JP2020508668A - ミオミキサーにより促進される筋細胞融合に関連する組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2017年2月24日に出願された米国仮出願番号62/463,365からの優先権の恩典を主張し、その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。
本発明は、National Institutes of Healthにより授与された助成金番号R01AR067294-01の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に関して一定の権利を有している。
1. 分野
本開示は、概して、発生生物学、細胞生物学および分子生物学の分野に関連する。より具体的には、ミオミキサー(Myomixer)タンパク質の筋細胞融合促進活性に関連する。
骨格筋は、ヒトの体重の約40%と見積もられる、体内で最も大きな組織である。骨格筋の形成には、Pax7およびMyoDによる筋細胞運命の決定、その後の筋肉構造および機能を確立する多数の遺伝子の発現から始まる一連のイベントが関与する(Bentzinger et al., 2012; Buckingham et al., 2014)。このプロセスにおいて基礎となる工程は、多核筋原線維を形成する単核筋芽細胞の融合である(Rochlin et al., 2010; Demonbreun et al., 2015; Krauss et al., 2017; Simionescu et al., 2011; Abmayr & Pavlath, 2012)。同様に、損傷に応答して、成体筋肉組織内の筋原性前駆細胞が活性化され、融合し、新しい筋原線維を形成する(Yin et al., 2013; Doles & Olwin, 2015; Brack & Rnado, 2012)。筋芽細胞融合の初期工程の多くは他の融合性の細胞型のそれらと似ているが(Chen & Olson, 2005)、個々の細胞型、例えば筋芽細胞の融合の構成要素および分子的基礎は、十分に定義づけられていない。
したがって、本開示にしたがい、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオミキサーポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換された細胞が提供される。細胞は、ヒト細胞、非筋細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。外因性核酸は、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にあり得る。細胞はさらに、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカー(Myomaker)ポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換され得る。外因性核酸は、細胞の染色体に組み込まれ得る。外因性核酸は、細胞によりエピソーム的に保持され得る。細胞は、検出マーカーおよび/または選択マーカーを発現し得る。細胞は、ミオミキサー以外の関心対象の遺伝子、例えば治療遺伝子またはマーカー遺伝子を発現するよう形質転換され得る。
(a)(i)非筋細胞において外因性のミオミキサータンパク質および
(ii)ミオメーカータンパク質
を発現する非筋細胞を用意する工程、ならびに
(b)非筋細胞を筋肉と接触させる工程
を含み、ミオミキサータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合することになる、方法が提供される。非筋細胞は、ヒト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。工程(b)は、インビトロで実施またはインビボで実施され得る。非筋細胞は、検出マーカーまたは選択マーカーを発現し得る。非筋細胞はさらに、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換され得る。筋細胞は、単離された筋細胞であり得る、インタクトな筋組織内に存在する筋細胞であり得る、および/または筋芽細胞であり得る。
(a)対象由来の非筋細胞を用意する工程、
(b)(i)非筋細胞において外因性のミオミキサーおよびミオメーカータンパク質ならびに
(ii)1つまたは複数の治療遺伝子
を発現する1つまたは複数の発現カセットを、非筋細胞に導入する工程、ならびに
(c)非筋細胞を、遺伝的欠陥を有する筋細胞と接触させる工程
を含み、ミオミキサーおよびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合し、かつ1つまたは複数の治療遺伝子を筋細胞に送達し、それによって遺伝的欠陥を修正することになる、方法が提供される。非筋細胞は、ヒト細胞、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞であり得る。工程(b)および/もしくは(c)は、インビトロもしくはインビボで実施され得る、または工程(b)はインビトロで実施され、工程(c)はインビボで実施され得る。
膜融合は、ウイルス・細胞融合、細胞内小胞融合および細胞・細胞融合を含めて、複数のタイプが存在する(Chen and Olson 2005)。異なる融合メカニズムの間には類似点が存在するが、細胞・細胞融合については、特に細胞内膜に直接結合する融合性タンパク質に関して、他の融合プロセスと比較して判明していることが比較的少ない。
A. ミオメーカー
ミオメーカーと命名された膜貫通タンパク質8c(Tmem8c)は、脊椎動物間で高度に保存されている221残基のほとんど特徴づけられていないタンパク質である。その遺伝子は、ヒト染色体9q34.2に存在する。それは、このタンパク質を通じて均等に分布しているおおよそ20アミノ酸の6つの推定らせん領域を含む。マウスミオメーカーのDNAおよびタンパク質配列は、それぞれ、SEQ ID NO:1および2として提供され、ヒトミオメーカーのDNAおよびタンパク質配列は、それぞれ、SEQ ID NO:3および4として提供される。
マウスミオミキサーは、84アミノ酸長のマイクロペプチドである(図1D)。ミオミキサーのオルトログは、多様な脊椎動物種間で保存されている(図1D)。ミオミキサーの小さなサイズは、それを、100アミノ酸未満の未プロセシングORFにより特徴づけられるマイクロペプチドのカテゴリーに収める(Marquez-Medina et al., 2015)。これに関して、特筆すべきことに、今日までに同定されているマイクロペプチドの大部分が膜に埋め込まれているものである(Anderson et al., 2015; 2016)。マウスミオミキサーのタンパク質およびDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO:5および6に示される。ヒトミオミキサーのタンパク質およびDNA配列は、それぞれ、SEQ ID NO:7および8に示される。
特定の態様において、本開示は、ミオミキサータンパク質分子に関連し得る。本明細書で使用される場合、「タンパク質」または「ポリペプチド」は、概ね、全長タンパク質を表す。これに対して、ペプチドは、通常約3〜約100アミノ酸であるものと定義される。上記の「タンパク質系」の用語はすべて、本明細書で言い換え可能に使用され得る。ヒトミオミキサーポリペプチド配列は、SEQ ID NO:7で提供され、マウスミオミキサーポリペプチド配列は、SEQ ID NO:5で提供される。
本開示の特定の態様において、ミオミキサーおよびミオメーカー由来のまたはそれらをコードする核酸が提供される。特定の局面において、核酸は、これらの遺伝子の野生型または修飾型を含み得る。特定の局面において、核酸は、転写される核酸をコードするまたはそれを含む。他の局面において、核酸は、SEQ ID NO:6もしくは8の核酸セグメント、またはその生物学的に機能的な等価物を含む。特定の局面において、核酸は、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードする。
核酸は、当業者に公知の任意の技術、例えば、化学合成、酵素生産または生物学的生産によって作製され得る。合成核酸(例えば、合成オリゴヌクレオチド)の非限定的な例は、ホスホジエステル、ホスファイトもしくはホスホラミダイト化学および例えば参照により本明細書に組み入れられるEP 266 032に記載される固相技術を用いるインビトロ化学合成により、または各々参照により本明細書に組み入れられるFroehler et al. (1986)および米国特許第5,705,629号に記載されるデオキシヌクレオシドH-ホスホナート中間体を通じて作製された核酸を含む。本開示の方法において、1つまたは複数のオリゴヌクレオチドが使用され得る。様々な異なるメカニズムのオリゴヌクレオチド合成が、例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,659,774号、同第4,816,571号、同第5,141,813号、同第5,264,566号、同第4,959,463号、同第5,428,148号、同第5,554,744号、同第5,574,146号、同第5,602,244号に開示されている。
核酸は、ポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心勾配により、または当業者に公知の任意の他の手段により精製され得る(例えば、参照により本明細書に組み入れられるSambrook et al. 2001を参照のこと)。
特定の態様において、核酸は、核酸セグメントである。本明細書で使用される場合、「核酸セグメント」という用語は、核酸の小フラグメント、例えば、非限定的な例として、ミオミキサーの一部のみをコードするもの、である。したがって、「核酸セグメント」は、ミオミキサー遺伝子の約10ヌクレオチド〜全長の遺伝子配列の任意の部分を含み得る。特定の態様において、核酸セグメントは、プローブまたはプライマーであり得る。本明細書で使用される場合、「プローブ」は、概ね、検出法または組成物において使用される核酸を表す。本明細書で使用される場合、「プライマー」は、概ね、伸長または増幅法または組成物において使用される核酸を表す。
本開示はまた、ミオミキサーをコードする核酸に相補的である核酸を包含する。特定の態様において、本開示は、SEQ ID NO:6または8に示される配列に相補的な核酸または核酸セグメントを包含する。核酸は、標準的なワトソン・クリック型、フーグスティーン型または逆フーグスティーン型結合相補性法則にしたがい別の核酸と塩基対を形成することができる場合、別の核酸の「相補体」であるまたは別の核酸に「相補的」である。本明細書で使用される場合、「別の核酸」は、別個の核酸または同じ核酸の空間的に隔離された配列を表し得る。
特定の態様において、ミオミキサーを発現させるために発現構築物が使用される。発現は、レシピエント細胞においてミオミキサーの発現を誘導する様々な調節要素、例えばウイルスおよび哺乳動物の両方の供給源由来のエンハンサー/プロモーターを含む適切なシグナルがベクター内に提供されることを必要とする。宿主細胞におけるメッセンジャーRNAの安定性および翻訳性を最適化するよう設計された要素もまた定義されている。薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現に関連付ける要素である生産物を発現する恒久的、安定的な細胞クローンの構築のための多くの優性薬物選択マーカーの使用条件も提供される。
本開示は特に、筋肉障害の分析および処置との関連性が見いだされる。特に、筋細胞が正常な機能に必要とされる十分な(または任意の)遺伝子産物を生成できないまたは異常なタンパク質が生成される筋肉障害において、遺伝子またはタンパク質を送達するための体細胞融合の使用が特に望ましい。
筋ジストロフィー(MD)は、筋骨格系が弱体化し、運動が妨げられる筋肉疾患のグループである。筋ジストロフィーは、進行性の骨格筋衰弱、筋タンパク質における欠陥ならびに筋細胞および組織の死により特徴づけられる。
ルー・ゲーリック病と呼ばれることもある筋萎縮性側索硬化症(ALS)は、いつの時点でも20,000人もの米国人に影響を及ぼしており、毎年米国において5,000件の新しい症例が診断されている。ALSは、すべての人種的および民族的背景の人々に影響する。男性は、この疾患を診断される可能性が女性よりも約1.5倍高い。ALSは、人生の最盛期に発症し、40歳〜70歳の間に診断されることが最も一般的である。しかし、それよりも若年および老年で診断される可能性もある。ALS症例の約90〜95%は、無作為に発症し、このことは、個体がこの疾患の家族歴を有さないこと、および他の家族構成員がこの疾患を発症する危険が高いわけではないことを意味する。ALS症例の約5〜10%において、この疾患の家族歴が確認される。
II型糖原病(ポンペ病または酸性マルターゼ欠損症とも呼ばれる)は、体全体の筋肉および神経細胞に損傷を与える常染色体劣性代謝障害である。それは、リソソーム酸性アルファ-グルコシダーゼ酵素の欠損に起因するリソソームにおけるグリコーゲンの蓄積によって引き起こされる。それは、リソソーム代謝の欠陥を伴う唯一の糖原病であり、1932年にドイツ人病理学者J.C.Pompeによって同定された最初の糖原病である。グリコーゲンの蓄積は、全身で進行性筋衰弱(ミオパシー)を引き起こし、特に心臓、骨格筋、肝臓および神経系における様々な身体組織に影響する。
一般的にはRMSと称される横紋筋肉腫は、癌細胞が骨格筋前駆体から発生すると考えられている癌、特に肉腫(結合組織の癌)の一タイプである。それはまた、筋組織に付着した状態、腸に巻き付いた状態、または任意の解剖学的位置で見いだされ得る。大部分は、本来的に骨格筋を欠く領域、例えば頭部、頸部および尿生殖路において起こる。
サルコペニア(「肉付きの不足(poverty of flesh)」を意味するギリシャ語由来)は、加齢に伴う骨格筋量(25歳以降毎年0.5〜1%の喪失)、質および強度の退行性喪失である。サルコペニアは、フレイル症候群の一要素である。2009年の時点で、医学文献において一般的に受け入れられているサルコペニアの定義はなかった。
本開示にしたがい、非筋細胞は、ミオミキサー遺伝子および任意でミオメーカー遺伝子ならびに/または関心対象のさらなる遺伝子、例えば治療遺伝子の遺伝子移入に供される。遺伝子移入法は、一般に、ウイルスおよび非ウイルスの2つの一般カテゴリーに分類される。これらの方法の適性は、対象物の個別の制約、例えば移入される遺伝子のサイズおよび構造、ならびに遺伝物質を送達する細胞のタイプによって決定される。当業者は、一般的に使用されており、その多くは市販されている多数の異なるシステムから適当な選択を行うことができる。以下は、両タイプの方法の一般的議論である。
細胞に効率的に感染または侵入し、ウイルス遺伝子を宿主細胞のゲノムに組み込み安定的に発現させる特定のウイルスベクターの能力は、多くの異なるウイルスベクターシステムの開発および応用を実現した(Robbins et al., 1998)。ウイルスシステムは、現在、エクスビボおよびインビボでの遺伝子移入のためのベクターとして使用するために開発されている。例えば、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レトロウイルスおよびアデノ随伴ウイルスベクターは、現在、癌、嚢胞性線維症、ゴーシェ病、腎臓病および関節炎等の疾患の処置について評価されている(Robbins and Ghivizzani, 1998; Imai et al., 1998; 米国特許第5,670,488号)。以下に記載される様々なウイルスベクターは、具体的な遺伝子療法適用ごとに、個別の利点および不利点を示す。
本開示において使用する細胞または組織の形質転換のための適当な核酸送達方法は、本明細書に記載されるまたは当業者に公知である、核酸(例えば、DNA)を導入することができる実質的に任意の方法を含むと考えられる。そのような方法は、DNAの直接送達、例えば、マイクロ注射(参照により本明細書に組み入れられる、Harland and Weintraub, 1985;米国特許第5,789,215号)を含む、注射によるもの(各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,994,624号、同第5,981,274号、同第5,945,100号、同第5,780,448号、同第5,736,524号、同第5,702,932号、同第5,656,610号、同第5,589,466号および同第5,580,859号);エレクトロポレーションによるもの(参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,384,215号);リン酸カルシウム沈降によるもの(Graham and Van Der Eb, 1973;Chen and Okayama, 1987;Rippe et al., 1990);DEAE-デキストランの後にポリエチレングリコールを用いるもの(Gopal, 1985);直接超音波ローディングによるもの(Fechheimer et al., 1987);リポソーム媒介トランスフェクションによるもの(Nicolau and Sene, 1982;Fraley et al., 1979;Nicolau et al., 1987;Wong et al., 1980;Kaneda et al., 1989;Kato et al, 1991);微粒子射出によるもの(各々参照により本明細書に組み入れられる、PCT出願番号WO 94/09699および95/06128;米国特許第5,610,042号、同第5,322,783号、同第5,563,055号、同第5,550,318号、同第5,538,877号および同第5,538,880号)、炭化ケイ素繊維を用いた撹拌によるもの(各々参照により本明細書に組み入れられる、Kaeppler et al., 1990;米国特許第5,302,523号および同第5,464,765号);またはPEGを通じたプロトプラストの形質転換によるもの(各々参照により本明細書に組み入れられる、Omirulleh et al., 1993;米国特許第4,684,611号および同第4,952,500号);乾燥/阻害を通じたDNA取り込みによるもの(Potrykus et al., 1985)を含むがこれらに限定されない。これらのような技術の適用を通じて、オルガネラ、細胞、組織または生物は、安定的または一過的に形質転換され得る。
非筋レシピエント細胞は、実質的に任意の細胞型であり得るが、特に、線維芽細胞(皮膚、毛髪等に豊富)または赤血球細胞(循環および筋肉との接触の点で理想的)であり得る。骨髄の細胞および脂肪幹細胞もまた、これらの細胞も非常に豊富であるという理由で、想定されている。さらに、筋前駆細胞も、筋肉に融合する「通常の」細胞型であることから、使用され得る。
本開示は、治療遺伝子を筋組織に送達するためにミオミキサー(およびミオメーカー)を発現する非筋細胞を用いる筋疾患の処置を想定している。これは、本発明者らの知る限り、非筋細胞キャリアを用いて筋特異的細胞融合を誘導する技術を実用可能とした最初の例である。
DMDおよび他の遺伝的欠陥を修復するためのCRISPR/Cas9システムの使用は、本開示において特に関心対象となる。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)は、短い反復塩基配列を含むDNA座である。各反復の後に、過去のウイルスへの暴露に由来する短い「スペーサーDNA」セグメントが続く。CRISPRは、配列決定された真正細菌ゲノムのおよそ40%および配列決定された古細菌の90%で見いだされている。CRISPRは、多くの場合、CRISPRに関連するタンパク質をコードするcas遺伝子を伴う。CRISPR/Casシステムは、外来遺伝子要素、例えばプラスミドおよびファージに対する耐性を付与し、後天性免疫の形態を提供する原核生物免疫系である。CRISPRスペーサーは、真核生物におけるRNAiのように、これらの外来遺伝子要素を認識し抑制する。
本開示の細胞はまた、1つまたは複数の他の「標準的」治療と組み合わせて使用され得る。組み合わせて提供される場合、これらの組成物は通常、1つまたは複数の疾患パラメータの減少を達成するのに効果的な併用量で投与される。このプロセスは、対象を、例えば両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的配合物を用いて、または対象を2つの別個の組成物または配合物と同時に接触させることによって、両方の薬剤/治療と同時に接触させることを含み得る。あるいは、数分から数週間の範囲の間隔をあけて、1つの処置が他の処置の前に行われ得るまたは1つの処置の後に他の処置が行われ得る。通常、その治療が細胞/対象に対して依然として有利な併用効果を達成することができるように、各送達間で相当な期間が経過しないことが確実にされる。そのような例において、細胞は、相互から約12〜24時間以内に、相互から約6〜12時間以内に、または約12時間のみの時間的遅延で、両方の様式と接触することが想定される。いくつかの状況において、数日(2、3、4、5、6または7)〜数週間(1、2、3、4、5、6、7または8)が各々の投与の間であけられる場合であるが、処置の時間を有意に延長することが望ましいことがある。いずれかの治療の2回以上の実施が望ましいことも想定される。
治療適用が企図される場合、意図される適用に適した形態で薬学的組成物を調製することが必要である。一般に、これは、発熱物質、およびヒトまたは動物に対して有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを伴う。
本明細書に記載される用途での使用に関して、キットも本開示の範囲に含まれる。そのようなキットは、1つまたは複数の容器、例えばバイアル、チューブ等を収容するよう区画化されたキャリア、パッケージまたは容器を含み得、この方法で使用される個別の要素、特にミオミキサー発現構築物またはそれを含む形質転換細胞の1つを含む各々の容器が、任意で、ミオメーカー発現構築物またはそれを含む形質転換細胞をさらに含む。本開示のキットは、典型的に、上記の容器ならびに、緩衝液、希釈剤、フィルター、針、注射器および使用説明書を含むパッケージ同封物を含む、商業的末端利用者の観点から望ましい材料を含む1つまたは複数の他の容器を含む。加えて、その組成物が特定の治療用途で使用されることを示すラベルが、容器上に提供され得、インビボまたはインビトロ利用のいずれかのための手引き、例えば上記のようなもの、も示し得る。手引およびまたは他の情報はまた、キットと共に含まれる同封物に含まれ得る。
以下の実施例は、本開示の様々な局面をさらに説明するために含まれる。以下の実施例に開示される技術は、本開示を実施する際に十分機能することが本発明者らによって発見された技術および/または組成物であり、したがってその実施に関する好ましい様式を構成するものとみなされ得ることが当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている個々の態様において多くの変更が加えられ得、そしてそれでもなお同様または類似の結果が得られ得ることを理解すべきである。
レンチウイルスライブラリの作製およびC2C12細胞の感染。マウスGeCKOv2 CRISPRノックアウト収集ライブラリは、Feng Zhang氏からの寄贈物であった(Addgeneプラスミド#1000000052)(Sanjana et al., 2014)。ライブラリレンチウイルス生産のために、1.8 x 107個のLenti-X 293T細胞(Clontech、カタログ番号632180)を、25 mlの(1%ペニシリン/ストレプトマイシン、10% FBSを含有する)DMEM中、15 cm組織培養プレート上にプレーティングした。12時間後、16.9μgのpsPAX2プラスミド、5.6μgのpMD2.Gプラスミドおよび22.5μgのGeCKOプラスミドライブラリと共にFuGENE6(Promega、#E2692)を用いてトランスフェクトを行った。2日後、レンチウイルス含有上清を、0.45μmフィルターを通じて濾過し、Lenti-X Concentrator(Clontech、PT4421-2)を製造元のプロトコルにしたがい用いて濃縮した。psPAX2ベクターは、Didier Trono氏からの寄贈物であった(Addgeneプラスミド#12260)。pMD2.Gベクターは、Didier Trono氏からの寄贈物であった(Addgeneプラスミド#12259)。新たに作製されたレンチウイルスの一部を使用して、その力価を測定した。簡単に説明すると、C2C12細胞を異なる量のウイルスストックに2日間感染させ、その後にさらに2日間のピューロマイシン選択(2μg/ml)を行った。細胞生存率を測定し、感染率として参照した。このウイルス力価に基づき、調節された量のウイルスストックを使用して、大部分の細胞が2個未満のレンチウイルス粒子を取り込むよう0.2の標的MOIでC2C12細胞に感染させた。感染から2日後、ピューロマイシン(Invitrogen)を終濃度2μg/mlで添加し、感染細胞を2日間選択した。選択後、細胞を(1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含有する)DMEM中2%ウマ血清に移し替え、分化第3日に新鮮な培地を交換しつつ1週間分化させた。分化後、37℃で(PBS中に希釈した)0.00625%トリプシンと共に5分間インキュベートすることによって筋管をプレートから剥離させ、プレートをPBSで穏やかに2回洗浄し、そこから剥離させた細胞を混合し、300 x gで5分間遠心分離した。ついで筋管を、0.25%トリプシンを用いて剥離させ、PBSで2回洗浄してすべての細胞を収集し、これを300 x gで5分間沈降させた。
を、Feng Zhang氏からの寄贈物であるlenti-CRISPR v2ベクター(Addgeneプラスミド#52961)に個別にクローニングした(Sanjana et al., 2014)。ミオミキサーCRISPR-sgRNAおよび対照(空のlenti-CRISPR v2)レンチウイルスを作製し、これを用いてC2C12または初代筋芽細胞に感染させ、その後にレンチウイルスCRISPRライブラリに対して実施したのと同様の手順でピューロマイシン選択を行った。選択後、細胞を1週間分化培地に移し替え、その後に免疫染色、RNA、タンパク質およびゲノムDNA抽出および分析を行った。これらの細胞におけるミオミキサーのターゲティングを検証するため、ターゲティング領域を増幅するプライマー
PCR産物のサイズは、非標的細胞の場合、743 bpであった)を用いてゲノムDNAを増幅した。PCR産物をゲル精製し、pCRII Topoベクター(ThermoFisher、K460001)にクローニングし、配列決定した。
。2ΔΔCt法を使用して、18S rRNA発現に対して正規化された遺伝子発現における相対変化を分析した。
、野生型マウスの場合、PCR産物のサイズは743 bpである)を用いる遺伝子タイピングのために使用した。
筋形成の新しい調節因子を同定するため、本発明者らは、図5Aに図示されているように、マウスC2C12筋細胞の分化および融合に必要とされる遺伝子についてのゲノムワイドCRISPR機能喪失スクリーンを行った。簡単に説明すると、彼らは、CRISPR遺伝子編集のための130,209個のシングルガイド(sg)RNAのプールおよびCas9を含むレンチウイルスライブラリを用いて6000万個のC2C12筋芽細胞に感染させた(Sanajan et al., 2014)。レンチウイルス感染は、ライブラリの460倍提示となる感染多重度で行った。2日間のピューロマイシン選択の後、筋管形成を促進するため、筋芽細胞培養物を、1週間、分化培地(DM)に移し替えた。この培養物を、低トリプシン(0.00625%)への短い暴露に供し、皿に付着した単核筋芽細胞を残しつつ筋管の剥離を促進した。その後の0.25%トリプシン処理により、筋芽細胞を放出させた。筋管および筋芽細胞集団の分離のための対照として、本発明者らは、筋管集団に非常に豊富に存在するミオシン重鎖をウェスタンブロット分析によって検出した(図5B)。
以下の参考文献は、それらが例示的な手法または本明細書に示されるそれらを補助するその他の詳細を提供する程度まで、個別に参照により本明細書に組み入れられる。
Claims (87)
- 細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオミキサー(Myomixer)ポリペプチドをコードする外因性核酸で形質転換された細胞。
- ヒト細胞である、請求項1記載の細胞。
- 非筋細胞である、請求項1記載の細胞。
- 線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項1記載の細胞。
- 外因性核酸が、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、請求項1記載の細胞。
- 細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカー(Myomaker)ポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換されている、請求項1記載の細胞。
- 外因性核酸が、前記細胞の染色体に組み込まれている、請求項1記載の細胞。
- 外因性核酸が、前記細胞によりエピソーム的に保持されている、請求項1記載の細胞。
- 検出マーカーおよび/または選択マーカーを発現する、請求項1記載の細胞。
- ミオミキサー以外の関心対象の遺伝子を発現するよう形質転換されている、請求項1記載の細胞。
- 細胞内で活性なプロモーターの制御下にある外因性ミオミキサータンパク質をコードする核酸を、非筋細胞に移入する工程を含む、非筋細胞融合パートナーを調製する方法。
- 前記細胞が安定的に形質転換される、請求項11記載の方法。
- 前記細胞が一過的にトランスフェクトされる、請求項11記載の方法。
- 検出マーカーをコードする核酸または検出マーカーを生成するのに十分な核酸を前記細胞に移入する工程をさらに含む、請求項11記載の方法。
- 外因性核酸が、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、請求項11記載の方法。
- 前記細胞が、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換される、請求項11記載の方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項11記載の方法。
- 前記細胞が線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項11記載の方法。
- 外因性核酸が、選択マーカーをさらにコードする、請求項11記載の方法。
- 前記細胞が、ミオミキサー以外の関心対象の遺伝子を発現するよう形質転換される、請求項11記載の方法。
- (a)(i)非筋細胞において外因性のミオミキサータンパク質および
(ii)ミオメーカータンパク質
を発現する非筋細胞を用意する工程、ならびに
(b)非筋細胞を筋肉と接触させる工程
を含む、非筋細胞を筋細胞に融合する方法であって、
ミオミキサータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合することになる、
前記方法。 - 非筋細胞がヒト細胞である、請求項21記載の方法。
- 非筋細胞が線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項21記載の方法。
- 工程(b)がインビトロで実施される、請求項21記載の方法。
- 工程(b)がインビボで実施される、請求項21記載の方法。
- 非筋細胞が、検出マーカーまたは選択マーカーを発現する、請求項21記載の方法。
- 非筋細胞が、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換される、請求項21記載の方法。
- 筋細胞が、単離された筋細胞である、請求項24記載の方法。
- 筋細胞が、インタクトな筋組織内に存在する、請求項21記載の方法。
- 筋細胞が、筋芽細胞である、請求項21記載の方法。
- (a)外因性ミオミキサータンパク質およびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞を用意する工程であって、非筋細胞が、関心対象の遺伝子をさらに含む、工程、ならびに
(b)非筋細胞を筋細胞と接触させる工程
を含む、関心対象の遺伝子を筋細胞に送達する方法であって、
ミオミキサーおよびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合し、かつ前記関心対象の遺伝子を筋細胞に送達することになる、
前記方法。 - 非筋細胞が、ヒト細胞である、請求項31記載の方法。
- 非筋細胞が、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項31記載の方法。
- 工程(b)が、インビトロで実施される、請求項31記載の方法。
- 工程(b)が、インビボで実施される、請求項31記載の方法。
- 非筋細胞が、検出マーカーまたは選択マーカーを発現する、請求項31記載の方法。
- 非筋細胞が、細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸でさらに形質転換される、請求項31記載の方法。
- 筋細胞が、単離された筋細胞である、請求項34記載の方法。
- 筋細胞が、インタクトな筋組織内に存在する、請求項31記載の方法。
- 筋細胞が病的表現型を示し、かつ前記関心対象の遺伝子がその遺伝子型を修正する、請求項31記載の方法。
- 病的表現型が、正常遺伝子産物の低発現または非存在である、請求項40記載の方法。
- 病的表現型が、欠陥遺伝子産物の発現である、請求項40記載の方法。
- 筋細胞が、先天性ミオパシー、サルコペニア、筋萎縮性側索硬化症、筋ジストロフィー、ポンペ病、または横紋筋肉腫に関連する病的表現型を有する、請求項40記載の方法。
- 非筋細胞が、対象内の、筋肉を含む罹患した筋組織に送達される、請求項40記載の方法。
- 送達が、筋肉内注射によって行われる、請求項44記載の方法。
- 送達が、少なくとも1回繰り返される、請求項44記載の方法。
- 前記対象に二次療法が施される、請求項44記載の方法。
- 非筋細胞が、エクスビボで筋細胞に送達され、その後、対象に移植される、請求項40記載の方法。
- 筋細胞が、インタクトな筋組織内に含まれる、請求項48記載の方法。
- 筋細胞が、筋芽細胞である、請求項31記載の方法。
- 真核生物細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオミキサーポリペプチドをコードする外因性核酸を含む、発現カセット。
- 外因性核酸が、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターの制御下にある、請求項51記載の発現カセット。
- 真核生物細胞内で活性なプロモーターの制御下にあるミオメーカーポリペプチドをコードする外因性核酸をさらに含む、請求項51記載の発現カセット。
- 検出マーカーおよび/または選択マーカーをコードする、請求項51記載の発現カセット。
- ミオミキサーまたはミオメーカー以外の関心対象の遺伝子をコードする外因性核酸を含む、請求項51または53記載の発現カセット。
- 複製可能ベクター内に含まれる、請求項51記載の発現カセット。
- 複製可能ベクターが、ウイルスベクターである、請求項56記載の発現カセット。
- ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項57記載の発現カセット。
- 複製可能ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項56記載の発現カセット。
- 非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子中に配合されている、請求項59記載の発現カセット。
- (a)対象由来の非筋細胞を用意する工程、
(b)(i)非筋細胞において外因性のミオミキサーおよびミオメーカータンパク質ならびに
(ii)1つまたは複数の治療遺伝子
を発現する1つまたは複数の発現カセットを、非筋細胞に導入する工程、ならびに
(c)非筋細胞を、遺伝的欠陥を有する筋細胞と接触させる工程
を含む、対象における細胞内の遺伝的欠陥を修正する方法であって、
ミオミキサーおよびミオメーカータンパク質を発現する非筋細胞が、筋細胞と融合し、かつ1つまたは複数の治療遺伝子を筋細胞に送達し、それによって遺伝的欠陥を修正することになる、
前記方法。 - 非筋細胞が、ヒト細胞である、請求項61記載の方法。
- 非筋細胞が、線維芽細胞、骨髄細胞、または血液細胞である、請求項61記載の方法。
- 工程(b)および/または(c)が、インビトロまたはインビボで実施される、請求項61記載の方法。
- 工程(b)がインビトロで実施され、かつ工程(c)がインビボで実施される、請求項61記載の方法。
- 非筋細胞が、検出マーカーまたは選択マーカーを発現する、請求項61記載の方法。
- 1つまたは複数の治療遺伝子が、Cas9と、少なくとも1つの治療sgRNAとを含む、請求項61記載の方法。
- 筋細胞が、単離された筋細胞である、請求項61記載の方法。
- 筋細胞が、インタクトな筋組織内に存在する、請求項65記載の方法。
- 遺伝的欠陥が、デュシェンヌ型筋ジストロフィー変異である、請求項61記載の方法。
- 遺伝的欠陥が、先天性ミオパシーである、請求項61記載の方法。
- 遺伝的欠陥が、ポンペ病である、請求項61記載の方法。
- 遺伝的欠陥が、筋萎縮性側索硬化症である、請求項61記載の方法。
- 非筋細胞が、対象内の、筋肉を含む罹患した筋組織に送達される、請求項65記載の方法。
- 送達が、筋肉内注射によって行われる、請求項74記載の方法。
- 送達が、少なくとも1回繰り返される、請求項74記載の方法。
- 前記対象に二次療法が施される、請求項74記載の方法。
- 非筋細胞が、エクスビボで筋細胞と接触し、その後、対象に移植される、請求項65記載の方法。
- 筋細胞が、インタクトな筋組織に含まれる、請求項65記載の方法。
- 筋細胞が、筋芽細胞である、請求項61記載の方法。
- 1つまたは複数の発現カセットが、構成性プロモーターまたは誘導性プロモーターを含む、請求項61記載の方法。
- 1つまたは複数の発現カセットが、検出マーカーおよび/または選択マーカーをコードする、請求項61記載の方法。
- 発現カセットが、複製可能ベクター内に含まれる、請求項61記載の方法。
- 複製可能ベクターが、ウイルスベクターである、請求項83記載の方法。
- ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルスベクターである、請求項84記載の方法。
- 複製可能ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項83記載の方法。
- 非ウイルスベクターが、リポソームまたはナノ粒子中に配合されている、請求項86記載の方法。
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