CN106692974B - 雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用 - Google Patents
雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106692974B CN106692974B CN201611071285.3A CN201611071285A CN106692974B CN 106692974 B CN106692974 B CN 106692974B CN 201611071285 A CN201611071285 A CN 201611071285A CN 106692974 B CN106692974 B CN 106692974B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cells
- angiogenesis
- agent
- skeletal muscle
- inhibitor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
Abstract
本发明涉及雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。在小鼠缺血疾病模型中，雌激素受体抑制剂能够有效地促进血流恢复。
Description
技术领域
本发明涉及雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。
背景技术
缺血性疾病是由于血管损伤、血管堵塞等原因造成组织细胞供血量不足的外周血管疾病的一种。由于血液是为组织和细胞提供氧气、营养等对生命至关重要的物质的介质，供血量不足使得组织和细胞缺氧、缺营养，导致组织和细胞的坏死。对于机体而言，组织和细胞的坏死带来巨大的痛苦，坏死面积大的患者需要切除坏死部位，大大降低了患者的生活质量；坏死严重甚至能导致机体的死亡。
对于缺血性疾病，目前被认为有望起到良好效果的治疗方法之一是通过促进血管新生，改善供血状况，从而阻止细胞和组织继续坏死并起到改善它们的功能的作用。
以下肢缺血性疾病为例，作为下肢缺血性疾病的药物，目前有第一代治疗药物和第二代治疗药物。其中，第一代治疗药物利用的是单个血管新生因子(血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)等)，但临床试验结果不理想，新生血管不成熟，出现漏的情况，缺乏功能性(参见非专利文献1)。治疗结果不理想的原因被认为是由于血管重构是个多因子参与的复杂的过程。第二代治疗药物则利用了多种血管新生因子的组合(成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)和血小板衍生因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)；VEGF和血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG1)，虽然有一定的效果，然而血管新生因子种类繁多，它们在血管重构的不同的阶段起到不同的作用。因此，存在着血管新生因子种类的选择、组合时的比率、何时给药等难题。另外，目前对下肢缺血性疾病的治疗手段还面临外来血管新生因子的局部化，因此不足以在广泛的缺血区域内诱导足够的新生成熟血管的难题。
血管新生能力的个体差异较大，但可以肯定的是对于较严重的缺血疾病患者，机体本身的修复能力是不足以补偿血管的损伤。另外，组织细胞所处的环境对血管新生能力的影响也非常关键。比如，糖尿病患者的组织修复能力，包括血管新生能力差，更加无法有效诱导血管新生。高糖条件使得血管内皮细胞、平滑肌细胞等严重受损；另外，由于高糖条件这个特殊环境，各种血管新生因子(VEGF等)以及它们的受体(VEGFR等)、血小板衍生因子-BB(Platelet-derived growth factor-BB PDGF-BB)等血管新生因子的表达异常降低，而这些因子在血管重构中起到重要作用。更为重要的是，在高血糖这种独特的病理环境条件下，很多正常生理状态下能够促进血管新生的方法，在高糖条件下失去效果。即，机体在高糖条件下的响应水平下降。例如，糖尿病人的组织/细胞缺失了细胞对低氧环境的应激能力。这些原因导致现有的血管新生治疗方法无法起到有效效果。促进血管重构等血管新生治疗被认为是有效的治疗方法，但目前有效的促进血管新生，达到血流回复仍是个难题。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Therapeutic angiogenesis for critical limbischaemia.Nature Reviews Cardiology 2013 10(7):387-96
非专利文献2：Diabetes Mellitus and Ischemic Diseases:MolecularMechanisms of Vascular Repair Dysfunction.Arteriosclerosis Thrombosis andVascular Biology 2014 34(6):1126-1135.
发明内容
发明所要解决的问题
现状是，目前迫切需要一种能在广泛的缺血区域内起作用，并同时调控多种血管新生因子和参与成熟血管重构的多种体内通路的药物。
发明人发现雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病方面展现了积极的效果，而且这种效果在高糖的生理条件下也有效。
解决问题的手段
本申请的发明人等关注骨骼肌细胞，因为骨骼肌是体内最大的内分泌器官，可以分泌各种血管新生因子。经过广泛深入的研究，结果发现，骨骼肌细胞内的雌激素受体(以下有时将其简称为“ERα”)的抑制剂对于治疗缺血性疾病有良好的效果。
本发明涉及雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。
在本发明的一个实施方式中，所述治疗缺血性疾病的药物为促进血管新生的药物。
在本发明的一个实施方式中，所述促进血管新生药物为促进骨骼肌细胞分泌血管新生因子的药物。
在本发明的一个实施方式中，所述促进血管新生药物为促进骨骼肌细胞迁移的药物。
在本发明的一个实施方式中，所述促进血管新生药物为促进骨骼肌细胞增殖的药物。
在本发明的一个实施方式中，所述促进血管新生药物为促进血管组成细胞迁移的药物。
在本发明的一个实施方式中，所述血管组成细胞包括血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。
在本发明的一个实施方式中，所述治疗缺血性疾病的药物为在高糖条件下促进血管新生的药物。
在本发明的一个实施方式中，所述雌激素受体抑制剂包括选自他莫昔芬(Tamoxifene)、氟维司琼(Fulvestrant)、盐酸雷洛昔芬(Raloxifene hydrochloride)、拉索昔芬(Lasofoxifene)、酒石酸拉索昔芬(Lasofoxifene tartrate)、阿非昔芬(Afimoxifene)、吲哚昔芬(Idoxifene)、米普昔芬(Miproxifene)、阿佐昔芬(Arzoxifene)、阿佐昔芬盐酸盐(Arzoxifene hydrochloride)、克罗米酚(Clomiphene)、AZD9496((E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸)、阿克比芬(Acolbifene)、巴多昔芬(Bazedoxifene)、萘福昔定(Nafoxidine)、萘福昔盐酸定(Nafoxidine hydrochloride)、枸橼酸硝灭芬(Nitromifenecytrate)、奥培米芬(Ospemifene)、帕诺米芬(Panomifene)、比本哚昔芬(Pipendoxifene)、希比芬(Sivifene)、替米丽芬(Tesmilifene)、托瑞米芬(Toremifene)、三对甲氧苯氯乙烯(Chlorotrianisene)及其衍生物中的一种或多种(以下有时将它们称为“ERα小分子抑制剂”)、以及雌激素受体基因沉默剂(以下有时称为“ERα基因沉默剂”)。以下有时将ERα小分子抑制剂和ERα基因沉默剂统称为“ERα抑制剂”)。
本发明还涉及一种治疗缺血性疾病的组合物，其特征在于，含有雌激素受体抑制剂。本发明还涉及一种治疗缺血性疾病的药物，其特征在于，含有雌激素受体抑制剂。
发明效果
根据本发明，对于促进血管新生有良好的效果的效果，进一步地对于治疗缺血性疾病有良好。根据本发明，能够促进骨骼肌细胞表达血管新生因子、促进骨骼肌细胞迁移和增殖、能够促进血管组成细胞(例如，血管内皮细胞和平滑肌细胞等)迁移。根据本发明，能够促进如下肢、脑、心脏等的缺血组织的血流恢复。另外，本发明即使在高糖条件下同样能够取得上述优异的效果。
附图说明
图1为表示葡萄糖浓度对ERα表达量的影响的图。
图2为表示葡萄糖浓度对血管新生因子表达量的影响的图。
图3为表示ERα基因沉默剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响的图。
图4为表示氟维司琼对骨骼肌细胞血管新生因子的影响的图。
图5为表示他莫西芬对骨骼肌细胞血管新生因子的影响的图。
图6为表示盐酸雷洛西芬对骨骼肌细胞血管新生因子的影响的图。
图7为表示酒石酸拉索昔芬对骨骼肌细胞血管新生因子的影响的图。
图8为表示ERα抑制剂对骨骼肌细胞迁移的影响的图。
图9为表示ERα抑制剂对骨骼肌细胞增殖的影响的图。
图10为表示ERα抑制剂处理过的骨骼肌细胞条件培养基对血管内皮细胞迁移的影响的图。
图11为表示ERα抑制剂处理过的骨骼肌细胞条件培养基对血管平滑肌细胞迁移的影响的图。
图12为表示ERα基因沉默剂对促进缺血部位血流恢复的作用的图。该图为动物模型图，其中，图12(A)为原始结果的灰度图，图12(B)为对灰度图进行了图像处理后的图。
图13为表示ERα小分子抑制剂对促进缺血部位血流恢复的作用的图。该图为动物模型图，其中，图13(A)为原始结果的灰度图，图13(B)为对灰度图进行了图像处理后的图。
图14为表示ERα小分子抑制剂对促进缺血部位血流恢复的作用的图。该图为动物模型图，其中，图14(A)为原始结果的灰度图，图14(B)为对灰度图进行了图像处理后的图。
图15为表示ERα抑制剂对促进缺血部位血管新生的作用的图。
图16为表示ERα抑制剂对促进缺血部位血管新生的作用的图。
具体实施方式
本发明的缺血性疾病可以包括心肌缺血、脑缺血，另外，还包括下肢缺血性疾病，例如血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、间歇性跛行(Intermittent claudication)、糖尿病足(Diabetic Foot)等糖尿病相关血管病变以及恶性下肢缺血性疾病(CriticalLimb Ischemia)。下文中虽以糖尿病足为例进行了实验，但根据本发明的原理可知，本发明并不限于以糖尿病足为代表的下肢缺血性疾病，还可以包括各种人等哺乳动物的缺血性疾病。即，本发明可以用于制备治疗缺血性疾病的药物。
本发明涉及一种雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用。其机理还未明确，但根据发明者的新发现推测：在高糖条件下骨骼肌细胞ERα表达上升，血管新生能力下降，因此认为骨骼肌细胞ERα的过表达是导致糖尿病人血管修复能力差的原因。通过在骨骼肌细胞中抑制ERα的表达，能够实现：促进骨骼肌细胞分泌血管新生因子、促进骨骼肌细胞迁移、促进骨骼肌细胞增殖，进而促进血管内皮细胞和血管平滑肌细胞等血管组成细胞迁移，最终促进缺血下肢血管新生和血流恢复。需要说明的是，虽然上述推测针对高糖条件，但如上说明的，机体在高糖条件下的响应水平下降，可知在非高糖条件下，本发明仍可取得上述优异的效果。
本发明的治疗缺血性疾病的药物包含雌激素受体抑制剂，其没有特别限定，包括选自他莫昔芬、氟维司琼、盐酸雷洛昔芬、拉索昔芬、酒石酸拉索昔芬、阿非昔芬、吲哚昔芬、米普昔芬、阿佐昔芬、阿佐昔芬盐酸盐、克罗米酚、AZD9496即(E)-3-(3,5-二氟-4-((1R,3R)-2-(2-氟-2-甲基丙基)-3-甲基-2,3,4,9-四氢-1H-吡啶并[3,4-b]吲哚-1-基)苯基)丙烯酸、阿克比芬、巴多昔芬、萘福昔定、萘福昔盐酸定、枸橼酸硝灭芬、奥培米芬、帕诺米芬、比本哚昔芬、希比芬、替米丽芬、托瑞米芬、三对甲氧苯氯乙烯及其衍生物中的一种或多种的选择性雌激素受体调节剂(selective estrogen receptor modulators，SERMs)。
上述物质的结构式如下所示。
表1-1
表1-2
表1-3
表1-4
表1-5
表1-6
所述雌激素受体抑制剂还包括靶向雌激素受体的基因沉默剂。基因沉默剂的种类没有限定，可包括通过阻止转录或翻译抑制雌激素受体的表达的各种核酸、质粒、蛋白质等，例如引起RNA干扰(RNA interference)的siRNA(small interfering RNA)和表达siRNA或短发夹型RNA(short hairpin RNA,shRNA)的质粒、引起基因编辑的基因编辑器(如Crispr/Cas9、TALEN、ZFN等)、与信使RNA形成双链从而阻碍翻译的反义RNA(antisense)、可降解RNA的酶性核糖核酸(ribozyme)等。
本发明中的糖尿病模型包括1型糖尿病模型、2型糖尿病模型以及糖尿病前期。1型糖尿病和2型糖尿病的空腹血糖≥7.4mmol/L，糖尿病前期(pre-diabetes)的空腹血糖大于6.1mmol/L而小于7.4mmol/L。本说明书中记载的“高糖”是指由糖尿病以及糖尿病相关病变引起的高糖。
另外，本领域技术人员应可以理解，本发明实施例中的糖尿病足小鼠模型是采用完全切断大腿大动脉构建的，且所用的糖尿病小鼠模型的空腹血糖≥16.7mmol/L，远远高于糖尿病标准的空腹血糖(即≥7.4mmol/L)，是严重的糖尿病小鼠。因此可知，本发明实施例中的糖尿病足小鼠患有严重的糖尿病足。基于糖尿病的程度(即血糖的高低)与组织修复、伤口愈合等能力成反比，本领域技术人员应可以理解，后述的本发明的效果除了对严重糖尿病足具有良好的治疗效果之外，对血管重构和下肢功能恢复能力更强的非糖尿病患者的下肢缺血疾病，以及前期病变、轻度或中度的糖尿病足能起到更好的治疗效果。并且，本领域技术人员可以理解，本发明对于脑缺血、心肌缺血也可以具有积极的治疗作用。
本发明中的治疗缺血性疾病的药物和/或促进血管新生的药物也可以包含一种或多种辅料。辅料没有限定，例如溶剂、等张剂、赋形剂、pH调整剂、抗氧化剂、崩解剂、调味剂、香料、保存剂等本领域常用的辅料。
作为溶剂可以列举：注射用蒸馏水、生理盐水、植物油，丙二醇、聚乙二醇、乙醇、甘油之类的醇类等。
作为等张剂可以列举：山梨醇、氯化钠、葡萄糖等本领域常用的等张剂。
作为赋形剂可以列举：乳糖、甘露醇、葡萄糖、微晶纤维素、淀粉等。
作为pH调整剂可以列举：盐酸、枸橼酸、氢氧化钠、强氧化钾、碳酸氢钠、磷酸氢二钠等。
作为抗氧化剂可以列举：亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸等。
作为崩解剂可以列举：马铃薯淀粉。
作为调味剂可以列举：蔗糖、单糖浆等甜味剂，等。
作为香料可以列举：薄荷油，橙皮油等。
作为保存剂可以列举：尼泊金类、山梨酸及其盐等本领域常用的保存剂。
本发明中的雌激素受体抑制剂可以为任何一种剂型，例如口服液、贴剂、片剂、胶囊、注射剂等；注射剂可以为静脉注射剂、肌肉注射剂等。
本发明中的血管新生因子为对促进成熟血管的形成起到作用的因子，其中包括对管腔形成起作用的因子(VEGF、HGF等)、对细胞成熟起作用的因子(HGF、PDGF-BB、ANG1等)等。另外，本领域技术人员应可以理解，这些因子在小鼠和包括人类在内的哺乳动物中的调控机制以及它们的作用效果是共通的，因此，本领域技术人员应可以理解，基于本说明书对雌激素受体抑制剂作用效果以及作用机制的描述，本发明的效果在包括人类在内的哺乳动物体内也能达到治疗缺血性疾病、能够促进骨骼肌细胞表达血管新生因子、促进骨骼肌细胞迁移和增殖、能够促进血管组成细胞(例如，血管内皮细胞和平滑肌细胞等)迁移等本说明书所描述的效果。
实施例
1.葡萄糖浓度对ERα表达量的影响
实验方法及试剂
细胞培养
首先将C2C12骨骼肌细胞种到24孔细胞培养板内(30000个细胞/孔)，所用的培养基为杜尔伯科改良伊格尔培养基(Dulbecco′s Modified Eagle Medium，DMEM)+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin。24h后将培养基换成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+葡萄糖的培养基(葡萄糖最终浓度如图1和图2所示，DMEM本身已含有4.5mg/ml的葡萄糖)，继续培养24h。之后将培养基换成DMEM+Penicillin+Streptomycin+葡萄糖的培养基(葡萄糖最终浓度如图1和图2所示)的培养基并在低氧环境下培养，4h后取总RNA。
低氧环境下的细胞培养：
低氧处理是将细胞培养板和Anaero Pack.Anaero(Mitshubishi Gas Chemical,Japan)放入专用密封容器(标准四角形密封容器，Mitsubishi Gas Chemical)内，放入培养箱。所述密封容器内的氧气浓度低于0.1％。
RNA提取
根据Trizol的说明书提取RNA。RNA提取之后用Nanodrop-2000(Gene Company,Ltd)检测所提取的RNA的质量和浓度后进行反转录。
mRNA水平的测定：
RT-PCR
TAKARA-PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA ERaser(Code No.RR047A)
(1)
去除基因组DNA反应
试剂使用量
体系完成之后置于Bio-Rad T100Thermal cycler机子上面，反应条件如下：
42℃ 2min
4℃。
(2)反转录反应
| 试剂 | 使用量 |
| PrimeScript RT Enzyme Mix Ⅰ | 1.0μL |
| RT Prime Mix<sup>*4</sup> | 1.0μL |
| 5*PrimeScript Buffer2 | 4.0μL |
| RNase Free DH<sub>2</sub>O | 4.0μL |
| 步骤1的反应液 | 10.0μL |
| Total | 20.0μL |
体系完成之后置于Bio-Rad T100Thermal cycler机子上面，反应条件如下：
37℃ 15min
85℃ 5sec
4℃
(3)得到cDNA后稀释10倍。稀释后的样品用来做定量PCR实验(定量PCR仪：CFX96Optical Reaction Module#1845097，Bio-Rad)，测定表2中记载的各血管新生因子的基因的表达水平，用β-Actin的表达量归一化并将对照组(即糖浓度4.5mg/mL)的值为1，算出其它组的相对表达量(各实验进行了三次并获得了平均值)。反应体系如下
| 试剂 | 用量 |
| SYBR | 5.0μL |
| PCR Forward Primer(10Mm) | 0.4μL |
| PCRReverse Primer(10Mm) | 0.4μL |
| RT反应液 | 2.5μL |
| DH<sub>2</sub>O | 1.7μL |
| Total | 10μL |
定量PCR反应程序
1. 50.0℃ for 2min
2. 95.0℃ for 10min
3. 95.0℃ for 15sec
4. 60.0℃ for 35sec
5. GOTO 3.40more times
6. 95.0℃ for 15sec
7. 60.0℃ for 1min
8. Melt Curve 65.0to 95.0,increment 0.5℃.
定量PCR相关引物序列
图1为示出葡萄糖浓度对ERα表达量的影响的图。从该图可知，雌激素受体ERα的表达显示出葡萄糖浓度依赖性，即随着葡萄糖浓度的升高，雌激素受体ERα的表达量升高。图中，NS为没有显著差异；*为p值(ttest)＜0.05，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。
2.葡萄糖浓度对血管新生因子表达量的影响
实验方法及试剂
实验方法如1，所用引物：
图2为示出葡萄糖浓度对血管新生因子表达量的影响的图。从该图可知，血管新生因子的表达显示出葡萄糖浓度依赖性，即随着葡萄糖浓度的升高，血管新生因子的表达量降低。图中，NS为没有显著差异；*为p值(ttest)＜0.05，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。
3.ERα基因沉默剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响
(1)实验方法及试剂
构建2个以ERα为靶标，表达能诱导RNA干扰的短发夹型RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达质粒，即shERα-1和shERα-2。质粒的制作可参见下述文献：Yin Yang 1inducestranscriptional activity of p73through cooperation with E2F1,Shourong Wuet.al.,Biochemical and Biophysical Research Communications 365(2008)75–81；以及Synergistic cooperation of MDM2and E2F1contributes to TAp73transcriptionalactivity,Vivi Kasim et al.,Biochemical and Biophysical ResearchCommunications 449(2014)319–326)。接种小鼠骨骼肌细胞C2C12于6孔板中，每孔30万细胞，24h后，按照Lipofectamine2000(Invitrogen)试剂的指导说明进行转染。将2μg质粒(shERα-1、shERα-2shRNA表达质粒)或不表达任何shRNA的对照质粒(shCon，可参考上述文献)分别与200μL的Opti-MEM培养基混合均匀，另外取4μL Lipofectamine2000与200μL的Opti-MEM培养基混合均匀。室温静置5min。将两个混合体系混合在一起，静置20min后加入六孔板中。24h后换成含有最终浓度为2.5mg/mL的嘌呤霉素的培养基(DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+2.5mg/ml的嘌呤霉素)培养筛选未被导入shRNA质粒的细胞。36h后更换培养基(DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖)，4h后更换为DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖并在低氧环境下培养12h，之后收集样品进行总RNA提取和定量PCR。
构建shERα质粒使用的核酸序列如下所示：
图3为示出ERα基因沉默剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响的图。从该图可知，ERα基因沉默剂促进血管新生因子表达。图中，*为p值(ttest)＜0.05，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。
4.ERα小分子抑制剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响
实验方法及试剂
首先将C2C12骨骼肌细胞接种到24孔细胞培养板内(80000个细胞/孔)进行培养，所用的培养基为DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin。24h后将培养基换成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖+ERα小分子抑制剂的培养基(各个ERα小分子抑制剂的最终浓度如下所示)，继续培养24h。之后将培养基换成DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖+ERα小分子抑制剂的培养基(各个ERα小分子抑制剂的最终浓度如下所示)并在低氧环境下培养，4h后取总RNA进行定量PCR(具体操作如上所述)。另外将不添加ERα小分子抑制剂而是添加了等量的磷酸盐缓冲液(PhosphateBuffered Saline，PBS)的样品作为对照组。
| ERα小分子抑制剂 | 最终浓度 |
| 氟维司琼(FL) | 0.4nM |
| 他莫昔芬(TA) | 12nM |
| 盐酸雷洛昔芬(RA) | 5.7nM |
| 酒石酸拉索昔芬(LA) | 1nM |
从图4～7可知，高糖条件下，ERα的表达量升高，同时骨骼肌细胞血管新生因子的表达量降低。具体如下所述。图4为示出氟维司琼对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响的图。从该图4可知，氟维司琼促进血管新生因子表达。图5为示出他莫昔芬对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响的图。从该图5可知，他莫昔芬促进血管新生因子表达。图6为示出盐酸雷洛昔芬对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响的图。从该图6可知，盐酸雷洛昔芬促进血管新生因子表达。图7为示出酒石酸拉索昔芬对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响的图。从该图7可知，酒石酸拉索昔芬促进血管新生因子表达。图中，*为p值(ttest)＜0.05，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。
5.ERα抑制剂对骨骼肌细胞迁移的影响
实验方法(transwell小室实验)及试剂
ERα基因沉默剂实验
按照上述项目“3.ERα基因沉默剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响”(进行至嘌呤霉素筛选36h的步骤)准备对照细胞(导入不表达短发夹型RNA的shCon对照质粒的细胞)和导入shERα-1以及shERα-2或shCon质粒的细胞，嘌呤霉素筛选后将培养基换成DMEM+penicillin+streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培养基培养24h。将细胞接种在transwell小室的上室(upper chamber)内(每个小室内接种7000细胞，培养基为DMEM+penicillin+streptomycin)，将DMEM+penicillin+streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培养基加入下室(lower chamber)，置于低氧条件下培养。4h后取出transwell小室，去除transwell小室内部未迁移的细胞后，用结晶紫(碧云天)染色透过滤膜而到达小室另一侧的细胞并在荧光显微镜下拍照(每组6张以上)，并通过数出6张照片中的细胞数(即迁移的细胞)得出每张照片中细胞数的平均。
ERα小分子抑制剂实验
首先将C2C12骨骼肌细胞接种到24孔细胞培养板内(80000个细胞/孔)进行培养，所用的培养基为DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin。24h后将培养基换成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖+ERα小分子抑制剂的培养基(各个ERα抑制剂的最终浓度如下所示)，继续培养24h，准备各种ERα小分子抑制剂处理后的细胞。作为对照，将C2C12骨骼肌细胞接种到24孔细胞培养板内(80000个细胞/孔)用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin培养基进行培养24h后，更换培养基(“正常”对照换成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin，“高糖”对照换成DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖)继续培养24h。之后与上述ERα基因沉默剂实验的方法一样地进行transwell小室实验。
| ERα小分子抑制剂 | 最终浓度 |
| 氟维司琼(FL) | 0.4nM |
| 他莫昔芬(TA) | 12nM |
| 盐酸雷洛昔芬(RA) | 5.7nM |
| 酒石酸拉索昔芬(LA) | 1nM |
图8为示出ERα抑制剂对骨骼肌细胞迁移的影响的图。该图中，相对迁移细胞数以高糖对照组或shCon组为1。通过比较正常和高糖对照可知，高糖导致骨骼肌细胞迁移能力下降，但抑制ERα能使这个功能恢复。即，ERα抑制剂能够促进骨骼肌细胞迁移。图中，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。FL为氟维司琼、TA为他莫昔芬、RA为盐酸雷洛昔芬、LA为酒石酸拉索昔芬。
6.ERα抑制剂对骨骼肌细胞增殖的影响
ERα小分子抑制剂实验
如上述项目“4.ERα小分子抑制剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响”中所记载地准备各种ERα小分子抑制剂处理后的细胞细胞；另外准备正常对照(即不经过ERα小分子抑制剂处理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin培养的细胞)和高糖对照(即不经过ERα小分子抑制剂处理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培养的细胞)。之后在低氧培养12h(培养基：DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培养的细胞)后将细胞用4％多聚甲醛固定并用TritonX-100处理，之后用1％牛血清白蛋白封闭并用抗Ki67抗体(Abcam，Ab15580)在室温孵育90分钟，然后用PBS清洗三次，每次5min。再用针对抗Ki67抗体的二抗(驴抗兔抗体，Donkey Anti-rabbit Alexa
488conjugate,Invitrogen A21206)在室温孵育70分钟，用PBS清洗3次后加入DAPI(碧云天)，在室温孵育15分钟后清洗，用丙三醇封片后，利用荧光显微镜(LeicaMicrosystems，DMI6000B)进行检测。
ERα基因沉默剂实验
按照上述项目“3.ERα基因沉默剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响”(进行至嘌呤霉素筛选36h的步骤)准备对照细胞(导入不表达短发夹型RNA的shCon对照质粒的细胞)和导入shERα-1以及shERα-2或shCon质粒的细胞，嘌呤霉素筛选后将培养基换成DMEM+penicillin+streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培养基培养24h。之后在低氧培养(培养基：DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培养的细胞)12h后将细胞用4％多聚甲醛固定并用TritonX-100处理，之后用1％牛血清白蛋白封闭并用抗Ki67抗体(Abcam，Ab15580)在室温孵育90分钟，然后用PBS清洗三次，每次5min。再用针对抗Ki67抗体的二抗(驴抗兔抗体，Donkey Anti-rabbit Alexa
488conjugate,Invitrogen A21206)在室温孵育70分钟，用PBS清洗3次后加入DAPI(碧云天)，在室温孵育15分钟后清洗，用丙三醇封片后，利用荧光显微镜(Leica Microsystems，DMI6000B)进行检测。
图9为示出ERα抑制剂对骨骼肌细胞增殖的影响的图。该图中，相对迁移细胞数以高糖对照组或shCon组为1。通过比较正常和高糖对照可知，高糖导致肌细胞增殖能力下降，但通过抑制ERα能使骨骼肌细胞增殖恢复。图中，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。FL为氟维司琼、TA为他莫昔芬、RA为盐酸雷洛昔芬、LA为酒石酸拉索昔芬。
7.ERα抑制剂处理过的肌细胞条件培养基对血管内皮细胞迁移的影响
实验方法(transwell小室实验)及试剂
条件培养基的制备
骨骼肌细胞能分泌各种血管新生因子从而影响组成血管的各种细胞，且上述实验结果已证明，抑制ERα能促进骨骼肌细胞表达血管新生因子。为了进一步验证抑制ERα是否促进骨骼肌细胞分泌血管新生因子而影响血管组成细胞，发明人制备了富含骨骼肌细胞各种分泌因子的条件培养基，并考察了它们对血管组成细胞的影响。
如上述项目“3.ERα基因沉默剂对骨骼肌细胞血管新生因子表达量的影响”和上述项目“4.ERα小分子抑制剂对骨骼肌细胞血管新生因子的影响”中所记载地准备细胞，在低氧条件下培养12h(培养基：DMEM+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/mL葡萄糖培养的细胞)后收集培养基，3000rpm/min离心5min，收集上清液，用0.22μm膜滤器进行过滤。由此，得到各种条件培养基。
Transwell小室实验
除在上室接种7000个血管内皮细胞HUVECs、并把下室(lower chamber)的培养基改成各种条件培养基外，与上述项目“5.ERα抑制剂对骨骼肌细胞迁移的影响”同样地进行实验。
图10为示出ERα抑制剂处理过的肌细胞条件培养基对血管内皮细胞迁移的影响的图。从该图可知，ERα抑制剂处理过的肌细胞条件培养基促进血管内皮细胞的迁移。图中，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。“正常”为从不经过ERα小分子抑制剂处理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin培养的C2C12细胞获得的条件培养基，“高糖”为从不经过小分子抑制剂处理，利用DMEM+10％胎牛血清+Penicillin+Streptomycin+32.5mg/ml葡萄糖培养的C2C12细胞获得的条件培养基，“FL”为从经过氟维司琼处理过的C2C12细胞获得的条件培养基、“TA”为从经过他莫昔芬处理过的C2C12细胞获得的条件培养基、“RA”为从经过盐酸雷洛昔芬处理过的C2C12细胞获得的条件培养基、“LA”为从经过酒石酸拉索昔芬处理过的C2C12细胞的C2C12细胞获得的条件培养基。
8.ERα抑制剂处理过的肌细胞条件培养基对血管平滑肌细胞迁移的影响
如上述项目7“ERα抑制剂处理过的肌细胞条件培养基对血管内皮细胞迁移的影响”中所记载地准备条件培养基。
Transwell小室实验
除在上室种上7000个血管平滑肌细胞MOVAS细胞、并把下室(lower chamber)的培养基改成各种条件培养基外，与上述项目“5.ERα抑制剂对骨骼肌细胞迁移的影响”同样地进行实验。
图11为示出ERα抑制剂处理过的肌细胞条件培养基对血管平滑肌细胞迁移的影响的图。从该图可知，ERα抑制剂处理过的肌细胞条件培养基促进血管平滑肌细胞的迁移。图中，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。
9.ERα抑制剂对促进缺血部位血流恢复的作用
(1)I型糖尿病小鼠模型的建立
C57BL/6J小鼠(8周，雄性)购买(购自中国人民解放军第三军医大学)回来一周后测量小鼠血糖，用下述高脂饲料喂养4周后测量血糖，出现糖尿病前期(pre-diabetes)的情况后，将链脲佐菌素通过肌肉连续注射五天，射量为50mg/kg，继续高脂饲料喂养一周后测量小鼠血糖，血糖高于16.7mmol/L的被选用做下一步实验。在此，需要说明的是，一般血糖为7.4mmol/L以上已被认为患有糖尿病，但本发明的模型选定血糖为16.7mmol/L以上的小鼠。另外，至实验结束(3周)，小鼠的血糖没有降低的现象，因此本实施例的血流恢复的作用不是因为血糖下降导致的血管修复能力上升，而是因为ERα的抑制导致骨骼肌细胞迁移和表达血管新生因子的功能上升。
高脂饲料的配方：15％猪油
10％蛋黄
10％白糖
65％普通饲料
其中，普通饲料、蛋黄、猪油、白糖由第三军医大学大坪医院提供，并由第三军医大学大坪医院生产高脂饲料。
(2)II型糖尿病小鼠
利用db/db二型糖尿病小鼠模型(常州卡文斯实验动物中心)。
(3)ERα抑制剂对促进缺血部位血流恢复的治疗效果
使用上述糖尿病小鼠模型，在麻醉条件下对左侧大腿大动脉进行切除手术，并利用Laser Doppler Perfusion Imaging System检测血流的情况。需要说明的是，关于本申请说明书中“左侧”、“右侧”的表述，进行了手术的是左侧大腿，此时小鼠处于俯卧状态，后述的血流图的照片中小鼠处于仰卧状态，所以该血流图照片中手术的大腿在图中右侧)(参照文献Shourong Wu et al.Prolyl hydroxylase domain-2silencing induced byhydrodynamic limb vein injection enhances vascular regeneration in criticallimb ischemia mice through activation of multiple genes(2015)Curr GeneTher.15(3):313-325中的方法)。
ERα抑制剂的注射
ERα基因沉默剂：将shERα-1质粒(1μg/μl，用PBS溶解)用0.22μm膜过滤后保存。在小鼠术后的第二天，将质粒溶液(1mg/kg body weight)肌肉注射到小鼠缺血下肢(即进行手术的下肢)腓肠肌内。之后一周一次按以上方法注射质粒溶液。对照组则使用对照质粒shCon作为对照，同样地过滤、保存和注射。
ERα小分子抑制剂：将氟维司琼用PBS溶解(最终浓度10nM)，用0.22μm膜过滤后保存。在小鼠术后的第二天，将氟维司琼(最终浓度1.2mg/kg body weight)肌肉注射到小鼠缺血下肢(即进行手术的下肢)腓肠肌内。之后两天一次按以上方法注射质粒溶液。关于对照组，使用PBS作为对照，同样地过滤、保存和注射。
利用Laser Doppler Perfusion Imaging System(MOOR INSTRUMENTS Ltd，MOORLDLS2-IR)检测手术前、刚手术后、术后第7、14、21天的血流情况(II型糖尿病小鼠观察到第14天)。参见图12～14可知，I型和II型糖尿病小鼠模型中，术前对照组小鼠和给药组小鼠具有同等的血流状况。在I型糖尿病小鼠模型的情况下，在术后第21天时，与shCon对照组或PBS对照组相比，分别注射了shERα-1质粒和氟维司琼的小鼠的下肢血流显著恢复。在II型糖尿病小鼠模型的情况下，在术后第14天时，与PBS对照组相比，注射了氟维司琼的小鼠的下肢血流显著恢复。
具体地，图12～14中，灰色部分反应血流状况。术前，对照组小鼠和给药组小鼠具有同等的血流状况(需要说明的是，Laser Doppler Perfusion Imaging System原初成像为彩图，转化为灰度图片后，与原初所成的像看起来有些许差异。在原彩图中，红色表示血流丰富，蓝色或绿色表示没有血流。在灰度图像下无法较清晰地区分血流恢复的地方(即原彩图中红色部位)和没有血流(即原彩图中蓝色或绿色部位)的地方)。针对该问题，本申请发明人依据彩图结果对灰度图进行了图像处理，从而得到了图12(B)、图13(B)和图14(B)。在处理后的图像中，网点状表示血流恢复的地方，即原彩图中的红色部分。
刚手术后，对照组小鼠和给药组小鼠左侧下肢均显示出没有血流的状态(在原彩图中均为蓝色或绿色的部分，在处理后的图中显为黑色，没有网点状图案)，可知手术成功地制造出缺血小鼠模型。在I型糖尿病小鼠模型的情况下，在术后第21天时，相对于对照组，给药组观察到明显的血流恢复(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)。在II型糖尿病小鼠模型的情况下，在术后第14天时，相对于对照组，给药组观察到明显的血流恢复(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)。
10.ERα抑制剂对促进缺血部位血管新生的作用
实验方法及试剂
采用冰冻切片进行，术后21天(II型糖尿病小鼠术后14天)，取得小鼠的左侧腓肠肌组织后保存在-80℃。待组织冷冻后进行切片。
切片流程如下，包埋剂包埋组织后在切片机(Leica生产)上进行切片，切片厚度是10μm。切片结束后将切片置于37℃烘箱中烘干30min，2.5％牛血清白蛋白(BSA)中封闭30～60min。将组织周围的BSA除去后，用抗PECAM-1(别名：CD31)抗体室温孵育1h(PECAM-1：Purified Rat Anti-Mouse CD31(Clone MEC13.3,BD PharmingenTM Cat 550274)，抗体稀释比例1:50)，然后用含有0.1％吐温的PBS(PBS-T)清洗三次，每次5min。进一步将该切片用带有荧光标记的抗α-Smooth Muscle Actin(α-SMA)的抗体Mouse monoclonal(Clone 1A4,Sigma-Aldrich Cat C6198)(即α-Smooth Muscle-Cy3，抗体稀释比例1:100)、和荧光标记的针对抗PECAM-1抗体的二抗(Goat anti-Rat IgG(H+L)Secondary Antibody,Alexa
488conjugate(Thermo Scientific Cat A11006)(抗体稀释比例1:100)的混合液室温孵育30min。然后PBS-T清洗三次，每次5min。免疫荧光染色结束并用丙三醇封片后，在荧光显微镜(Leica Microsystems，DMI6000B)上面检测。对注射了ERα抑制剂、对照质粒shCon和PBS的小鼠确认血管生成及血管成熟情况。结果如图15左侧所示。另外，对所获得的图片利用Leica Application Suite Version 4.6软件进行定量，得出PECAM-1阳性和α-SMA阳性的面积。结果如图15右侧所示。
图15-16为示出ERα抑制剂对促进缺血部位血管新生的作用的图。从这些图可知，ERα抑制剂实现了促进缺血部位血管新生的作用。图中，**为p值(ttest)＜0.01。p值＜0.05被认为有显著性差异。FL为氟维司琼。结果可以确认，注射ERα抑制剂的小鼠的组织内发现了血管内皮细胞(即PECAM-1阳性)和血管平滑肌细胞(即α-SMA阳性)的细胞增多。通过重叠图片(Merge image)发现PECAM-1和α-SMA双阳性的结构增多，并形成由血管平滑肌细胞包围血管内皮细胞的管腔结构，意味着形成了丰富的成熟血管，而注射PBS的小鼠仅有微弱的噪音信号。另外，定量结果也显示了抑制ERα能在缺血缺氧条件下显著地诱导更多的血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。
该结果表明，抑制ERα能够治疗小鼠恶性下肢缺血、即促进缺血下肢血流的恢复，其原因很可能是由于抑制ERα促进了小鼠的血管新生和成熟血管的形成。需要说明的是，虽然动物实验所用的ERα抑制剂为ERα基因沉默剂以及氟维司琼，但基于上述实验，他莫昔芬、盐酸雷洛昔芬、酒石酸拉索昔芬也均有促进骨骼肌细胞迁移和表达血管新生因子的作用，且经过上述ERα抑制剂处理过的骨骼肌细胞的条件培养基也能促进血管组成细胞的迁移，而这些细胞功能与血管新生和成熟血管的形成密切相关。换句话说，由于他莫昔芬、盐酸雷洛昔芬、酒石酸拉索昔芬对骨骼肌细胞和血管组成细胞的影响与ERα基因沉默剂以及氟维司琼非常相似，可以推断上述ERα小分子抑制剂乃至其它ERα抑制剂也能促进缺血部位的血管新生和成熟血管的形成，从而导致缺血部位的血流恢复，能有效地治疗缺血性疾病。
产业实用性
雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中有良好的效果。
Claims (8)
1.ERα抑制剂在制备治疗下肢缺血性疾病的药物中的应用，其中，
所述ERα抑制剂为由序列号13～16表示的ERα基因沉默剂、氟维司琼、他莫昔芬、盐酸雷洛昔芬和酒石酸拉索昔芬，
所述下肢缺血性疾病为糖尿病足。
2.如权利要求1的应用，其中，所述治疗缺血性疾病的药物为促进血管新生的药物。
3.如权利要求2的应用，其中，所述促进血管新生药物为促进骨骼肌细胞分泌血管新生因子的药物。
4.如权利要求2的应用，其中，所述促进血管新生药物为促进骨骼肌细胞迁移的药物。
5.如权利要求2的应用，其中，所述促进血管新生药物为促进骨骼肌细胞增殖的药物。
6.如权利要求2的应用，其中，所述促进血管新生药物为促进血管组成细胞迁移的药物。
7.如权利要求6的应用，其中，所述血管组成细胞包括血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。
8.如权利要求2的应用，其中，所述治疗缺血性疾病的药物为在高糖条件下促进血管新生的药物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611071285.3A CN106692974B (zh) | 2016-11-29 | 2016-11-29 | 雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201611071285.3A CN106692974B (zh) | 2016-11-29 | 2016-11-29 | 雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106692974A CN106692974A (zh) | 2017-05-24 |
| CN106692974B true CN106692974B (zh) | 2021-04-06 |
Family
ID=58935156
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201611071285.3A Active CN106692974B (zh) | 2016-11-29 | 2016-11-29 | 雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN106692974B (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111870694B (zh) * | 2020-07-20 | 2022-01-14 | 重庆大学 | Sglt2抑制剂的用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101653438A (zh) * | 2009-07-14 | 2010-02-24 | 澳门大学 | 黄芪中毛蕊异黄酮在制备血管保护、促进血管新生药物中的应用 |
| CN104337761A (zh) * | 2013-08-07 | 2015-02-11 | 江苏豪森药业股份有限公司 | 氟维司群药物组合物 |
| CN105687216A (zh) * | 2016-01-21 | 2016-06-22 | 重庆大学 | 治疗下肢缺血性疾病的药物 |
-
2016
- 2016-11-29 CN CN201611071285.3A patent/CN106692974B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101653438A (zh) * | 2009-07-14 | 2010-02-24 | 澳门大学 | 黄芪中毛蕊异黄酮在制备血管保护、促进血管新生药物中的应用 |
| CN104337761A (zh) * | 2013-08-07 | 2015-02-11 | 江苏豪森药业股份有限公司 | 氟维司群药物组合物 |
| CN105687216A (zh) * | 2016-01-21 | 2016-06-22 | 重庆大学 | 治疗下肢缺血性疾病的药物 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Effects of tamoxifen on myocardial ischemia-reperfusion injury model in ovariectomized rats;Rauf Onur Ek et al.;《Mol Cell Biochem》;20071103;第308卷;第227-235页 * |
| Tamoxifen, a Selective Estrogen Receptor Modulator, Reduces Ischemic Damage Caused by Middle Cerebral Artery Occlusion in the Ovariectomized Female Rat;Mehta SH et al.;《Neuroendocrinology》;20030131;第77卷(第1期);第44-50页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN106692974A (zh) | 2017-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Zuo et al. | Inhibition of JNK and p38 MAPK‐mediated inflammation and apoptosis by ivabradine improves cardiac function in streptozotocin‐induced diabetic cardiomyopathy | |
| Bernardo et al. | Understanding key mechanisms of exercise-induced cardiac protection to mitigate disease: current knowledge and emerging concepts | |
| Zhang et al. | Enhancing efficacy of stem cell transplantation to the heart with a PEGylated fibrin biomatrix | |
| Harper et al. | GDF11 decreases pressure overload–induced hypertrophy, but can cause severe cachexia and premature death | |
| EP1786428B1 (en) | Pde5 inhibitor compositions and methods for treating cardiac indications | |
| Lei et al. | Bradycardia induces angiogenesis, increases coronary reserve, and preserves function of the postinfarcted heart | |
| AU2017277277B2 (en) | Modified RNA encoding VEGF-A polypeptides, formulations, and uses relating thereto | |
| CN105535001B (zh) | 红景天苷在制备治疗糖尿病足的药物中的应用 | |
| CN108697653A (zh) | 小RNA-146a和纳米氧化铈缀合物促进伤口愈合和促进组织再生的用途 | |
| Wang et al. | Dapagliflozin improves cardiac function, remodeling, myocardial apoptosis, and inflammatory cytokines in mice with myocardial infarction | |
| CN105687216B (zh) | 治疗下肢缺血性疾病的药物 | |
| JP4499560B2 (ja) | Ｉｉ型糖尿病を治療又は予防するためのインターロイキン１受容体アンタゴニスト及び／又はピロリジンジチオカルバメートの使用 | |
| CN106692974B (zh) | 雌激素受体抑制剂在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用 | |
| Miao et al. | ErbB3 binding protein 1 (EBP1) participates in the regulation of intestinal inflammation via mediating Akt signaling pathway | |
| Peng et al. | Nicorandil attenuates ventricular dysfunction and organ injury after cardiopulmonary bypass | |
| Berlanga-Acosta et al. | Epidermal Growth Factor (EGF) intralesional infiltrations: from the bench to the diabetic ulcers cells | |
| von Wattenwyl et al. | Scaffold-Based Transplantation of Vascular Endothelial Growth Factor—Overexpressing Stem Cells Leads to Neovascularization in Ischemic Myocardium but Did Not Show a Functional Regenerative Effect | |
| CN111870694B (zh) | Sglt2抑制剂的用途 | |
| JP2020510616A (ja) | 心不全および心臓虚血再灌流障害の治療 | |
| Tian et al. | Adiponectin improves the therapeutic efficacy of mesenchymal stem cells by enhancing their engraftment and survival in the peri-infarct myocardium through the AMPK pathway | |
| CN109893655B (zh) | miR-327抑制剂和/或FGF10促进剂在预防和/或治疗糖尿病的药物中的应用 | |
| CN107625781B (zh) | miRNA抑制子在制备防治心肌梗死药物中的应用 | |
| Zhao et al. | Mesenchymal stem cell derived exosomes enhance lymphangiogenesis via exosomal transfer of Ang-2/Tie2 | |
| CN110141565A (zh) | 芒柄花黄素在制备治疗肺动脉高压药物中的应用及治疗肺动脉高压药物 | |
| WO2017125076A1 (zh) | 红景天苷在制备治疗缺血性疾病的药物中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |