CN104388556A - 一种长链非编码rna在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用 - Google Patents

一种长链非编码rna在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因治疗和医学诊断领域，本发明在研究卵巢癌发生发展机制过程中发现LOC101929219是一种主要表达于卵巢癌细胞的长链非编码RNA，在其他组织、细胞中完全不表达或仅有少量表达，本发明首次发现了LOC101929219的功能及其应用价值。本发明还进一步提供了LOC101929219在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用。

Description

一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用
技术领域
本发明涉及基因治疗和医学诊断领域，具体涉及一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用。
背景技术
卵巢癌(Ovarian Cancer)是目前第六大常见肿瘤，在女性生殖器官常见恶性肿瘤中卵巢癌位居第三，致死率占各类妇科肿瘤之首(Jemal,A.,et al.,Cancer statistics,2002.CA Cancer J Clin,2002.52(1):p.23-47.)，其发病十分隐匿，转移前常无症状，手术不能完全清除病灶，再加上术后化疗作用局限，术后复发率高、预后差，卵巢恶性肿瘤组织类型繁多，其中上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)最常见，约占80-90％，是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，高达70％。(Luesley,D.,et al.,Failure of second-look laparotomyto influence survival in epithelial ovarian cancer.Lancet.1988,2(8611):599-603.)。卵巢癌的病因至今尚不明了，一直是妇科肿瘤学家面临的最严峻挑战之一。
长链非编码RNA(Long noncoding RNA，LncRNA)是一类长度大于200个碱基的功能性RNA分子，占人类基因组4-9％。LncRNA缺乏编码蛋白的能力，但能够在多种层面上调控其他基因的表达，参与细胞内诸多生物过程。由于自身分子长度，LncRNA具有一定的调控特色：既可以通过核酸序列一级结构与其他基因结合，又可以通过复杂的高级空间结构与蛋白因子相互作用；另外它们整体保守性较差，有利于维持自身功能的长期存在。目前许多研究表明，LncRNA广泛参与机体多种生理病理过程，其特异性表达和/或表达变化与恶性肿瘤的发生发展密切相关(Lee,J.T..Epigenetic regulation by longnoncoding RNAs.Science.2012.338(6113):1435-1439.)。
LOC101929219转录的cDNA序列如SEQ ID NO:11所示。
目前有关LOC101929219的功能尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于寻找到能够有效用于卵巢癌诊断、卵巢癌治疗的一种长链非编码RNA。
本发明的另一目的在于提供长链非编码RNALOC101929219的新的医药用途，即在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用。
本发明人在研究卵巢癌发生发展机制过程中发现LOC101929219是一种主要表达于卵巢癌细胞的长链非编码RNA，在其他组织、细胞中完全不表达或仅有少量表达，本发明首次发现了LOC101929219的功能及其应用价值。
本发明的主要技术方案如下：OVCAR-3和SKOV-3均是卵巢癌细胞系，且OVCAR-3比SKOV-3恶性程度高，本发明采用Taq-Man荧光定量PCR研究发现：LOC101929219在卵巢癌细胞系中特异性高表达，且在恶性程度高的细胞系中呈高表达状态。另外，卵巢癌组织中LOC101929219的表达也远远高于卵巢癌癌旁组织。进一步的，本发明应用RNA干扰技术来研究高表达基因功能，以LOC101929219的特异性siRNA干扰其表达，通过transwell和荷瘤实验研究该基因在卵巢癌细胞转移中的作用及其在卵巢癌治疗上的应用。
本发明提供了一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，所述的长链非编码RNA是LOC101929219。
本发明所述的LOC1019292191在制备卵巢癌诊断药物中的应用，该诊断药物是诊断卵巢癌的试剂或试剂盒。
所述的试剂，为检测生物样品中LOC1019292191表达量的试剂。
所述的试剂盒，包含检测生物样品中LOC1019292191表达量的试剂。
所述的检测生物样品中LOC1019292191表达量的试剂，选自：对LOC1019292191具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
本发明所述的LOC1019292191在制备卵巢癌治疗药物中的应用，该治疗药物是指抑制(降低)LOC1019292191表达量的试剂。
所述的抑制(降低)LOC1019292191表达量的试剂，包括但不限于：siRNA、shRNA。
在本发明的一个优选实施例中，本发明提供了LOC1019292191在制备卵巢癌治疗药物中的应用，该治疗药物是siRNA，序列如下：
             CUGAGAAACUCUGCUUCUATT      UAGAAGCAGAGUUUCUCAGTT
siRNA 4
                (SEQ ID NO:7)               (SEQ ID NO:8)
             GGGAAUCUCAAUACUUGGATT      UCCAAGUAUUGAGAUUCCCTT
siRNA 5
                (SEQ ID NO:9)               (SEQ ID NO:10)
上述序列中，3’端加TT是为了加强siRNA的稳定性。
本发明经实验证明：
1.LOC101929219对卵巢癌细胞体外浸润能力的影响：将OVCAR-3细胞接种到6孔板中，24h后，用lipofectamine2000分别转染LOC101929219特异性siRNA和阴性对照siRNA，24h后分别将两组细胞用胰酶消化下来，1500rpm离心5min，去上清，PBS洗一遍，用无血清的培养液重悬细胞，计数，使用24-Well Cell Invasion Assay，在上室孔中准确接种OVCAR-3细胞，105细胞/孔，48h后固定、染色、计数发现：穿膜的LOC101929219特异性siRNA干扰组细胞数量显著少于对照组。上述结果说明：LOC101929219可以显著地促进OVCAR-3细胞的体外浸润能力。
2.LOC101929219对卵巢癌细胞体内转移能力的影响：选择4-6周的雌性裸鼠，腹腔注射细胞，2×105细胞/只，接种2周后，注射LOC101929219特异性siRNA进行治疗，治疗7-8周后处死小鼠，提取子宫、输卵管组织基因组，建立定量PCR方法，检测组织中人与小鼠β2-微球蛋白分子拷贝数之比，以此计为肿瘤细胞的卵巢癌转移率。统计结果显示：注射LOC101929219特异性siRNA的实验组小鼠转移率显著低于对照组。由此可知：LOC101929219可以显著地促进OVCAR-3细胞的体内转移能力。
3.收集肝癌细胞系Huh7和Hep3B，乳腺癌细胞系MUF-7，卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3以及一定数量的卵巢癌及癌旁组织样本，抽提RNA并反转录为cDNA。设计荧光定量PCR方法分析LOC101929219的表达水平，研究发现：LOC101929219在卵巢癌细胞系中特异性高表达，且在恶性程度高的OVCAR-3细胞系中表达水平高于恶性程度低的SKOV-3细胞系。另外，LOC101929219在卵巢癌组织中的表达水平远远高于卵巢癌癌旁组织。由此可见LOC101929219可以成为治疗卵巢癌尤其是卵巢细胞癌-较好的药物靶点，提高卵巢癌的靶向治疗水平。
因此，LOC101929219具有促进肿瘤细胞转移能力的作用，在卵巢癌细胞中特异性高表达，LOC101929219可以成为卵巢癌治疗，尤其是抗转移治疗中的药物靶点；我们所构建的RNA干扰序列可以在以LOC101929219为靶点的卵巢癌治疗中发挥有效作用；对LOC101929219基因进行转录调控也可以用于卵巢癌生物治疗。
附图说明
图1：不同癌细胞系中LOC101929219的含量检测；
图2：卵巢癌和癌旁组织中LOC101929219的含量检测；
图3：疑似EOC患者中手术确诊者和手术排除EOC者样本组织中
LOC101929219的含量检测；
图4：LOC101929219表达的RNA干扰分析；
图5：改变LOC101929219表达水平对OVCAR-3细胞穿膜的影响，其中右上图为阴性对照组细胞穿膜情况，右下图为转染LOC101929219特异性siRNA4的细胞穿膜情况，左边柱状图为两组细胞穿膜数统计结果。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作详细描述，但本发明的实施不仅限于此。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1：
本发明收集肝癌细胞系Huh7和Hep3B，乳腺癌细胞系MUF-7，卵巢癌细胞系OVCAR-3和SKOV-3以及一定数量的卵巢癌及癌旁组织样本，抽提RNA并反转录为cDNA，采用Real-time PCR方法分析LOC101929219的表达水平，具体方法如下：
1.采集样本及RNA抽提：
(1)样品收集
a、组织样本在上海长海医院病理科采集。剪取适量病人的卵巢癌和癌旁组织，PBS洗3遍，放入含1ml Trizol的离心管中，用匀浆机将组织匀浆，放置冰上15min。
b、细胞样本为本实验中心保存。6孔板中培养的细胞用PBS洗3遍，加入1ml Trizol裂解，移入1.5ml离心管中，放置冰上15min。
(2)每管加入200μl氯仿(三氯甲烷)，剧烈振荡摇晃混匀，静置冰上15min。12000g 4℃离心20min，离心后样品分为三层，取上层无色水相，水相体积约为所用TRIzol体积的50-60％。
(3)加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀5-6次，-20℃放置过夜。12000g 4℃离心20min，离心后在管侧和管底出现白色胶状沉淀。
(4)小心去上清，用DEPC处理的75℅乙醇(1ml/管)重悬RNA沉淀。12000g4℃离心5min。重复该步骤1次。
(5)去上清，将留有沉淀的离心管开盖放置于超净台室温自然干燥，直至沉淀变成半透明状，干燥过程约5-10min。加入适量已温热过的DEPC水(约10-40μl)，冰上静置溶解10min，震荡混匀。
(6)取少量RNA(1.5-2.0μl)使用Eppendorf紫外分光光度仪测定OD值(OD260值)，RNA纯度为OD260/OD280＝1.8-2，以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。
2.反转录成cDNA
取RNA 500ng为模板，用随机反转录引物进行反转录。使用TaKaRa反转录试剂，按照下列成分加入体系。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。
3.LOC101929219的实时定量
采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂和美国AppliedBiosystems公司的：Step Plus One实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：
Premix Ex TaqTM(2×) 10μl
上游引物(10μM) 0.4μl(终浓度0.2μM)
下游引物(10μM) 0.4μl(终浓度0.2μM)
ROX Reference Dye(50×) 0.4μl
反转录产物 1μl
ddH2O 7.8μl
总体系 20μl
通过预实验确定LOC101929219引物的合适退火温度，最终确定以下条件：
本实验采用标准反转录产物倍比稀释法建立标准曲线，每20μl体系分别添加标准反转录产物2,1,0.5,0.25,0.125μl，每种浓度设立3个平行复管。
按照上述Real-time PCR条件，对前期制备的各样本的反转录产物进行检测。每批次PCR均设立标准曲线作为批次间参照，并依据标准曲线设立CT值阈值。每样本均做3个平行复管，取其平均值分析，每个PCR测定中都包括阴性(水)对照。为防止污染，所有反应均在专区的清洁实验台进行，模板添加和引物添加不在同区操作。为防止引物二聚体和非特异性扩增，所有反应均在冰上操作。
研究发现：LOC101929219在OVCAR-3和SKOV-3中高表达，并且OVCAR-3中LOC101929219的表达量高于SKOV-3中LOC101929219的表达量，而在MUF-7中低表达，在Huh7和Hep3B中几乎不表达，说明LOC101929219在卵巢癌细胞系中特异性高表达，且在恶性程度高的细胞系中呈高表达状态(图1)。
另外，卵巢癌组织中LOC101929219的表达也远远高于卵巢癌癌旁组织(图2)。
实施例2：
1.siRNA(small interfering RNA)的设计：通过BLAST检索，在LOC101929219的特异性序列区域设计五对siRNA，如表1所示：
表1：siRNA的序列
上述序列中，3’端加TT是为了加强siRNA的稳定性。
利用RT-PCR证实：将siRNA转染OVCAR-3细胞(购自上海中科院细胞库)。转染方法：取对数生长的细胞，接种于培养板，加培养液，培养48h(细胞长至70-90％满)，按lipofectamine2000(invitrogen)说明书进行转染实验，24h后收RNA用Real-time PCR检测LOC101929219的表达情况。
结果：与阴性对照组相比，siRNA1、siRNA2及siRNA3干扰组的LOC101929219表达没有明显变化，siRNA4与siRNA5干扰组的LOC101929219表达明显降低，说明siRNA1、siRNA2及siRNA3的干扰效果较弱，siRNA4与siRNA5的干扰作用较强，siRNA4干扰效果最好(图3)。
实施例3：LOC101929219对肿瘤细胞体外浸润能力的影响
将OVCAR-3细胞接种到6孔板中，24h后，用lipofectamine2000分别转染LOC101929219特异性siRNA和阴性对照siRNA，24h后分别将两组细胞用胰酶消化下来，1500rpm离心5min，去上清，PBS洗一遍，用无血清的培养液重悬细胞，计数，使用24-Well Cell Invasion Assay，在上室孔中准确接种OVCAR-3细胞，105细胞/孔，48h后固定、染色、计数发现：穿膜的LOC101929219特异性siRNA干扰组细胞数量显著少于对照组(图4)。
上述结果说明：LOC101929219可以显著地促进OVCAR-3细胞的体外浸润能力。
实施例4：LOC101929219对肿瘤细胞体内转移能力的影响
选择4-6周的雌性裸鼠，腹腔注射细胞，2×105细胞/只，接种2周后，注射LOC101929219特异性siRNA进行治疗，治疗7-8周后处死小鼠，提取子宫、输卵管组织基因组，建立定量PCR方法，检测组织中人与小鼠β2-微球蛋白分子拷贝数之比，以此计为肿瘤细胞的卵巢癌转移率。
统计结果显示：注射LOC101929219特异性siRNA的实验组小鼠转移率显著低于对照组。由此可知：LOC101929219可以显著地促进OVCAR-3细胞的体内转移能力(表2)。
表2 LOC101929219低表达对OVCAR-3卵巢癌细胞转移的影响
实施例5：
免疫学手段是一种很有潜力的诊治恶性肿瘤的方法，也是近年来抗肿瘤研究热点之一，其首要目标在于确认肿瘤抗原，以有针对性地实施治疗。本发明采集同期收治入院的疑似EOC患者术后组织样本，共43例。待手术确诊后，43例患者中36例确诊为EOC，另外7例则为卵巢良性肿瘤。检测并比较36例EOC患者和7例卵巢良性肿瘤患者术后组织中LOC101929219的含量。Real-time PCR结果发现，卵巢良性肿瘤组中LOC101929219的含量较低，但EOC组LOC101929219的表达高于卵巢良性肿瘤组约8.64倍(见图5)。
由此可见LOC101929219可以成为治疗卵巢癌尤其是卵巢细胞癌-较好的药物靶点，其严格的限制性分布为精确的卵巢癌免疫疗法提供了新的可能。
本发明阐述的是该基因在卵巢癌转移方面的重要功能及其与卵巢癌的相关性，足见LOC101929219具有有效的免疫原性和潜在的临床应用价值。首先，鉴于该基因在卵巢癌转移中的重要作用及其在卵巢癌细胞中特异性高表达，该基因可以作为人及其他哺乳动物的抗卵巢癌转移治疗的药物靶点，减少卵巢癌转移率，提高卵巢癌的治疗水平。其次，所构建的siRNA可以在以LOC101929219为靶点的卵巢癌治疗中发挥有效作用，并且LOC101929219特异性启动子也可用于卵巢癌的治疗。该基因还可以用来开发各种试剂或手段用于卵巢癌治疗。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (10)

1.一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的长链非编码RNA是LOC101929219。
2.根据权利要求1所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，该应用是指LOC1019292191在制备诊断卵巢癌的试剂或试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的试剂为检测生物样品中LOC1019292191表达量的试剂。
4.根据权利要求2所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的试剂盒包含检测生物样品中LOC1019292191表达量的试剂。
5.根据权利要求3或4所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的检测生物样品中LOC1019292191表达量的试剂，选自：对LOC1019292191具有检测特异性的探针、基因芯片，或PCR引物。
6.根据权利要求3或4所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的生物样品选自：获自对象的新鲜组织或细胞、福尔马林固定或石蜡包埋组织或细胞、血液或体液。
7.根据权利要求1所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，该治疗药物是指抑制LOC1019292191表达量的试剂。
8.根据权利要求7所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，所述的抑制LOC1019292191表达量的试剂，为siRNA、shRNA。
9.根据权利要求7所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，该治疗药物是siRNA，其序列如下：
正义链如SEQ ID NO:7所示；
反义链如SEQ ID NO:8所示。
10.根据权利要求7所述的一种长链非编码RNA在制备卵巢癌诊断或治疗药物中的应用，其特征在于，该治疗药物是siRNA，其序列如下：
正义链如SEQ ID NO:9所示；
反义链如SEQ ID NO:10所示。
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