CN103074439A - 辅助上皮性卵巢癌早期诊断的host2试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及医学生物检测技术领域。本发明提供的一种辅助上皮性卵巢癌（EOC）早期诊断的HOST2检测试剂盒，是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的HOST2特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物如SEQ ID NO:3所示。本发明的试剂盒利用实时定量PCR方法，通过检测血浆或血清中HOST2含量以早期辅助诊断EOC，具有创伤性小、操作性强等特点。本发明还进一步地提供了上述辅助早期诊断EOC的HOST2检测试剂盒的检测方法。
Description
技术领域
本发明涉及医学生物检测技术领域，具体涉及一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的HOST2试剂盒，及其在辅助上皮性卵巢癌的早期诊断中的应用和检测方法。
背景技术
上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer，EOC）是最常见的卵巢癌，约占80-90%，是目前死亡率最高的妇科恶性肿瘤，高达70%。由于卵巢位于盆底深部，这给卵巢癌的早期诊断造成诸多困难，在临床诊断时，70%的卵巢癌已是晚期（Luesley,D.,Lawton F.,Blackledge G.,Hilton C.,Kelly K.,Rollason T.,Wade-Evans T.,Jordan J.,Fielding J.,Latief T..Failure of second-look laparotomyto influence survival in epithelial ovarian cancer.Lancet.1988,2(8611):599-603.）。因此，EOC的诊断是妇科肿瘤学家面临的最严峻挑战之一。虽然CA125是目前被认为对上皮性卵巢癌较为敏感的肿瘤标记（Nagele,F.,Petru,E.,Medl,M.,Kainz,C.,Graf,A.H.,Sevelda,P..Preoperative CA125:an independent prognosticfactor in patients with stage I epithelial ovarian cancer.Obstet Gynecol.1995,86(2):259-264.），但迄今为止，并没有特异性强能够辅助诊断EOC的生物学指标。因此，目前诊断EOC方面的突破主要针对多肿瘤标记联合检测，以提高EOC的检出率及其敏感性和特异性（Husseinzadeh N..Status of tumor markers inepithelial ovarian cancer has there been any progress?A review.Gynecol Oncol.2011,120(1):152-157.）。
长链非编码RNA（Long noncoding RNA，LncRNA）是一类长度大于200个碱基的功能性RNA分子，占人类基因组4-9%。LncRNA缺乏编码蛋白的能力，但能够在多种层面上调控其他基因的表达，参与细胞内诸多生物过程。由于自身分子长度，LncRNA具有一定的调控特色：既可以通过核酸序列一级结构与其他基因结合，又可以通过复杂的高级空间结构与蛋白因子相互作用；另外它们整体保守性较差，有利于维持自身功能的长期存在。目前许多研究表明，LncRNA广泛参与机体多种生理病理过程，其特异性表达和/或表达变化与恶性肿瘤的发生发展密切相关（Lee,J.T..Epigenetic regulation by long noncodingRNAs.Science.2012.338(6113):1435-1439.）。
LncRNA特异性表达可作为肿瘤的生物标志物，对于LncRNA能否作为临床检测指标，已有诸多集中于癌症诊断、预后方面的研究报道，如前列腺癌中高表达的LncRNA DD3，可辅助PSA用于早期诊断（Kusuda,Y.,Miyake,H.,Kurahashi,T.,and Fujisawa,M.Assessment of optimal target genes for detectingmicrometastases in pelvic lymph nodes in patients with prostate cancer undergoingradical prostatectomy by real-time reverse transcriptase-polymerase chain reaction.Urol Oncol.2011.18.[Epub ahead of print]）；肝细胞性肝癌中的LncRNA MVIH，可作为治疗的潜在靶点，并且其表达下调可以在一定程度上预测复发率（Yuan,S.X.,Yang,F.,Yang,Y.,Tao,Q.F.,Zhang,J.,Huang,G.,Wang,R.Y.,Yang,S.,Huo,X.S.,Zhang,L.,Wang F.,Sun S.H.,Zhou W.P..Longnoncoding RNA associated with microvascular invasion in hepatocellularcarcinoma promotes angiogenesis and serves as a predictor for hepatocellularcarcinoma patients'poor recurrence-free survival after hepatectomy.Hepatology.2012.56(6):2231-2241.）。目前已知的是，短链非编码RNA，如microRNA，在血浆、血清等体液中的表达非常稳定。这一结论为LncRNA应用于体液检测领域奠定基础。
2003年，Rangel等人利用RACE技术，即进行cDNA末端快速克隆的方法，在EOC组织中发现一个特异性转录本HOST2，长度约3000个碱基，没有开放式可读框，不能编码蛋白质，属于LncRNA（Rangel L.B.,Sherman-BaustC.A.,Wernyj R.P.,Schwartz D.R.,Cho K.R.,Morin P.J..Characterization ofnovel human ovarian cancer-specific transcripts(HOSTs)identified by serialanalysis of gene expression.Oncogene.2003,22(46):7225-7232.）。文献并未就该特异性转录本HOST2展开深入研究，至今也没有其他相关报道。
目前，尚无其他检测HOST2的方法问世，尚无HOST2作为EOC生物学标记物的文献。
发明内容
本发明的目的在于提供一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的HOST2试剂盒，本发明的另一目的是提供该HOST2试剂盒在辅助上皮性卵巢癌的早期诊断中的应用，以及相应的检测方法。
本发明人首先采集了50例EOC患者的新鲜血液作为实验组，对照组选择35例良性卵巢上皮性肿瘤患者的新鲜血液，将所有样品分为两部分，一部分抗凝处理后取血浆，另一部分促凝处理后取血清。分别检测两组血浆及血清中HOST2的表达情况，结果发现血浆和血清的数据差异无统计学意义，对照组血浆或血清中HOST2的含量极其微弱，个别样品甚至无法检测出，但是实验组HOST2的含量远远高于对照组13倍左右。这个结果说明HOST2的含量变化可作为早期辅助诊断EOC的重要方法之一。
本发明人认为以聚合酶链式反应（qRT-PCR）为基础技术，通过检测患者血浆或血清中HOST2的表达来实现早期辅助诊断EOC是完全可行的。
本发明提供的一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的HOST2检测试剂盒，是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成。其中反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由SYBR Premix Ex TaqTM试剂组成；引物系统由总RNA反转录随机引物（Oligo dT(18)primer）和HOST2特异性的qRT-PCR的上、下游引物组成：
上游引物5`-GGACAGGTCCCTTGTTTCAA-3`（如SEQ ID NO:2所示）
下游引物5`-CTGGTCTTTCCTTGCCTCTG-3`（如SEQ ID NO:3所示）。
本发明的试剂盒，具体组成如下：
A）总RNA反转录引物，1管，浓度：10μM，100μl/管；
B）qRT PCR上游引物，1管，浓度：10μM，100μl/管；
qRT PCR下游引物，1管，浓度：10μM，100μl/管；
C）Trizol reagent（总RNA提取试剂），1管，2000μl/管；
D）氯仿，1管，500μl/管；
E）无水乙醇，1管，7ml/管；
F）DEPC H2O（经焦炭酸乙二酯处理的纯水），1管，1000μl/管；
G）dd H2O（双蒸水），1管，2000μl/管。
本发明还提供了上述的HOST2检测试剂盒在辅助上皮性卵巢癌的早期诊断中的应用。
本发明的试剂盒适用于：根据患者年龄、病史及局部体征初步怀疑EOC的患者。
用本发明的试剂盒分别检测若干已知的EOC患者及若干正常患者血浆或血清中HOST2含量，以作为标准数据。再用相同的方法检测未知患者血清中HOST2含量，对照上述标准数据，即可初步判断该患者是否患有EOC，以便作进一步检查确诊。
本发明的试剂盒是首次利用实时定量PCR方法，通过检测血浆或血清中HOST2含量以早期辅助诊断EOC，具有创伤性小、操作性强等特点。
本发明还进一步地，提供了上述辅助早期诊断EOC的HOST2检测试剂盒的检测方法，具体步骤如下：按常规处理方法抽血，离心后取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血浆中的总RNA；由反转录系统反转录成cDNA；用扩增系统进行Real-timePCR扩增，测定HOST2含量。
本发明通过检测血浆或血清中的HOST2分子含量的变化，早期辅助诊断EOC，以便尽早进行临床干预，采取手术治疗和/或化疗等其他治疗，防止病情进展，影响预后生存率和复发率。
附图说明
图1：EOC患者和正常人术前血清中HOST2的含量检测。
图2：EOC患者和正常人术前血浆中HOST2的含量检测。
图3：术后病理确诊EOC患者的手术前后血清中HOST2的含量检测。
图4：疑似EOC患者中手术确诊者和手术排除EOC者术前血浆中HOST2的含量检测。
具体实施方式
现结合实施例和附图，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
实施例1：制备本发明的试剂盒
HOST2的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
其特异性的Real-time PCR的上下游引物通过Primer5软件设计如下，由美国Invitrogen公司负责引物合成，纯度为PAGE级，合成后的引物用DEPCH2O溶解，终浓度为10μM。
上游引物5`-GGACAGGTCCCTTGTTTCAA-3`（如SEQ ID NO:2所示）
下游引物5`-CTGGTCTTTCCTTGCCTCTG-3`（如SEQ ID NO:3所示）
制备包括下列组成成分的试剂盒：总RNA提取试剂、氯仿、无水乙醇、总RNA反转录引物（100μl/管浓度:10μM）、特异性的HOST2上游引物（100μl/管浓度:10μM）、下游引物（100μl/管浓度:10μM）、DEPC H2O（1000μl/管）、dd H2O（2000μl/管）
DEPC H2O的配置：用购买的DEPC（焦碳酸二乙酯），纯度>99%，密度为1.12g/ml，配置DEPC H2O。100mlMiliQ纯水中加0.1mlDEPC，放在100ml干烤过的容量瓶中静置4小时后高压灭菌，制成千分之一浓度的DEPC H2O，经检测不含RNase、DNase和proteinase。用来溶解合成的反转录引物，并作为反转录时的稀释用水。
ddH2O的配置：MiliQ纯水经高压灭菌后，配置成Real-time PCR用的ddH2O。
实施例2：本发明的试剂盒的检测
一、采集血清或血浆样本及处理：
由于血清或血浆具有取材方便、连续检测的优点，因此从血清或血浆中检测术前疑似EOC的患者的生物标记物可以将EOC的早期诊断提高到一个新的水平。
血清或血浆样本在上海长海医院住院部采集，所有患者均无血液、肾脏、肿瘤等可能影响血清或血浆水平的疾病。样品收集：收集约3~6ml病人的外周血放入含360μl EDTA的抗凝管中，颠倒混匀，静置约半小时，离心取上清得到血浆；收集约3~6ml病人的外周血放入真空促凝管中，颠倒数次以便充分结合，静置约半小时，离心取上清得到血清。
离心注意事项：4℃离心两次,首先1600g离心10min，取上清，加入新的离心管中，第二层12000g离心10min，取上清，加入新离心管中。
二、提取血清或血浆样本中的总RNA：
1、在制备好的血清或血浆样本中加入Trizol reagent(Invitrogen公司购买)，Trizol reagent:血浆＝1:0.6~1.0。
2、摇晃混匀，放置冰上15min，1000g2-8℃离心10min，取上清，分别放入经DEPC处理过的2ml EP管中。
3、每使用1ml TRIzol加入200μl氯仿（三氯甲烷），剧烈振荡摇晃混匀，静置冰上10-15min。12000g2-8℃10-15min离心，离心后样品分为三层，取上层无色水相，水相体积约为所用TRIzol体积的50-60%。
4、每使用1ml TRIzol加入0.5ml异丙醇，轻轻摇匀5-6次，-20℃放置1h或室温放置10-15min。2-8°C12000rpm10-15min离心，离心后在管侧和管底出现白色胶状沉淀。
5、小心去上清，用DEPC处理的75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1ml TRIzol至少加1ml75℅乙醇，振荡混匀。2-8°C，12000rpm，5min离心。在RNA沉淀较多的情况下可以重复该步骤1次。
6、去上清，将留有沉淀的离心管开盖放置于超净台室温自然干燥，直至沉淀变成半透明状，干燥过程约5-10min。加入适量已温热过的DEPC水（约10-40μl），用枪头吹打几次混匀，65℃有助于RNA溶解。
7、取少量RNA（1.5-2.0μl）使用Eppendorf紫外分光光度仪测定OD值（OD260值），RNA纯度为OD260/OD280=1.8-2，以评估其浓度和质量。符合定量检测要求的样本进行下一步反应。
三、反转录成cDNA
取富集液500ng为模板，用随机反转录引物进行反转录。使用TaKaRa反转录试剂，按照下列成分加入体系。以上步骤所用的tip头、EP管均经过DEPC水处理后高压灭菌。
四、HOST2的实时定量
采用TaKaRa公司的SYBR Premix Ex TaqTM试剂和美国Applied Biosystems公司的：Step Plus One实时定量PCR仪，按照下述体系进行PCR反应：
| Premix Ex TaqTM（2×） | 10μl |
| 上游引物（10μM） | 0.4μl(终浓度0.2μM) |
| 下游引物（10μM） | 0.4μl(终浓度0.2μM) |
| ROX Reference Dye（50×） | 0.4μl |
| 反转录产物 | 1μl |
| ddH2O | 7.8μl |
| 总体系 | 20μl |
通过预实验确定HOST2引物的合适退火温度，最终确定以下条件：
本实验采用标准反转录产物倍比稀释法建立标准曲线，每20μl体系分别添加标准反转录产物2,1,0.5,0.25,0.125μl，每种浓度设立3个平行复管。
按照上述Real-time PCR条件，对前期制备的各样本的反转录产物进行检测。每批次PCR均设立标准曲线作为批次间参照，并依据标准曲线设立CT值阈值。每样本均做3个平行复管，取其平均值分析，每个PCR测定中都包括阴性（水）对照。为防止污染，所有反应均在专区的清洁实验台进行，模板添加和引物添加不在同区操作。为防止引物二聚体和非特异性扩增，所有反应均在冰上操作。
获得的各样本HOST2表达量均由标准曲线转换为相对定量值，目标基因表达量/持家基因GAPDH表达量进行标准归一化处理。最终获得比值进行比较和统计分析。通过法计算HOST2在EOC患者血清或血浆中的相对表达量。经过统计，我们得出正常人血清或血浆中HOST2的表达在0.674~41.84U/ml，若患者Real-time PCR检测结果得出的CT值经
运算后大于41.84U/ml，则可辅助诊断为EOC。
实施例3：正常人和EOC患者外周血血浆当中HOST2的表达
首先，分别检测EOC患者术前血清及血浆中HOST2的含量，均以正常人做对照，共20例，Real-time PCR结果发现血浆和血清的数据差异无统计学意义，对照组血浆或血清中HOST2的含量极其微弱，个别样品甚至无法检测出，但是实验组HOST2的含量远远高于对照组13倍左右（见图1和图2）。
然后，选择根据年龄、病史及局部体征初步怀疑EOC的患者，共43例，留取这些患者术前和术后的血清样品。其中，22例患者术中术后病理确诊为EOC，检测并比较该22例患者术前、术后血清中HOST2的含量，结果发现术前术后并无显著统计学差异（见图3）。
实施例4：疑似EOC患者中手术确诊者和手术排除EOC者术前血浆中HOST2的表达
首先，采集同期收治入院的疑似EOC患者术前的血液样本，共34例。待手术确诊后，34例患者中27例确诊为EOC，另外7例则为卵巢良性肿瘤。检测并比较27例EOC患者和7例卵巢良性肿瘤患者术前血浆中HOST2的含量。Real-time PCR结果发现，卵巢良性肿瘤组血浆中HOST2的含量极低，但EOC组HOST2的表达高于卵巢良性肿瘤组约11.4倍（见图4）。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
Claims (3)
1.一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的HOST2检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒是由反转录系统、引物系统和扩增系统组成，其中的反转录系统由反转录酶、反转录体系缓冲液和RNA酶抑制剂组成；扩增系统由SYBR Premix ExTaqTM试剂组成；引物系统由总RNA反转录随机引物和HOST2特异性的qRT-PCR的上、下游引物组成；
HOST2特异性的qRT-PCR的上游引物如SEQ ID NO:2所示，
HOST2特异性的qRT-PCR的下游引物如SEQ ID NO:3所示。
2.根据权利要求1所述的一种辅助上皮性卵巢癌早期诊断的HOST2检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的具体组成如下：
A）总RNA反转录引物，1管，浓度：10μM，100μl/管；
B）qRT PCR上游引物，1管，浓度：10μM，100μl/管；
qRT PCR下游引物，1管，浓度：10μM，100μl/管；
C）Trizol reagent，1管，2000μl/管；
D）氯仿，1管，500μl/管；
E）无水乙醇，1管，7ml/管；
F）DEPC H2O，1管，1000μl/管；
G）dd H2O，1管，2000μl/管。
3.一种如权利要求1或2所述的辅助上皮性卵巢癌早期诊断的HOST2检测试剂盒的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：按常规处理方法抽血，离心后取血清或血浆，用总RNA提取试剂处理血清或血浆，加氯仿离心后取上层水相，并富集血清或血浆中的总RNA；由反转录系统反转录成cDNA；用扩增系统进行Real-time PCR扩增，测定HOST2含量。
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