CN115885043A

CN115885043A - 用于dwarf开放阅读框的腺相关病毒载体

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Publication number: CN115885043A
Application number: CN202180048248.3A
Authority: CN
Inventors: 埃里克·N·奥尔森; 朗达·S·巴塞尔-达比; 本杰明·R·纳尔逊; 凯瑟琳·A·马卡雷维什
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2023-03-31
Also published as: AU2021306697A1; MX2023000318A; BR112022026997A2; WO2022010834A1; EP4179083A4; EP4179083A1; KR20230035584A; US20230241249A1; JP2023534647A; CA3183844A1; IL299638A

Abstract

公开了用有效量的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体来治疗对象(例如患有心肌病或处于心肌病之风险中的那些)的方法，所述rAAV病毒体包含AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的编码DWORF多肽的多核苷酸。还公开了与其相关的组合物和药盒。

Description

用于DWARF开放阅读框的腺相关病毒载体

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年7月7日提交的美国临时申请No.63/048,743的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。

关于联邦政府资助的研究和开发的声明

本发明是在国立卫生研究院(National Institutes of Health，NIH)的HL141630、HL130253、HL138426、HD087351和AR067294下在政府支持下完成的。政府享有本发明的某些权利。

参考序列表

本申请通过EFS-Web电子提交并且包括.txt格式的电子提交的序列表。该.txt文件包含标题为“UTFDP3586WO_ST25.txt”的序列表，其创建于2021年6月24日且大小为17千字节。该.txt文件中包含的序列表是说明书的一部分并通过引用整体并入本文。

技术领域

本公开内容涉及用于在对象中治疗或预防心脏病(例如，心肌病)的组合物和方法。特别地，本公开内容涉及用于治疗心脏病(例如，心肌病)的包含与治疗性基因产物可操作性连接的心脏特异性启动子的载体。

背景技术

心肌病导致约一半的心脏相关死亡。据估计，约1/250至1/10,000的成年人受某种形式的心肌病的影响(McKenna et al.Circ Res.121:722-730(2017))。尽管在筛查、诊断和治疗策略方面做出了重大努力，但心肌病的患病率和心肌病相关死亡的发生率仍然很高(Brieler Am Fam Physician.96:640-646(2017))。

心肌病是指当心脏的泵血能力降低时发生的一系列心脏病症。心脏肌肉正常功能的降低例如收缩功能障碍可导致心肌梗死、心力衰竭、血凝块、瓣膜问题和心脏骤停。心肌病可分为原发性和继发性类别，从而导致不同的表型(McKenna et al.Circ Res.121:722-730(2017))。原发性心肌病可以是遗传性的、获得性的或混合病因学的。遗传性心肌病是遗传性的并且包括致心律失常性右心室发育不良、肥厚性离子通道病症、左心室紧缩和线粒体肌病。获得性心肌病主要由导致心脏并发症的非继发性、非遗传原因引起的，并且包括心肌炎，围产期、心动过速诱发的心肌病和应激诱发的心肌病。具有混合病因学的心肌病是由非遗传和遗传因素的组合引起的，并且包括扩张型心肌病和限制型心肌病。继发性心肌病是指由心血管外原因引起的心脏病。继发性心肌病的根本原因可以是内分泌性的、感染、暴露于毒素、自身免疫相关的、营养的和/或神经肌肉性的。

心肌细胞在心肌病病理学中起着核心作用。心肌细胞(cardiomyocyte)，也称为心脏肌肉细胞、心脏肌细胞或心肌细胞(myocardiocyte)，是构成心脏肌肉的心脏细胞并负责使心脏作为泵发挥作用的收缩功能。具有降低心肌细胞的能力以正常发挥功能的许多机制(Dadson et al.Clin Sci(Lond)131:1375-1392(2017))。在致心律失常性右心室心肌病中，心肌细胞逐渐被纤维化组织替代，导致心肌细胞的电隔离和心室心肌的萎缩，所述心室心肌是负责心脏收缩功能的主要结构。在线粒体心肌病中，ATP产生不足对具有高代谢需求的心肌细胞的收缩功能具有直接影响。由于调节酶(例如肌浆网/内质网钙ATP酶(sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase，SERCA))的活性丧失，由正常Ca²⁺离子释放、摄取和隔离过程丧失造成的收缩功能异常也导致出现心肌病(Lennon et al.Int J MolMed.7:131-41(2001))。

需要用于心肌病的治疗策略。靶向控制心脏细胞的异常收缩功能的机制是有效的方法。

发明概述

在一个方面中，本公开内容提供了在有此需要的对象中治疗心力衰竭的方法，所述方法包括施用有效量的重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)病毒体(virion)，所述rAAV病毒体包含AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的编码DWarf开放阅读框(DWarf Open Reading Frame，DWORF)多肽的多核苷酸。

在一些实施方案中，所述对象患有心肌病或处于肌病之风险中。在一个实施方案中，所述心肌病是扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)。在一些实施方案中，对象患有心肌梗死或处于患有心肌梗死之风险中。在一个实施方案中，所述心肌梗死是慢性心肌梗死。在一个实施方案中，所述心肌梗死是急性心肌梗死。

在一些实施方案中，所述rAAV病毒体通过静脉内或冠状动脉内注射来施用。在一些实施方案中，所述rAAV转导心脏细胞。在一些实施方案中，所述rAAV转导心肌细胞。

在一些实施方案中，rAAV转导提高对象心脏中的DWORF多肽表达。

在一些实施方案中，所述rAAV转导增强SERCA活性。

在一些实施方案中，所述rAAV病毒体是血清型AAV9的rAAV病毒体。在一些实施方案中，所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少98％同一性的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少99％同一性的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV衣壳包含含有SEQ ID NO:14的多肽序列的衣壳蛋白。

在一些实施方案中，所述启动子是鸡心脏肌钙蛋白-T(cardiac troponin-T，cTnT)启动子。在一些实施方案中，所述鸡cTnT启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述鸡cTnT启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述鸡cTnT启动子包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，DWORF多肽是小鼠DWORF多肽。在一些实施方案中，所述DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少98％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述DWORF多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多肽序列。

在一些实施方案中，所述表达盒的侧翼是AAV反向末端重复(inverted terminalrepeat，ITR)。在一些实施方案中，所述ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述ITR包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，所述对象在施用之后经历与MCD相关的症状改善。在一些实施方案中，所述症状改善是以下中的一种或更多种：收缩能力(contractility)增强；疲劳减轻；呼吸困难减轻；水肿减轻；胸痛减轻；心律失常减轻；血凝块减少；心脏瓣膜功能改善；以及心脏杂音减少。

在一个方面中，本公开内容提供了可药用载体和重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，所述rAAV病毒体包含AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的编码DWORF多肽的多核苷酸。

在一个实施方案中，所述rAAV病毒体是血清型AAV9的rAAV病毒体。在一些实施方案中，所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少98％同一性的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少99％同一性的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV衣壳包含含有SEQ ID NO:14的多肽序列的衣壳蛋白。

在一些实施方案中，所述启动子是心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子。在一些实施方案中，所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，DWORF多肽是DWORF多肽。在一些实施方案中，所述DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少98％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，所述DWORF多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多肽序列。

在一些实施方案中，所述表达盒的侧翼是AAV反向末端重复(ITR)。在一些实施方案中，所述ITR是AAV2 ITR。在一些实施方案中，所述ITR包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的多核苷酸序列。

在另一个方面中，本公开内容提供了药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体和可药用载体。在一些实施方案中，所述组合物包含约5×10¹³个病毒体。

在另一个方面中，本公开内容提供了药盒，其包含容纳本文中所述的药物组合物的容器。

从以下详细描述中，本发明的另一些方面和实施方案将变得明显。

附图简述

以下附图构成本说明书的一部分并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参照这些附图中的一幅或更多幅并结合本文中所示的具体实施方案的详细描述，可更好地理解本公开内容。

图1示出了表达盒的说明性实施方案的图，所述表达盒包含编码cTnT启动子和DWORF多肽的多核苷酸，侧翼是AAV反向末端重复。

图2A示出了来自在AAV递送之后4周经AAV-tdTomato或AAV-DWORF处理小鼠的组织裂解物的western印迹分析。使用针对红色荧光蛋白(red fluorescent protein，RFP)的抗体评估tdTomato表达。Quad，股四头肌(quadriceps)；GP，腓肠肌跖肌(gastrocnemiusplantaris)。

图2B示出了8周龄小鼠的心脏功能和尺寸的超声心动图分析。在收缩期(s)和舒张期(d)期间测量左心室内径(left ventricular internal diameter，LVID)。数据表示为n＝8至12只小鼠的平均值±SD。相对于MLP KO/AAV-tdTomato的P-值**p<0.01或***p<0.005。

图2C示出了来自具有指定基因型和处理的小鼠的组织学切片的代表性苏木精和伊红(hematoxylin and eosin，H&E)染色。

图2D示出了来自在手术之后12周用AAV-tdTomato或AAV-DWORF处理的假手术(sham)小鼠或MI小鼠的心脏裂解物的Western印迹分析。

图2E示出了在基线(0周)以及假手术或MI手术之后1、2、4、8和12周时通过超声心动图评估的心脏功能和尺寸。数据表示为n＝4只假手术小鼠或n＝6至8只MI小鼠的平均值±SD。相对于MI/AAV-tdTomato的P-值*p<0.05，**p<0.01或***p<0.005。

图2F示出了对来自假手术或MI手术之后12周的小鼠的连续心脏切片的Masson三色染色。如所指示的用AAV-tdTomato或AAV-DWORF处理小鼠。以0.5μm的增量获取切片。

发明详述

综述

钙处理异常是心肌病的普遍特征，并且肌浆网/内质网钙ATP酶(SERCA)活性降低在疾病的开始和进展二者中起着核心作用。SERCA是促进心脏细胞(例如心肌细胞)中Ca²⁺离子的摄取、维持和循环的钙泵。SERCA活性受抑制性肽受磷蛋白(phospholamban)的调节。人们对通过提高称为DWarf开放阅读框(DWORF)的多肽的丰度来提高SERCA的活性非常感兴趣，所述多肽通过其直接置换SERCA抑制性肽受磷蛋白来增强SERCA活性。使SERCA与DWORF接触是提高细胞中SERCA活性的策略。

本公开内容提供了包含编码DWORF多肽或其功能性变体的多核苷酸的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，及其使用方法。在一些实施方案中，本文中所述的rAAV病毒体可例如在具有编码与心脏细胞特异性启动子区域有效连接的DWORF多肽的序列的多核苷酸下将心脏细胞转导至宿主细胞基因组中。在一些实施方案中，所靶向的心脏细胞表达DWORF多肽并且可具有提高的SERCA活性。本公开内容中还提供了包含本文中所述的rAAV病毒体的药物组合物。在一方面中，本公开内容提供了使用本公开内容的rAAV病毒体和药物组合物用于治疗诊断为患有心肌病或处于心肌病之风险中的对象的方法。

表达盒

本公开内容的rAAV病毒体可包含表达盒(图1)。表达盒可包含任选地与启动子、任选的多腺苷酸化信号和任选的转录终止信号有效连接的编码DWORF多肽或其功能性变体的多核苷酸。表达盒的侧翼可以是反向末端重复(ITR)。这些组分提供了在宿主细胞被rAAV病毒体靶向之后表达转基因的功能。当存在时，启动子序列控制编码DWORF多肽或其功能性变体的多核苷酸的表达。启动子可以是细胞类型特异性的。组成型启动子用于表达盒并且可以是例如与鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)、猿猴病毒40(simian virus 40，SV40)启动子和单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，HSV-TK)启动子融合的巨细胞病毒增强子(Damdindorj et al.PLoS One.9:e106472(2014))。也可使用其他细胞类型特异性启动子。心脏细胞特异性启动子可以是例如MLC2v启动子(Phillips etal.Hypertension 39:651-5(2002))和心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子(Konkalmatt etal.Circ Cardiovasc Imaging.6:478–486(2013))。表达盒中的转基因多核苷酸序列可以是例如编码蛋白质的开放阅读框。表达盒中的ITR用作标志物用于表达盒的病毒包装(Clark et al.Hum Gene Ther.6:1329-41(1995))。

在一些实施方案中，表达盒与SEQ ID NO:16具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性。

表1.表达盒序列

在一些实施方案中，本公开内容的表达盒包含编码DWORF多肽的多核苷酸序列。在一些实施方案中，表达盒提供了心脏细胞中提高的DWORF多肽表达。在一些实施方案中，心脏细胞是心肌细胞。在一些实施方案中，与未治疗对象中DWORF多肽因子的表达相比，DWORF多肽的表达可提高5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，与未治疗对象中DWORF多肽的表达相比，DWORF多肽的表达可提高1倍、2倍、3倍、4倍或5倍。在一些实施方案中，DWORF多肽可在心脏细胞中以任何可检测的水平表达，而在未治疗的对象中，DWORF多肽可以不表达或以检测不到的水平表达。换句话说，施用了rAAV病毒体的心脏可比仅具有DWORF多肽的内源性(即天然)表达的心脏细胞以更高的丰度表达DWORF多肽。

DWORF多肽是SERCA钙泵活性的内源性增强剂，是用于调节心肌收缩能力的期望的药物靶标。DWORF也是一种异常小的蛋白质，这使其成为用于通过rAAV病毒体递送至靶细胞或组织的良好候选物。由于DWORF是内源性蛋白质，因此DWORF在人中的表达将不会产生免疫原性，允许长期给药和表达。DWORF多肽的结构特征如下。首先，该多肽可具有DWarf开放阅读框(DWORF)的5至35个连续残基，位于哺乳动物物种(包括小鼠和人)的3号染色体上(Nelson et al.Science.351:271–275(2016)；美国专利No.10,570,183)。因此，即使在包括术语“包含”时，术语“具有不超过X个连续残基的肽”也不能被理解为包含更多数目的连续残基。一般而言，肽将为35个残基或更少，同样包含不超过DWORF的20个连续残基。总长度可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35个残基。预期了肽长度的范围为5至34/35个残基、6至34/35个残基、7至50个残基、7至25个残基、5至20个残基、6至20个残基、7至20个残基和7至15个残基。连续DWORF残基的数目可以是5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个。预期了连续残基的范围为5至20个残基、5至20个残基、6至20个残基、7至20个残基和5至15个残基、5至15个残基、6至15个残基或7至15个残基。

在一些实施方案中，DWORF多肽是人DWORF多肽。在一些实施方案中，DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少98％同一性的多肽序列。在一些实施方案中，DWORF多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多肽序列。

表2：DWORF序列

在一些实施方案中，本公开内容的表达盒包含启动子。本文中使用的术语“启动子”是指指导RNA聚合酶结合并由此促进RNA合成的DNA序列，即足以指导转录的最小序列。启动子和相应的蛋白质或多肽表达可以是普遍存在的，这意味着在广泛的细胞、组织和物种中具有强烈的活性或者是细胞类型特异性、组织特异性或物种特异性的。启动子可以是“组成型的”，这意指是持续活跃的，或“诱导型的”，这意指该启动子可由于生物或非生物因素的存在或不存在而活化或失活。本发明的核酸构建体或载体中还包含可以或可以不与启动子序列相邻的增强子序列。增强子序列影响依赖于启动子的基因表达并且可位于天然基因的5’或3’区域。

可使用多种启动子。有利地，启动子任选地与增强子结合，在靶细胞中表达编码DWORF多肽或其功能性变体的多核苷酸。在一些实施方案中，表达盒包含细胞类型特异性启动子。在一些实施方案中，启动子特异性地促进心脏细胞中编码DWORF多肽或其功能性变体的多核苷酸的表达。在一些实施方案中，启动子特异性地促进心肌细胞中编码DWORF多肽或其功能性变体的多核苷酸的表达。

在一些实施方案中，启动子是鸡心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子。在一些实施方案中，鸡cTnT启动子包含与鸡cTnT启动子(SEQ ID NO:11)具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。

表3.鸡cTnT启动子序列

在一些实施方案中，表达盒的侧翼是AAV2反向末端重复(ITR)。在一些实施方案中，ITR包含与SEQ ID NO:12和/或SEQ ID NO:13具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。

表4：ITR序列

在一些实施方案中，表达盒包含多腺苷酸化(poly(A))信号。在一些实施方案中，poly(A)信号包含与SEQ ID NO:17具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的多核苷酸序列。

表5.多腺苷酸化序列

重组AAV病毒体

在本公开内容的一些方面中，rAAV病毒体用于将本文中所述的表达盒递送至对象的心脏细胞例如来治疗心肌病。因此，本公开内容提供了可药用载体和rAAV病毒体，所述rAAV病毒体包含AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的编码DWORF多肽的多核苷酸。

本公开内容的rAAV病毒体包含衣壳蛋白。衣壳蛋白是构成包含表达盒的rAAV病毒体的组装二十面体包装的结构蛋白。衣壳蛋白按血清型分类。rAAV病毒体中的野生型衣壳血清型可以是例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11或AAV12(Naso et al.BioDrugs 31:317–334(2017))。工程化衣壳类型包括嵌合衣壳和镶嵌衣壳(Choi et al.Curr Gene Ther.5:299–310(2005))。基于其转导特定组织或细胞类型的能力，为rAAV病毒体选择衣壳(Liu et al.Curr Pharm Des.21:3248-56(2015))。

可使用可促进将rAAV病毒体转导至心脏细胞以递送如本文中所述的转基因的任何衣壳蛋白。在rAAV病毒体中用于转基因递送至心脏细胞导致高表达的衣壳蛋白包括AAV4、AAV6、AAV7、AAV8和AAV9(Zincarelli et al.Mol.Ther.16:P1073-1080(2008))。

在一些实施方案中，rAAV病毒体是血清型AAV9的rAAV病毒体。在一些实施方案中，AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性的衣壳蛋白。在一些实施方案中，编码AAV衣壳的多核苷酸与SEQ ID NO:15具有至少90％、95％、98％、99％或100％同一性。在一些实施方案中，AAV衣壳包含含有SEQ ID NO:14的多肽序列的衣壳蛋白。

表6.AAV衣壳序列

在一些实施方案中，rAAV是复制缺陷型的，因为rAAV病毒体不能独立地进一步复制和包装其基因组。例如，当用rAAV病毒体靶向心脏细胞时，DWORF多肽在所靶向的心脏细胞中表达，然而，由于所靶向的心脏细胞缺乏AAV rep和帽(cap)基因以及辅助功能基因的事实，rAAV不能够复制。

在一些实施方案中，可使用无辅助产生(helper-free production)来产生包封如本文中所述的表达盒的本公开内容的rAAV病毒体。rAAV是复制缺陷型病毒并且通常需要来自宿主细胞中的活辅助病毒(例如腺病毒)的组分来包装感染性rAAV病毒体。rAAV无辅助产生系统允许在不使用活辅助病毒的情况下产生感染性rAAV病毒体。在无辅助系统中，宿主包装细胞系与三种质粒共转染。第一质粒可包含包装rAAV病毒体所需的腺病毒基因产物(例如，E2A、E4和VARNA基因)。第二质粒可包含所需的AAV基因(例如，REP和CAP基因)。第三质粒包含编码目的蛋白的多核苷酸序列和启动子，侧翼是ITR。宿主包装细胞系可以是例如AAV-293宿主细胞。合适的宿主细胞包含包装感染性rAAV病毒体所需但不由质粒提供的另外的组分。在一些实施方案中，CAP基因可编码例如如本文中所述的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，启动子是如本文中所述的启动子序列。在一些实施方案中，启动子序列是cTnT启动子序列。在一些实施方案中，目的多肽是DWORF多肽。

使用方法

在一方面中，rAAV病毒体可用于治疗疾病(Wang et al.Nat Rev DrugDiscov.18:358–378(2019))。rAAV病毒体可将转基因递送至对象中的细胞，进而在细胞中表达。由rAAV病毒体递送的转基因可并入到靶细胞的基因组中，允许转基因产物的潜在长期表达。与其他病毒转基因递送系统(例如腺病毒)相比，rAAV病毒体具有免疫原性低的优势。rAAV病毒体可用于将转基因转导和递送至许多细胞类型，包括眼细胞、血细胞、肝细胞、心脏细胞、关节组织细胞、肌细胞、脑肾细胞或肺细胞(美国专利No.10,308,957；美国专利No.9,803,218)。rAAV病毒体可包含多至约5.2千碱基(kb)的基因组，将可整合到宿主细胞中的多核苷酸的尺寸限制至约4.4kb(Choi et al.Mol Brain.7:1(2014))。对于治疗，rAAV病毒体已被用于递送编码这样的多肽的转基因，例如微肌养蛋白(microdystrophin)(Chamberlain et al.Mol Ther.25:1125-1131(2017))、神经胶质细胞系来源的神经营养因子(McFarthing et al.J Parkinsons Dis.9:251–264(2019))和因子IX(Nathwani etal.N Engl J Med.371:1994–2004(2014))。

已在体内研究了使用基于rAAV的转基因递送来治疗心力衰竭的多种策略。在心力衰竭的猪模型中，已通过递送间接阻止β-肾上腺素能受体信号传导的破坏的小的多肽βARKct来靶向收缩能力调节因子β-肾上腺素能受体(Raake et al.Eur Heart J.34:1437–47(2013))。在犬模型中，通过基于rAAV的血管内皮生长因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)同种型递送增强了心肌细胞生存力。在人临床试验中，将基于rAAV的SERCA钙泵同种型SERCA2a向心脏的递送作为针对心力衰竭的治疗进行了测试。SERCA、或肌浆网/内质网Ca²⁺-ATP酶、或SR Ca²⁺-ATP酶是钙ATP酶型P-ATP酶。SERCA存在于肌肉细胞内的肌浆网(sarcoplasmic reticulum，SR)中。它是在肌肉放松期间以ATP水解为代价将Ca²⁺从细胞的胞质溶胶转移至SR的内腔的Ca²⁺ATP酶。SERCA活性是正常心脏收缩功能所必需的。然而，通过基于rAAV的SERCA2a同种型递送直接替代SERCA活性未能在临床试验中显示出显著效果(Bass-Stringer et al.Heart,Lung and Circulation.27:1285–1300(2018))。期望使用替代策略来增强SERCA活性以用于治疗心脏病，例如心力衰竭和心肌病。

在SERCA的细胞质面上有3个主要结构域：磷酸化结构域和核苷酸结合结构域，其形成催化位点，以及致动器结构域，其参与主要构象变化的递送。SERCA移动Ca²⁺穿过SR膜的速率可由调节蛋白受磷蛋白(PLB/PLN)控制。SERCA通常被与其密切相关的PLB抑制。通过PKA对PLB的磷酸化，提高的β-肾上腺素能刺激降低了SERCA与PLB之间的关联。当PLB与SERCA相关联时，Ca²⁺移动速率降低；在PLB解离之后，Ca²⁺移动提高。

通过递送SERCA2a同种型来增强SERCA活性的替代策略是通过置换PLB来增强天然表达的SERCA的活性。使SERCA与上文详细描述的DWORF多肽接触可置换PLB并增强SERCA活性。

在一方面中，本公开内容提供了在有此需要的对象中治疗心力衰竭的方法，所述方法包括施用有效量的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，所述rAAV病毒体包含AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的编码DWORF多肽的多核苷酸。

在如本文中所述的治疗对象的方法中，“治疗”或“治疗病症或有此需要的对象”是指(1)采取步骤以获得有益或期望的结果，包括临床结果例如症状的减轻；(2)预防疾病，例如使可倾向于患有疾病但尚未经历疾病或表现出疾病症状的患者不出现疾病的临床症状；(3)抑制疾病，例如阻止或减少疾病或其临床症状的发生；(4)缓解疾病，例如使疾病或其临床症状消退；或(5)使疾病延迟。出于本文中所述方法的目的，有益或期望的临床结果包括但不限于减轻与心力衰竭、心肌病、扩张型心肌病、心肌梗死、急性心肌梗死和慢性心肌梗死相关的症状。

需要使用本公开内容的组合物和方法进行治疗的对象包括但不限于患有心力衰竭或正处于心力衰竭之风险中的对象。在一些实施方案中，本文中所述的方法可用于治疗例如心肌病。在一些实施方案中，本文中所述的方法可用于治疗例如扩张型心肌病。在一些实施方案中，对象患有心肌病或处于肌病之风险中。在一个实施方案中，心肌病是扩张型心肌病(DCM)。在一些实施方案中，对象患有心肌梗死或处于心肌梗死之风险中。在一些实施方案中，心肌梗死是慢性心肌梗死。在一些实施方案中，心肌梗死是急性心肌梗死。

在一些方面中，本文中所述的方法导致与施用rAAV病毒体之前的心脏病的症状相比，心脏病一种或更多种症状的减轻。针对该方法的心脏病为但不限于心力衰竭、心肌病、扩张型心肌病、心肌梗死、慢性心肌梗死和急性心肌梗死。本文中使用的“症状”包括与本文中所述的心脏病相关的任何诊断标准或症状。症状的严重程度和变化以及诊断结果由有资格提供评估和分析这样的评估结果的医疗专业人员确定。在本公开内容的一些实施方案中，在施用本公开内容的rAAV和组合物之后症状减轻。

患有心脏病或处于发生心脏病之风险中的对象的常见症状是疲劳、呼吸困难、水肿、胸痛、心律失常、血凝块、心脏瓣膜功能受损和心脏杂音。在一些实施方案中，对象在施用本公开内容的rAAV病毒体和组合物之后经历与本文中所述的心脏病相关的症状减轻。在本文中所述方法的一些实施方案中，症状改善是以下中的一种或更多种：收缩能力增强；疲劳减轻；呼吸困难减轻；水肿减轻；胸痛减轻；心律失常减轻；血凝块减少；心脏瓣膜功能改善；以及心脏杂音减少。

心脏收缩能力的评估可用于评估急性和慢性形式的心力衰竭。心脏收缩能力可通过使用以下来监测：侵入性血液动力学监测、连续ECG监测、中心静脉压(central venouspressure)、肾功能、脉搏氧饱和度法(pulse oximetry)、动脉压监测、肺动脉导管和/或经食管超声心动图(transeophageal echocardiography)(Kuhn C,Werdan K.SurgicalTreatment:Evidence-Based and Problem-Oriented.Munich:Zuckschwerdt；2001。可获自：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6895/)。

与本文中所述的心脏病相关的呼吸困难和疲劳可使用问卷测量。例如改进的肺功能状态和呼吸困难问卷(Modified Pulmonary Functional Status and DyspneaQuestionnaire，PFSDQ-M)10(Huang et al.Am J Crit Care.17:436–442(2008))和明尼苏达心力衰竭生活质量问卷(Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire，MLHFQ)11(Bilbao et al.Health Qual Life Outcomes.14:23(2016))可用于测量患有如本文中所述的心脏病的对象。问卷是自我管理的并且允许得出分数，用于评估呼吸困难、疲劳和其他心脏健康相关症状的症状严重程度。

心肌病、心肌梗死和心脏瓣膜功能可使用以下中的一种或更多种来评估：运动负荷试验(exercise stress test)、心电图、超声心动图、胸部X光、心脏CT扫描或使用心导管插入术的血管造影、心脏MRI、血液中的B型利尿钠肽(B-type natriuretic peptideBNP)水平和/或遗传筛查。需要进一步测试来诊断特定类型的心肌病、心肌梗死或心脏瓣膜功能障碍。

扩张型心肌病(DCM)是心脏肌肉的进行性疾病，其特征在于在不存在慢性压力和/或容量超负荷的情况下左心室的腔室扩大和收缩功能障碍。DCM主要使用超声心动图进行诊断。

在2D/M模式下具有PLAX视图的超声心动图用于测量数个参数，包括LVIDd/s、IVSd、LVPWd和缩短分数(fractional shortening)。这些参数用于评估左心室腔尺寸、壁厚和径向功能。DCM的诊断标准包括针对年龄和体表面积(body surface area，BSA)校正的LVIDd/s大于112％(2S.D)。缩短分数小于25％是心室扩张存在下诊断DCM的标准(Mathewet al.Echo Res Pract.4:G1–G13(2017))。

通过2D模式下的心尖四腔(apical four-chamber，A4C)视图中的超声心动图评估左心室和右心室结构和功能的定性评估，特别参考径向和纵向功能以及局部室壁运动异常(regional wall motion abnormality)。使用双平面Simpsons方法估算射血分数(ejection fraction，EF)。EF小于45％是心室扩张存在下针对DCM的诊断标准(Mathew etal.Echo Res Pract.4:G1–G13(2017))。

施用

本公开内容的rAAV病毒体和组合物可通过全身应用施用于有此需要的对象，例如，通过类似于已在动物模型中表明的载体的静脉内、动脉内或腹膜内递送(Katz et al.,Gene Ther 19:659-669(2012))。在一些实施方案中，本公开内容的rAAV病毒体和组合物治疗或预防心力衰竭。在一些实施方案中，所述心肌病，其中全身施用载体。在一些实施方案中，rAAV病毒体通过静脉内或冠状动脉内注射来施用。

在一些实施方案中，rAAV转导心脏细胞。在一些实施方案中，rAAV转导心肌细胞。

在一些实施方案中，rAAV转导提高对象心脏中的DWORF多肽表达。“DWORF多肽表达提高”通常是指与未用载体处理的对照对象或组织相比表达至少5％、10％、15％、20％或更多。在一些实施方案中，可检测的表达意指比无载体对照高1.5倍、2倍、2.5倍或3倍的表达。可通过Western印迹(如以下在实施例中所述)，或酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)，或本领域已知的其他方法来评估表达。在一些情况下，使用标准曲线定量地测量表达。可使用经纯化的蛋白质例如经纯化的DWORF多肽，通过实施例中所述或本领域已知的方法生成标准曲线。或者，可通过对相应的mRNA进行定量来评估治疗性基因产物的表达。

在一些实施方案中，心脏组织中DWORF表达提高在剂量下发生，以载体基因组(vg)/千克对象体重(kg)计，为3×10¹⁴vg/kg或更少、2×10¹⁴vg/kg或更少、1×10¹⁴vg/kg或更少、9×10¹³vg/kg或更少、8×10¹³vg/kg或更少、7×10¹³vg/kg或更少、6×10¹³vg/kg或更少、5×10¹³vg/kg或更少、4×10¹³vg/kg或更少、3×10¹³vg/kg或更少、2×10¹³vg/kg或更少、或者1×10¹³vg/kg或更少。

药物组合物和药盒

本公开内容的rAAV病毒体通常作为药物组合物递送至对象。药物组合物包含可药用溶剂(例如，水等)和一种或更多种赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物包含为约中性pH(pH 5、6、7、8或9)的缓冲液。在一些实施方案中，药物组合物包含磷酸盐缓冲盐水(例如，pH为约7的PBS)。药物组合物可包含可药用盐。可选择盐的浓度以确保药物组合物与靶组织等张或接近与靶组织等张。

在多个实施方案中，本文中所述的组合物包含载剂(例如，载体、稀释剂和赋形剂)，其对于能够被注射的制剂而言是可药用。这些可特别地是等张的、无菌的盐水溶液(磷酸一钠或磷酸二钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙或氯化镁等，或者这些盐的混合物)，或干燥的，特别是冷冻干燥的组合物，其根据情况在添加无菌水或生理盐水之后，可构成可注射溶液。适用于可注射使用的说明性药物形式包括例如，无菌水溶液或分散剂；包含芝麻油、花生油或水性丙二醇的制剂；以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散剂的无菌粉末。

在多个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含约1×10⁸个基因组拷贝/毫升(genome copy per milliliter，GC/mL)、约5×10⁸GC/mL、约1×10⁹GC/mL、约5×10⁹GC/mL、约1×10¹⁰GC/mL、约5×10¹⁰GC/mL、约1×10¹¹GC/mL、约5×10¹¹GC/mL、约1×10¹²GC/mL、约5×10¹²GC/mL、约5×10¹³GC/mL、或约1×10¹⁴GC/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒体)。在多个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含约1×10⁸个基因组拷贝/毫升(GC/mL)、约5×10⁸GC/mL至约1×10⁹GC/mL、约1×10⁹GC/mL至约5×10⁹GC/mL、约5×10⁹GC/mL至约1×10¹⁰GC/mL、约1×10¹⁰GC/mL至约5×10¹⁰GC/mL、约5×10¹⁰GC/mL至约1×10¹¹GC/mL、约1×10¹¹GC/mL至约5×10¹¹GC/mL、约5×10¹¹GC/mL至约1×10¹²GC/mL、约1×10¹²GC/mL至约5×10¹²GC/mL、约5×10¹²GC/mL至约5×10¹³GC/mL、或约5×10¹³GC/mL至约1×10¹⁴GC/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒体)。在多个另外的实施方案中，本公开内容的药物组合物包含约5×10⁸GC/mL至约5×10⁹GC/mL、约5×10⁹GC/mL至约5×10¹⁰GC/mL、约5×10¹⁰GC/mL至约5×10¹¹GC/mL、约5×10¹¹GC/mL至约5×10¹²GC/mL、或约5×10¹²GC/mL至约1×10¹⁴GC/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒体)。在另一些实施方案中，本公开内容的药物组合物包含约5×10⁸GC/mL至约5×10¹⁰GC/mL、约5×10¹⁰GC/mL至约5×10¹²GC/mL、或约5×10¹²GC/mL至约1×10¹⁴GC/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒体)。

在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物以约10μL、约20μL、约30μL、约40μL、约50μL、约60μL、约70μL、约80μL、约90μL、约100μL、110μL、约120μL、约130μL、约140μL、约150μL、约160μL、约170μL、约180μL、约190μL、或约200μL的总体积施用。在一些实施方案中，本公开内容的药物组合物以约10μL至约20μL、约20μL至约30μL、约30μL至约40μL、约40μL至约50μL、约50μL至约60μL、约60μL至约70μL、约70μL至约80μL、约80μL至约90μL、约90μL至约100μL、约100μL至110μL、110μL至约120μL、约120μL至约130μL、约130μL至约140μL、约140μL至约150μL、约150μL至约160μL、约160μL至约170μL、约170μL至约180μL、约180μL至约190μL、或约190μL至约200μL的总体积施用。

可使用用具有已知浓度的病毒多核苷酸基因组的参考样品生成的标准曲线通过定量聚合酶变化反应(qPCR)来确定每毫升的基因组拷贝。对于AAV，所使用的参考样品通常是用于产生rAAV病毒体的转移质粒，但也可使用其他参考样品。

作为替代或补充，病毒载体的浓度可通过测量细胞系上载体的滴度来确定。病毒滴度通常表示为病毒颗粒(viral particle，vp)/单位体积(例如，vp/mL)。在多个实施方案中，本公开内容的药物组合物包含约1×10⁸个病毒颗粒/毫升(vp/mL)、约5×10⁸vp/mL、约1×10⁹vp/mL、约5×10⁹vp/mL、约1×10¹⁰vp/mL、约5×10¹⁰vp/mL、约1×10¹¹vp/mL、约5×10¹¹vp/mL、约1×10¹²vp/mL、约5×10¹²vp/mL、约5×10¹³vp/mL、或约1×10¹⁴vp/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒体)。在多个另外的实施方案中，本公开内容的药物组合物包含约1×10⁸个病毒颗粒/毫升(vp/mL)至约5×10⁸vp/mL、约5×10⁸vp/mL至约1×10⁹vp/mL、约1×10⁹vp/mL至约5×10⁹vp/mL、约5×10⁹vp/mL至约1×10¹⁰vp/mL、约1×10¹⁰vp/mL至约5×10¹⁰vp/mL、约5×10¹⁰vp/mL至约1×10¹¹vp/mL、约1×10¹¹vp/mL至约5×10¹¹vp/mL、约5×10¹¹vp/mL至约1×10¹²vp/mL、约1×10¹²vp/mL至约5×10¹²vp/mL、约5×10¹²vp/mL至约5×10¹³vp/mL、或约5×10¹³vp/mL至约1×10¹⁴vp/mL的病毒载体(例如，rAAV病毒体)。

在一个实施方案中，本公开内容提供了药盒，其包含容纳如本文中所述的药物组合物的容器。

实施例

包括以下实施例以及附图以说明本公开内容的一些优选实施方案。本领域技术人员应理解，实施例或附图中公开的技术代表本发明人发现的在本公开内容的实践中运行良好的技术，并因此可被认为是构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域的技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下可对所公开的具体实施方案进行许多改变并且仍然获得相似或类似的结果。

实施例1

结果。为了探究DWORF基因治疗在心力衰竭中的治疗潜力，开发了腺相关病毒(AAV)方法，该方法对于体内基因递送是安全且有效的(Lin et al.Circ Res.115:354-63(2014))。AAV血清型9(AAV9)因其心脏向性特性而被选择，并且心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子用于驱动心肌细胞特异性表达(Addgene质粒#69915)(Lin et al.Circ Res.115:354-63(2014))。在小鼠出生之后第5天(P5)在其中通过递送(通过腹膜内注射5×10¹³个病毒基因组/千克)来验证AAV9-cTnT-DWORF(AAV-DWORF)和对照AAV9-cTnT-tdTomato(AAV-tdTomato)病毒。在4周之后通过Western印迹分析评估蛋白质表达，并观察到DWORF(16.9±2.4倍)和tdTomato的心脏特异性过表达(图2A)。在由肌肉特异性LIM蛋白(MLP，由Cspr3基因编码)的基因缺失引起的DCM的小鼠模型中评估了AAV-DWORF基因治疗的效力。与之前在MLP敲除(KO)小鼠中通过转基因过表达DWORF观察到的保护作用一致(Makarewich etal.Elife.7(2018))，与8周龄的对照MLP KO/AAV-tdTomato小鼠相比在P5时用AAV-DWORF处理的MLPKO小鼠的超声心动图显示出心脏功能的显著改善(图2B)。另外，与MLP KO/AAV-tdTomato动物相比，MLP KO/AAV-DWORF小鼠中以心室壁变薄、腔室扩张以及心脏重量与胫骨长度之测量值增大为特征的不良心脏重塑减弱(图2B和图2C)。与MLP KO/DWORF Tg小鼠相比，在MLP KO/AAV-DWORF小鼠中观察到的心脏保护程度降低(Makarewich etal.Elife.7(2018))，这可能是由于与DWORF Tg过表达(58.5±14.7倍)相比，通过AAV递送实现的DWORF过表达水平降低(16.9±2.4倍)(图2A)。然而，这些结果表明通过DWORF基因治疗增强SERCA活性是可行且有前景的治疗策略。

接下来，测试了DWORF基因治疗在心力衰竭的心肌梗死(MI)模型中改善心脏结局的潜力。小鼠在P5时接受AAV-DWORF或AAV-tdTomato基因治疗，并在8周龄时通过永久结扎左冠状动脉进行假手术或MI，并监测心力衰竭诱导和进展持续12周。与之前在其他心力衰竭模型(Makarewich et al.Elife.7(2018)；Nelson et al.Science.351；271-275(2016))中的观察结果一致，如通过Western印迹分析检测到的(图2D)，心脏中响应于MI的内源性DWORF蛋白表达降低(3.4±1.0倍降低)，这可能有助于降低起因为心力衰竭的SERCA活性。Western印迹分析还表明了在手术之后12周的最终时间点，在假手术样品(14.9±1.0倍)和MI样品(17.0±4.8倍)二者中的AAV介导的DWORF过表达(图2D)。在基线(手术之前)和MI之后通过超声心动图评估小鼠的心脏功能(图2E)。与MI/AAV-tdTomato小鼠相比，MI/AAV-DWORF小鼠显示出心室功能的显著改善(其通过缩短分数测量)(图2D)，并且还表现出心脏扩张的明显降低(图2E和图2F)。用Masson的三色染色进行的心脏组织学分析表明，各组之间的梗死面积(infact size)没有显著差异(图2F)。AAV-DWORF无法完全恢复心脏功能可能反映了心肌细胞响应于缺血的永久性损失，使得DWORF的有益作用限于剩余的那些心肌细胞。

讨论。与之前已经用于心力衰竭临床试验的SERCA基因治疗方法(Penny etal.Hum Gene Ther.28:378-384(2017))相比，AAV-DWORF出于数种原因可能在治疗上更优越。首先，DWORF微肽的尺寸小(34个氨基酸)使其与SERCA(其是大得多的多通道跨膜蛋白(接近1,000个氨基酸))相比更有效地翻译。另外，之前的工作已经表明，DWORF对SERCA的表观亲和力高于对抑制性肽受磷蛋白的表观亲和力，并且可抵消受磷蛋白转基因小鼠3中SERCA的超抑制作用，因此DWORF过表达可能会降低由受磷蛋白与SERCA的比率提高而驱动的SERCA在心力衰竭中的抑制作用(Kranias et al.Circ Res.110:1646-1660(2012))。此外，DWORF表达本身在人心力衰竭和数个遗传性和获得性心肌病小鼠模型中降低(Makarewich et al.Elife.7(2018)；Nelson et al.Science.351；271-275(2016))，这直接导致钙失调，因此提高DWORF表达可以是恢复疾病中的钙稳态的重要因素。本实施例将DWORF描述为能够强效增强SERCA活性和心肌细胞收缩能力的分子强心剂(molecularinotrope)，为其作为用于心脏病治疗靶标的潜在临床相关性提供了另外的证据。总的来说，在此给出的数据表明DWORF基因治疗具有作为新的心力衰竭治疗的前景，并且与之前对SERCA水平的操作相比代表了新方法。

**************

应理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明的目的，并且本领域技术人员将能够想到鉴于其的多种修改或变化，并且这些修改或变化将包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求书的范围内。本文中引用的所有出版物、专利和专利申请均出于所有目的在此通过引用整体并入本文。

序列表

<110> 德克萨斯大学系统董事会

<120> 用于DWARF开放阅读框的腺相关病毒载体

<130> UTFD.P3548WO

<140> 尚未分配

<141> 2021-07-06

<150> 63/048,743

<151> 2020-07-07

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> PRT

<213> 小家鼠（Mus Musculus）

<400> 1

Met Ala Glu Lys Glu Ser Thr Ser Pro His Leu Met Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Gly Trp Ile Val Gly Cys Ile Ile Val Ile Tyr Ile Val

20 25 30

Phe Phe

<210> 2

<211> 105

<212> DNA

<213> 小家鼠

<400> 2

atggctgaga aagagtcaac atcaccacac ctcatggttc ccattcttct cctggttgga 60

tggattgtag gctgcatcat cgttatttac attgtcttct tctaa 105

<210> 3

<211> 35

<212> PRT

<213> 智人（Homo Sapiens）

<400> 3

Met Ala Glu Lys Ala Gly Ser Thr Phe Ser His Leu Leu Val Pro Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Ile Gly Trp Ile Val Gly Cys Ile Ile Met Ile Tyr Val

20 25 30

Val Phe Ser

35

<210> 4

<211> 108

<212> DNA

<213> 智人

<400> 4

atggctgaaa aagcggggtc tacattttca caccttctgg ttcctattct tctcctgatt 60

ggctggattg tgggctgcat cataatgatt tatgttgtct tctcttag 108

<210> 5

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DWORF变体

<400> 5

Met Ala Glu Lys Ala Glu Ser Thr Ser Pro His Leu Met Val Pro Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Gly Trp Ile Val Gly Cys Ile Ile Val Ile Tyr Ile

20 25 30

Val Phe Phe

35

<210> 6

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DWORF变体

<400> 6

atggctgaga aagcagagtc aacatcacca cacctcatgg ttcccattct tctcctggtt 60

ggatggattg taggctgcat catcgttatt tacattgtct tcttctaa 108

<210> 7

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DWORF变体

<400> 7

Met Ala Glu Lys Glu Ser Thr Ser Pro His Leu Ile Val Pro Ile Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Gly Trp Ile Val Gly Cys Ile Ile Val Ile Tyr Ile Val

20 25 30

Phe Phe

<210> 8

<211> 105

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DWORF变体

<400> 8

atggctgaga aagagtcaac atcaccacac ctcattgttc ccattcttct cctggttgga 60

tggattgtag gctgcatcat cgttatttac attgtcttct tctaa 105

<210> 9

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DWORF变体

<400> 9

Met Ala Glu Lys Ala Glu Ser Thr Ser Pro His Leu Ile Val Pro Ile

1 5 10 15

Leu Leu Leu Val Gly Trp Ile Val Gly Cys Ile Ile Val Ile Tyr Ile

20 25 30

Val Phe Phe

35

<210> 10

<211> 108

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> DWORF变体

<400> 10

atggctgaga aagcagagtc aacatcacca cacctcattg ttcccattct tctcctggtt 60

ggatggattg taggctgcat catcgttatt tacattgtct tcttctaa 108

<210> 11

<211> 413

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> cTnT启动子

<400> 11

gggataaaag cagtctgggc tttcacatga cagcatctgg ggctgcggca gagggtcggg 60

tccgaagcgc tgccttatca gcgtccccag ccctgggagg tgacagctgg ctggcttgtg 120

tcagcccctc gggcactcac gtatctccgt ccgacgggtt taaaatagca aaactctgag 180

gccacacaat agcttgggct tatatgggct cctgtggggg aagggggagc acggaggggg 240

ccggggccgc tgctgccaaa atagcagctc acaagtgttg cattcctctc tgggcgccgg 300

gcacattcct gctggctctg cccgccccgg ggtgggcgcc ggggggacct taaagcctct 360

gccccccaag gagcccttcc cagacagccg ccggcaccca ccgctccgtg gga 413

<210> 12

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV反向末端重复序列

<400> 12

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcc 129

<210> 13

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV反向末端重复序列

<400> 13

ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc 60

cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg 120

agcgcgcag 129

<210> 14

<211> 736

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9衣壳多肽

<400> 14

Met Ala Ala Asp Gly Tyr Leu Pro Asp Trp Leu Glu Asp Asn Leu Ser

1 5 10 15

Glu Gly Ile Arg Glu Trp Trp Ala Leu Lys Pro Gly Ala Pro Gln Pro

20 25 30

Lys Ala Asn Gln Gln His Gln Asp Asn Ala Arg Gly Leu Val Leu Pro

35 40 45

Gly Tyr Lys Tyr Leu Gly Pro Gly Asn Gly Leu Asp Lys Gly Glu Pro

50 55 60

Val Asn Ala Ala Asp Ala Ala Ala Leu Glu His Asp Lys Ala Tyr Asp

65 70 75 80

Gln Gln Leu Lys Ala Gly Asp Asn Pro Tyr Leu Lys Tyr Asn His Ala

85 90 95

Asp Ala Glu Phe Gln Glu Arg Leu Lys Glu Asp Thr Ser Phe Gly Gly

100 105 110

Asn Leu Gly Arg Ala Val Phe Gln Ala Lys Lys Arg Leu Leu Glu Pro

115 120 125

Leu Gly Leu Val Glu Glu Ala Ala Lys Thr Ala Pro Gly Lys Lys Arg

130 135 140

Pro Val Glu Gln Ser Pro Gln Glu Pro Asp Ser Ser Ala Gly Ile Gly

145 150 155 160

Lys Ser Gly Ala Gln Pro Ala Lys Lys Arg Leu Asn Phe Gly Gln Thr

165 170 175

Gly Asp Thr Glu Ser Val Pro Asp Pro Gln Pro Ile Gly Glu Pro Pro

180 185 190

Ala Ala Pro Ser Gly Val Gly Ser Leu Thr Met Ala Ser Gly Gly Gly

195 200 205

Ala Pro Val Ala Asp Asn Asn Glu Gly Ala Asp Gly Val Gly Ser Ser

210 215 220

Ser Gly Asn Trp His Cys Asp Ser Gln Trp Leu Gly Asp Arg Val Ile

225 230 235 240

Thr Thr Ser Thr Arg Thr Trp Ala Leu Pro Thr Tyr Asn Asn His Leu

245 250 255

Tyr Lys Gln Ile Ser Asn Ser Thr Ser Gly Gly Ser Ser Asn Asp Asn

260 265 270

Ala Tyr Phe Gly Tyr Ser Thr Pro Trp Gly Tyr Phe Asp Phe Asn Arg

275 280 285

Phe His Cys His Phe Ser Pro Arg Asp Trp Gln Arg Leu Ile Asn Asn

290 295 300

Asn Trp Gly Phe Arg Pro Lys Arg Leu Asn Phe Lys Leu Phe Asn Ile

305 310 315 320

Gln Val Lys Glu Val Thr Asp Asn Asn Gly Val Lys Thr Ile Ala Asn

325 330 335

Asn Leu Thr Ser Thr Val Gln Val Phe Thr Asp Ser Asp Tyr Gln Leu

340 345 350

Pro Tyr Val Leu Gly Ser Ala His Glu Gly Cys Leu Pro Pro Phe Pro

355 360 365

Ala Asp Val Phe Met Ile Pro Gln Tyr Gly Tyr Leu Thr Leu Asn Asp

370 375 380

Gly Ser Gln Ala Val Gly Arg Ser Ser Phe Tyr Cys Leu Glu Tyr Phe

385 390 395 400

Pro Ser Gln Met Leu Arg Thr Gly Asn Asn Phe Gln Phe Ser Tyr Glu

405 410 415

Phe Glu Asn Val Pro Phe His Ser Ser Tyr Ala His Ser Gln Ser Leu

420 425 430

Asp Arg Leu Met Asn Pro Leu Ile Asp Gln Tyr Leu Tyr Tyr Leu Ser

435 440 445

Lys Thr Ile Asn Gly Ser Gly Gln Asn Gln Gln Thr Leu Lys Phe Ser

450 455 460

Val Ala Gly Pro Ser Asn Met Ala Val Gln Gly Arg Asn Tyr Ile Pro

465 470 475 480

Gly Pro Ser Tyr Arg Gln Gln Arg Val Ser Thr Thr Val Thr Gln Asn

485 490 495

Asn Asn Ser Glu Phe Ala Trp Pro Gly Ala Ser Ser Trp Ala Leu Asn

500 505 510

Gly Arg Asn Ser Leu Met Asn Pro Gly Pro Ala Met Ala Ser His Lys

515 520 525

Glu Gly Glu Asp Arg Phe Phe Pro Leu Ser Gly Ser Leu Ile Phe Gly

530 535 540

Lys Gln Gly Thr Gly Arg Asp Asn Val Asp Ala Asp Lys Val Met Ile

545 550 555 560

Thr Asn Glu Glu Glu Ile Lys Thr Thr Asn Pro Val Ala Thr Glu Ser

565 570 575

Tyr Gly Gln Val Ala Thr Asn His Gln Ser Ala Gln Ala Gln Ala Gln

580 585 590

Thr Gly Trp Val Gln Asn Gln Gly Ile Leu Pro Gly Met Val Trp Gln

595 600 605

Asp Arg Asp Val Tyr Leu Gln Gly Pro Ile Trp Ala Lys Ile Pro His

610 615 620

Thr Asp Gly Asn Phe His Pro Ser Pro Leu Met Gly Gly Phe Gly Met

625 630 635 640

Lys His Pro Pro Pro Gln Ile Leu Ile Lys Asn Thr Pro Val Pro Ala

645 650 655

Asp Pro Pro Thr Ala Phe Asn Lys Asp Lys Leu Asn Ser Phe Ile Thr

660 665 670

Gln Tyr Ser Thr Gly Gln Val Ser Val Glu Ile Glu Trp Glu Leu Gln

675 680 685

Lys Glu Asn Ser Lys Arg Trp Asn Pro Glu Ile Gln Tyr Thr Ser Asn

690 695 700

Tyr Tyr Lys Ser Asn Asn Val Glu Phe Ala Val Asn Thr Glu Gly Val

705 710 715 720

Tyr Ser Glu Pro Arg Pro Ile Gly Thr Arg Tyr Leu Thr Arg Asn Leu

725 730 735

<210> 15

<211> 2209

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> AAV9核酸

<400> 15

atggctgccg atggttatct tccagattgg ctcgaggaca accttagtga aggaattcgc 60

gagtggtggg ctttgaaacc tggagcccct caacccaagg caaatcaaca acatcaagac 120

aacgctcgag gtcttgtgct tccgggttac aaataccttg gacccggcaa cggactcgac 180

aagggggagc cggtcaacgc agcagacgcg gcggccctcg agcacgacaa ggcctacgac 240

cagcagctca aggccggaga caacccgtac ctcaagtaca accacgccga cgccgagttc 300

caggagcggc tcaaagaaga tacgtctttt gggggcaacc tcgggcgagc agtcttccag 360

gccaaaaaga ggcttcttga acctcttggt ctggttgagg aagcggctaa gacggctcct 420

ggaaagaaga ggcctgtaga gcagtctcct caggaaccgg actcctccgc gggtattggc 480

aaatcgggtg cacagcccgc taaaaagaga ctcaatttcg gtcagactgg cgacacagag 540

tcagtcccag accctcaacc aatcggagaa cctcccgcag ccccctcagg tgtgggatct 600

cttacaatgg cttcaggtgg tggcgcacca gtggcagaca ataacgaagg tgccgatgga 660

gtgggtagtt cctcgggaaa ttggcattgc gattcccaat ggctggggga cagagtcatc 720

accaccagca cccgaacctg ggccctgccc acctacaaca atcacctcta caagcaaatc 780

tccaacagca catctggagg atcttcaaat gacaacgcct acttcggcta cagcaccccc 840

tgggggtatt ttgacttcaa cagattccac tgccacttct caccacgtga ctggcagcga 900

ctcatcaaca acaactgggg attccggcct aagcgactca acttcaagct cttcaacatt 960

caggtcaaag aggttacgga caacaatgga gtcaagacca tcgccaataa ccttaccagc 1020

acggtccagg tcttcacgga ctcagactat cagctcccgt acgtgctcgg gtcggctcac 1080

gagggctgcc tcccgccgtt cccagcggac gttttcatga ttcctcagta cgggtatctg 1140

acgcttaatg atggaagcca ggccgtgggt cgttcgtcct tttactgcct ggaatatttc 1200

ccgtcgcaaa tgctaagaac gggtaacaac ttccagttca gctacgagtt tgagaacgta 1260

cctttccata gcagctacgc tcacagccaa agcctggacc gactaatgaa tccactcatc 1320

gaccaatact tgtactatct ctcaaagact attaacggtt ctggacagaa tcaacaaacg 1380

ctaaaattca gtgtggccgg acccagcaac atggctgtcc agggaagaaa ctacatacct 1440

ggacccagct accgacaaca acgtgtctca accactgtga ctcaaaacaa caacagcgaa 1500

tttgcttggc ctggagcttc ttcttgggct ctcaatggac gtaatagctt gatgaatcct 1560

ggacctgcta tggccagcca caaagaagga gaggaccgtt tctttccttt gtctggatct 1620

ttaatttttg gcaaacaagg aactggaaga gacaacgtgg atgcggacaa agtcatgata 1680

accaacgaag aagaaattaa aactactaac ccggtagcaa cggagtccta tggacaagtg 1740

gccacaaacc accagagtgc ccaagcacag gcgcagaccg gctgggttca aaaccaagga 1800

atacttccgg gtatggtttg gcaggacaga gatgtgtacc tgcaaggacc catttgggcc 1860

aaaattcctc acacggacgg caactttcac ccttctccgc tgatgggagg gtttggaatg 1920

aagcacccgc ctcctcagat cctcatcaaa aacacacctg tacctgcgga tcctccaacg 1980

gccttcaaca aggacaagct gaactctttc atcacccagt attctactgg ccaagtcagc 2040

gtggagatcg agtgggagct gcagaaggaa aacagcaagc gctggaaccc ggagatccag 2100

tacacttcca actattacaa gtctaataat gttgaatttg ctgttaatac tgaaggtgta 2160

tatagtgaac cccgccccat tggcaccaga tacctgactc gtaatctgt 2209

<210> 16

<211> 1684

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 表达盒

<400> 16

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180

atcctctaga actatagcta gaattcgccc ttacgggccc cccctcgagg tcgggataaa 240

agcagtctgg gctttcacat gacagcatct ggggctgcgg cagagggtcg ggtccgaagc 300

gctgccttat cagcgtcccc agccctggga ggtgacagct ggctggcttg tgtcagcccc 360

tcgggcactc acgtatctcc gtccgacggg tttaaaatag caaaactctg aggccacaca 420

atagcttggg cttatatggg ctcctgtggg ggaaggggga gcacggaggg ggccggggcc 480

gctgctgcca aaatagcagc tcacaagtgt tgcattcctc tctgggcgcc gggcacattc 540

ctgctggctc tgcccgcccc ggggtgggcg ccggggggac cttaaagcct ctgcccccca 600

aggagccctt cccagacagc cgccggcacc caccgctccg tgggacgatc cccgaagctc 660

tagagcttta ttgcggtagt ttatcacagt taaattgcta acgcagtcag tgcttctgac 720

acaacagtct cgaacttaag ctgcagaagt tggtcgtgag gcactgggca ggtaagtatc 780

aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcttgtcgag acagagaaga 840

ctcttgcgtt tctgataggc acctattggt cttactgaca tccactttgc ctttctctcc 900

acaggtgtcc actcccagtt caattacagc tcttaaggct agagtactta atacgactca 960

ctataggcta gccgccacca tggctgagaa agagtcaaca tcaccacacc tcatggttcc 1020

cattcttctc ctggttggat ggattgtagg ctgcatcatc gttatttaca ttgtcttctt 1080

ctaacggccg cgcggatcca gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa 1140

ctagaatgca gtgaaaaaaa tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg 1200

taaccattat aagctgcaat aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc 1260

aggttcaggg ggaggtgtgg gaggtttttt agtcgacccg ggcggcctcg aggacggggt 1320

gaactacgcc tgaggatccg atctttttcc ctctgccaaa aattatgggg acatcatgaa 1380

gccccttgag catctgactt ctggctaata aaggaaattt attttcattg caatagtgtg 1440

ttggaatttt ttgtgtctct cactcggaag caattcgttg atctgaattt cgaccaccca 1500

taatacccat taccctggta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac 1560

ccctagtgat ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc 1620

gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc 1680

gcag 1684

<210> 17

<211> 134

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 多腺苷酸化序列

<400> 17

gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag aatgcagtga 60

aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac cattataagc 120

tgcaataaac aagt 134

Claims

1.治疗有此需要的对象的方法，所述方法包括施用有效量的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，所述rAAV病毒体包含AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的编码DWORF多肽的多核苷酸。

2.权利要求1所述的方法，其中所述方法治疗心力衰竭。

3.权利要求1所述的方法，其中所述方法预防心力衰竭。

4.权利要求1所述的方法，其中所述对象患有心肌病或处于心肌病之风险中。

5.权利要求1所述的方法，其中所述对象患有扩张型心肌病或处于扩张型心肌病之风险中。

6.权利要求1所述的方法，其中所述对象具有针对心力衰竭的遗传风险等位基因。

7.权利要求1所述的方法，其中所述心力衰竭是心肌梗死。

8.权利要求1所述的方法，其中所述心力衰竭是射血分数降低的心力衰竭(HFrEF)。

9.权利要求1所述的方法，其中所述心力衰竭是射血分数保留的心力衰竭(HFpEF)。

10.权利要求1至9中任一项所述的方法，其中对象患有心肌梗死或处于患有心肌梗死之风险中。

11.权利要求10所述的方法，其中所述心肌梗死是慢性心肌梗死。

12.权利要求10所述的方法，其中所述心肌梗死是急性心肌梗死。

13.权利要求1至12中任一项所述的方法，其中所述对象具有针对心力衰竭的遗传风险等位基因。

14.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述方法导致所述对象心脏中所述DWORF多肽的表达。

15.权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述方法导致除心脏之外在所述对象的肌肉中检测不到所述DWORF多肽的表达。

16.权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述方法导致在所述对象的肝中检测不到所述DWORF多肽的表达。

17.权利要求1至16中任一项所述的方法，其中所述方法导致心肌细胞中所述DWORF多肽的表达。

18.权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述方法导致在心脏成纤维细胞中检测不到所述DWORF多肽的表达。

19.权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述方法改善心脏功能的一项或更多项测量结果，其任选地为缩短分数和/或左心室内径(LVID)。

20.权利要求18所述的方法，其中在第2周至第12周观察到心脏功能的改善。

21.权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述方法降低心脏重塑。

22.权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述方法防止患有心肌梗死的对象中DWORF表达的降低。

23.权利要求1至22中任一项所述的方法，其中所述rAAV病毒体通过静脉内或冠状动脉内注射来施用。

24.权利要求17所述的方法，其中所述方法提高SERCA活性。

25.权利要求1至24中任一项所述的方法，其中所述rAAV病毒体是血清型AAV9的rAAV病毒体。

26.权利要求1至25中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少98％同一性的衣壳蛋白。

27.权利要求1至26中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少99％同一性的衣壳蛋白。

28.权利要求1至27中任一项所述的方法，其中所述AAV衣壳包含含有SEQ ID NO:14的多肽序列的衣壳蛋白。

29.权利要求1至28中任一项所述的方法，其中所述启动子是心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子。

30.权利要求1至29中任一项所述的方法，其中所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的多核苷酸序列。

31.权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的多核苷酸序列。

32.权利要求1至31中任一项所述的方法，其中所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列。

33.权利要求1至32中任一项所述的方法，其中DWORF多肽是人DWORF多肽。

34.权利要求1至33中任一项所述的方法，其中DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9具有至少95％同一性的多肽序列。

35.权利要求1至34中任一项所述的方法，其中DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9具有至少98％同一性的多肽序列。

36.权利要求1至35中任一项所述的方法，其中DWORF多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多肽序列。

37.权利要求1至36中任一项所述的方法，其中所述表达盒的侧翼是AAV反向末端重复(ITR)。

38.权利要求1至37中任一项所述的方法，其中所述ITR是AAV2ITR。

39.权利要求1至38中任一项所述的方法，其中所述ITR包含SEQ IDNO:12或SEQ ID NO:13的多核苷酸序列。

40.权利要求1至39中任一项所述的方法，其中所述对象在施用之后经历症状改善。

41.权利要求40中任一项所述的方法，其中所述症状改善是以下中的一种或更多种：收缩能力增强；疲劳减轻；呼吸困难减轻；水肿减轻；胸痛减轻；心律失常减轻；血凝块减少；心脏瓣膜功能改善；以及心脏杂音减少。

42.重组腺相关病毒(rAAV)病毒体，所述rAAV病毒体包含AAV衣壳和表达盒，所述表达盒包含与启动子有效连接的编码DWORF多肽的多核苷酸。

43.权利要求42所述的rAAV病毒体，其中所述rAAV病毒体是血清型AAV9的rAAV病毒体。

44.权利要求42或43所述的rAAV病毒体，其中所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少98％同一性的衣壳蛋白。

45.权利要求42至44中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述AAV衣壳包含与SEQ ID NO:14具有至少99％同一性的衣壳蛋白。

46.权利要求42至45中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述AAV衣壳包含含有SEQ IDNO:14的多肽序列的衣壳蛋白。

47.权利要求42至46中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述启动子是心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子。

48.权利要求42至47中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少95％同一性的多核苷酸序列。

49.权利要求42至48中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含与SEQ ID NO:11具有至少98％同一性的多核苷酸序列。

50.权利要求42至49中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述心脏肌钙蛋白-T(cTnT)启动子包含SEQ ID NO:11的多核苷酸序列。

51.权利要求42至50中任一项所述的rAAV病毒体，其中DWORF多肽是人DWORF多肽。

52.权利要求42至51中任一项所述的rAAV病毒体，其中DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的多肽序列。

53.权利要求42至52中任一项所述的rAAV病毒体，其中DWORF多肽包含与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7，或SEQ ID NO:9具有至少98％同一性的多肽序列。

54.权利要求42至53中任一项所述的rAAV病毒体，其中DWORF多肽包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9的多肽序列。

55.权利要求42至54中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述表达盒的侧翼是AAV反向末端重复(ITR)。

56.权利要求42至55中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述ITR是AAV2 ITR。

57.权利要求42至56中任一项所述的rAAV病毒体，其中所述ITR包含SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的多核苷酸序列。

58.药物组合物，其包含权利要求42至57中任一项所述的重组腺相关病毒(rAAV)病毒体和可药用载体。

59.药盒，其包含容纳权利要求58所述药物组合物的容器。