CN111870694B

CN111870694B - Sglt2抑制剂的用途

Info

Publication number: CN111870694B
Application number: CN202010701077.7A
Authority: CN
Inventors: 江启慧; 吴寿荣; 奥利维娅·马塞利纳; 季亚·阿里·努格拉哈宁格鲁姆
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2020-07-20
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: CN111870694A

Abstract

本发明涉及SGLT2抑制剂的用途。本发明提供SGLT2抑制剂在制备用于治疗受试者的缺血性疾病的药物中的用途。本发明还提供SGLT2抑制剂在制备用于在受试者中促进骨骼肌细胞增殖、促进骨骼肌细胞迁移、促进骨骼肌细胞血管新生因子的表达和分泌、促进血管新生和/或血流恢复、和/或促进细胞(如血管内皮细胞和/或平滑肌细胞)增殖和迁移的产品中的用途，以及包含通过SGLT2抑制剂处理的骨骼肌细胞或其成分的组合物或试剂盒。

Description

SGLT2抑制剂的用途

技术领域

本发明属于医药领域，尤其涉及SGLT2抑制剂的新用途。

背景技术

钠-葡萄糖共转运蛋白2(sodium-glucose co-transporters 2，SGLT2)抑制剂是一种新的口服降糖药物，包括达格列净、根皮苷、坎格列净、恩格列净、依格列净、鲁格列净、托格列净、埃格列净、索格列净以及瑞格列净等，可以抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，使过量的葡萄糖从尿液中排出。研究表明，它们的作用不仅包括降糖，还在包括无糖尿病的患者的心力衰竭、慢性肾病治疗中起作用。

作为SGLT2抑制剂的达格列净(dapagliflozin，ForxigaTM)是由百时美施贵宝和阿斯利康公司联合开发的一种新型的抗糖尿病药物。其目前的临床应用主要为以下4种(目前都是片剂、口服)：

(1)2012年11月12日被欧洲药品管理局(EMA)批准上市，是第1个获准上市用于治疗2型糖尿病的SGLT2抑制剂，可作为糖尿病药物治疗中的重要选择，适用在有2型糖尿病成人中作为辅助饮食和运动改善血糖控制。

(2)2019年3月获欧盟和日本批准新适应症：作为胰岛素的口服辅助治疗药物，用于1型糖尿病(T1D)成人患者的治疗。该药是欧洲批准治疗T1D的首个SGLT2抑制剂，也是阿斯利康获得监管批准的首个T1D药物。该药具体适应症为：作为胰岛素的口服辅助治疗药物，用于接受胰岛素治疗但血糖水平控制不佳并且身体质量指数(BMI)≥27kg/m²(超重或肥胖)1型糖尿病(T1D)成人患者，改善其血糖控制。但在美国方面，该药治疗T1D因糖尿病酮症酸中毒(DKA)风险于2019年7月被FDA拒绝批准。

(3)2020年4月达格列净因治疗慢性肾病由于临床效果太好临床试验提前终止III期临床试验(DAPA-CKD研究)。这类药物治肾病，不能完全用改善患者的血糖来解释其临床效果，还涉及到其他非血糖作用机制途径。例如：恢复球管反馈，减轻肾小球高滤过，改善肾组织缺氧，以及减轻炎症和纤维化等。

(4)2020年05月美国食品和药物管理局(FDA)又批准达格列净一个新的适应症，用于射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)成人患者(伴或不伴2型糖尿病)，该适应症通过FDA的优先审查程序获得批准。是第一个被批准用于治疗心力衰竭的SGLT2抑制剂，将CV死亡(心血管死亡)和心衰恶化(心衰住院、紧急心衰就诊)复合终点的分线显著降低了26％。

达格列净的主要毒副作用包括：

2015年5月15日FDA首次发布的药物安全警告的更新：当时，FDA警告说，SGLT2抑制剂类降糖药可能导致严重酮症酸中毒和尿路感染，两种风险均会导致入院治疗。

缺血性疾病是由于血管损伤、血管堵塞等原因造成组织细胞供血量不足的一种疾病，包括心肌缺血、脑缺血、肢体缺血、肠缺血等。下肢缺血性疾病(Hind-limb Ischemia)是一种最常见的缺血性疾病，由于血管堵塞、血栓、高血糖等原因导致远端(下肢)供血不足。由于氧气是由血液中的红血球运输到各个组织器官，供血不足的结果是引起下肢组织缺氧、缺营养，严重时会导致组织坏疽，组织缺失(tissue loss)甚至个体的死亡。下肢缺血性疾病能导致下肢疼痛、下肢组织坏死、截肢甚至死亡。

目前，下肢缺血性疾病尚未有有效的治疗和控制方法，严重时需要对患者进行截肢，给患者带来巨大的痛苦和损失。目前被认为有望起到良好效果的治疗方法是通过促进血管新生，改善远端供血的情况，从而阻止组织继续坏死并起到改善下肢功能的作用。

作为下肢缺血性疾病的药物，目前有第一代治疗药物和第二代治疗药物。其中，第一代治疗药物利用的是单个血管新生因子(血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)等)，但临床试验结果不理想，新生血管不成熟，出现漏的情况，缺乏功能性(参见：Therapeutic angiogenesis for critical limb ischaemia.NatureReviews Cardiology，2013，10(7)：387-96)。治疗结果不理想的原因被认为是由于血管重构是个多因子参与的复杂的过程。第二代治疗药物则利用了多种血管新生因子的组合(成纤维细胞生长因子2(Fibroblast growth factor 2，FGF2)和血小板衍生因子(Platelet-derived growth factor，PDGF)；VEGF和血管生成素-1(Angiopoietin-1，ANG1))，虽然有一定的效果，然而血管新生因子种类繁多，它们在血管重构的不同的阶段起到不同的作用。因此，存在着血管新生因子种类的选择、组合时的比率、何时给药等难题。另外，目前对下肢缺血性疾病的治疗手段还面临外来血管新生因子的局部化，因此不足以在广泛的缺血缺氧区域内诱导足够的新生成熟血管的难题。

下肢缺血性疾病也是糖尿病的最常见、最严重并发症之一。由于血糖控制不理想，导致下肢外周血管易发病变，从而引起下肢供血不足并导致下肢组织细胞缺氧，加上高糖条件下组织修复、伤口愈合能力明显下降，严重时出现组织坏疽、组织缺失(tissue loss)甚至死亡；临床上严重患者往往需要截肢。

下肢缺血性疾病的理想的治疗方法为改善供血状态，目前针对治疗血管病变的方法有利用支架、搭桥、气囊扩张术等；另外，最近，由于其无侵袭性等优势，促进血管重构被认为是最好的治疗途径。然而，对血管病变反复率高、病变部位较广的患者(比如糖尿病下肢缺血性疾病患者等)，上述利用支架、搭桥或气囊扩张术不是理想的治疗方法。

更为重要的是，在高血糖这种独特的病理环境条件下，各种体内机能下降，各种因子的行为和生物调控途径以及反应也与正常条件有所不同。例如，糖尿病人的组织/细胞缺失了细胞对低氧环境的应激能力。高糖环境使血管内皮生长因子(Vascular endothelialgrowth factor，VEGF)以及VEGF受体(VEGFR)、血小板衍生因子-BB(Platelet-derivedgrowth factor-BB，PDGF-BB)等血管新生因子的表达异常降低、且这些因子对低氧的应激反应也受损害，而这些因子在血管重构中起到重要作用。且也有报道，高糖条件下细胞表面的VEGFR2下降，阻止了VEGF-VEGFR2通路的信号传导，抑制了VEGF所诱导的血管内皮细胞的增殖等血管重构过程，导致糖尿病小鼠对VEGF的灵敏度明显低于正常小鼠，因此利用VEGF诱导下肢血管重构对治疗糖尿病下肢缺血行疾病不是一个理想的治疗方法。

研究表明，口服达格列净对血流恢复的效果和对照相同，并没有显著促进血流恢复(Lin Y.et al.，EBioMedicine，2020，52：102367)。口服卡格列净(Canagliflozin)能增加截肢的风险(Matthews D.R.et al.，Diabetologia，2019，62：926-938)。口服卡格列净也导致糖尿病下肢缺血小鼠的血流恢复相对于对照组缓慢(Lin Y.et al.，EBioMedicine，2020，52：102367)。总之，现有研究发现目前列净类SGLT2抑制剂对下肢缺血血管新生治疗没有改善作用，甚至有恶化的风险。

骨骼肌细胞是体内最大的分泌器官，它可以分泌多种血管新生因子从而促进血管新生。因此，骨骼肌细胞是一个血管新生疗法的新策略。之前有报道利用基因治疗、小分子化合物的方法靶向骨骼肌从而促进血管新生的方法，然而这些方法都具有药物传导困难、生物和临床安全性隐患、成药性差等问题。

发明内容

发明人通过深入研究，已经发现肌肉注射SGLT2抑制剂如达格列净能有效促进骨骼肌细胞增殖，促进骨骼肌细胞血管新生因子(例如VEGF-A、FGF2、HGF、PDGF-BB和ANG1)的表达和分泌，促进骨骼肌细胞迁移能力，而且SGLT2抑制剂如达格列净处理的骨骼肌细胞条件培养基促进血管内皮细胞增殖和迁移能力和平滑肌细胞增殖和迁移能力，促进下肢缺血小鼠模型的血管新生和血流恢复。研究还发现SGLT2抑制剂的所述作用不依赖于血糖浓度，例如其可以在糖尿病和非糖尿病模型中起作用。发明人进一步发现SGLT2抑制剂的所述作用不是通过直接作用于血管内皮细胞或平滑肌细胞而发挥的，而是通过其对骨骼肌细胞的促进作用来行使的。

在一些实施方案中，本发明涉及SGLT2抑制剂在制备用于治疗受试者的缺血性疾病的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明涉及SGLT2抑制剂在制备用于在受试者中促进骨骼肌细胞增殖、促进骨骼肌细胞迁移、促进骨骼肌细胞血管新生因子的表达和分泌、促进血管新生和/或血流恢复、和/或促进细胞(如血管内皮细胞和/或平滑肌细胞)增殖和迁移的产品中的用途。

在一些实施方案中，本发明涉及一种产品，其包含通过SGLT2抑制剂处理的骨骼肌细胞或其成分。在一些实施方案中，本发明所述产品没有特别限制，可以包括组合物或试剂盒，例如可以包括药物组合物或试剂盒，研究用组合物或试剂盒，培养基组合物或试剂盒。在一些实施方案中，SGLT2抑制剂可以用于制备促进细胞(如血管内皮细胞和/或平滑肌细胞)增殖和迁移的条件培养基。在一些实施方案中，所述条件培养基可以通过使用SGLT2抑制剂处理骨骼肌细胞来制备。在一些实施方案中，所述组合物或试剂盒包含通过SGLT2抑制剂处理的骨骼肌细胞获得的活性成分，例如通过SGLT2抑制剂处理的骨骼肌细胞后，进行纯化处理，以获得包含活性因子如SGLT2抑制剂处理的骨骼肌细胞产生的血管新生因子包括VEGF-A、FGF2、HGF、PDGF-BB和ANG1中的一种或多种因子混合物的成分。在一些实施方案中，用于处理骨骼肌细胞的SGLT2抑制剂的量没有特别限制，例如可以是1-100mM或甚至更高的量。

在一些实施方案中，本文所述SGLT2抑制剂包括吡喃葡糖基取代的苯衍生物，例如达格列净(Dapagliflozin)、根皮苷(Phlorizin)、坎格列净(Canagliflozin)、恩格列净(Empagliflozin)、依格列净(Ipragliflozin)、鲁格列净(Luseogliflozin)、托格列净(Tofogliflozin)、埃格列净(Ertugliflozin)、索格列净(Sotagliflozin)以及瑞格列净(Remogliflozin)，优选包括达格列净、坎格列净、恩格列净、托格列净、埃格列净和索格列净。

在一些实施方案中，本发明所述血管新生因子包括VEGF-A、FGF2、HGF、PDGF-BB和ANG1中的一种或多种。

在一些实施方案中，本文所述受试者包括血糖水平正常的或血糖水平异常(如血糖水平升高或降低)的受试者，包括例如糖尿病患者和非糖尿病患者。血糖水平可以通过本领域已知的方法测定，并且其标准时本领域已知的。例如，在一些实施方案中，认为空腹血糖正常值在6.1mmol/L以下、餐后两小时血糖正常值在7.8mmol/L以下，高于上述范围则为高血糖。在一些实施方案中，成人空腹血糖水平低于2.8mmol/L，糖尿病患者血糖值≤3.9mmol/L可以认为是低血糖。在一些实施方案中，本文所述受试者没有特别限制，可以包括哺乳动物如人、鼠(例如小鼠或大鼠)、猴、狗、猪等。

在一些实施方案中，本发明所述缺血性疾病包括任何血管病变导致的缺血性疾病，包括下肢缺血疾病(例如糖尿病和非糖尿病下肢缺血疾病)、心肌缺血病变、下肢动脉闭塞症、下肢溃疡、下肢坏死等缺血性疾病。在一些实施方案中，下肢缺血性疾病可以为任何一种下肢缺血性疾病，例如血栓闭塞性脉管炎、闭塞性动脉硬化症、间歇性跛行等糖尿病相关或非糖尿病相关血管病变以及恶性下肢缺血性疾病。本公开中的下肢缺血性疾病的程度没有任何限制，可为前期病变、轻度、中度或严重的下肢缺血性疾病，也可为慢性或急性下肢缺血性疾病。

在一些实施方案中，本文所述产品如药物、组合物或试剂盒适于局部施用药物或胃肠外施用，例如适于注射如肌肉注射。

在一些实施方案中，本文所述产品如药物、组合物或试剂盒包括药学可接受的无菌水溶液或非水溶液，分散液、混悬液或乳液，以及用于复溶成无菌可注射液的无菌粉末。

在一些实施方案中，本发明所述SGLT2抑制剂可以与另外的治疗缺血性疾病的方法联合使用。本发明的药物的用量可以通过本领域已知的方法确定，并可以根据具体情况进行适当调整。在一些实施方案中，可以以每天约1mg至约1000mg的量施用SGLT2抑制剂局部注射，例如以约0.5mg至约350mg/天，以约1mg至约200mg/天或约2.5mg至约75mg/天，以约5mg至约50mg/天的量施用所述SGLT2抑制剂。在一些实施方案中，可以1-100mg/kg体重以内的适当量施用所述SGLT2抑制剂。在一些实施方案中，可以按单一剂量或按例如每天1至4次的分份给药形式来给药。在一些实施方案中，也可以间隔性给药，给药间隔没有任何限定，可以以间隔1天至约一个月，例如间隔1天至14天，例如间隔1天至7天，例如间隔1天至3天。

在一些实施方案中，本文所述药物可以包括药物组合物和药物试剂盒，其中SGLT2抑制剂可以单独存在或与药用载体、赋形剂或稀释剂形成组合物。在一些实施方案中，本发明的药物优选为适合肌肉注射的药物。本发明所述的药物可以通过本领域已知的方法制备。例如，可以将药物配置成固体或液体形式。在一些实施方案中，本发明的药物可以包含药用载体，其包括惰性固体、半固体或液体的填充剂、稀释剂、或任何类型的辅料。在一些实施方案中，水性和非水性载体、稀释剂、溶剂或媒介物可以包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)及合适的混合物、植物油(诸如橄榄油)及注射用有机酯诸如油酸乙酯。在一些实施方案中，药物也可以包含防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂、等渗剂例如糖、氯化钠等；延长注射用药物吸收的试剂如单硬脂酸铝、明胶等。在一些实施方案中，本文所述产品如药物、组合物或试剂盒可以包括活性成分以单位剂型存在于安瓿、预填充注射器、小体积输注容器或多剂量容器中。在一些实施方案中，活性成分可以是粉剂，在使用前与适当载体组合。在一些实施方案中，可注射制剂可根据已知技术，例如使用适当液体载体(例如无菌水)及任选的其它添加剂如防腐剂、pH值调节剂、缓冲剂、等张剂、溶解助剂和/或表面活性剂等制备，获得可注射溶液或悬浮液，其中还可以包括延缓药物释放的其它添加剂，例如盐、溶解度调节剂或沉淀剂。本发明的产品还可包含标签或药品说明书，所述说明书可含有与使用所述治疗产品的使用有关的适应症、用法、剂量、给药、禁忌和/或警告的信息。在一些实施方案中，标签或药品说明书可以说明所述产品可用于实现本文描述的目的。制备SGLT2抑制剂的方法是本领域技术人员已知的。

附图说明

图1：达格列净促进高糖条件下骨骼肌细胞增殖。(A)各种浓度的达格列净处理(24小时)对C2C12细胞总数变化曲线的影响(MTS实验)；(B)各种浓度的达格列净处理(24小时)对C2C12细胞总数的影响(结晶紫染色，达格列净处理24小时后，高糖条件下培养24小时)；(C)达格列净促进C2C12细胞增殖(达格列净10mM，EdU染色；标尺：100μm)。

图2：达格列净促进骨骼肌细胞血管新生因子表达和分泌。(A-B)达格列净(10mM)促进C2C12细胞内血管新生因子的表达水平：western blotting结果图(A)以及定量图(B)；(C)达格列净(10mM)促进C2C12细胞分泌血管新生因子的功能。

图3：达格列净促进高糖条件下骨骼肌细胞迁移能力。(A)达格列净(10mM)促进C2C12细胞迁移能力(划伤实验)；(B-C)达格列净(10mM)促进C2C12细胞迁移能力(transwell小室实验)：代表性照片(B；标尺：100μm)和迁移到transwell小室的下部小室的细胞定量结果(C)。

图4：达格列净处理的骨骼肌细胞条件培养基促进高糖条件下血管内皮细胞增殖和迁移能力。(A-B)达格列净(10mM)处理骨骼肌细胞C2C12，获得条件培养基(CM-Dapa)；该条件培养基能促进血管内皮细胞HUVECs增殖能力(EdU实验)：代表性照片(A；标尺：100μm)和EdU阳性定量结果(B)；(C-D)CM-Dapa能促进血管内皮细胞HUVECs迁移能力(transwell小室实验)：代表性照片(C；标尺：100μm)和迁移到transwell小室的下部小室的细胞定量结果(D)。

图5：达格列净处理的骨骼肌细胞条件培养基促进高糖条件下平滑肌细胞增殖和迁移能力。(A-B)达格列净(10mM)处理骨骼肌细胞C2C12，获得条件培养基(CM-Dapa)；该条件培养基能促进平滑肌细胞MOVAS增殖能力(EdU实验)：代表性照片(A；标尺：100μm)和EdU阳性定量结果(B)；(C-D)CM-Dapa能促进平滑肌细胞MOVAS迁移能力(transwell小室实验)：代表性照片(C；标尺：100μm)和迁移到transwell小室的下部小室的细胞定量结果(D)。

图6：达格列净不能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖和迁移能力。(A)利用达格列净(10mM)处理血管内皮细胞HUVECs对HUVECs血管新生因子表达水平没有显著影响(western blotting)；(B-C)达格列净(10mM)处理对血管内皮细胞HUVECs的增殖能力没有显著影响(EdU实验)：代表性照片(B；标尺：100μm)和EdU阳性定量结果(C)；(D-E)达格列净(10mM)处理对血管内皮细胞HUVECs的迁移能力没有显著影响(transwell小室实验)：代表性照片(D；标尺：100μm)和迁移到transwell小室的下部小室的细胞定量结果(E)。

图7：达格列净不能直接作用于平滑肌细胞促进血管内皮细胞增殖和迁移能力。(A)利用达格列净(10mM)处理平滑肌细胞MOVAS对MOVAS血管新生因子表达水平没有显著影响(western blotting)；(B-C)达格列净(10mM)处理对平滑肌细胞MOVAS的增殖能力没有显著影响(EdU实验；标尺：100μm)：代表性照片(B)和EdU阳性定量结果(C)；(D-E)达格列净(10mM)处理对平滑肌细胞MOVAS的迁移能力没有显著影响(transwell小室实验)：代表性照片(D；标尺：100μm)和迁移到transwell小室的下部小室的细胞定量结果(E)。

图8：达格列净促进糖尿病下肢缺血小鼠模型中缺血下肢的血流恢复，改善外观状态。(A-C)在缺血下肢腓肠肌里(靠近血管切割部位)肌肉注射达格列净(10mg/kg体重)，并利用Laser Doppler Imaging System观察血流状况：代表性图片(A)和定量结果(B，n＝7)；(C)外观观察结果：0＝与对照组没有显著差异；1＝略微变色；2＝中度变色；3＝严重变色、坏死、皮下组织的丢失；4＝下肢截肢)。对照组：在缺血下肢腓肠肌里(靠近血管切割部位)肌肉注射生理盐水。(D)是示出对(A)中的血流部分进行处理后的图。术前，对照组小鼠和处理组小鼠具有同等的血流状况(需要说明的是，Laser Doppler Perfusion ImagingSystem原初成像为彩图，转化为灰度图片后，与原初所成的像看起来有些许差异。在原彩图中，红色表示血流丰富，蓝色表示没有血流。在灰度图像下无法较清晰地区分血流恢复的地方(即原彩图中红色部位)和没有血流(即原彩图中蓝色部位)的地方)。针对该问题，本申请发明人依据彩图结果对灰度图进行了图像处理。在(D)中，网点状图案表示血流恢复的地方，即原彩图中的红色部分。刚手术后，对照组小鼠和处理组小鼠左侧下肢均显示出黑色(在原彩图中均为蓝色部分，在处理后的图中为没有网点状图案的黑色部分)。在术后第3天，处理组小鼠左侧下肢开始出现灰色和黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)，可知出现了明显的血流恢复状况；与之相对，对照组小鼠左侧下肢仍为黑色(即原彩图中的蓝色部分，在处理后的图中为没有网点状图案的黑色部分)，可知没有出现血流恢复的迹象。术后第21天时，处理组小鼠左侧下肢达到了与未处理的左侧下肢几乎同等的血流状况，即左侧下肢的血流得到了较为充分的恢复；与之相对，图中对照组小鼠左侧下肢影像缺失，推测是由于没有血流恢复而导致了下肢萎缩和组织坏死。另外从图中也可以看出，随着治疗时间的延长，处理组左侧下肢的灰色和黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)越来越达到下肢的远端(即靠近脚趾)部位，可知血流逐渐恢复到距离动脉切除较远的部位。

图9：达格列净促进糖尿病下肢缺血小鼠模型缺血下肢血管新生。(A)在缺血下肢腓肠肌里(靠近血管切割部位)肌肉注射达格列净(10mg/kg体重)，21天后取出腓肠肌组织并进行免疫荧光染色(标尺：100μm)。可看出，相对于对照组(注射生理盐水)，达格列净给药组的缺血下肢腓肠肌组织里PECAM-1阳性(绿色，PECAM-1是血管内皮细胞的标识物)和α-SMA阳性(红色，α-SMA是平滑肌细胞的标识物)，以及α-SMA阳性细胞覆盖的PECAM-1阳性管状结构显著增加。(B)达格列净给药组缺血下肢腓肠肌里PECAM-1单阳性细胞(毛细血管)显著增加；(C)达格列净给药组缺血下肢腓肠肌里PECAM-1/α-SMA双阳性细胞(成熟血管，动脉)显著增加。

图10：达格列净促进非糖尿病下肢缺血小鼠模型中缺血下肢的血流恢复。(A)在缺血下肢腓肠肌里(靠近血管切割部位)肌肉注射达格列净(10mg/kg体重)，并利用LaserDoppler Imaging System观察血流状况。对照组：在缺血下肢腓肠肌里(靠近血管切割部位)肌肉注射生理盐水。(B)是示出对(A)中的血流部分进行处理后的图。术前，对照组小鼠和处理组小鼠具有同等的血流状况(需要说明的是，Laser Doppler Perfusion ImagingSystem原初成像为彩图，转化为灰度图片后，与原初所成的像看起来有些许差异。在原彩图中，红色表示血流丰富，蓝色表示没有血流。在灰度图像下无法较清晰地区分血流恢复的地方(即原彩图中红色部位)和没有血流(即原彩图中蓝色部位)的地方)。针对该问题，本申请发明人依据彩图结果对灰度图进行了图像处理。在(B)中，网点状图案表示血流恢复的地方，即原彩图中的红色部分。刚手术后，对照组小鼠和处理组小鼠左侧下肢均显示出黑色(在原彩图中均为蓝色部分，在处理后的图中为没有网点状图案的黑色部分)。在术后第7天，处理组小鼠左侧下肢开始出现灰色和黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)，可知出现了明显的血流恢复状况；与之相对，对照组小鼠左侧下肢仍为黑色(即原彩图中的蓝色部分，在处理后的图中为没有网点状图案的黑色部分)，可知没有出现血流恢复的迹象。术后第14天时，处理组小鼠左侧下肢血流有显著恢复；与之相对，图中对照组小鼠左侧下肢影像缺失，推测是由于没有血流恢复而导致了下肢萎缩和组织坏死。另外从图中也可以看出，随着治疗时间的延长，处理组左侧下肢的灰色和黑色部分(即原彩图中的红色部分、处理后的图中的网点部分)越来越达到下肢的远端(即靠近脚趾)部位，可知血流逐渐恢复到距离动脉切除较远的部位。

图11：SGLT2抑制剂在高糖和非高糖环境下促进骨骼肌细胞表达血管新生因子。(A)在非高糖环境下，各种SGLT2抑制剂(最终浓度：10μM)处理后骨骼肌细胞C2C12中血管新生因子的mRNA水平。(B)在高糖环境下，各种SGLT2抑制剂(最终浓度：10μM)处理后骨骼肌细胞C2C12中血管新生因子的mRNA水平。Co：对照(DMSO)；D：达格列净(Dapagliflozin)；C：坎格列净(Canagliflozin)；E：恩格列净(Empagliflozin)；T：托格列净(Tofogliflozin)；Er：埃格列净(Ertugliflozin)；S：索格列净(Sotagliflozin)。

具体实施方式

1.下肢缺血模型小鼠的血流恢复作用的测定

1-1非糖尿病下肢缺血模型小鼠的建立

使用Balb/c小鼠(8周，雄性)，在麻醉条件下对左侧大腿大动脉进行切除手术，并利用Laser Doppler Perfusion Imaging System(MOOR INSTRUMENTS Ltd，MOORLDLS2-IR)检测血流的情况(参照文献Shourong Wu et al.，Prolyl hydroxylase domain-2silencing induced by hydrodynamic limb vein injection enhances vascularregeneration in critical limb ischemia mice through activation of multiplegenes(2015)Curr Gene Ther.，15(3)：313-25.中的方法)。需要说明的是，关于本申请说明书中“左侧”、“右侧”的表述，进行了手术的是左侧大腿，此时小鼠处于俯卧状态，后述的血流图的照片中小鼠处于仰卧状态，所以该血流图照片中手术的大腿在图中右侧。

1-2糖尿病下肢缺血模型小鼠的建立

C57BL/6J小鼠(6周，雄性)购买(购自中国人民解放军陆军军医大学)回来一周后测量小鼠血糖，用下述高脂饲料喂养3周后测量血糖，出现糖尿病前期(pre-diabetes)的情况后，通过肌肉连续注射五天链脲佐菌素，射量为50mg/kg，继续高脂饲料喂养一周后测量小鼠血糖，血糖高于16.7mmol/L的被选用做下一步实验。

在此，需要说明的是，一般血糖为7以上已被认为患有糖尿病，但本公开的模型选定血糖为16.7以上的小鼠。

高脂饲料的配方：15％猪油

10％蛋黄

10％白糖

65％普通饲料

其中，普通饲料、蛋黄、猪油、白糖由陆军军医大学大坪医院提供，并由陆军军医大学大坪医院生产高脂饲料。

选出糖尿病小鼠后，利用上述1-1的方法构建糖尿病下肢缺血模型。

1-3给药方法

构建下肢缺血模型和糖尿病下肢缺血模型之后，将小鼠随意分成对照组和给药组。针对给药组，术后24小时将达格列净(10mg/kg体重)肌肉注射至小鼠左侧下肢腓肠肌，即靠近切除的左侧大腿大动脉位置。给药每3天进行一次，直到术后第21天(手术当天为第0天)。针对对照组也进行同样的措施，只是利用生理盐水替代达格列净。

1-4观察结果

血流情况：如1-1所述，利用Laser Doppler Perfusion Imaging System检测术前和术后各个时间点的血流情况。

血流恢复率＝左侧下肢(缺血下肢)血流/同一只小鼠右侧下肢(对照)血流。

表观观察与评估：参照Stabile et al.，Impaired arteriogenic response toacute hindlimb ischemia in CD4-knockout mice(2003)Circulation，108：205-210中的方法，观察并评估缺血下肢的表观。0：与对照没有差异；1：略有颜色变化；2：中等颜色变化；3：严重色变，坏死，表皮组织缺失；4：下肢截肢/自离断。

2.免疫组织染色

(1)制造疾病模型小鼠组织冰冻切片

术后21天，取得达格列净处理组和对照处理组小鼠的腓肠肌组织后保存在-80℃。待组织冷冻后进行切片，得到实验样本。

切片流程如下，包埋剂包埋组织后在切片机(Leica生产)上进行切片，切片厚度是10μM。切片结束后将切片置于37℃烘箱中烘干30min，2.5％牛血清白蛋白(BSA)中封闭30～60min。将组织周围的BSA除去后，用抗PECAM-1(别名：CD31)抗体染色(PECAM-1：PurifiedRat Anti-Mouse CD31(Clone MEC13.3，BD Pharmingen^TM Cat 550274，抗体稀释比例1∶100)。室温孵育1h后，用含有0.1％吐温的生理盐水(PBS-T)清洗三次，每次5min。

将带有荧光标记的抗α-Smooth Muscle Actin(α-SMA)的抗体(即α-SmoothMuscle-Cy3，Mouse monoclonal(Clone 1A4，Sigma-Aldrich Cat C6198))和荧光标记的，针对抗PECAM-1抗体的二抗(Goat anti-Rat IgG(H+L)Secondary Antibody，Alexa

488conjugate(Thermo Scientific Cat A11006))混合(抗体稀释比例均为1∶500)，并将上述用抗PECAM-1抗体孵育并清洗过的切片进一步用上述抗α-SMA和抗PECAM-1抗体的二抗的混合液在室温孵育30min。然后PBS-T清洗三次，每次5min。免疫荧光染色结束并用丙三醇封片后，用荧光显微镜(Leica Microsystems，TPS-SP8)进行检测。

3.治疗下肢缺血疾病的机理的研究

3-1.细胞培养

小鼠骨骼肌细胞C2C12、人内皮细胞HUVECs以及小鼠平滑肌细胞MOVAS从AmericanType Culture Collection购买。细胞在加入了10％胎牛血清(FBS；BiologicalIndustries)的Dulbecco’s modified Eagle Medium(DMEM；Gibco，Life Technologies)培养基和双抗(Penicillin、Streptomycin)中培养。高糖条件：将最终浓度25mM的葡萄糖加入到上述DMEM培养基中。

3-2.细胞给药处理

用10％二甲基亚砜(DMSO)将达格列净(Selleckchem Co.Ltd.；分子量：408.87；纯度：99.31％)溶解，并将相应的达格列净溶液量加入到细胞培养基(葡萄糖最终浓度25mM)里，使最终浓度达到2mM，5mM或10mM。加入达格列净后继续培养24小时。之后在血清剥夺、低氧条件(利用Anaeropouch Box，0.1％O₂，Mitsubishi Gas Chemical)条件下培养。

3-3.达格列净对骨骼肌细胞活细胞总数的影响

MTS实验：如3-2所述，将达格列净加入到培养C2C12细胞的培养基(高糖)中并继续培养细胞24小时。之后将细胞重新重在96孔板中，在高糖、血清剥夺、低氧条件下培养，并在12小时、24小时、36小时和48小时后利用MTS试剂盒(Promega)和分光光度计(BioTekInstruments)，根据试剂盒说明书测活细胞的总细胞数。

结晶紫染色：将C2C12细胞在高糖条件下培养在24孔板中，如3-2所述进行达格列净给药。24小时候，将细胞在高糖、血清剥夺、低氧条件下培养24小时。之后，将细胞用固定(4％多聚甲醛处理5分钟)，并用0.05％结晶紫(碧云天)处理30分钟。之后，将细胞用生理盐水清洗、晾干并拍照。

3-4达格列净对骨骼肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖能力的影响(EdU实验)

如3-2所述，将达格列净加入到培养C2C12细胞的培养基(高糖)中并继续培养24小时后，将细胞在高糖、血清剥夺、低氧条件下培养12小时。之后利用BeyoClick EdU-488CellProliferation Assay Kit(碧云天)根据试剂盒说明书进行EdU染色。细胞核用Hoechst染色。染色结果用Olympus IX73(Olympus)荧光显微镜拍照，并用Image J软件进行定量分析，显示EdU阳性细胞与Hoechst阳性细胞的比率。

3-5.达格列净对骨骼肌细胞、血管内皮细胞、平滑肌细胞血管新生因子表达的影响：Western blotting

如3-2所述，将达格列净加入到培养C2C12、HUVECs或MOVAS细胞的培养基(高糖)中并继续培养24小时后，将细胞在高糖、血清剥夺、低氧条件下培养12小时。之后，通过与Wuet al.，Transcription factor YY1 promotes cell proliferation by directlyactivating the pentose phosphate pathway(2018)Cancer Research，78：4549中公开的相同方法提取蛋白质并进行western blotting。各个蛋白质表达量的定量通过利用Quantity One软件(Thermo Scientific)对western blotting所获条带进行，并除以内参(β-Actin)条带的定量数据。定量结果以对照为1的相对量显示。所有抗体产品信息及稀释比率如下：

3-6条件培养基的制备

如3-2所述，将达格列净加入到培养C2C12细胞的培养基(高糖)中并继续培养24小时后，将细胞在高糖、血清剥夺、低氧条件下培养24小时。之后将培养基收集，并利用0.22μm的过滤膜进行过滤制备含有达格列净处理过的骨骼肌细胞分泌物的条件培养基(CM-Dapa)。对照条件培养基(CM-Con)也用同样的方法制备，只是细胞不用利用达格列净，而是用等量的10％DMSO处理。

3-7达格列净对骨骼肌细胞血管新生因子分泌的诱导：ELISA

利用Mouse VEGF ELISA Kit(Neobioscience)和Mouse bFGF/FGF2 ELISA Kit(Elabscience)，根据产品说明书分别检测3-6中获得的条件培养基中VEGF-A和FGF2的含量，分析达格列净对骨骼肌细胞血管新生因子分泌功能的影响。

3-8达格列净对骨骼肌细胞、血管内皮细胞和平滑肌细胞迁移能力的诱导：划伤实验及transwell小室实验

划伤实验：

将细胞种到6孔板(2x10⁵细胞/孔)后，如3-2所述，将达格列净或10％DMSO加入到培养C2C12、HUVECs或MOVAS细胞的培养基(高糖)中并继续培养24小时。之后将细胞在高糖、血清剥夺、低氧条件下培养，同时加入环乙酰胺(最终浓度：10mg/ml，纯度≥95％，CaymanChemicals)处理2小时阻止细胞增殖。然后利用移液枪枪头进行划伤，36小时候观察愈合情况。

Transwell小室实验：

如3-2所述，将达格列净或10％DMSO入到培养C2C12、HUVECs或MOVAS细胞的培养基中(高糖)并继续培养24小时。之后，将细胞重新种到transwell小室上部小室内(8000细胞/小室；培养基：高糖、血清剥夺的DMEM培养基)，而transwell小室下部小室内放入同样的高糖、血清剥夺的DMEM培养基，在低氧环境下培养24小时。去除transwell小室内部未迁移的细胞后，用DAPI染色透过滤膜而到达小室另一侧的细胞并在荧光显微镜下拍照(OlympusIX71，每组6张以上)，并通过数6张照片中的细胞数(即迁移的细胞)得出每张照片中细胞数的平均。

3-9达格列净通过促进骨骼肌细胞分泌对血管内皮细胞和平滑肌细胞增殖能力的影响：EdU染色

如3-6所述，制备CM-Dapa和CM-Con条件培养基，并利用CM-Dapa和CM-Con培养血管内皮细胞HUVECs和平滑肌细胞MOVAS 24小时，之后将细胞在高糖、血清剥夺、低氧条件下培养12小时。然后根据3-4中描述的方法进行EdU染色。

3-10达格列净通过促进骨骼肌细胞分泌对血管内皮细胞和平滑肌细胞迁移能力的影响：transwell小室实验

将HUVECs或MOVAS细胞种到transwell小室上部小室内(8000细胞/小室；培养基：高糖、血清剥夺的DMEM培养基)，而transwell小室下部小室内放入如3-6所述的CM-Dapa或CM-Con条件培养基，在低氧环境下培养24小时。去除transwell小室内部未迁移的细胞后，用DAPI染色透过滤膜而到达小室另一侧的细胞并在荧光显微镜下拍照(Olympus IX71，每组6张以上)，并通过数6张照片中的细胞数(即迁移的细胞)得出每张照片中细胞数的平均。

3-11 SGLT2抑制剂促进骨骼肌细胞血管新生因子mRNA的表达水平：实时定量PCR 实验

mRNA的收集：如3-2所述，将SGLT2抑制剂(参照以下表1)或10％DMSO加入到培养C2C12细胞的培养基(非高糖或高糖)中并继续培养24小时。之后将细胞在非高糖或高糖、血清剥夺、低氧条件下培养，6小时后加入TRIZOL(Invitrogen)并收集到1.5mL的无菌EP管中，并根据TRIZOL的说明书提取RNA。RNA提取之后用Nanodrop-2000(Gene Company，Ltd)检测所提取的RNA的质量和浓度后进行反转录。非高糖：葡萄糖最终浓度5.5mM；高糖：葡萄糖最终浓度25mM。

表1 SGLT2抑制剂

一些示例性SGLT2抑制剂化合物结构

mRNA水平的测定：

RT-PCR

TAKARA-PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Code No.RR047A)(1)

去除基因组DNA反应

试剂	使用量
		5*gDNA Eraser Buffer	2.0μL
gDNA Eraser	1.0μL
		Total RNA	1.0μg
RNase Free DH<sub>2</sub>O	Up to 10.0μL

体系完成之后置于Bio-Rad T100 Thermal cycler中，反应条件如下：

42℃ 2min

4℃。

(2)

反转录反应

试剂	使用量
		PrimeScript RT Enzyme Mix I	1.0μL
RT Prime Mix<sup>*4</sup>	1.0μL
		5*PrimeScript Buffer2	4.0μL
RNase Free DH<sub>2</sub>O	4.0μL
		步骤1的反应液	10.0μL
Total	20.0μL

体系完成之后置于Bio-Rad T100Thermal cycler中，反应条件如下：

37℃ 15min

85℃ 5sec

4℃

(3)得到cDNA后稀释10倍。稀释后的样品用来做定量PCR实验(定量PCR仪：CFX96Optical Reaction Module#1845097，Bio-Rad)，测定PHD1、PHD2、PHD3、FGF2、HGF、ANG1、VEGF-A、HO-1、NF-κB以及PDGF-BB的基因的表达水平，并用β-Actin的表达量归一化。反应体系如下

试剂	用量
		SYBR	5.0μL
PCR Forward Primer(10Mm)	0.4μL
		PCR Reverse Primer(10Mm)	0.4μL
RT反应液	2.5μL
		DH<sub>2</sub>O	1.7μL
Total	10μL

定量PCR反应程序

1. 50.0℃ for 2min

2. 95.0℃ for 10min

3. 95.0℃ for 15sec

4. 60.0℃ for 35sec

5. GOTO 3.40more times

6. 95.0℃ for 15sec

7. 60.0℃ for 1min

8. Melt Curve 65.0to 95.0，increment 0.5℃.

定量PCR相关引物序列

结果和讨论

1.骨骼肌是体内最大的分泌器官，能分泌多种因子，包括多种血管新生因子。因此骨骼肌在血管新生方面是一个重要的治疗靶点。然而，在下肢缺血疾病患者中，骨骼肌本身的内在的(或称先天的)功能往往不足以促进有效的血管新生，尤其是在高糖条件下，高糖抑制了骨骼肌细胞的增殖、迁移、旁分泌等功能。因此，靶向骨骼肌细胞，促进它的增殖、迁移和旁分泌功能有望成为下肢缺血的新治疗方法。我们发现，不同浓度的达格列净(Selleckchem Co，Ltd.(上海)，Mw：408.87，溶解于10％DMSO溶液中，2μM、10μM、50μM)对高糖条件下骨骼肌细胞C2C12的总细胞数增加起到促进作用(图1A-B)，且10μM和50μM的效果没有显著差异。因此进一步用10μM的达格列净进行实验。我们发现，利用10μM达格列净处理骨骼肌细胞C2C12能促进它们在高糖条件下的增殖(图1C)。

2.利用不同浓度的达格列净(2μM、10μM、50μM)处理骨骼肌细胞C2C12，考察它们对高糖条件下骨骼肌细胞表达血管新生因子(VEGF-A、FGF2、HGF、PDGF-BB和ANG1)的水平，发现达格列净能促进骨骼肌细胞血管新生因子的表达水平，且呈浓度依赖性(图2A-B)。进一步考察对VEGF-A和FGF2的分泌，发现达格列净促进高糖条件下骨骼肌细胞分泌VEGF-A和FGF2的量。

VEGF-A：血管新生的主要促进因子，它促进内皮细胞的增殖和迁移，内皮细胞(血管内皮细胞)形成管状结构，诱导新生血管的形成。然而，VEGF-A单独诱导的血管不成熟、渗漏。

HGF：与VEGF-A共同作用，促进内皮细胞的功能。

FGF2：促进细胞外基质(extracellular matrix)的破坏以及诱导血管内皮细胞增殖和迁移、促进平滑肌细胞增殖、促进下游血管新生通路，与PDGF-BB一起诱导血管成熟。成熟的血管主要有血管内皮细胞组成的管状结构和覆盖于管状结构外的内皮细胞组成。

PDGF-BB：是血管成熟的主要因子，同时促进FGF2的释放从而诱导平滑肌细胞增殖。

ANG1：募集平滑肌细胞，同时介导骨骼肌细胞和内皮细胞间的旁分泌功能。

3.骨骼肌迁移能力对血管新生非常重要，因为它能使得骨骼肌细胞的分泌因子更加扩散，影响范围更为广泛。10μM的达格列净处理能显著促进骨骼肌细胞C2C12的迁移能力(图3A：划伤实验；3B-C：transwell小室实验)。

4.利用10μM达格列净处理骨骼肌细胞C2C12，获得条件培养基(CM-Dapa)后，用条件培养基培养血管内皮细胞HUVECs，发现CM-Dapa能促进血管内皮细胞的增殖(图4A-B)和迁移(图4C-D)。血管内皮细胞是形成管状的细胞，因此它们的增殖对血管新生非常重要；同时，它们需要迁移到缺血的位点，因此迁移能力也非常重要。

对照(CM-Con)：用与达格列净同等量的10％DMSO处理的骨骼肌细胞C2C12的条件培养基。

5.C2C12采用培养基(DMEM+10％血清)进行培养。利用10μM达格列净处理骨骼肌细胞C2C12，获得条件培养基(CM-Dapa)后，用条件培养基培养平滑肌细胞MOVAS，发现CM-Dapa能促进平滑肌细胞的增殖(图5A-B)和迁移(图5C-D)。平滑肌细胞覆盖于内皮细胞组成的管状外面，是成熟血管的标识，因此它们的增殖对血管新生非常重要；同时，它们需要迁移到缺血的位点，因此迁移能力也非常重要。

6.而达格列净不直接作用于血管内皮细胞。用10μM达格列净直接处理血管内皮细胞HUVECs并未能促进其血管新生因子(VEGF-A和PDGF-BB)的表达(图6A)，也未能促进其增殖(图6B-C)和迁移(图6D-E)能力。

7.同样，达格列净不直接作用于血管内皮细胞。用10μM达格列净直接处理平滑肌细胞MOVAS并未能促进其血管新生因子(VEGF-A和PDGF-BB)的表达(图7A)，也未能促进其增殖(图7B-C)和迁移(图7D-E)能力。

8.动物实验(糖尿病下肢缺血小鼠模型)，10mg/kg体重达格列净(肌注到缺血下肢)能促进血流恢复(图8A-B)和外观评估改善(图8C)。

9.动物实验的组织结果：达格列净促进缺血下肢中内皮细胞(PECAM-1阳性细胞)和平滑肌细胞(α-SMA阳性细胞)的数量，促进双阳性管状结构的数量(图9A-D)，9B：PECAM-1单阳性细胞数量(毛细血管)；9C：PECAM-1/α-SMA双阳性结构(动脉)。同时发现达格列净促进骨骼肌内血管新生因子的表达(图9D)。

10.在非糖尿病下肢缺血小鼠(正常下肢缺血小鼠)中，达格列净也能促进血流恢复(图10)。

11.在非高糖(图11A)和高糖(图11B)条件下，多种SGLT2抑制剂能促进骨骼肌细胞C2C12中血管新生因子VEGF和PDGF-BB的表达水平。

12.口服的达格列净作为SGLT2抑制剂起到降低血糖的作用，而对改善缺血下肢血流恢复没有显著效果。然而我们发现，局部肌肉注射达格列净对血流恢复和血管新生有显著促进的效果，然而对血糖没有任何显著效果，说明其起到的作用不是通过改善患者血糖环境(表2)。此外，在非糖尿病的下肢缺血小鼠中肌肉注射达格列净也能起到该效果，说明肌肉注射起到口服意想不到的作用。这个不同的效果很可能是因为口服给药后药物被代谢，而局部肌肉注射则是把达格列净直接靶向到骨骼肌细胞。同时，达格列净对内皮细胞和平滑肌细胞没有显著作用也说明了它对不同细胞起到不同作用效果。

表2实验期间糖尿病下肢缺血小鼠血糖浓度

^#P value：相对于高脂食物3周，One-way ANOVA.

^*P value：相对于术前1天，One-way ANOVA.

Claims

1.SGLT2抑制剂在制备用于治疗受试者的下肢缺血性疾病的注射用的药物中的用途，其中所述SGLT2抑制剂选自达格列净、坎格列净、恩格列净、托格列净、埃格列净和索格列净。

2.权利要求1所述的用途，其中所述受试者包括血糖水平正常的或血糖水平升高的受试者。

3.权利要求1或2所述的用途，其中所述受试者包括糖尿病患者。

4.权利要求1或2所述的用途，其中所述下肢缺血性疾病包括糖尿病和非糖尿病下肢缺血疾病。

5.权利要求1或2所述的用途，其中所述下肢缺血性疾病包括下肢动脉闭塞症、下肢溃疡、下肢坏死。

6.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括适于局部施用药物。

7.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括适于肌肉注射的药物。

8.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括药学可接受的无菌水溶液或非水溶液。

9.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括分散液、混悬液或乳液。

10.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括用于复溶成无菌可注射液的无菌粉末。

11.权利要求1或2所述的用途，其中所述SGLT2抑制剂与另外的治疗缺血性疾病的药物联合使用。

12.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括药物组合物。

13.权利要求1或2所述的用途，其中所述药物包括药物试剂盒。

14.权利要求1或2所述的用途，其中所述SGLT2抑制剂单独存在或与赋形剂形成组合物。

15.权利要求1或2所述的用途，其中所述SGLT2抑制剂与药用载体形成组合物。

16.权利要求1或2所述的用途，其中所述SGLT2抑制剂与稀释剂形成组合物。