CN113278696A

CN113278696A - 一种分子标志物rad51b-as1及其应用

Info

Publication number: CN113278696A
Application number: CN202110531593.4A
Authority: CN
Inventors: 吕卫国; 韦欣仪; 王聪慧; 杨倩; 程晓东; 谢幸; 王新宇
Original assignee: Womens Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Current assignee: Womens Hospital of Zhejiang University School of Medicine
Priority date: 2021-05-14
Filing date: 2021-05-14
Publication date: 2021-08-20
Anticipated expiration: 2041-05-14
Also published as: CN113278696B

Abstract

本发明公开了一种分子标志物RAD51B‑AS1及其应用，RAD51B‑AS1为长链非编码RNA(ID:ENST00000554679.1)，通过检测RAD51B‑AS1的表达水平来实现诊断卵巢癌的目的。本发明RAD51B‑AS1的表达水平在卵巢癌组织中，比在良性卵巢肿瘤组织中，明显增高，可用于制备诊断卵巢癌的产品与试剂盒；另外本发明RAD51B‑AS1可以影响卵巢癌增殖、迁移侵袭和抗失巢凋亡的能力，故抑制RAD51B‑AS1可以制备治疗卵巢癌的药物。

Description

一种分子标志物RAD51B-AS1及其应用

技术领域

本发明属于诊断与治疗领域，尤其涉及一种分子标志物RAD51B-AS1及其应用。

背景技术

卵巢癌依旧是当今世界女性致死率最高的妇科恶性肿瘤，以上皮性卵巢肿瘤为最常见的组织类型，它代表了全世界女性中被诊断出的第八大癌症，诊断后5年的生存率不超过50％。由于卵巢位于盆腔深部，卵巢癌早期缺乏特异性症状，隐匿性极强，以及缺乏特异性强且高效的早期筛查策略，所以绝大部分卵巢癌患者在初次诊断时即有明显的盆腹腔或远处转移。数据显示大多数浆液性癌在III期(51％)或IV期(29％)确诊，患者5年特异性生存期分别为42％和26％。如果肿瘤在早期诊断时仍局限于单个卵巢，即FIGO分期I期，5年生存率超过80％。因此，探索卵巢癌发生发展的生物学过程与机制以及寻找早期诊断和不良预后预测的生物标志物与有效的治疗靶点和干预措施显得格外重要，成为研究者迫切需要探索的重心。

lncRNA作为一类长度大于200个核苷酸，但无蛋白质编码功能的RNA，多数位于细胞质中，少数位于细胞核，曾经被误以为是RNA聚合酶Ⅱ转录时形成的转录副产物，不具有任何生物学功能。随着对基因组学深入研究，lncRNA被报道参与了各种生理病理过程，以及在各种肿瘤的发生发展过程中具有至关重要的作用。目前虽然越来越多的研究表明lncRNA与卵巢癌的发生发展相关，但依旧没有清楚阐释卵巢癌进展过程的机制，也没有一个明确的生物标志物进入实践应用。LncRNA成为分子标志物与治疗靶标还有很长的路要走。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种分子标志物RAD51B-AS1及其应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种诊断卵巢癌的分子标志物，为长链非编码RNA RAD51B-AS1，序列如SEQ ID NO.1所示。

一种上述分子标志物的应用，RAD51B-AS1用于制备诊断卵巢癌的试剂盒。

进一步地，所述试剂盒用于定量检测RAD51B-AS1的表达水平。

进一步地，所述试剂盒基于实时定量反转录PCR、原位杂交、芯片或高通量测序进行检测。

进一步地，通过实时定量反转录PCR检测RAD51B-AS1的表达水平以诊断卵巢癌的试剂盒至少包括一对特异性的引物，如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

进一步地，通过原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RAD51B-AS1表达水平的试剂盒包括与RAD51B-AS1的核酸序列杂交的特异性探针。

一种治疗卵巢癌的药物，所述药物包括抑制RAD51B-AS1的试剂。

进一步地，所述试剂至少包括RAD51B-AS1的siRNA、shRNA、ASO中的一个。

进一步地，RAD51B-AS1的siRNA如SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示，或如SEQ IDNO.8和SEQ ID NO.9所示。

一种上述药物在治疗卵巢癌中的应用。

本发明的有益效果是：本发明提供卵巢癌分子标志物RAD51B-AS1在诊断与治疗中的应用。通过对9例良性卵巢肿瘤与36例卵巢癌组织的qRT-PCR验证RAD51B-AS1确在卵巢癌组织中上调。且敲低RAD51B-AS1具有明显抑制卵巢癌的增殖、转移、抗失巢凋亡的能力。以上结果表明RAD51B-AS1在卵巢癌中是一个重要的致癌因子，可作为诊断的分子标志物与治疗靶点。

附图说明

图1为利用qPCR检测RAD51B-AS1在卵巢癌组织和良性卵巢肿瘤组织中的表达差异统计图；

图2为利用两条siRNA敲低卵巢癌细胞中的RAD51B-AS1的敲低效率结果示意图；其中，

图3为利用CCK8检测抑制RAD51B-AS1表达对卵巢癌细胞增殖影响的生长曲线图；

图4为抑制RAD51B-AS1表达对卵巢癌细胞迁移侵袭影响的结果统计图；

图5为抑制RAD51B-AS1表达对卵巢癌细胞抗失巢凋亡能力的影响的结果统计图；

图6为抑制RAD51B-AS1表达抑制抗失巢凋亡基因BCL-2的表达示意图；

图中，**：p＜0.01；***：p＜0.001。

具体的实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

本发明提供一种诊断卵巢癌的分子标志物，为长链非编码RNA(long non-codingRNA，lncRNA)RAD51B-AS1(ID:ENST00000554679.1)，其序列如SEQ ID NO.1所示。RAD51B-AS1来源包括但不限于组织和存在核酸的体内液体成分，包括血液、腹水等。

本发明还提供一种上述分子标志物RAD51B-AS1在制备诊断卵巢癌试剂盒中的应用。所述试剂盒通过定量检测RAD51B-AS1的表达水平来诊断卵巢癌；试剂盒可以基于实时定量反转录PCR、原位杂交、芯片或高通量测序等。其中，通过实时定量反转录PCR检测RAD51B-AS1的表达水平以诊断卵巢癌的试剂盒，至少包括一对特异性扩增RAD51B-AS1的引物，正向引物如SEQ ID NO.2所示，反向引物如SEQ ID NO.3所示；通过原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RAD51B-AS1表达水平以诊断卵巢癌的试剂盒，包括与RAD51B-AS1的核酸序列杂交的DNA、RNA或其它特异性探针。

本发明还提供一种治疗卵巢癌的药物，所述药物包括抑制RAD51B-AS1的试剂。所述试剂不受限制，可以抑制RAD51B-AS1表达水平或抑制RAD51B-AS1功能活性均可；包括siRNA、shRNA或ASO等。本发明实施例中，RAD51B-AS1的siRNA序列如SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

本发明还提供一种上述药物在治疗卵巢癌中的应用。

实施例1RAD51B-AS1在卵巢癌中的差异表达

1、标本来源

标本选自医院手术切除的36例上皮性卵巢癌组织，良性卵巢肿瘤组织9例。

2、病例筛选

所有卵巢癌和良性卵巢肿瘤患者均为初诊，均已签署知情同意书，术前均未接受过化疗、放疗或其他治疗。没有其他部位的恶性肿瘤或者重大疾病个人史。

3、所用试剂

表1：所用试剂

4、所用设备

表2：所用设备

6、RNA提取

1)先将研钵等研磨工具预冷。

2)将组织从-80℃冰箱中取出，剪取米粒大小的组织放入装有1mL Trizol的无RNA酶的离心管中。

3)置于研钵剧烈震荡研磨20min，使组织得到充分研磨。

4)每1mL Trizol加入200μL氯仿，上下颠倒混匀15s，室温静置15min，12000rpm，4℃离心15分钟。分为三层，上层为无色透明层，即RNA；底层为红色有机相，中间絮状沉淀层，主要是DNA。

5)吸取上层水相至另一干净的离心管，注意不要吸到中间层沉淀。

6)加500μL异丙醇至吸取的上清中，上下颠倒混匀15s，室温静置孵育15min，14000rpm，4℃离心15分钟。

7)离心后能在管底明显看到白色沉淀，弃上清，加1mL预冷的75％乙醇清洗RNA沉淀，7500rpm4℃离心5min。

8)弃上清，重复7一遍。

9)倒置ep管于干净的吸水纸上晾干，视沉淀大小加入10μL-50μL的DEPC水使RNA充分溶解。

10)取1μL RNA溶液于用微量核酸定量分析仪检测RNA的浓度和纯度，质量较好的RNA OD260/OD280应该在1.8～2.2之间。于-80℃冰箱保存。

7、逆转录和qPCR

1)去除DNA

以1ug RNA体系为例。反应条件：42℃2min，4℃forever

试剂	反应量(μL)
		5×gDNA Eraser Buffer	2.0
gDNA Eraser	1.0
		提取的RNA	1ug除以RNA浓度算出体积
RNase Free H<sub>2</sub>O	补齐到10

2)逆转录

以20μL RT体系为例。反应体系：37℃15min，85℃5sec，4℃forever

试剂	反应量(μl)
		去除DNA的RNA	10
PrimeScript RT Enzyme Mix I	1
		RT Primer Mix	1
5×PrimeScript Buffer 2	4
		RNase Free H<sub>2</sub>O	4
Total	20

3)qPCR反应

以20μL PCR体系为例。反应条件：95℃10sec，[95℃×5sec+60℃×30sec]×40个循环，4℃forever

结果：获得每个样品的CT值后以β-actin为内参，根据2^-ΔΔCT方法计算目的基因的相对表达量。引物序列见表3。

表3：RT-PCR检测片段引物序列

8、统计分析

采用Graphpad Prism 8.0.1软件进行统计学分析。结果以Mean±SD表示。正态分布且方差齐的数据比较采用Student’s t检验，正态分布却方差不齐的数据比较采用Welch’s correction的非配对t检验。非正态分布的实验数据采用非参数Mann–Whitney检验。P<0.05为差异有统计学意义。

9、结果

结果如图1所示，与正常卵巢组织相比，卵巢癌组织中RAD51B-AS1平均表达水平明显上调，差异具有统计学意义(P<0.05)。

实施例2RAD51B-AS1表达对卵巢癌细胞增殖的影响

1.细胞复苏

将存放在-80℃冰箱或液氮中的细胞取出，置于37℃电热水浴锅中摇晃使其迅速融化，随后将细胞悬液吸至15ml离心管中，1000rpm离心5分钟后，弃上清，再加入1ml新鲜的完全培养基，轻轻吹打，混匀后吸至培养瓶中，再根据培养瓶的大小加入相应足够的培养基的量，在瓶中混合均匀后，平置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱中，次日换液。

2.常规细胞培养

人卵巢癌细胞株HO8910和HO8910PM培养在含10％FBS的RPMI-1640培养液中，置于5％CO₂、37℃细胞培养箱中常规培养，每2-3天换液一次，每当细胞融合度达到90％时候传代，并取对数生长期细胞用于后续实验。

3.siRNA合成

针对RAD51B-AS1区域选择作用靶点，根据确定序列的原则设计，委托上海吉玛制药技术有限公司合成两条针对RAD51B-AS1的siRNA (si-RAD51B-AS1)：

确定该序列用于本实施例。同时合成通用随机阴性序列(si-NC)用于计算转染率，转染48h后利用qRT-PCR检测siRNA转染效率，结果如图2显示，敲低效率均大于50％。

4.用DharmaFECT进行细胞转染

1)HO8910PM细胞以25万/孔的密度种于六孔板中，当细胞贴壁生长融合至50％-60％左右时，进行转染。实验分为si-NC,si-RAD51B-AS1#1,si-RAD51B-AS1#2三组。

2)以六孔板的1孔加液量为例：

A液：5μL的siRNA和195μL OPTI-MEM混合；

B液：5μL的DharmaFECT和195μL的OPTI-MEM混合；

室温静置5min后，将A液和B液混合均匀，室温静置20min后配成工作液，之后请勿剧烈吹打混匀。往六孔板中加入1.6ml培养基后再缓慢逐滴加入400μL上述工作液，以免对细胞刺激太大。

3)细胞板的每个孔中加混合液100μL，并前后轻轻摇动细胞板使混合液与孔中的培养液混匀。

4)于37℃的CO₂培养箱中培养48小时，检测敲低效率。

5.细胞增殖检测，以下实验步骤重复三次：

1)以细胞密度为5*10³/孔，接种于96孔板，每孔100μL，每组设置3个复孔。

2)待细胞完全贴壁后按照上面的步骤进行转染，分别在转染后0h、24h、48h、72h、96h进行CCK8法检测。

3)每孔加入10μLCCK8溶液，注意不要在孔中产生气泡，避免影响OD值读数。

4)避光37℃孵育2h，用酶标仪测定在450nm波长处的吸光度值，以时间为横坐标、吸光值为纵坐标，绘制细胞生长曲线。

6.统计分析

7.结果

结果见图3，表明抑制RAD51B-AS1表达可以显著抑制卵巢癌细胞增殖。

实施例3RAD51B-AS1表达对卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响

1.铺胶(迁移实验无需此步骤)：提前BD基质胶置于冰上化开，将1.5ml无菌EP管、装有200μL枪头的枪头盒和Transwell板置于冰箱中预冷。将BD基质胶和预冷的OPTI-MEM按1:10的比例混合均匀，取100μL加入Transwell板中的上室，注意不要产生气泡，然后轻轻放入培养箱中静置30min后取出Transwell板，小心吸弃上层未凝的液体，BD胶包被完成。

2.消化收集细胞并用无血清培养基重悬细胞；将20万个细胞重悬于200μL的无血清培养基种于上室；下室放置含20％FBS的高浓度培养基。

3.将细胞置于37℃培养箱孵育24h。

4.结晶紫染色15分钟后用清水轻柔的冲洗，并用棉签小心擦去上室的细胞，拍照、计数。

5.统计分析

6.结果如图4所示，表明抑制RAD51B-AS1表达可以显著抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭。

实施例4RAD51B-AS1表达对卵巢癌细胞抗失巢凋亡能力的影响

1.细胞失巢凋亡模型建立：将卵巢癌细胞用0.25％胰酶消化后加入从康宁公司购入的超低吸附六孔板(超低吸附表面具有中性的亲水性水凝胶polystyrene)中，每孔加入约25万个细胞。在此条件下悬浮培养细胞，用倒置显微镜观察悬浮细胞的形态和生长状况，视细胞状态2-3日换液(换液方法：800rpm离心3min，弃上清，加入新鲜的完全培养基重悬后加入培养板中)。另有贴壁细胞作为对照。

2.凋亡检测：细胞接种和转染方法同例2，转染72h后，收集上清液的漂浮细胞。以及用不含EDTA的胰酶消化贴壁细胞，用15ml离心管收集同一孔的漂浮细胞和贴壁细胞。1000rpm离心5min，弃上清液后收集沉淀，PBS洗涤2次。将沉淀悬浮于500μL 1×结合缓冲液中，加入5μL FITC-膜联蛋白V标记的膜联蛋白与10μL PI在避光条件下室温孵育15分钟。在流式细胞仪上采集细胞，计算并比较实验组与对照组之间的细胞凋亡率。

3.抗失巢凋亡蛋白BCL-2的检测：

1)细胞总蛋白提取：用预冷的PBS洗涤细胞2次，每孔加入100μL含1％PMSF的高效蛋白裂解液RIPA。于冰上充分裂解半小时后，将蛋白刮至1.5ml EP管中，14000rpm，4℃离心30min，取上清，弃沉淀，保存于-80℃。

2)Western blot法半定量蛋白浓度：

①蛋白变性：将蛋白样品与5×Loading buffer按4:1充分混匀后，100℃煮10min变性。

②SDS-PAGE电泳：将10％的预制胶固定到电泳架上，加入1×电泳缓冲液，拔出梳子，每孔加入适量蛋白样品。恒压120V，当指示剂跑到接近玻璃边缘1cm时停止电泳。

③转膜：将0.22μm的PVDF膜根据自己需要的胶的大小裁剪，左上角减一缺口作为区分标记。用甲醇15秒激活后，置于膜平衡液中摇晃洗涤一次1分钟。根据海绵-PVDF膜-胶-海绵的顺序放置好，夹紧电转夹子。注意避免气泡产生。将夹子小心置入电转槽中，使用标准转膜程序进行转膜。

④免疫反应：封闭：电转结束后，将膜浸没于5％脱脂牛奶中，置于摇床上缓慢摇动，室温封闭1h。一抗孵育：去除封闭液，用1×TBST溶液洗去多余的牛奶，根据膜上Marker的条带定位目的蛋白的位置，将膜裁剪后浸没于一抗稀释液中(β-actin 1:2000；RAD51B1:200)，4℃孵育过夜。一抗洗膜：回收一抗，加入1×TBST溶液，室温下快摇洗涤3次，10min/次，每次均更换1×TBST。二抗孵育：将膜浸没在相应的二抗中(1:5000)，常温摇床慢摇孵育1h。二抗洗膜：回收二抗，加入1×TBST溶液，洗涤2次，10min/次；最后用1×TBS溶液洗膜1次，10min。

⑤显影：避光吸取ECL的A液和B液各1ml，充分混匀，将膜浸没在混合液中1min。使用GE公司的ImageQuant LAS 4000mini仪器自动曝光成像，保存图片。使用Image J软件分析条带灰度值，目的蛋白的相对表达量＝目的蛋白的灰度值/β-ACTIN的灰度值。

5.统计分析

采用Graphpad Prism 8.01软件进行统计学分析。结果以Mean±SD表示。正态分布且方差齐的数据比较采用Student’s t检验，正态分布却方差不齐的数据比较采用Welch’scorrection的非配对t检验。非正态分布的实验数据采用非参数Mann–Whitney检验。P<0.05为差异有统计学意义。

6.结果如图5、图6所示，图5表明表明抑制RAD51B-AS1表达可以显著抑制卵巢癌细胞抵抗失巢凋亡的能力；图6表明抑制RAD51B-AS1明显抑制了抗失巢凋亡基因BCL2的表达。

上述实例的说明只是用于理解本发明的方法及思想。本领域的技术人员可以在不脱离本发明原理的前提下，对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 浙江大学医学院附属妇产科医院

<120> 一种分子标志物RAD51B-AS1及其应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 537

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

gagaacaacc tctaggagtt gagagcagtc cctggctgat accaagaaaa caagacttca 60

gttctaaagc tgcagaggaa tgaaatctgc caataaaagg aatgatcttg gaagaggact 120

atgagctcca gtttttcttc cagctctcat ggaaacaagc actgccacag ccccttgatg 180

agccagcaga gtccagtcat ctggcaacaa tgacaggtat ctggcatctg agaggaatat 240

caactgaaga caatgagaga attaaaaaag aagtaaacac aagacaatct tttttcaccc 300

ccttagattc tgcatttcca cttgcttgat tcagtaattg ttttgttttg aatgttgtgt 360

aaatgaatgc tacagcccta tgcaattttt aaaccacttt gctgtgtgtc tcatatggag 420

ctcaacaatg ttactgctgg catgagtgca ccataaagca tatgactccc tgatgtaaca 480

ttttaaataa ggatacattt ctcatccaat gtgacattat gcaggaaaat ttcactt 537

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tcaccccctt agattctgca tt 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tgcactcatg ccagcagtaa 20

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

acagagcctc gcctttgccg at 22

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

catgcccacc atcacgccct g 21

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcacgagagg aaacatt 17

<210> 7

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaaccccaga gctt 14

<210> 8

<211> 14

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccacgcgaca gatt 14

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

acgaacaagc aagggtt 17

Claims

1.一种诊断卵巢癌的分子标志物，其特征在于，为长链非编码RNA RAD51B-AS1，序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种权利要求1所述分子标志物的应用，其特征在于，RAD51B-AS1用于制备诊断卵巢癌的试剂盒。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂盒用于定量检测RAD51B-AS1的表达水平。

4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂盒基于实时定量反转录PCR、原位杂交、芯片或高通量测序进行检测。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，通过实时定量反转录PCR检测RAD51B-AS1的表达水平以诊断卵巢癌的试剂盒至少包括一对特异性的引物，如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。

6.根据权利要求4所述应用，其特征在于，通过原位杂交、芯片或高通量测序平台检测RAD51B-AS1表达水平的试剂盒包括与RAD51B-AS1的核酸序列杂交的特异性探针。

7.一种治疗卵巢癌的药物，其特征在于，所述药物包括抑制RAD51B-AS1的试剂。

8.如权利要求7所述药物，其特征在于，所述试剂至少包括RAD51B-AS1的siRNA、shRNA、ASO中的一个。

9.如权利要求8所述药物，其特征在于，RAD51B-AS1的siRNA如SEQ ID NO.6和SEQ IDNO.7所示，或如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

10.一种权利要求7所述药物在治疗卵巢癌中的应用。