CN110029166A

CN110029166A - 长链非编码rna linc00205在制备诊断卵巢癌试剂或治疗卵巢癌药物中的应用

Info

Publication number: CN110029166A
Application number: CN201910327405.9A
Authority: CN
Inventors: 吴一华; 夏大静; 李宏毅
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2019-04-23
Filing date: 2019-04-23
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2039-04-23
Also published as: CN110029166B

Abstract

MEHP处理显著增加了肿瘤细胞的迁移以及侵袭能力，同时结果显示MEHP能够诱导卵巢癌细胞发生上皮间质转化；500nM浓度MEHP处理后的SKOV3细胞经高通量测序的方法进行转录组测序并分析测序结果，筛选出39条已证实的长链非编码RNA；在差异表达的39条lncRNA中，通过实验验证发现linc00205在MEHP引起的卵巢癌细胞迁移、侵袭能力增加以及上皮间质转化发挥了一定的作用。

Description

长链非编码RNA LINC00205在制备诊断卵巢癌试剂或治疗卵巢癌药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及长链非编码RNA对于肿瘤抑制的应用领域。

背景技术

环境内分泌干扰物(Environmental endocrine disruptors,EEDs)，也称内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs)，是指对维持机体内环境稳态和调节发育过程的体内天然激素的生成、释放、转运、代谢、结合、效应造成严重影响的一类天然存在或污染的外源性物质。已被证实或疑为具有内分泌干扰作用的环境化学物质有上百种，包括邻苯二甲酸酯类、多氯联苯类、有机氯杀虫剂、烷基酚类和双酚化合物类等。通常以受干扰的内分泌器官和组织进行分类，如雌激素干扰物、雄激素干扰物、甲状腺素干扰物、糖皮质激素干扰物、生长激素干扰物等。目前认为EDCs与生殖障碍、出生缺陷、发育异常、代谢紊乱以及某些癌症(如乳腺癌、睾丸癌、卵巢癌等)的发生发展有关。人们在日常生活中可以通过空气污染、农药、化工原料、重金属和食物接触到各种各样的EDCs，因此EDCs对于人体健康的影响是现今的热点问题。

邻苯二甲酸酯类增塑剂的常见种类包括：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、邻苯二甲酸二环己酯(DCHP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二甲(DMP)等。DEHP是一种全球年产量达三到四百万吨最普遍使用的塑化剂^[10][11]，被广泛用于聚氯乙烯塑料制品，如医疗用品，塑料袋和玩具。DEHP的暴露途径有很多种，在所有的途径中，DEHP主要是通过消化道、呼吸道和皮肤接触被吸收入体内，其中消化道接触被认为是一般人群接触DEHP的主要方式，据报道，每日估计的DEHP摄入量为3至30毫克/千克体重/天。由于DEHP与塑料聚合物并不是通过共价连接，因此很容易浸入环境中。在2011年，国际癌症研究机构(IARC)重新评估了DEHP的分类，并将它从3类致癌物质升级到2B类致癌物质。之前的研究表明哺乳动物肠道中存在的水解酶可以将DEHP转化为其初级代谢物邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)，MEHP同时具有生殖毒性和发育毒性，毒性高于DEHP。流行病学研究提示DEHP和MEHP在甾类激素依赖型肿瘤中(乳腺、子宫、睾丸、前列腺)可能发挥着重要的作用。

卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一^[18](宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜癌)，发病率仅次于子宫颈癌和子宫内膜癌。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命造成严重威胁转移和侵袭的发生是卵巢癌致死最重要的原因。当卵巢癌病变仅仅局限在卵巢时，五年生存率到达了90％以上；而当病变转移到腹膜内时，五年生存率急剧下降到20％以下^[28]。在卵巢癌发生转移之前的早期诊断是提高治疗效果以及五年生存率的关键，因此了解卵巢癌发生转移的机制至关重要。

高通量测序(High-Throughput Sequencing)，又称下一代测序(Next-GenerationSequencing)，与第一代测序方法相比，其主要优点是能够以更低的成本产出更大量的数据；与传统的DNA微阵列相比，高通量测序能够在不需要特异性探针的情况下鉴定和定量稀有转录本。高通量测序技术可用于基因组测序和重测序、转录组分析(RNA-Seq)、DNA蛋白质互相作用(ChIP-Seq)以及表观基因组测序^[31]。转录组(transcriptome)广义上指某一生理条件下，细胞内所有转录产物的集合，包括信使RNA、核糖体RNA、转运RNA以及非编码RNA；狭义上是指所有mRNA的集合。针对转录组的研究对于阐释基因组的功能和揭示细胞和组织的分子组成成分以及理解发育和疾病至关重要。转录组学研究的主要目的是：将所有物种的转录本进行编目，包括mRNA、非编码RNA以及小RNA；从起始位点、剪切模式和其他转录后修饰等方面确定基因的转录结构；并且在发育期间和不同环境下定量转录本表达水平的改变。

邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)是DEHP的代谢产物，大鼠经口接触MEHP的LD50为1340mg/kg，其发挥的内分泌干扰作用对人类健康的影响同样是当前的研究热点。毋庸置疑，EDCs污染已成为全球共同面临的重大公共卫生问题，EDCs与人类生殖健康是21世纪生命科学和环境科学领域亟待研究和解决的重大科学问题。由于化妆品中含有这些化学物质，年轻的女性相比于同年龄段的男性可能更容易暴露于邻苯二甲酸酯类物质，所以人们应该更多地关注PAEs对于女性生殖系统的影响。

本发明基于现有技术中对于MEHP在低浓度下与卵巢癌的关系的研究不足，分别从MEHP对人卵巢癌细胞系细胞活力、迁移和侵袭能力以及相关蛋白表达水平的影响等多个方面，来探讨生理浓度范围内的MEHP是否能够促进人卵巢癌的发展，并进一步研究其促肿瘤的分子机制。

发明内容

本发明的一个方面是提供一种肿瘤不良预后的诊断靶标；在一个具体的实施例中，所述的肿瘤是妇科肿瘤，优选卵巢癌；在另外一个具体的实施例中，所述的不良预后是由环境内分泌干扰物引起的，具体的，所述的环境内分泌物为邻苯二甲酸酯类增塑剂，更具体的，所述的环境内分泌物为DEHP在体内的初级代谢物MEHP；在另外一个具体的实施例中，所述的靶标是非编码RNA，进一步的，所述的非编码RNA为长链非编码RNA；更进一步的，所述的长链非编码RNA在MEHP处理的卵巢癌细胞系中高表达；更进一步的，所述的长链非编码RNA选自linc01233、linc00205、MIR193BHG、GAS5以及NOP14-AS1，优选的，所述的长链非编码RNA为linc00205。在一个具体的实施例中，所述的linc00205的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，或者所述的linc00205的核苷酸序列为与SEQ ID NO:1所示的序列具有99％同源性且来源于人类的核酸序列。

本发明的另外一个方面是长链非编码RNA在制备诊断试剂中的应用。在一个具体实施例中，所述的诊断试剂是用于诊断卵巢癌；在另外一个具体的实施例中，所述的长链非编码RNA在MEHP处理的卵巢癌细胞系中高表达；更进一步的，所述的长链非编码RNA选自linc01233、linc00205、MIR193BHG、GAS5以及NOP14-AS1，优选的，所述的长链非编码RNA为linc00205。在一个具体的实施例中，所述的linc00205的核苷酸序列为SEQ ID NO:1所示，或者所述的linc00205的核苷酸序列为与SEQ ID NO:1所示的序列具有99％同源性且来源于人类的核酸序列。

本发明的另外一个方面是检测长链非编码RNA的试剂在制备诊断或预后肿瘤试剂中的应用。在一个具体的实施例中，所述的肿瘤为妇科肿瘤，优选卵巢癌；在另外一个具体的实施例中，所述的长链非编码RNA在MEHP处理的卵巢癌细胞系中高表达；更进一步的，所述的长链非编码RNA选自linc01233、linc00205、MIR193BHG、GAS5以及NOP14-AS1，优选的，所述的长链非编码RNA为linc00205；在另外一个具体的实施例中，所述的检测试剂为所属领域技术人员所熟知的检测试剂，可选自但不限于引物、探针、抗体。

本发明的另外一个方面是长链非编码RNA的抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用。在一个具体的实施例中，所属的肿瘤为妇科肿瘤，优选为卵巢癌；在另外一个具体的实施例中，所述的长链非编码RNA在MEHP处理的卵巢癌细胞系中高表达；更进一步的，所述的长链非编码RNA选自linc01233、linc00205、MIR193BHG、GAS5以及NOP14-AS1，优选的，所述的长链非编码RNA为linc00205；在另外一个具体的实施例中，所述的抑制剂为本领域技术人员所熟知的具有抑制长链非编码RNA的试剂，可选自但不限于小分子化合物、干扰RNA、抗体等。在一个具体的实施例中，所述的抑制剂是siRNA，进一步的，所述的siRNA的序列为SEQID NO:2所示。

附图说明

图1 MEHP对SKOV3、A2780细胞迁移与侵袭能力的影响。(A)-(B)不同浓度的MEHP处理SKOV3、A2780细胞24小时、48小时后划痕的愈合情况。细胞用0.1％DMSO(对照)、20nM、100nM以及500nM的MEHP处理。(C)-(D)不同浓度的MEHP处理SKOV3、A2780后细胞发生侵袭的情况以及统计图。

图2 MEHP对SKOV3、A2780细胞上皮间质转化的影响。(A)和(B)卵巢癌细胞系SKOV3、A2780预先使用空白对照、0.1％DMSO(溶剂对照)、20nM、100nM、500nM浓度MEHP处理24小时，蛋白免疫印迹法的结果显示MEHP能够下调上皮标记物ZO-1的表达量，同时上调间质标记物N-cad、Vimentin以及转录因子Slug的表达量，内参是GAPDH。(C)和(D)荧光显微镜下观察500nM浓度MEHP处理SKOV3、A2780细胞24小时后，与对照组(0.1％DMSO)相比细胞内间质标记物Vimentin的荧光变化情况。(E)和(F)卵巢癌细胞系SKOV3、A2780预先使用0.1％DMSO(对照)、500nM浓度MEHP处理24小时，使用实时荧光定量PCR方法分析ZO-1以及Slug的mRNA的表达水平。

图3 MEHP暴露后卵巢癌细胞SKOV3长链非编码RNA表达量的改变。(A)和(C)火山图，蓝色点：lncRNA的表达水平在对照组和实验组中没有显著性差别；绿色点：与对照组相比，实验组中表达水平发生下调的lncRNA；红色点：与对照组相比，实验组中表达水平发生上调的lncRNA。(B)和(D)基因热图，红色：与对照组相比，实验组中表达量发生下调的lncRNA；绿色：与对照组相比，实验组中表达水平发生上调的lncRNA。(E)和(F)卵巢癌细胞系SKOV3、A2780预先使用0.1％DMSO(对照)、500nM浓度的MEHP处理24小时，使用实时荧光定量PCR方法检测长链非编码RNA的表达水平，GAPDH的mRNA表达水平作为内参使用，实验数据使用均数±标准差形式呈现，使用两样本t检验进行统计分析。

图4 linc00205在卵巢癌细胞系迁移、侵袭以及上皮间质转化中的作用。(A)和(B)在完成细胞转染之后，使用实时荧光定量PCR方法检测小干扰RNA在卵巢癌细胞系SKOV3、A2780中的敲低效率。(C)和(D)在转染靶向linc00205效率较高的小干扰RNA后，使用0.1％DMSO、500nM浓度MEHP处理SKOV3、A2780细胞24小时、48小时后划痕的愈合情况。(E)和(F)在转染靶向linc00205效率较高的小干扰RNA后，使用0.1％DMSO、500nM浓度MEHP处理SKOV3、A2780后细胞发生侵袭的情况以及统计图。完成转染后，SKOV3、A2780细胞预先使用0.1％DMSO(对照)以及500nM的MEHP处理24小时后，之后在铺有基底胶的transwell小室中孵育18小时，最后进行固定、染色以及拍照，每个处理组选取三张图片计数并进行统计分析。(G)和(H)在转染靶向linc00205效率较高的小干扰RNA后，SKOV3、A2780细胞使用0.1％DMSO、500nM浓度的MEHP处理24小时。蛋白免疫印迹法检测间质标记物N-cad、Vimentin以及转录因子Slug的蛋白表达量，GAPDH的蛋白表达量作为内参。使用两样本t检验或单因素方差分析进行统计分析。

具体实施方式

材料方法

1、人卵巢癌细胞系SKOV3购买于中国科学院干细胞库(中国，上海)，用含10％胎牛血清的McCoy’s5A培养基培养；人卵巢癌细胞系A2780来自浙江大学范衡宇实验室，用含10％胎牛血清的DMEM培养基培养；所有细胞均培养在37℃、5％CO₂的培养箱中。

2、邻苯二甲酸单乙基己基酯(mono-2-Ethylhexyl phthalate,MEHP)购买于美国sigma公司，CAS号4376-20-9，分子式C₁₆H₂₂O₄，分子量278.34，DMSO溶解分装，-20℃避光保存。

3、细胞培养：细胞复苏、细胞传代、细胞冻存均为所属领域技术人员所熟知的操作技术，或参照细胞系来源的实验protocol。

4、细胞染毒实验：

细胞传代后，种板培养至对数生长期时，用完全培养基将MEHP储液分别稀释成0nM、20nM、100nM和500nM的工作浓度。按照6孔板2mL/孔；12孔板1mL/孔；96孔板100μL/孔的培养基用量，运用换液的方式对细胞进行染毒处理。

5、细胞增殖实验(CCK-8法测细胞活力)

1)接种细胞：取处于对数生长期的SKOV3、A2780细胞，同细胞传代的方法，将贴壁细胞处理为均匀的细胞悬液，使用细胞计数板计数并用完全培养基将细胞浓度调整至2×10⁴个/mL，按照每孔100μL细胞悬液的体积将SKOV3、A2780细胞接种于96孔板中。将96孔板置于37℃培养箱中过夜。2)染毒：细胞贴壁之后，用含有不同浓度(10^-8至10^-5M)DEHP、MEHP的完全培养基对细胞进行换液，分别处理24h、48h和72h。3)显色：结束染毒后，每孔加入CCK-8试剂10μL，在恒温培养箱中继续孵育1h。选择450nm激发波长，使用酶联免疫检测仪测量每个孔的吸光度，记录结果。通过计算处理样品与对照样本的吸光度之比表示细胞活力，每组设置三个平行重复。

6、划痕愈合实验：

1)接种细胞：取对数生长期的SKOV3、A2780细胞，同细胞传代的方法，将贴壁细胞处理成分散、均匀的单细胞悬液，计数调整细胞悬液浓度，按照每孔细胞数量4×10⁵个将SKOV3、A2780细胞接种于6孔板中。将6孔板放于培养箱中继续培养。2)待细胞达到100％贴合后，通过用灭菌的200μL移液管尖端尽可能均匀、笔直地刮擦表面使单层细胞受伤，得到划痕。PBS缓冲液漂洗三次，加入无血清培养基，并进行DEHP、MEHP染毒处理(0nM、20nM、100nM、500nM)。置于恒温培养箱中继续培养48h。3)按照0h、24h、48h的时间点取样拍照，观察划痕的愈合情况。

7、Transwell侵袭实验

1)Matrigel基底胶化冻过夜，枪头与eppendorf管4℃预冷。2)打冰，放置Matrigel基底胶、无血清培养基、枪头与eppendorf管。将transwell小室放入24孔板的小孔中，在小室边缘编号。涡旋混匀化冻好的Matrigel，以1:40的比例用无血清培养基稀释，吹打几下混匀后置于冰上。每孔100μL无血清的培养基，2.5μL基底胶，多配1孔。取100μl稀释后的Matrigel基底胶加入transwell小室中，避免加到侧壁上，不要产生气泡。置培养箱中1-2h。3)将待处理的细胞(融合程度70-80％)弃培养基，同细胞传代的方法，将贴壁细胞处理成单细胞悬液，离心后弃胰酶，用无血清培养基重悬。计数将细胞浓度调整为1.25×10⁵个/mL，(A2780细胞为5×10⁵个/mL)。4)待1)中transwell小室Matrigel基底胶包被好后吸去多余液体(无血清培养基)，立即取200μL细胞悬液(含2.5×10⁴个细胞)加入小室，防止基底膜干燥。加入毒物，下室加入600μL完全培养基，确保渗透支撑膜/聚碳酯膜未有气泡附着，培养箱中放置12-16h。5)取出放有transwell小室的24孔板，在24孔板中选择2个孔，加入1mLPBS缓冲液，将小室中的培养基倒掉，放入PBS缓冲液中，上室加入1mLPBS，重复清洗2次，不要戳到膜。6)在24孔中加入600μL的4％多聚甲醛，上室不加，静置5-20min。如5)中步骤用PBS缓冲液清洗两次。7)在24孔板中加入500μL结晶紫染料，染色5min。PBS缓冲液清洗上下室2-3次，用湿润的棉签擦掉膜的上层细胞2-3次，显微镜下观察总体情况。8)干燥后用显微镜进行拍照，拍摄三张照片以备后续统计。

8、蛋白印记实验、RNA提取以及逆转录实验按照冷泉港出版的《分子克隆实验手册》操作。

9、转录组测序分析

1)RNA的质控和定量：在1％琼脂糖凝胶上监测RNA降解和污染，测量RNA的纯度、浓度以及完整性，样品合格后进行后续实验。2)用于lncRNA测序的文库制备：每个样品吸取3μgRNA用作RNA样品准备的原材料。首先，去除RNA样品中的核糖体RNA，并通过乙醇沉淀清除无rRNA的残基。随后，使用消除rRNA的RNA建立测序文库。3)聚类和测序：使用TruSeq PECluster Kitv3-cBot-HS(Illumia)在cBot Cluster Generation System上进行样品的聚类。在簇生成后，将文库在Illumina Hiseq 4000平台上测序，并产生150bp的双末端读数。4)数据分析：在cDNA文库测序后，使用FastQC工具检查FASTQ格式的原始数据(原始读数)以进行质量控制。通过去除衔接子序列，重复序列，未知核苷酸(“N”)大于10％的读数和低质量读数，从每个文库的原始读数中生成高质量的待分析数据。所有后续的分析都基于这些高质量的待分析数据。在去除衔接子序列、低质量读数后，我们分析了实验组与对照组的差异表达基因(DEG)。将待分析数据映射到参考序列Emsembl91。我们计算FPKM(fragmentsper kilo-base per million reads)来评估基因转录表达水平，完成基因差异表达分析，将q值(FDR调整的p值)或p值<0.05的基因定义为差异表达基因作为进一步分析的候选基因。5)差异表达基因的功能分析：在http://www.heatmapper.ca/expression/上对差异表达基因(DEG)进行了热图分析。上调和下调基因的GO、KEGG富集分析由DAVID网站制作(https：//david.ncifcrf.gov/)。GO富集分析在生物过程，分子功能和细胞组成成分等方面分别进行。

10、统计分析：

全部实验重复三次或者三次以上。数据结果中符合正态分布的计量资料均以均数±标准差表示，并用t检验或者方差分析进行显著性差异分析。使用GraphPad Prism 5数据处理软件进行统计分析和作图，以P值<0.05作为显著性差异的标准。

实施例1、纳摩尔剂量MEHP对人卵巢癌细胞系迁移与侵袭能力的影响

我们先探究低剂量MEHP(0nM、20nM、100nM、500nM)在体外对卵巢癌细胞SKOV3、A2780迁移与侵袭能力的影响。我们发现使用20nM、100nM还是500nM浓度浓度梯度的MEHP(DEHP的初级代谢产物)处理SKOV3、A2780细胞24、48小时，划痕区域的愈合速度较对照组相比发生了显著的增加，使用500nM浓度处理时，愈合速度变化尤为明显。与划痕愈合实验的结果一致，与对照组相比，DEHP处理并不能使得SKOV3、A2780细胞的侵袭能力产生显著性改变；而MEHP处理能够显著增加SKOV3、A2780细胞的侵袭能力。上述实验结果提示，MEHP，DEHP的水解产物，却能够显著增加卵巢癌细胞的侵袭能力，并且促进卵巢癌细胞的转移，MEHP的处理浓度为500nM时实验现象最为明显。结果见图1。

实施例2 MEHP暴露诱导卵巢癌细胞发生上皮间质转化

之前的实验结果表明低剂量的MEHP能够显著增加卵巢癌细胞的侵袭能力、促进卵巢癌细胞的转移。肿瘤细胞发生侵袭和转移的第一步是EMT，我们使用MEHP(0nM、20nM、100nM以及500nM)刺激SKOV3、A2780细胞24小时后，发现两株卵巢癌细胞系均发生了EMT的过程。如图2所示，我们使用蛋白免疫印迹法观察EMT标记物的变化情况，MEHP暴露使得上皮标记物ZO-1的蛋白表达量发生下调；同时间质标记物Vimentin、N-cad以及相关转录因子Slug的蛋白表达量发生了上调，其中使用500nM浓度处理时，蛋白表达量的变化最为明显。除此之外，我们还运用免疫荧光的方法观察卵巢癌细胞系SKOV3、A2780细胞内间质标记物Vimentin蛋白的表达情况，在荧光显微镜下观察，结果显示使用500nM浓度MEHP处理细胞时，处理组与对照组相比，绿色荧光明显增多，表明Vimentin蛋白表达量增加；通过实时荧光定量PCR的方法检测EMT相关标记物mRNA水平的表达情况，以对照组为参照，MEHP处理24小时后，上皮细胞标记物ZO-1的mRNA表达水平发生显著性的减少，而EMT相关的转录因子Slug的mRNA表达水平产生了具有统计学意义的增加。以上实验结果通过蛋白免疫印迹法、免疫荧光法以及实时荧光定量PCR法从蛋白水平、mRNA水平方面证明了MEHP暴露(500nM，24h)能够诱导卵巢癌细胞系SKOV3、A2780发生EMT。

实施例3 MEHP暴露后长链非编码RNA表达量的改变

我们对MEHP暴露后lncRNA表达情况进行观察。p值小于0.05的lncRNA被定义为差异表达基因(DEGs)。与mRNA的分析方法相同，我们发现，与对照组lncRNA表达量相比，MEHP暴露组一共有754条lncRNA的表达量发生具有统计学意义的改变，如图3火山图和基因热图所示，754条lncRNA中695条lncRNA的表达量发生上调，59条lncRNA的表达水平产生下调。我们筛选到的表达量有差异的754条lncRNA中，包括了39条已证实的lncRNA以及715潜在的lncRNA。我们选取了已获证实的39条lncRNA做进一步的研究，探究这些差异表达的lncRNA与卵巢癌细胞系迁移、侵袭能力增加以及EMT的关系。如图3火山图与基因热图所示，39条差异表达的已证实的lncRNA中，与对照组相比较，MEHP处理后共有27条lncRNA表达量发生上调，表达量下降的lncRNA有12条。前期实验结果中，500nM浓度的MEHP暴露后，卵巢癌细胞系SKOV3、A2780的迁移、侵袭能力增加，并发生了EMT，表明MEHP处理能够促进卵巢癌发展，因此测序结果中，相比于对照组，实验组中表达量发生上调的lncRNA是潜在的促肿瘤lncRNA。由于促肿瘤lncRNA可以作为肿瘤治疗的靶点，具有潜在的治疗价值，我们课题组长期关注lncRNA在促进肿瘤发生发展方面的具体作用以及机制，因此我们接下来研究这些潜在的促肿瘤lncRNA是否影响卵巢癌细胞株SKOV3、A2780的迁移、侵袭以及EMT的发生。

首先，我们运用实时荧光定量PCR的方法在两株卵巢癌细胞系上验证lncRNA的测序结果。如图3所示，在SKOV3细胞中，经过500nM浓度的MEHP处理后，表达量发生上调的lncRNA有linc01233、linc00205、MIR193BHG、GAS5以及NOP14-AS1，其中linc01233与linc00205的表达量上调最为显著，上调倍数达到了1.5倍以上；而在A2780细胞中，这五条lncRNA表达量同样运用了实时荧光定量PCR的方法进行验证。实验结果显示，在低剂量MEHP暴露后，两株卵巢癌细胞系同时发生明显上调的lncRNA是linc00205，表明linc00205极有可能在卵巢癌进展过程中发挥着一定的作用，增加肿瘤细胞的迁移、侵袭能力，并诱导EMT的发生。因此，我们针对linc00205设计了一系列的实验，以验证我们的猜想。

实施例4 linc00205在卵巢癌细胞系迁移、侵袭以及上皮间质转化中的作用

首先，我们针对linc00205设计了三条小干扰RNA(siRNA)，利用实时荧光定量PCR的方法验证小干扰RNA在卵巢癌细胞系SKOV3、A2780中对于linc00205的敲低效率。所述的siRNA的序列下表所示：

实验结果如图4所示，转染48小时后，在两株卵巢癌细胞系中敲低效率最好的小干扰RNA是si-L1，因此我们选用si-L1这条小干扰RNA进行后续的实验。先前的实验结果已经证明，500nM浓度的MEHP处理后，卵巢癌细胞系SKOV3、A2780的迁移、侵袭能力发生了具有统计学意义的增加，并诱导EMT；与此同时，低剂量MEHP暴露后，卵巢癌细胞系SKOV3、A2780的linc00205的表达量也发生了上调。因此我们假设低剂量MEHP暴露是通过上调linc00205的表达量进而促进卵巢癌细胞的迁移、侵袭能力。为了验证这一猜想，我们在卵巢癌细胞系SKOV3、A2780中敲低linc00205的表达量后，观察肿瘤细胞的迁移、侵袭能力以及EMT标记物蛋白表达量的改变。如图4所示，在SKOV3和A2780细胞中，500nM浓度的MEHP处理后，linc00205敲低组与对照组相比，肿瘤细胞的迁移能力以及侵袭能力都发生了显著性的降低，同时linc00205敲低组中间质标记物N-cad、Vimentin以及EMT转录因子Slug的蛋白表达量与对照组比较则有显著性的减少。上述实验结果均能够初步证实，linc00205能够介导低剂量MEHP暴露诱导的卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的增加以及EMT的发生，敲低linc00205的表达量后，卵巢癌细胞迁移、侵袭能力的增加以及EMT的现象发生逆转。

我们的研究从宏观的角度阐释了低剂量环境内分泌干扰物MEHP在卵巢癌调控作用中的信号转导网络，全面解析了低剂量MEHP调控卵巢癌进展的基因表达谱以及长链非编码RNA的表达情况，并结合以上组学分析结果初步验证了linc00205在低剂量MEHP促进卵巢癌进展中发挥的作用，为后续的研究提供了一定的启示。

上述实施例仅是为表现本发明的研究思路的最佳实施方式，任何本领域技术人员根据现有技术公开可以显而易见获得的技术方案均落入本申请要去保护的发明之内。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 长链非编码RNALINC00205在制备诊断卵巢癌试剂或治疗卵巢癌药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 3

<211> 7181

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

gccctcctga ccgcagcggc tagaggttcc attgcagacc cggaggccgt ggctgtggtt 60

cgcggcggtg ctgtcgcggg cgccctggcg cagcccacgc aggggctcct gagggtccgc 120

gaggccggga ggtccggggg tcgggaggtc ccggggtcgg gaagtcggtg gaccctgcag 180

gccagtgggg aggggagaca taagacatca gtcagtacat gtgaggtgtg cattggattg 240

atccagaaag tcaggacgac tccaagtgga aaggcctcca gagacaggag acagtaaaag 300

aaatggcctc tctcctctgt cagagtggag tcccgagctc ccagaaatgc cacatgatgg 360

acaaacgctt gggggaaaaa aaaaaaaaag gagacctcag tcggacacaa aagcaggagc 420

tttaaaagaa aaaataagag ataagttgaa cttcaccaaa aaataagcgt ttctggtctt 480

tgaaagacac ttaaaatgaa aaggcaagcc atcgatgggg aaaatactca gaataatgga 540

tctgacagag ggctgtatct agaatatatg aagatatttt aaaatccagt aatttgacat 600

aaagatggta gccagcctga cacacaaagg aacccgaatg gccaatggac aggaagggaa 660

cccgtatggc cgatggacag aaagggaagt gaacgtgaac atctcattgg ggatgccgtt 720

atcaccactg gaatagtcaa aaacatggac accaagtatt ggtgggtgag tggaatggcg 780

ggaacccaca tacacggtcg atgggagctg caccctttgg aaatcatttc acagtttgtg 840

ctccatcctg gccaaaccca cagctggagt ctttccaaaa acagtgacgg gagtttccac 900

cagggagtgc ctcaaaccat cccgagatgg ggctggttgg gattccaggg agaggcactc 960

gttgccaggg tgatccgtcc agagcacttc ctaggggatc tggcataagg agggctgcag 1020

tgtatcctca ggacagatag gacagatagt gtatctttgg gacagacggc aagatgggga 1080

ttccacccag gtctgtctgc agcgagttga tatgagagtt taaggaattt ggaccagggc 1140

tgctttgttt cagggttttg ggcaatgacc taaacacctt tatcagtgcc tgggaatgct 1200

caaggcccag cttgagttca ggcctgcagg gaaaacctgc aactggccgg gctgcagagt 1260

ggtcagggca cggaaagcca gaagctgggg acacacctgc tgtatgatcc agccgttcgt 1320

ctttacctgg gagaaatggc accacctggc tgaacataac ttcttacact cccatgagtc 1380

ctcctggaca ggtgctgtga cctcgtgcag ccttggggac cctgacactc ccacggacag 1440

gccaaggggt ttgcctgggc cctgtgggca cagagcccct tgagatgggt ttccctatgc 1500

agccccccac cccccaccgg ggacccatgg cactgcagcc ctcacccccc ctctagggac 1560

ccacaacact gcagccctcg cccccctccg gggtcccaca gcactgcagc cctcgccccc 1620

catcggggac ccacagcact gcagccacgc ccaggccacc gcctccaaac acagggccgc 1680

tgctgtttct gtgaacagat acttcttgca gatgtcaatg gttaatggat ggggaggtga 1740

ccgcccaagc agaagccgac cctcttcatg aaggggccac aggtcacccc gaagcagaaa 1800

tccatagaac agccaaggcc acagcggaac cgagcaggcc acgcctctgc ctctgggccg 1860

ctcagggcca ggcctccctg accccactgg ctctattgtg aggactcagg gtggagctct 1920

gctgggctca gtggccttca cagccggggt ccacagaccc gggtcctacg ggcagtactg 1980

tgctcaccta gaggccacgg tccatgccct gtctccagca ggcccaagtc acttgtccat 2040

ggcgaaggcc cggccttgct tcaggccccg ggcgcgctcc ccctgctccc cctgcccacc 2100

gtttcttccc aggtgacaga ggcgggagag caggcgagcc acgtgccggg cgccgcagca 2160

gggggcactc caggctggcg cccctctgcc tctccgtggg ctctgacctt tcttctccct 2220

gcctgggcag cctccttcag gttggggagt cttttgttga cccctggatt aaagtcctaa 2280

tcaggaatga cccggaagag gtcttatgag gctttcctca agagaagaaa atctgtccct 2340

gagtatcagg aagtggcccc tttccctgca ccgcagtctt ctgtgaccag cggctcacac 2400

agcgaaggag gggctggcgg cccccacagg ccactgcccc gaggccgcca cgagagggca 2460

ggagagccct tcctgggagc tctgtgccac ggggaaacgc agccccgcca agcacagcat 2520

ggatgtttcc agcagggaat gaagagagag gccccagcac atgagagaag agcacactgg 2580

gcggcccctg tcggagcctc tcctgtcccc agcgacccct gagagcaggc cctgggcctc 2640

tgcggcccct cccggagcca ctcttcaact gctgacctgc tcccagctct tctgtgcccc 2700

gcccagctcc ctgcaaaacc tcacctgagg ggaaggaggc cctgtttggg ctcagacgca 2760

gcaggtgcag cttgtggtcc tggggccaca cctgttagag cccatccttc tacccctgct 2820

gggccctgag tgtcgtccgt ccccacagaa ctcagcaggg tcaggtctgg gcactccagg 2880

ccgccagccc cctgagtgag ccctgggccg gaggtagttg tgggtcacag gcaccccagc 2940

cagaacaccc acagtgggta gatgtgtggg gaccggatgt gggtcctctc ctgagagacg 3000

tgcagatggg gagaggctgg gcagttctca gcacagctgg agcatctacc tgtcaccacc 3060

tcggagcctc ctggccccgt gggggcggcc ctgggagcag ggtcggcagt gaagagcaga 3120

gaaaggcagt tggggatgtt gccactgtcc cccgagacca ccctgccatg gagacgaggg 3180

agctgtccct tcgcggaagg gggctggcca gcaagaagga cagagagtgg actggccgag 3240

gaccgctgag ctcaggaccc aaggaggact cttctaggag acgagagagc gaacgccagg 3300

gaccctgtgc aggcctgctc ctccgtttgc aaggtgagtt accaggttca cgtgtttgga 3360

gtttctggac tcattgcgga gttccacccc tgcacgttgc ggttccccag taatcaaatc 3420

ctggcttttg tgcctggaag tgcacaggga ggggacaact ttgtgagtca gtggcagggc 3480

agggagttct ggttctccag agccagaggc cgtgctcaga aggatttctt agcaggagcc 3540

ttggggcccc cagtcaacac ttccctacgg acagcctggc cagctctgtg cacggagcag 3600

gcgcccgagg gtcccaggtc accaagtgac caagtcgtga aggcgcccag ggtttcctgg 3660

gggtgcgctg atcccaagga agccacgtgt ggtcagcatg ggggagggga ccagcgcccc 3720

ggggggcctg cagcacagca gggcctgccc tcctgggtga gactggccgg tgcctgtggg 3780

gatctggggg gctacagtca gggctctgtg ctcccgaggg ccacgccagc ccacctgccc 3840

tggaacagaa cccgaggctt ctgcctaggg gagtacctgg gcacctgcct cctgtgctgc 3900

cctggacaca tcccagcggc tgcacatagg ggaggcacag cctgggctca gggccagggt 3960

ccactctgtg gggatactag acccgggggt gacaatgcca gctcagaact tccccccaca 4020

cctgggctcc tccagcctgg cctttcctgg ggaagggagg gcctgtcctt cctcagcact 4080

gtgggaggga ggcaaggcct gcggttgaag cgtccccaac acggggctcc aggagagaaa 4140

gcaccacatc tcagggaatg aaaacagaga cggggccgcc cagtgcactc ggtggctcgg 4200

aaatcattaa agaatgttct gagcccccga ttttggctgt aaaagggact ggccggcttg 4260

tgaccgctcc cctgtctgtg ccttgagacg ggagtgttca gcgttggggg cagctttccc 4320

tccaagagga gcttcacaaa catccgctct ctgcggggcc gcctctccgt ggcctggggc 4380

cgctgtcgga ggaaggctct ccagctgccg tcatctggga aacgtggggg gcgagcaggg 4440

gtcatggatg gggctcactg gggactgtga gaatctgtcc cgcaggactt tctgggatgg 4500

aaacgctggc agaggtgaag cctgcgtcat gtgcttcact gaacccggct gcttatttat 4560

gttcggaggg ctggtttcaa ggactcctcg tctccctctc cagtgatagc gtcagcggaa 4620

atgcagacgg ggacggggct gctgggtttc ctccctggaa tgaagcacag ccggaggttt 4680

tgctgattca ccagcaggcc ctgaccgctg agttcagggt aacaaatcca catggatcct 4740

gagcccgcat agctccctgg gcctcagcat aaacatcgta aacctccggg ccctggcagt 4800

gtctgtttca tcccctccag agcaagtgca agtgtgagat ttagagattc taagagggga 4860

agggccagag gtcttgaaaa cgaccttcat tcgttcattc attcgagaag tttgcgaggg 4920

cctccgtgtc ctgcgtttag tggggcctag gacgcagatg tgaagggcgc tgctctcagg 4980

agcagacaga ggtggggatg aatcagtaca cgcccacctc gggcccacag gggaggatgc 5040

gcggagctgt gggtgtgggg aggagacccc tctgcgtcat gctgacggtg tcggcagagt 5100

cgccagcttc tgcaggagcg gtacctgtgg gttcttctgt gacttgttta accgcatctt 5160

ttgcccagta gttagtcttt tcctgttggg acaccatgtt ggtagtttgg aaatggtttc 5220

ttccatccat tgcctgcctt ttagctttgt cgatggtgtt ctgttgtaaa ttttggtgca 5280

cgtttaatgt gaacaatggt tatgagacga gtgccatgag ttcctgtgtg cctgtcaccc 5340

agcccggcca caagaggtgc tgggggcagt gtccacaccc ccctttctta ggacgcctga 5400

gtctcagatg tgacttatag ggtatttctt atggcaagac ggttaaaaca aacttcagcg 5460

tctcgtctgt ccttctatgg ctgtggcttc tgatgttcta atggcgttct cgtcagccgg 5520

ggctgagaac aaaataacat agactgtggg gcttaaacag cagaaactta cttcccacgg 5580

ttctggaggt tgggagtctt ggatcaccgt gtagcatggt caggttcctg gtgagggtgg 5640

gattcctggc taacgtaacg aaggctccct ctcctgatac cgtgtcactg ggggtgaggc 5700

ttcaacacag gaattttggg gggacacatc agcattcact ccatcacagg tggttagccc 5760

tttaatccgc gggaattttg tttggggttg tgtgagatac gggtctaacg ttttcttttt 5820

caaatacgta gccagttgtc acatcattta ttgaaaaagg aatcttttct ccaccgactg 5880

acatgaaatg ctaccatcat cgtaaataaa attcccgtaa atacttgctg tctctgctgt 5940

ctcagtcctg actcacgggc tgagttctct ttctgcacag tagcactggc attaactgtg 6000

acagctttac agcaggctcc ctccccgagg ccgttcagaa gcattcctca gcgggtccta 6060

cacgtttcct ctcccatgtc aagtttagaa gcagtgtcaa gacccacagc agtcctgcgg 6120

gagttttaag ggatgcacgg agtttatggg gacagtttgg aaaattgaca ttcatgtgac 6180

ttagagtcct actacttgaa aatggattcc agctctcaac gaatttagag ctttggcaaa 6240

atttttaaga tttctttgat gtccgatgtg ctcatttctt ggtttgttct tgagtatttt 6300

gtggattttt atgaaatcca caaagttttt gttataatga atgggacact ttcccataaa 6360

atgttgtaat tctgtattgc tgttttagta aacactgttg attgatgtat attgatgtta 6420

cacttggtca cttgtaatag tttgtccgtt cattattttg aactttttag gtaaacagtc 6480

atataattat gcaaataatt atagttgtgt ctctgccttt ctaatattta tactttgtgt 6540

atattatcat gttggccagg actcaagcgt ctttctcttg tttctgacta atgcgaatga 6600

ttctaatgca ggggtttcca aactggtggc cggggggcca aatccagcca atggtctctt 6660

cttgtaaata aagttttatt ggaacacagt tacacacatt tttctacata ttgtctgatg 6720

gctactgtca cgccacagca atgctgttaa atagtccaga cagaggcggt attgcccgaa 6780

aaacctagaa tattcaccat ctgagctttt acgggaaaat ttgctaatat ctgttctcat 6840

gcattaaata caatgtttgt tacaggttaa ggaagtttct gactattttt agctttctga 6900

atatcttgtg gttgtgtgtg ctttaaaatt aggactaaat attaaattta ccagttgctt 6960

gttaggggcc tatcttttga gatgcccaaa gtttcccttt tttagtctct tcatgtagtg 7020

agttgtacta acagattctc taatgttgaa ccgtctttgc tttccggaga tagactttac 7080

ttgctcctgg tggattggat tctgtttgtt aatactttta tttttgggta attacatccc 7140

tattataaat aatatgtcag catcaaaaaa aaaaaaaaaa a 7181

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccguuauca ccacuggaat t 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaguacugu gcucaccuat t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccuguuagag cccauccuut t 21

Claims

1.长链非编码RNA在制备肿瘤诊断产品中的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA是内分泌干扰物(EDC)诱导高表达的长链非编码RNA，所述的肿瘤为妇科肿瘤，优选为卵巢癌。

2.权利要求1所述的用途，其中所述的EDC是邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)。

3.权利要求1-2任一项所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA为linc00205。

4.权利要求1-3任一项所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA的序列为SEQID NO:1所示序列中的片段，所述的片段能够特异性表征SEQ ID NO:1表达；或与SEQ IDNO:1具有99％同源性且来源于人类的RNA序列；或者所述的长链非编码RNA为SEQ ID NO:1所示的序列。

5.检测权利要求1-4中任一项中所述的长链非编码RNA的表达的试剂在制备肿瘤诊断产品中的用途，所述的肿瘤为妇科肿瘤，优选为卵巢癌。

6.长链非编码RNA的抑制剂在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述的长链非编码RNA是内分泌干扰物(EDC)诱导高表达的长链非编码RNA，优选的，所述的EDC是邻苯二甲酸单乙基己基酯(MEHP)。

7.权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤是妇科肿瘤，优选为卵巢癌。

8.权利要求6-7任一项所述的用途，其特征在于，所述的长链非编码RNA为linc00205。

9.权利要求6-8任一项所述的用途，其特征在于所述的抑制剂为干扰RNA。

10.权利要求6-9任一项所述的用途，其特征在于所述的抑制剂为干扰RNA，所述的干扰RNA的序列如SEQ ID NO:2所示。