAGCAAGTGA AAAAAAAGCT GAAAGAGCAC TACAATAAGA CCATCGAGTT CAACCCTCCT

1081   TCCGGCGGCG ATCTGGAGGT CACAACACAC TCCTTTAACT GTAGGGGGGA GTTCTTTTAC

1141   TGCAACACAA CAAAGCTGTT TAGCAACAAC TCCGACAGCA ATAATGAGAC TATCACCCTG

1201   CCTTGCAAGA TCAAGCAAAT CATTAACATG TGGCAGAAAG TGGGAAGGGC AATGTATGCA

1261   CCTCCCATCG AGGGCAACAT CACATGCAAG TCTAATATCA CCGGCCTGTT GCTGACTAGA

1321   GACGGTGGCA AGAATACTAC TAACGAAATC TTCAGGCCAG GTGGAGGGAA CATGAAAGAT

1381   AATTGGCGCT CCGAACTGTA TAAGTACAAG GTGGTGGAGA TTGAGCCCCT CGGCGTCGCC

1441   CCCACAAAGT CTAAGCGCCG CGTGGTGGAA AGAGAGAAGA GGGCTGTCGG CCTCGGCGCA

1501   GTGCTGCTGG GGTTCTTGGG TGCCGCTGGG TCTACAATGG GCGCTGCCTC TATTACACTC

1561   ACCGTGCAAG CTAGGCAGCT GCTGTCCGGT ATTGTGCAAC AACAGAGCAA TCTCTTGAGA

1621   GCTATCGAGG CCCAGCAGCA TATGCTGCAA CTTACAGTGT GGGGTATTAA GCAGCTGCAA

1681   ACTCGCGTCC TGGCAATCGA ACGCTACCTG AAAGACCAGC AACTCCTGGG TCTGTGGGGC

1741   TGCTCCGGTA AGATCATCTG TACCACAGCC GTGCCCTGGA ACAGCAGCTG GTCCAATAAG

1801   AGCCAAGAGG ATATTTGGGA TAATATGACC TGGATGCAAT GGGATAGAGA GATCAGCAAC

1861   TACACAGGAA CCATTTATAG GCTCCTGGAA GATTCTCAGA ACCAGCAGGA GAAGAACGAG

1921   AAGGACTTGC TCGCCCTGGA TAGCTGGAAA AACCTGTGGA ATTGGTTTAA CATCACCAAC

1981   TGGCTTTGGT ACATTAAGAT TTTCATCATG ATTGTGGGAG GCTTGATCGG CCTGAGGATT

2041   ATCTTCGGGG TGCTTGCCAT TGTGAAAAGG GTCAGACAAG GATACTCCCC ATTGTCCTTT

2101   CAGACCTTGA CTCCAAGCCC ACGCGGACCC GACAGGTTGG GCAGGATCGA GGAGGAAGGA

2161   GGCGAACAGG ATAAGGACCG CTCCATCAGA CTTGTTAGCG GGTTTCTGGC CCTGGCCTGG

2221   GATGATCTGA GGAGCCTGTG CCTCTTCTCC TATCACCACC TCCGCGATTT CATCCTCATT

2281   GCAGCTAGGG CTGCTGAGTT GCTGGGACGC TCCTCCCTGA GAGGTCTCCA GAGAGGCTGG

2341   GAGGCACTGA AGTACCTCGG GAACCTTGTG CAATACGGCG GGCTGGAGCT GAAAAGATCC

2401   GCCATCAAGC TGTTCGACAC CATCGCAATC GCCGTTGCAG AGGGCACCGA CAGGATCTTG

2461   GAGGTCATTC AGAGGATCTG TCGCGCCATC CGCCACATCC CCATCAGGAT CAGACAAGGA

2521   TTCGAGGCAG CACTGCAATG ATAGTTAATT AAACGCGTGG ATCC

序列I.D.No：12：Du151合成的Env蛋白质

KLMRVMGIQRNWPQWWIWGTLGFWMIIICRVVGNLNLWVTVYYGVPVWKEAKTTLFCASD

AKAYDKEVHNVWATHACVPTDPNPREIVLENVTENFNMWKNDMVDQMHEDIISLWDQSLK

PCVKLTPLCVTLNCTNAPAYNNSMHGEMKNCSFNTTTEIRDRKQKAYALFYKPDVVPLNR

REENNGTGEYILINCNSSTITQACPKVTFDPIPIHYCAPAGYAILKCNNKTFNGTGPCNN

VSTVQCTHGIMPVVSTQLLLNGSLAEEEIIIRSENLTNNIKTIIVHLNKSVEIVCTRPNN

NTRKSIRIGPGQTFYATGEIIGNIREAHCNISKSNWTSTLEQVKKKLKEHYNKTIEFNPP

SGGDLEVTTHSFNCRGEFFYCNTTKLFSNNSDSNNETITLPCKIKQIINMWQKVGRAMYA

PPIEGNITCKSNITGLLLTRDGGKNTTNEIFRPGGGNMKDNWRSELYKYKVVEIEPLGVA

PTKSKRRVVEREKRAVGLGAVLLGFLGAAGSTMGAASITLTVQARQLLSGIVQQQSNLLR

AIEAQQHMLQLTVWGIKQLQTRVLAIERYLKDQQLLGLWGCSGKIICTTAVPWNSSWSNK

SQEDIWDNMTWMQWDREISNYTGTIYRLLEDSQNQQEKNEKDLLALDSWKNLWNWFNITN

WLWYIKIFIMIVGGLIGLRIIFGVLAIVKRVRQGYSPLSFQTLTPSPRGPDRLGRIEEEG

GEQDKDRSIRLVSGFLALAWDDLRSLCLFSYHHLRDFILIAARAAELLGRSSLRGLQRGW

EALKYLGNLVQYGGLELKRSAIKLFDTIAIAVAEGTDRILEVIQRICRAIRHIPIRIRQG

FEAALQOOLIKRVD*

序列I.D.No：13：Du179 Env基因(非人类化的)

AGGCTAATTTTTTAGGGAAAATTTGGCCTTCCCACAAGGGGAGGCCAGGGAATTTCCTTCAGAGCAGGCCAATGAGAGT

GAGGGGGATACAGAGGAATTGGCCACAATGGTGGATATGGGGCATCTTAGGCTTTTGGATGTTAATGATTTGTAGTGGG

GTGGGAAACTTGTGGGTCACAATCTATTATGGGGTACCTGTGTGGAGAGAAGCAAAAACTACTCTATTCTGTGCATCAG

ATGCTAAAGCATATGATAGAGAAGTGCATAATGTCTGGGCTACACATGCCTGTGTACCCACAGACCCCAACCCACAAGA

AATAGTTATGGGAAATGTAACAGAAAATTTTAACATGTGGAAAAATGACATGGTGGATCAGATGCATGAGGATATAATC

AATTTATGGGATCAAAGCCTAAAGCCATGTGTAAAGTTAACCCCACTCTGTGTCACTTTAAAATGTAGTACCTATAATG

GTAGTGATACCAACGATATGAGAAATTGCTCTTTCAATACAACTACAGAAATAAGGGACAAGAAACAGACAGTGTATGC

ACTTTTTTATAAACCTGATATAGTACCAATTAATGAGAGTGAGTATATATTAATACATTGCAATACCTCAACCATAACA

CAAGCCTGTCCAAAGGTCTCTTTTGACCCAATTCCTATACATTATTGTGCTCCAGCTGGTTATGCGATTCTAAAGTGTA

ATAATAAGACATTCAATGGGACGGGACCATGCCAAAATGTCAGCACAGTACAATGCACACATGGAATTAAGCCAGTAGT

ATCAACTCAACTACTGTTAAATGGTAGCATAGCAGAAGGAGAGATAATAATTAGATCTGAAAATCTGACAAACAATGTT

AAAACAATAATAGTACACCTTAATGAATCTATAGGAATTGTGTGTACAAGACCCGGCAATAATACAAGAAAAAGTATAA

GGATAGGACCAGGACAAGCATTCTATACAAATCACATAATAGGAGATATAAGACAAGCATATTGTAACATTAGTAAACA

AGAATGGAACAAAACTTTAGAAGAGGTGAGAAAAAAATTGCAAGAACACTTCCCAAATAAAACAATAAAATTTAACTCA

TCCTCAGGAGGGGACCTAGAAATTACAACACATAGCTTTAATTGCAGAGGAGAATTTTTCTATTGCAATACATCAAAAC

TATTTAATGATAGTCTAGTAAATGATACAGAAAGTAATTCAACCATCACTATTCCATGCAGAATAAAACAAATTATAAA

CATGTGGCAGGAGGTAGGACGAGCAATGTATGCCCCTCCCATTGCAGGAAACATAACATGTAAATCAAATATCACAGGA

CTACTATTGACACGTGATGGAGGAACAGATAACACAACAGAGATATTCAGACCTGGAGGAGGAAATATGAAGGACAATT

GGAGAAGTGAATTATATAAATATAAAGTAGTAGAAATTAAGCCATTGGGAATAGCACCCACTGAAGCAAAAAGGAGAGT

GGTGGAGAGAGAAAAAAGAGCAGTGGGAATAGGAGCTGTGCTCCTTGGGTTCTTGGGAGCAGCAGGAAGCACTATGGGC

GCGGCGTCAATAACGCTGACGGTACAGGCCAGACAACTGTTGTCTGGTATAGTGCAACAGCAAAGCAATTTGCTGAGAG

CTATAGAGGCGCAACAGCATATGTTGCAACTCACAGTCTGGGGCATTAAGCAGCTCCAGACAAGAGTCCTGGCTATAGA

AAGATACCTAAAGGATCAACAGCTCCTAGGACTTTGGGGCTGCTCTGGAAAACTCATCTGCACCACTAATGTGCCTTGG

AACTCCAGTTGGAGCAATAAATCTCAACAAGCTATTTGGGATAACATGACATGGATGCAGTGGGATAGAGAAATTAATA

ATTACACAAACATAATATACCAGTTGCTTGAGGACTCGCAAATCCAGCAGGAACAGAATGAAAAAGATTTATTAGCATT

GGACAAGTGGCAAAATCTGTGGAGTTGGTTTAGCATAACAAATTGGCTATGGTATATAAAAATATTCATAATGATAGTA

GGAGGCTTAATAGGTTTAAGAATAATTTTTGCTGTGCTATCTATAGTAAATAGAGTTAGGCAGGGATACTCACCTTTGT

CGTTTCAGACCCTTACCCCAAACCCGAGGGGACCCGACAGGCTCGGAGAAATCGAAGAAGAAGGTGGAGAGCAAGACAG

AGACAGATCCGTTCGATTAGTGAGCGGATTCTTACCACTTGCCTGGGACGATCTGCGGAGCCTGTGCCTCTTCAGCTAC

CACCGATTGAGAGACTTCATATTCGATTGCAGCGAGGACAGTGGAACTTCTGGGACGCAGCAGTCTCAGGGGACTCCAG

AGGGGTGGGAAGTCCTTAAATATCTGGGAAGCCTTGTGCAGTATTGGGGTCTGGAGCTAAAAAGAGTGCTATTAGTCTG

CTTGATACCCATAGCAATAGCAGTAGCTGAAGGAACAGATAGGATTATTGAATTAGTACTAAGATTTTGTAGAGCTATC

CGCAACATACCTACAAGAGTAAGACAGGGCTGTGAAGCAGCTTTGCTATAA

序列I.D.No：14：Du179 Env蛋白质

1      ANFLGKIWPS HKGRPGNFLQ SRPMRVRGIQ RNWPQWWIWG ILGFWMLMIC SGVGNLWVTI

61     YYGVPVWREA KTTLFCASDA KAYDREVHNV WATHACVPTD PNPQEIVMGN VTENFNMWKN

121    DMVDQMHEDI INLWDQSLKP CVKLTPLCVT LKCSTYNGSD TNDMRNCSFN TTTEIRDKKQ

181    TVYALFYKPD IVPINESEYI LIHCNTSTIT QACPKVSFDP IPIHYCAPAG YAILKCNNKT

241    FNGTGPCQNV STVQCTHGIK PVVSTQLLLN GSIAEGEIII RSENLTNNVK TIIVHLNESI

301    GIVCTRPGNN TRKSIRIGPG QAFYTNHIIG DIRQAYCNIS KQEWNKTLEE VRKKLQEHFP

361    NKTIKFNSSS GGDLEITTHS FNCRGEFFYC NTSKLFNDSL VNDTESNSTI TIPCRIKQII

421    NMWQEVGRAM YAPPIAGNIT CKSNITGLLL TRDGGTDNTT EIFRPGGGNM KDNWRSELYK

481    YKVVEIKPLG IAPTEAKRRV VEREKRAVGI GAVLLGFLGA AGSTMGAASI TLTVQARQLL

541    SGIVQQQSNL LRAIEAQQHM LQLTVWGIKQ LQTRVLAIER YLKDQQLLGL WGCSGKLICT

601    TNVPWNSSWS NKSQQAIWDN MTWMQWDREI NNYTNIIYQL LEDSQIQQEQ NEKDLLALDK

661    WQNLWSWFSI TNWLWYIKIF IMIVGGLIGL RIIFAVLSIV NRVRQGYSPL SFQTLTPNPR

721    GPDRLGEIEE EGGEQDRDRS VRLVSGFLPL AWDDLRSLCL FSYHRLRDFI FDCSEDSGTS

781    GTQQSQGTPE GWEVLKYLGS LVQYWGLELK RVLLVCLIPI AIAVAEGTDR IIELVLRFCR

841    AIRNIPTRVR QGCEAALL*

Claims (41)

1.一种用于筛选用于开发预防性和治疗性药用组合物的HIV亚型分离物的方法，包括以下步骤：

从新感染的对象体内分离病毒；

通过在所分离的病毒中鉴定沿着有关基因的至少一部分的每一个位点上的最常见的密码子或氨基酸，制备至少一种HIV基因的至少一部分的共有序列；

筛选与所述共有序列具有高度序列相同性的分离的病毒，它是与特定HIV亚型传染相关的一种表型。

2.如权利要求1的方法，其中，所述分离的病毒具有与类似的攻击菌株相同的亚型。

3.如权利要求1或2的方法，其中，所述HIV-1亚型是HIV-1亚型C。

4.如权利要求3的方法，其中，所述与传染相关的表型是使用CCR5共同受体的病毒，并且是非合胞体诱导的(NSI)。

5.一种HIV-1亚型C分离物，代号为Du422，其欧洲细胞培养物保藏中心所确定的临时保藏号为01032114。

6.一种HIV-1亚型C分离物，代号为Du151，其欧洲细胞培养物保藏中心所确定的临时保藏号为00072724。

7.一种HIV-1亚型C分离物，代号为Du179，其欧洲细胞培养物保藏中心所确定的临时保藏号为00072725。

8.一种分子，该分子具有：

(i)在序列I.D.No.1所示序列中示出的核苷酸序列；

(ii)相当于序列I.D.No.1所示核苷酸序列的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.1所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.1所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任一项的序列修饰或衍生的序列。

9.如权利要求8的分子，该分子具有序列I.D.No.7所示的修饰序列。

10.一种分子，该分子具有：

(i)序列I.D.No.3所示核苷酸序列；

(ii)与序列I.D.No.3所示核苷酸序列相应的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.3所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.3所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任一项的序列修饰或衍生的序列。

11.如权利要求10的分子，该分子具有序列I.D.No.9所示的修饰序列。

12.一种分子，该分子具有：

(i)序列I.D.No.5所示核苷酸序列；

(ii)与序列I.D.No.5所示核苷酸序列相应的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.5所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.5所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任一项的序列修饰或衍生的序列。

13.如权利要求12的分子，该分子具有序列I.D.No.11所示的修饰序列。

14.一种分子，该分子具有：

(i)序列I.D.No.13所示核苷酸序列；

(ii)与序列I.D.No.13所示核苷酸序列相应的RNA序列；

(iii)能在严格杂交条件下与序列I.D.No.13所示核苷酸序列或与它相应的RNA序列杂交的序列；

(iv)与序列I.D.No.13所示核苷酸序列或与之相应的RNA序列同源的序列；

(v)由(i)-(iv)任一项的序列修饰或衍生的序列。

15.如权利要求14的分子，该分子具有与序列I.D.No.11所示分离物Du151的env基因的序列相似或相同的修饰的修饰序列。

16.一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.2所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.2所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

17.如权利要求16的多肽，其中，所述修饰序列如序列I.D.No.8所示。

18.一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.4所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.4所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

19.如权利要求18的多肽，其中，所述修饰序列如序列I.D.No.10所示。

20.一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.6所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.6所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

21.如权利要求20的多肽，其中，所述修饰序列如序列I.D.No.12所示。

22.一种多肽，该多肽具有：

(i)序列I.D.No.14所示氨基酸序列；或

(ii)由序列I.D.No.14所示序列修饰或衍生的氨基酸序列。

23.如权利要求22的多肽，其中，所述修饰序列具有与序列I.D.No.12所示分离物Du151的env基因的氨基酸序列相似或相同的修饰。

24.HIV-1亚型C的部分gag基因的共有氨基酸序列，该序列如下：

GEKLDKWEKI RLRPGGKKHY MLKHLVWASR ELERFALNPG LLETSEGCKQ  ⁵⁰

IMKQLQPALQ TGTEELRSLY NTVATLYCVH EKIEVRDTKE ALDKIEEEQN ¹⁰⁰

KSQQ-CQQKT QQAKAADGG- KVSQNYPIVQ NLQGQMVHQA ISPRTLNAWV ¹⁵⁰

EEKAFSP    EVIPMFTALS EGATPQDLNT MLNTVGGHQA AMQMLKDTIN ²⁰⁰

EEAAEWDRLH PVHAGPIAPG QMREPRGSDI AGTTSTLQEQ IAWMTSNPPI ²⁵⁰

PVGDIYKRWI ILGLNKIVRM YSPVSILDIK QGPKEPFRDY VDRFFKTLRA ³⁰⁰

EQATQDVKNW MTD ³¹³

25.HIV-1亚型C的部分pol基因的共有氨基酸序列，该序列如下：

LTEEKIKALT AICEEMEKEG KITKIGPENP YNTPVFAIKK  KDSTKWRKL- ⁵⁰

VDFRELNKRT QDFWEVQLGI PHPAGLKKKK SVTVLDVGDA YFSVPLDEGF ¹⁰⁰

RKYTAFTIPS INNETPGIRY QYNVLPQGWK GSPAIFQSSM TKILEPFRAK ¹⁵⁰

NPEIVIYQYM DDLYVGSDLE IGQHRAKIEE LREHLLKWGF TTPDKKHQKE ²⁰⁰

PPFLWMGYEL HPDKWTVQPI QLPEKDSWTV NDIQKLVGKL NWASQIYPGI ²⁵⁰

KVRQLCKLLR GAKALTDIVP LTEEAELE ²⁷⁸

26.HIV-1亚型C的部分env基因的共有氨基酸序列，该序列如下：

YCAPAGYAIL KCNNKTFNGT GPCNNVSTVQ CTHGIKPVVS TQLLLNGSLA  ⁵⁰

EEEIIIRSEN LTNNAKTIIV HLNESVEIVC TRPNNNTRKS IRIGPGQTFY ¹⁰⁰

ATGDIIGDIR QAHCNISEGK WNKTLQKVKK KLKEELYKYK VVEIKPLGIA ¹⁵⁰

PTEAKRRVVE REKRAVGIGA VFLGFLGAAG STMGAASITL TVQARQLLSG ²⁰⁰

IVQQQSNLLR AIEAQQHMLQ LTVWGIKQL ²²⁹

27.如权利要求1的方法，本质上如本文所披露的。

28.如权利要求5的HIV-1亚型C分离物，本质上如本文所披露的。

29.如权利要求6的HIV-1亚型C分离物，本质上如本文所披露的。

30.如权利要求7的HIV-1亚型C分离物，本质上如本文所披露的。

31.如权利要求8的分子，本质上如本文所披露的。

32.如权利要求10的分子，本质上如本文所披露的。

33.如权利要求12的分子，本质上如本文所披露的。

34.如权利要求14的分子，本质上如本文所披露的。

35.如权利要求16的多肽，本质上如本文所披露的。

36.如权利要求18的多肽，本质上如本文所披露的。

37.如权利要求20的多肽，本质上如本文所披露的。

38.如权利要求22的多肽，本质上如本文所披露的。

39.如权利要求24的共有氨基酸序列，本质上如本文所披露的。

40.如权利要求25的共有氨基酸序列，本质上如本文所披露的。

41.如权利要求26的共有氨基酸序列，本质上如本文所披露的。

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