CN113952322A - Mmb在制备抗结直肠癌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及1,2‑Benzenediol,3‑[[(4‑methoxyphenyl)imino]methyl]‑(以下简称MMB)在制备抗结直肠癌物中的应用，所述MMB的化学结构如下所示：
Description
技术领域
本发明属于化工医药技术领域，具体涉及一种MMB在制备抗结直肠癌药物中的应用。
背景技术
恶性肿瘤是导致死亡最重要的原因之一，也是阻碍21世纪延长人类寿命的最大障碍。结直肠癌是临床上常见的消化道恶性肿瘤，其是临床上常见的消化道恶性肿瘤，其发生通常与饮食改变和环境因素有关，发病率和死亡率均偏高。据2018年全球185个国家癌症数据统计，结直肠癌发病率和病死率皆居全球前三位。临床上结直肠癌治疗方式仍以手术治疗、放疗、化疗为主。其中常见的化疗药物氟尿嘧啶、伊立替康、奥利沙铂等具有可预测肝毒性。因此开发一种高效低毒的结直肠癌治疗药物迫在眉睫。
目前没有关于MMB该化合物相关抗结直肠癌活性的研究。
发明内容
本发明目的是提供一种MMB作为药物的新用途，即MMB在制备抗结直肠癌药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明提供了一种抗结直肠癌药物，该抗结直肠癌药物的活性成分为MMB。
本发明提供了MMB在制备抗癌药物中的应用，所述MMB的化学结构如下所示：
化学名称：(E)-4-((4-methoxyphenylimino)methyl)benzene-1,2-diol；
分子式：C14H13NO3；分子量：243.26；检测方式：HNMR（见图1）；性状：本品为橘黄色粉末；来源：上海陶素生化科技有限公司。药理性质：不溶于水，溶于DMSO。
进一步的，MMB在制备抗结直肠癌药物中的应用。
本发明提供了一种体外抑制肿瘤生长的方法，其将MMB加入肿瘤细胞的培养液中，加入MMB的终浓度分别为6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM、100 μM、200 μM。所述肿瘤细胞是结直肠癌DLD-1、SW480、HCT116细胞等。进一步的，MMB抑制结直肠癌DLD-1、HCT116、SW480细胞活力的作用浓度为6.25－200 μM。
进一步的，MMB抑制结直肠癌DLD-1细胞BALB/C 裸鼠皮下荷瘤生长的剂量为1 mg/kg/d。
具体的， MMB通过WEE1介导的CDK1磷酸化和CDC25C介导的CDK1去磷酸化诱导结直肠癌细胞DLD-1、SW480、HCT116的G2/M期阻滞。
本发明提供了一种体内抑制肿瘤生长的方法，其将MMB经尾静脉注射到BALB/C 裸鼠体内，注射MMB的剂量为1 mg/kg/3d。所述体内模型可以是结直肠癌DLD-1细胞BALB/C 裸鼠荷瘤模型。
和现有技术相比，本发明的有益效果如下：
本发明提供了MMB在制备抗结直肠癌药物中的应用。MTT结果显示：MMB显著抑制结直肠癌细胞的增殖。动物实验结果显示：MMB显著抑制人结直肠癌DLD-1细胞BALB/C 裸鼠皮下荷瘤生长。本发明的小分子化合物MMB作为新的抗结直肠癌药物或者其辅助成分进行开发，抑制结直肠癌效果显著，将为治疗和治愈结直肠癌提供新的治疗途径和手段。
附图说明
图1为MMB结构鉴定HNMR图谱数据；
图2为MMB抑制结直肠癌DLD-1（图A,D）、SW480（图B,E）、HCT116（图C,F）细胞活力的测定。*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001；
图3为MMB抑制结直肠癌DLD-1细胞BALB/C 裸鼠皮下荷瘤生长的测定。A：MMB干预25 d期间裸鼠荷瘤体积变化统计图；B：取材前NS组、5-Fu组、MMB干预组裸鼠全身照；C：NS组、5-Fu组、MMB干预组荷瘤图片；D：NS组、5-Fu组、MMB干预组荷瘤重量变化统计图；E：NS组、MMB干预组荷瘤组织HE染色结果。*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001；
图4为MMB干预对荷瘤裸鼠毒性的测定；A：心脏系数；B：肝脏系数；C：脾脏系数；D：肺系数；E：肾脏系数；F：MMB干预25 d期间裸鼠荷瘤体重变化统计图；*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001；
图5为MMB干预对健康裸鼠毒性的测定。A：毒性试验-裸鼠体重；B：毒性试验-NS组、MMB组裸鼠图片；C-D：MMB干预健康裸鼠肝损伤检测结果。ALT :谷丙转氨酶；AST :谷草转氨酶；E-F：MMB干预健康裸鼠肾损伤检测结果。BUN :尿素氮检测；CR :肌酐检测；G：心脏系数。心脏重量/裸鼠体重； H：肝系数。肝脏重量/裸鼠体重；I：脾系数。脾重量/裸鼠体重；J：肺系数。肺重量/裸鼠体重；K：肾脏系数。肾重量/裸鼠体重；L：MMB干预健康裸鼠组织石蜡切片染色结果；
图6为MMB对结直肠癌细胞细胞凋亡影响的测定。小分子抑制剂Z-VAD-FMK（凋亡抑制剂）（图A）与MMB联合作用对结直肠癌细胞DLD-1、SW480和HCT116活力无影响。Annexin V-FITC/PI双染对结直肠癌细胞DLD-1、SW480和HCT116凋亡无影响（图B）。Western blot法测定MMB对凋亡相关蛋白表达无影响（图C）；*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001；
图7为MMB对结直肠癌细胞细胞坏死和铁死亡影响的测定。小分子抑制剂Necrostatin（坏死抑制剂）（图A）、Ferrostatin（铁死亡抑制剂）（图B）与MMB联合作用对结直肠癌细胞DLD-1、SW480和HCT116活力无影响。*, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001；
图8为MMB对结直肠癌细胞细胞周期影响的测定。A：MMB干预结直肠癌细胞周期流式细胞术结果图。B：MMB干预结直肠癌细胞周期相关蛋白表达结果图。C：MMB干预结直肠癌细胞CDK1蛋白表达结果图；
图9为MMB通过WEE1介导CDK1磷酸化诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞。A ：MMB调控WEE1蛋白磷酸化。B：MK1775与MMB共干预结直肠癌细胞周期结果图。C：MK1775与MMB共干预结直肠癌细胞WEE1、CDK1活性；
图10为MMB通过CDC25C介导CDK1磷酸化诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞。
具体实施方式
为了使本发明的技术目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面结合具体实施例对本发明的技术方案作出进一步的说明，但所述实施旨在解释本发明，而不能理解为对本发明的限制，实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
实验方法：
化合物准备：MMB溶于DMSO中，配置成100 mM母液备用。MMB购自上海陶术生物科技有限公司，货号：AG-690/11450044，CAS号：24028-78-2 。
应用实例1、MTT法和细胞克隆实验测定MMB对结直肠癌细胞的生长抑制作用
DLD-1细胞、SW480细胞、HCT116细胞（购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库）按 3×103/孔接种至96孔板，应用5% CO2、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI1640完全培养基37 ℃培养12 h，加入不同浓度（分别为6.25 μM、12.5μM、25μM、50 μM、100μM、200μM）的MMB，每个浓度设定5个复孔，继续培养48 h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力。
测定方法为：15 μL/孔加入预先配制好的MTT反应液，继续培养4 h，吸弃上清，100μL/孔加入DMSO 溶解还原产物，490 nm波长处读取吸光度值，计算细胞存活率，以测定MMB干预孔吸光度值/对照孔吸光度值作为细胞活力，并以此计算MMB对结直肠癌DLD-1细胞、SW480细胞、HCT116细胞的IC50值。
IC50指细胞生长被抑制一半时抑制剂的浓度。这里即为结直肠癌DLD-1细胞数量为对照组一半时MMB的浓度。
结果：MMB对结直肠癌DLD-1细胞的IC50值为52.61 μM（见图2 A）。
同样的方法测定MMB对SW480细胞的抑制作用，结果显示其对SW480细胞的IC50值为74.20 μM（图2 B）。
同样的方法测定MMB对HCT116细胞的抑制作用，结果显示其对HCT116细胞的IC50值为59.95 μM（图2 C）。
每孔取500个DLD-1细胞接种于6孔细胞培养，37 ℃、5 % CO2培养箱RPMI 1640完全培养基培养48 h后，梯度药物处理，药物浓度分别为3.125 μM、6.25 μM、12.5 μM、25 μM、50 μM。药物处理48 h后更换正常完全培养基继续培养，空白组长成一定数量肉眼可见的菌落后，吸去培养基，PBS洗涤1次，每孔加入1 ml 4 %多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗涤1次；每孔加入1 %结晶紫染液1 ml，染色10-20 min；PBS洗涤细胞数次，晾干，数码相机拍照，结果显示：MMB能显著抑制DLD-1细胞的增殖（图2 D）。
同样的方法测定MMB对SW480细胞的影响，结果显示：MMB显著抑制SW480细胞的增殖（图2 E）。
同样的方法测定MMB对HCT116细胞的影响，结果显示：MMB显著抑制HCT116细胞的增殖（图2 F）。
应用实例2、MMB显著抑制结直肠癌细胞BALB/C 裸鼠荷瘤生长
测定方法为：以皮下注射方式建立结直肠癌DLD-1细胞BALB/C裸鼠荷瘤模型，随机将裸鼠分为三组，分别为NS组（生理盐水对照组）、5-Fu组（5-氟尿嘧啶组）、MMB干预组按照1mg/kg/3d的剂量，尾静脉注射给予MMB干预治疗25天，每3天给药一次，裸鼠实施安乐死并切取肿瘤组织，确定MMB抑制结直肠癌DLD-1细胞BALB/C裸鼠荷瘤生长的作用。
结果：MMB显著抑制结直肠癌DLD-1细胞BALB/C裸鼠荷瘤生长，抑制率为61.4%（图3）。并且，治疗期间，与生理盐水对照组相比，MMB未显著抑制荷瘤BALB/C裸鼠体重增长，并且未显著影响荷瘤BALB/C裸鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等脏器系数改变（图4）。进一步的，与生理盐水对照组相比，MMB未显著影响健康BALB/C裸鼠体重和心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等脏器系数改变，并且未显著引起心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏等脏器组织形态改变（图5）。
由上述实验结果可以看出：MMB显著抑制结直肠癌肿瘤DLD-1细胞活力，并显著抑制结直肠癌DLD-1细胞BALB/C裸鼠荷瘤生长，并且未表现显著的毒副作用，可用于制备抗结直肠癌药物（图3、4、5）。
应用实例3、MTT法、流式细胞术和Western blot法测定MMB对结直肠癌细胞凋亡无影响
MTT法：参照应用实例1，加药前配置6 ml含Z-VAD-FMK的RPMI 1640培养基，用含有Z-VAD-FMK的培养基加入不同浓度的MMB，每个浓度设定5个复孔，继续培养48 h，弃培养液，MTT试剂测定细胞活力。结果显示：抑制剂Z-VAD-FMK与MMB联合对DLD-1、SW480、HCT116细胞增殖无影响（图6 A）。
流式细胞术：DLD-1细胞按 1×105/孔接种至6孔板，应用5 % CO2、100 U/mL青霉素和100 μg/mL 链霉素的RPMI 1640完全培养基37 ℃培养12 h，加入50 μM的MMB，继续培养48 h，弃培养液，无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤3次，分别加入500μL的Binding Buffer，5 μL（2.5 μg/ml）的 Annexin-V-FITC 和 5 μL（50 μg/ml）PI（碘化丙啶），注意避光，染色15 min后用流式细胞仪测定。采用同样的方法处理并测定SW480、HCT116细胞。Annexin-V-FITC 和 PI的染色结果显示：MMB对DLD-1、SW480、HCT116细胞凋亡无影响（图6 B）。
Western bolt法：制备聚丙烯酰胺凝胶电泳；上样；电泳，转膜恒流300 mA，1.5 h；应用5 %脱脂牛奶封闭PVDF膜摇床孵育1 h；将PVDF膜浸在分别含有兔抗BCL-2抗体、兔抗Caspase3抗体、兔抗Caspase8抗体、兔抗Bax抗体、兔抗PARP-1抗体的杂交袋中，4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10 min；并分别与山羊抗兔的第二抗体室温摇床孵育1 h；TBST洗3次，每次10 min；最后进行蛋白检测。结果显示：MMB对DLD-1、SW480、HCT116细胞凋亡相关蛋白表达水平无影响（图6 C）。
应用实例4、MTT法测定小分子抑制剂Necrostatin（坏死抑制剂）、Ferrostatin（铁死亡抑制剂）对MMB抑制结直肠癌细胞细胞活力的影响
参照应用实例3的MTT法进行铺板，同时分别给予MMB和坏死抑制剂Necrostatin、铁死亡抑制剂Ferrostatin共同干预结直肠癌细胞DLD-1、SW480、HCT116，确定MMB和坏死抑制剂Necrostatin、铁死亡抑制剂Ferrostatin对MMB诱导的结直肠癌细胞活力抑制的影响。
结果显示：Necrostatin与MMB联合应用对DLD-1、SW480、HCT116细胞增殖无显著影响（图7A），Ferrostatin与MMB联合应用对DLD-1、SW480、HCT116细胞增殖无显著影响（图7B）。结论：MMB未主要通过诱导细胞坏死或者铁死亡抑制结直肠癌细胞活力。
应用实例5、流式细胞术和Western blot法测定MMB对结直肠癌细胞细胞周期的影响
参照应用实例3流式细胞术进行铺6孔板、加药继续培养48 h，弃培养液，无EDTA的胰蛋白酶消化并收集细胞于离心管中，PBS洗涤3次，去除上清，加入500 μL冷乙醇固定2小时至过夜，4 ℃保存，染色前用PBS洗去固定液，加入500 μL碘化丙啶染色液，37 ℃避光温浴30 min，上机待测。MMB显著诱导结直肠癌DLD-1、SW480、HCT116细胞周期 G2/M期阻滞（图8 A）。
参照应用实例3 Western bolt法进行蛋白检测，分别检测细胞周期蛋白cyclinB1, cyclin A2, cyclin D1, cyclin E1。结果显示：MMB未显著下调结直肠癌细胞周期蛋白cyclin B1, cyclin A2, cyclin D1, cyclin E1表达（图8 B）。CDK1 Thr14和Tyr15磷酸化将引起细胞周期 G2/M期阻滞，因此我们进一步检测周期蛋白依赖性激酶CDK1表达及其Thr14和Tyr15磷酸化水平。结果显示，MMB未显著下调CDK1表达，但显著诱导CDK1 Thr14和Tyr15磷酸化（图8 C）。
结论：MMB通过诱导CDK1 Thr14和Tyr15磷酸化，引起结直肠癌DLD-1、SW480、HCT116细胞周期 G2/M期阻滞。
应用实例6、Western blot法和流式细胞术测定MMB通过WEE1促进CDK1磷酸化诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞。
参照应用实例3 Western bolt法进行蛋白检测WEE1磷酸化激活水平，其激活将引起CDK1 Thr14和Tyr15磷酸化。结果显示：MMB干预后，与对照组相比，WEE1表达未发生显著变化，WEE1 Ser642磷酸化水平随MMB浓度增大显著升高，这表明MMB诱导的结直肠癌细胞周期G2/M期阻滞可能与 WEE1蛋白磷酸化相关（图9 A）。
MK1775为WEE1特异性抑制剂，应用流式细胞术测定WEE1抑制剂MK1775对MMB诱导的结直肠癌细胞G2/M期阻滞的影响。参照应用实例3加药方式，加MMB和MK1775共处理结直肠癌细胞，参照应用实例5进行染色并应用流式细胞术检测。结果显示：与单独MMB处理结直肠癌细胞相比，MK1775和MMB共干预三种结直肠癌细胞组，G2/M期细胞数量显著减少，细胞通过G2/M期，这表明WEE1抑制剂MK1775显著逆转了MMB诱导的结直肠癌细胞G2/M期阻滞（图9 B）。
参照应用实例3 Western bolt法，分别检测MK1775对MMB处理的结直肠癌细胞WEE1 Ser642磷酸化、CDK1 Thr14和Tyr15 磷酸化水平。结果显示：MK1775显著逆转了MMB诱导的结直肠癌细胞WEE1 Ser642磷酸化、Tyr15 磷酸化水平升高（图9 C）。这表明MMB通过促进WEE1磷酸化激活从而促进CDK1 Tyr15磷酸化诱导结直肠癌细胞周期G2/M期阻滞。
应用实例7、Western blot法测定ATM通过CDC25C促进CDK1磷酸化诱导结直肠癌细胞G2/M期阻滞。
CDK1 Thr14和Tyr15磷酸化还受到CDC25C去磷酸化活性的影响。H2AX是DNA损伤的标志，当DNA受损伤时，H2AX Ser139被磷酸化，激活的H2AX进一步磷酸化ATM Ser1981，磷酸化激活的ATM进一步磷酸化CHK1 Ser345，磷酸化激活的CHK1进一步磷酸化CDC25C Ser216，磷酸化的CDC25C对CDK1 Thr14和Tyr15去磷酸化的作用受到抑制。因此我们参照应用实例3，应用Western bolt法检测H2AX Ser139、ATM Ser1981、CHK1 Ser345、CDC25C Ser216的磷酸化水平。
结果显示：与对照组相比，MMB显著增加了H2AX Ser139、ATM Ser1981、CHK1Ser345、CDC25C Ser216的磷酸化水平（图10）。这表明，MMB诱导的CDK1 Thr14和Tyr15磷酸化介导的结直肠癌细胞周期G2/M期阻滞，与其诱导的DNA损伤介导的ATM-CDC25C通路激活相关。
Claims (6)
1.一种抗结直肠癌药物，其特征在于，该抗结直肠癌药物的活性成分为MMB。
2.MMB在制备抗癌药物中的应用，其特征在于，所述MMB的化学结构如下所示：
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，MMB在制备抗结直肠癌药物中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，MMB抑制结直肠癌DLD-1、SW480、HCT116细胞活力的作用浓度为6.25－200 μM。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，MMB抑制结直肠癌DLD-1细胞BALB/C 裸鼠皮下荷瘤生长的剂量为1 mg/kg/d。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，MMB通过WEE1介导的CDK1磷酸化和CDC25C介导的CDK1去磷酸化诱导结直肠癌细胞DLD-1、SW480、HCT116的G2/M期阻滞。
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