CN118345170A - 一种结直肠癌相关的lncRNA生物标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药技术领域，涉及一种结直肠癌相关的lncRNA生物标志物及其应用，该lncRNA分子标记为lncRNA MSTRG.325353.1，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。研究结果表明lncRNAMSTRG.325353.1在结直肠癌(CRC)患者中高表达，说明lncRNA MSTRG.325353.1对CRC具有诊断价值，且lncRNA MSTRG.325353.1高表达与CRC的肿瘤分期和分化程度密切相关，说明lncRNAMSTRG.325353.1是CRC患者预后不良的潜在生物标记物。本发明还提供了lncRNA MSTRG.325353.1抑制剂的应用，抑制剂下调所述lncRNA水平，抑制CRC细胞增殖、克隆形成、细胞迁移，同时引起CRC细胞凋亡和G0/G1期细胞周期阻滞，可应用于临床治疗，具有临床转化价值。

Description

一种结直肠癌相关的lncRNA生物标志物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种结直肠癌相关的lncRNA生物标志物及其应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第三大最常见的癌症，也是全球癌症相关死亡的第二大原因。2早期发现CRC有助于将发病率和死亡率降至最低，然而由于缺乏明显的早期症状，大多数CRC通常在晚期被诊断出来，错过了早期治疗的最佳机会。因此，确定新的治疗靶点和生物标志物有助于早期发现CRC，并进行个性化治疗和监测以改善预后。

长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)是长度大于200个核苷酸的单链非编码RNA，不具有编码蛋白质的功能，但lncRNA可以RNA的形式在转录及转录后修饰、表观遗传学等方面参与细胞生长、分化、凋亡等生物学过程。目前已有研究表明lncRNA能通过多种机制参与CRC的发病过程，因此，lncRNA在临床实践中具有重要意义，可以作为诊断CRC的生物标志物。然而，目前临床尚无相关治疗手段，迫切需要筛选具有诊断潜力和预后价值的lncRNA应用于CRC的临床诊断和预后。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷和不足，提供一种结直肠癌相关的lncRNA生物标志物及其应用。

本发明的技术方案如下：

在第一个方面中，本发明提供了一种结直肠癌lncRNA生物标志物，所述lncRNA分子标记为lncRNAMSTRG.325353.1，其cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

优选地，所述LncRNAMSTRG.325353.1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

GATCGTGCCACTGCACCCCAACTGGGGGACAAGAGTGAAACTCCGTGTCTTAAAAAAAGACACAAATAGTGGACTTGGGGCTCACCCTAATCCATGATGTTCTCATCCCTAACTCCTTAACTAGATTACTTCTGCAAAGAGTCTTATACCAAACGCGGTCCCATTCTCAGGTTCTAGGGGGTTAAGCCATACTCATATCTTTTTGAGGAGACACCGTTGAATGGACTGAATTGTACTGCTAAATTCGTTTGTGGAGCCGTAACATCCAATGTGATGATATTTGAAGATGAGGACTTTGGGAGGTACATAGAGTTACTCGAAGTCGTATGTGAATGAATTATATTTTGTTACTTCACTCTTCTCTCGATGGACAGATTGTAGATTTTTGAGTAGGGCACTCACATGCGTTTCACTAAGGTTTTTAAAAGATCCCTTTACAGCGGTGTCAAGAGTAAATTATGAGCCACCGCGCCTGGCCAATTCCCTTGTTTTTAAGAGCTTGACGATTTTGAAGAGTCGTGGTACAGGTGTGCTGAGAAATGTCCATCACGTTTTTCCAGG(SEQ ID NO.1)。

在第二个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的结直肠癌lncRNA生物标志物在制备用于结直肠癌筛查和辅助诊断的产品中的应用。

作为可选的方式，在上述应用中，所述产品是试剂盒，其包含用于检测上述第一个方面所述的lncRNA的引物，或者包含与上述第一个方面所述的lncRNA分子标记特异性结合的抗体。

作为可选的方式，在上述应用中，所述产品是试剂盒，其包含用于检测患者结肠组织中lncRNAMSTRG.325353.1表达水平的试剂。

作为可选的方式，在上述应用中，通过高通量测序或qRT-PCR检测lncRNAMSTRG.325353.1的表达水平以进行结直肠癌筛查和辅助诊断。

作为可选的方式，在上述应用中，所述用于结肠癌筛查和辅助诊断的产品通过检测患者结肠组织中的lncRNAMSTRG.325353.1的表达水平筛查和辅助诊断结直肠癌，当检测结果显示lncRNAMSTRG.325353.1表达水平较正常结肠组织显著上调时，则患者罹患结直肠癌。

在第三个方面中，本发明提供了上述第一个方面所述的结直肠癌lncRNA生物标志物在制备筛查和/或治疗结直肠癌的药物中的应用。

作为可选的方式，在上述应用中，所述药物包含lncRNAMSTRG.325353.1的表达抑制剂。

作为可选的方式，在上述应用中，所述药物以lncRNAMSTRG.325353.1的表达抑制剂为活性成分，并辅以药学上可接受的辅料或载体。

作为可选的方式，在上述应用中，所述lncRNAMSTRG.325353.1的表达抑制剂是siRNA，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示。

SEQ ID NO.2：CCGTTGAATGGACTGAATT；

SEQ ID NO.3：GAGTTACTCGAAGTCGTAT；

SEQ ID NO.4：GAGTGAAACTCCGTGTCTT。

优选地，作为lncRNAMSTRG.325353.1的表达抑制剂的siRNA的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

本发明的有益效果体现在以下几个方面：

本发明发现了一种新的可以用于筛查、诊断及治疗的非编码RNA，即lncRNAMSTRG.325353.1。所述RNA在结直肠癌患者结肠组织中表达显著上调，可用于临床诊断。本发明还提供了lncRNAMSTRG.325353.1抑制剂的应用，该抑制剂可下调所述lncRNA的水平，抑制结肠癌细胞的迁移、侵袭，可应用于临床治疗，具有临床转化价值。

附图说明

图1为lncRNAMSTRG.325353.1在结直肠癌患者组织和结肠癌细胞中的表达差异。其中，图1A为利用基因芯片检测MSTRG.325353.1在正常组织和临床患者结肠癌组织中的表达差异热图；图1B为通过RT-qPCR实验检测人正常结肠上皮HCoEpiC细胞和人结肠癌HCT-116细胞中MSTRG.325353.1的表达差异，与HCoEpiC组比较，^***P<0.001，n＝3；图1C为17组临床结肠癌患者结肠癌组织和癌旁组织中MSTRG.325353.1的表达水平差异，n＝3。

图2为不同的干扰片段对MSTRG.325353.1的抑制作用。其中，图2A为通过RT-qPCR实验检测不同的干扰片段对HCT-116细胞中MSTRG.325353.1的抑制作用；图2B为不同的干扰片段对HT-29细胞中MSTRG.325353.1的抑制作用。与C-siRNA(购买的商品化序列，具体序列公司未公开，以下各图中使用的C-siRNA序列均是相同的)组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，n＝3。

图3为沉默MSTRG.325353.1对人结肠癌细胞增殖的作用。其中，图3A和图3B为通过MTT实验检测沉默MSTRG.325353.1后分别对人结肠癌HCT-116细胞和HT-29细胞增殖的影响，与C-siRNA组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，n＝3；图3C和图3D为通过克隆形成实验检测沉默MSTRG.325353.1分别对人结肠癌HCT-116细胞和HT-29细胞增殖的影响。

图4为沉默MSTRG.325353.1对人结肠癌细胞凋亡的影响。其中，图4A为通过流式细胞术检测沉默人结肠癌HCT-116细胞和HT-29细胞MSTRG.325353.1后的细胞凋亡率；图4B为图4A的量化图，与C-siRNA组比较，^***P<0.001，n＝3。

图5为沉默MSTRG.325353.1对人结肠癌细胞周期的影响。其中，图5A为通过流式细胞术检测沉默人结肠癌HCT-116细胞和HT-29细胞MSTRG.325353.1后的细胞周期；图5B为图5A的量化图，与C-siRNA组比较，^**P<0.01，^***P<0.001，n＝3。

图6为沉默MSTRG.325353.1对人结肠癌细胞迁移的影响。其中，图6A和图6B分别为沉默MSTRG.325353.1后人结肠癌HCT-116细胞和HT-29细胞迁移图片；图6C和图6D分别为图6A和图6B的量化图。与C-siRNA组比较，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001，n＝3。

图7为临床不同分期和分化程度结肠癌样本中的MSTRG.325353.1表达水平。其中，图7A为结肠癌病理分期Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期样本的MSTRG.325353.1表达水平；图7B为结肠癌分化程度高、中、低的样本的MSTRG.325353.1表达水平。与图中标示的组相比，^*P<0.05，^**P<0.01，^***P<0.001。

具体实施方式

下面参照具体的实施例对本发明做进一步说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明的范围。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例

1.临床样本收集

收集在高州市中医院采集的30组结直肠癌患者手术切除的肿瘤及癌旁组织标本，本研究符合人体实验伦理学标准，并经高州市中医院伦理委员会审查批准，所有受试者均自愿签署书面知情同意书。

2.仪器与材料

2.1实验仪器

多功能酶标仪、超微量分光光度计：Thermo；反转录PCR仪、实时荧光定量PCR仪：Bio-Rad；流式细胞仪：BD Biosciences；倒置生物显微镜：OLYMPUS。

2.2实验材料和试剂

人结肠癌细胞株HCT-116和HT-29：中国科学院昆明细胞库；反转录试剂盒(RR047A)、荧光定量PCR试剂盒(RR820A)、RNAiso Plus：Takara；人GAPDH内参引物：上海生工生物工程有限公司；siRNA套装、lncRNA引物：广州锐博生物技术有限公司；细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒、MTT、结晶紫染色液：碧云天生物技术公司；Lipofectamine 2000转染试剂(11668027)：Thermo。

3.实验方法

3.1基因芯片分析lncRNA表达差异

CRC患者结肠组织的lncRNA基因芯片测试由北京百迈客生物科技有限公司完成。

LncRNAMSTRG.325353.1的cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

GATCGTGCCACTGCACCCCAACTGGGGGACAAGAGTGAAACTCCGTGTCTTAAAAAAAGACACAAATAGTGGACTTGGGGCTCACCCTAATCCATGATGTTCTCATCCCTAACTCCTTAACTAGATTACTTCTGCAAAGAGTCTTATACCAAACGCGGTCCCATTCTCAGGTTCTAGGGGGTTAAGCCATACTCATATCTTTTTGAGGAGACACCGTTGAATGGACTGAATTGTACTGCTAAATTCGTTTGTGGAGCCGTAACATCCAATGTGATGATATTTGAAGATGAGGACTTTGGGAGGTACATAGAGTTACTCGAAGTCGTATGTGAATGAATTATATTTTGTTACTTCACTCTTCTCTCGATGGACAGATTGTAGATTTTTGAGTAGGGCACTCACATGCGTTTCACTAAGGTTTTTAAAAGATCCCTTTACAGCGGTGTCAAGAGTAAATTATGAGCCACCGCGCCTGGCCAATTCCCTTGTTTTTAAGAGCTTGACGATTTTGAAGAGTCGTGGTACAGGTGTGCTGAGAAATGTCCATCACGTTTTTCCAGG

3.2人结肠癌细胞的转染

取对数生长期的HCT-116或HT-29细胞，将细胞均匀地接种至96孔板或60mm培养皿中，于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养过夜。待细胞长至50％左右，根据细胞培养容器的不同，按照说明书的要求，将opti-MEM培养基分别与lipofectamine、siRNA按照一定比例混匀并在室温下孵育5min，将lipofectamine混合液与siRNA混合液混匀，在室温下孵育20min。将混匀后溶液加入细胞培养基中，于5％CO₂，37℃恒温培养箱中培养4h后更换成完全培养基，培养24～48h后，进行后续细胞实验操作。

3.3反转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

使用实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerasechain reaction,RT-qPCR)来检测目的基因的表达情况，具体实验步骤如下：

3.3.1总RNA的提取

对于细胞中RNA的提取：弃去细胞培养基，用PBS清洗一次，60mm细胞培养皿中加入1mL的Trizol裂解液，轻轻晃动使裂解液均匀的分布在细胞表面，之后将裂解液转移至1.5mL的无酶离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液无明显沉淀，室温静置5min后进行RNA的分离。

对于组织中RNA的提取：称取一定量的组织置于液氮预冷的研钵中，加入适量液氮后用研杵进行研磨，研磨过程中需不断地加入新鲜液氮以维持低温环境，直至组织研磨成粉末状，每50mg组织加入1mL的Trizol裂解液进行匀浆，匀浆液转移至无酶离心管中，室温静置5min后在4℃下12000rpm离心5min，小心吸取上清液转移至新的无酶离心管中。

对于处理后的细胞和组织裂解液样品，向其中加入200μL的氯仿，盖紧管盖并涡旋混合溶液至呈现乳白色，室温静置5min。4℃下12000rpm离心15min，小心吸取上清置于新的1.5mL无酶离心管中。加入1mL异丙醇，上下颠倒离心管将两者充分混匀，室温下静置10min，4℃下12000rpm离心10min，离心管底部会出现RNA沉淀，弃去上清。加入1mL的75％乙醇，上下颠倒离心管洗涤管壁，4℃下7500rpm离心5min，弃去上清，室温干燥后加入适量的RNase-free水溶解沉淀(RNA)，保存在-80℃冰箱中待用。

3.3.2RNA反转录成cDNA

使用TaKaRa的PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect RecaTime)试剂盒进行RNA的反转录，首先按照表1进行去除基因组DNA反应液的配制，室温静置30min后在冰上配制反转录反应液，轻轻混匀后离心3～5s，反应混合物37℃温浴15min，85℃加热5s，4℃保存，获得的cDNA反应也作为模板进行后续荧光定量测试。

表1DNA反转录试剂和使用量

3.3.3荧光定量RCR

使用TaKaRa的SYBR Premix EX Taq^TMII试剂盒进行荧光定量PCR，按照表2所示配制PCR的反应液。PCR扩增程序设置为95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火/延伸30s，其中变性和退火/延伸步骤设置循环40圈。所得结果使用2^-ΔΔCt来表示目的基因表达的相对倍数，GAPDH作为目的基因的内源性对照(ΔΔCt＝ΔCt_实验组-ΔCt_对照组，ΔCt＝Ct_目的基因-Ct_GAPDH)。在实验过程中使用的PCR引物序列如表3所示。

表2PCR反应试剂和使用量

表3PCR引物序列

3.4MTT法检测细胞存活率

取对数生长期的转染siRNA后的HCT-116或HT-29细胞，以2.5×10³个/孔的细胞密度均匀地接种于96孔板中，每组至少设置三个平行孔，于5％CO₂、37℃恒温培养箱中培养一定时间(24,48h)，每孔加入50μL浓度为2mg/mL的MTT(PBS溶解，0.22μm滤膜过滤)，于恒温培养箱中避光培养4h后弃上清液，每孔加入100μL DMSO，于摇床上震荡5min以完全溶解甲瓒结晶，使用酶标仪在490nm处测定吸光度数值并计算细胞存活率，GraphPadPrism 8.2.1软件统计数据结果。细胞存活率(％)计算公式如下：

[(A_490(样品)-A_490(空白))/(A_490(对照)-A_490(空白))]×100％

3.5流式细胞术检测细胞周期和凋亡

3.5.1细胞周期检测

将消化后的细胞液在1500rpm下离心5min后弃上清，加入预冷PBS重悬细胞并离心，离心后细胞沉淀加入预冷的70％乙醇轻轻重悬并放置在4℃冰箱中固定过夜，次日1500rpm离心5min去除上清并加入预冷的PBS重悬细胞，再次离心沉淀后去除上清，每个样品加入0.5mL配好的碘化丙啶染色液重悬细胞，于37℃水浴中避光温浴30min，随后在24h之内完成流式检测，采用FlowJo软件对周期结果进行分析。其中，对于细胞周期增殖指数(％)的计算公式如下：

[(S+G2/M)/(G0/G1+S+G2/M)]×100％

3.5.2细胞凋亡检测

将Annexin V和PI联合使用用于细胞凋亡测试，实验过程中将测试细胞用不含EDTA的胰酶消化，加入培养基终止消化后收集细胞液，4℃下1500rpm离心5min后弃上清，加入预冷PBS重悬细胞两次并离心收集细胞沉淀，每个样品加入500μL的1×结合缓冲液重悬细胞，并加入5μL的FITC-Annexin V和5μL的PI工作液，室温避光孵育15min后用细胞筛网过滤，并尽快完成流式检测，采用FlowJo软件对凋亡结果进行分析。

3.6细胞划痕实验

将细胞接种于60mm培养皿中，于37℃、5％CO₂下培养至细胞完全长满，使用1mL枪头沿着尺子均匀地在培养皿中划一条直线，在培养皿底部细胞划痕附近沿着直线每隔0.5cm处做好标记，每两个记号之间的区域即为一个视野。划痕后用PBS冲洗细胞表面3次，进行细胞转染处理并于37℃、5％CO₂恒温培养箱中培养0h、24h后在倒置显微镜下观察并拍照，Image J软件处理划痕图片。

3.7克隆形成实验

取对数生长期的细胞进行细胞转染并在转染24h后进行细胞消化处理，处理过程中需将细胞吹打呈单个细胞，以约1000个细胞/孔的密度接种于6孔板或者60mm的培养皿中，置于37℃，5％CO₂培养箱中培养14天。取出后弃去培养基，用PBS清洗2-3次、加入4％多聚甲醛固定细胞，PBS清洗后加入结晶紫染色10～30min，自来水缓慢洗去染色液，进行拍照。

4.实验结果

4.1lncRNAMSTRG.325353.1在结直肠癌中异常表达

根据临床结直肠癌患者的基因芯片结果，得到了一组在结直肠癌中差异表达的lncRNA，如图1A所示，其中lncRNAMSTRG.325353.1在临床结直肠癌患者组织中显著上调。利用RT-qPCR实验检测了人正常结肠上皮HCoEpiC细胞和人结肠癌HCT-116细胞中lncRNAMSTRG.325353.1的表达水平，结果如图1B所示，MSTRG.325353.1在结直肠癌细胞中的表达高于正常结肠上皮细胞，同时如图1C所示，在临床结直肠癌组织中MSTRG.325353.1高表达。

4.2不同干扰片段对lncRNAMSTRG.325353.1的干扰效果

为了确定MSTRG.325353.1在结肠癌中的作用，采用MSTRG.325353.1的siRNA来沉默结肠癌细胞中的MSTRG.325353.1水平，通过荧光定量PCR实验检测各组(si-MSTRG.325353.1-001(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，si-MSTRG.325353.1-002(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，si-MSTRG.325353.1-003(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示))MSTRG.325353.1的表达水平，结果如图2所示，MSTRG.325353.1的三个siRNA均可以降低HCT-116和HT-29细胞中MSTRG.325353.1水平，si-MSTRG.325353.1-003沉默效果最好。4.3MSTRG.325353.1对结肠癌细胞生物学功能的影响

采用MTT和克隆形成实验检测沉默MSTRG.325353.1后对结肠癌细胞增殖的影响，结果如图3A和图3B所示，沉默MSTRG.325353.1可以降低结肠癌细胞的存活率，同时如图3C和图3D所示，沉默MSTRG.325353.1可以降低结肠癌细胞的克隆形成能力，这些结果表明沉默MSTRG.325353.1可以抑制结肠癌细胞的增殖。采用流式细胞仪检测MSTRG.325353.1对HCT-116和HT-29细胞凋亡和周期的影响，细胞凋亡结果如图4所示，MSTRG.325353.1siRNA作用于HCT-116和HT-29细胞24h后，细胞凋亡率增加，表明沉默MSTRG.325353.1可以引起结肠癌细胞凋亡。细胞周期结果如图5所示，实验中测定的三种MSTRG.325353.1siRNA作用于HCT-116和HT-29细胞24h后，细胞G0/G1期比例增加，表明沉默MSTRG.325353.1会引起结肠癌细胞G0/G1期细胞周期阻滞。通过细胞划痕实验检测MSTRG.325353.1对HCT-116和HT-29细胞迁移的影响。细胞迁移结果如图6所示，实验中测定的三种MSTRG.325353.1siRNA作用于HCT-116和HT-29细胞24h后，细胞迁移数明显减少，表明沉默MSTRG.325353.1会抑制结肠癌细胞的迁移。

4.4MSTRG.325353.1与结肠癌临床分期和分化程度的关系

MSTRG.325353.1与CRC的临床分期和分化程度有关，如图7所示，采用RT-qPCR实验检测临床不同分期和分化程度CRC样本中MSTRG.325353.1的表达，晚期及低分化结肠癌患者中MSTRG.325353.1水平升高。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (10)

1.一种结直肠癌lncRNA生物标志物，其特征在于：所述标志物为lncRNAMSTRG.325353.1，其cDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1所述的结直肠癌lncRNA生物标志物在制备用于结直肠癌筛查和辅助诊断的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品是试剂盒，其包含用于检测根据权利要求1所述的lncRNA的引物，或者包含与权利要求1所述的lncRNA分子标记特异性结合的抗体。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品是试剂盒，其包含用于检测患者结肠组织中lncRNAMSTRG.325353.1表达水平的试剂。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：通过高通量测序或qRT-PCR检测lncRNAMSTRG.325353.1的表达水平以进行结直肠癌筛查和辅助诊断。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述用于结肠癌筛查和辅助诊断的产品通过检测患者结肠组织中的lncRNAMSTRG.325353.1的表达水平筛查和辅助诊断结直肠癌，当检测结果显示lncRNAMSTRG.325353.1表达水平较正常结肠组织显著上调时，则患者罹患结直肠癌。

7.权利要求1所述的结直肠癌lncRNA生物标志物在制备筛查和/或治疗结直肠癌的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物包含lncRNA MSTRG.325353.1的表达抑制剂。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述药物以lncRNA MSTRG.325353.1的表达抑制剂为活性成分，并辅以药学上可接受的辅料或载体。

10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述lncRNAMSTRG.325353.1的表达抑制剂是siRNA，所述siRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2-4所示。