JP2023534647A

JP2023534647A - Ｄｗａｒｆオープンリーディングフレームのためのアデノ随伴ウイルスベクター

Info

Publication number: JP2023534647A
Application number: JP2023501075A
Authority: JP
Inventors: エリックエヌ．オルソン; ロンダエス．バセル－デュビー; ベンジャミンアール．ネルソン; キャサリンエー．マカレウィッチ
Original assignee: ザボードオブリージェンツオブザユニバーシティーオブテキサスシステム
Priority date: 2020-07-07
Filing date: 2021-07-06
Publication date: 2023-08-10
Also published as: US20230241249A1; WO2022010834A1; CN115885043A; MX2023000318A; AU2021306697A1; CA3183844A1; BR112022026997A2; IL299638A; KR20230035584A; EP4179083A1

Abstract

有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを用いて、対象、例えば心筋症を有するまたは心筋症のリスクを有する対象を処置する方法であって、rAAVビリオンが、AAVカプシドとプロモーターに機能的に連結されたDWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとを含む、方法が開示されている。これに関連する組成物およびキットも開示されている。TIFF2023534647000009.tif25162

Description

関連出願の相互参照
本願は、2020年7月7日出願の米国仮出願第63/048,743号の優先権の恩典を主張し、その内容の全体を参照により本明細書に組み入れる。

連邦政府による支援を受けた研究開発に関連する宣言
本発明は、National Institutes of Health（NIH）からHL141630、HL130253、HL138426、HD087351およびAR067294の下で政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明に関して一定の権利を有している。

配列表の参照
本願は、EFS-Webを通じて電子出願され、.txt形式の電子的に提出された配列表を含んでいる。この.txtファイルは、2021年6月24日に作成され、17キロバイトのサイズを有する「UTFDP3586WO_ST25.txt」と名付けられた配列表を含んでいる。この.txtファイルに含まれる配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

技術分野
本開示は、対象における心臓病（例えば、心筋症）の処置または予防のための組成物および方法に関する。特に、本開示は、心臓病（例えば、心筋症）の処置のための治療遺伝子産物に機能的に連結された心臓特異的プロモーターを含むベクターに関する。

背景
心筋症は、心臓関連死の約半分の原因である。約250人に1人から10,000人に1人の成人が何らかの形態の心筋症に罹患していると推算されている（McKenna et al. Circ Res. 121:722-730 (2017)（非特許文献1））。スクリーニング、診断および治療戦略に関する多大な努力にもかかわらず、心筋症の発病率および心筋症関連死の発生率は、依然として高い（Brieler Am Fam Physician. 96:640-646 (2017)（非特許文献2））。

心筋症は、血液を送り出すその能力が低下したときに発生する一群の心臓状態を表す。心筋の適切な機能の低下、例えば収縮機能障害は、心筋梗塞、心不全、血栓、弁障害、および心停止を引き起こし得る。心筋症は、一次性および二次性のカテゴリーに分類され得、そのため表現型が多岐にわたる（McKenna et al. Circ Res. 121:722-730 (2017)（非特許文献1））。一次性心筋症は、病因が遺伝性、獲得性、または混合性であり得る。遺伝性心筋症は、継承されるものであり、不整脈原性右室異形成、異常肥大、イオンチャネル障害、左室緻密化、およびミトコンドリアミオパチーを含む。獲得性心筋症は、主として心臓合併症をもたらす非二次性、非遺伝性要因によるものであり、心筋炎、周産期、頻脈誘導心筋症、およびストレス誘導心筋症を含む。混合性病因を有する心筋症は、非遺伝性要因および遺伝性要因の組み合わせにより引き起こされ、拡張型心筋症および拘束型心筋症を含む。二次性心筋症は、心血管外要因から引き起こされる心臓病を表す。二次性心筋症の根底にある要因は、内分泌、感染、毒素への暴露、自己免疫関連、栄養、および／または神経筋であり得る。

心筋細胞は、心筋症の病理において中心的な役割を果たしている。心筋細胞（cardiac muscle cell）、心筋細胞（cardiac myocyte）、または心筋細胞（myocardiocyte）とも呼ばれる心筋細胞（cardiomyocyte）は、心筋を構成し、心臓がポンプとして作用できるようにする収縮機能を担う心臓細胞である。適切に機能する心筋細胞の能力を低下させるメカニズムは多数存在する（Dadson et al. Clin Sci (Lond) 131:1375-1392 (2017)（非特許文献3））。不整脈原性右室心筋症において、線維性組織による心筋細胞の漸進的置換は、心筋細胞の電気的孤立および心臓における収縮機能を担う主要構造である心室心筋層の委縮をもたらす。ミトコンドリア性心筋症において、ATP産生不足は、高い代謝的要求を有する心筋細胞の収縮機能に対する直接的影響を有する。心筋症はまた、調節酵素、例えば筋小胞体／小胞体カルシウムATPase（SERCA）の活性の消失に起因する正常なCa²⁺イオン放出、取り込み、および隔離プロセスの消失により引き起こされる異常な収縮機能の結果として現れる（Lennon et al. Int J Mol Med. 7:131-41 (2001)（非特許文献4））。

心筋症に対する処置戦略が求められている。心臓細胞の異常な収縮機能を制御するメカニズムを標的とすることが、効果的なアプローチである。

McKenna et al. Circ Res. 121:722-730 (2017) Brieler Am Fam Physician. 96:640-646 (2017) Dadson et al. Clin Sci (Lond) 131:1375-1392 (2017) Lennon et al. Int J Mol Med. 7:131-41 (2001)

要旨
1つの局面において、本開示は、その必要がある対象において心不全を処置する方法であって、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを投与する工程を含み、rAAVビリオンが、AAVカプシドと、プロモーターに機能的に連結されたDWarfオープンリーディングフレーム（DWORF）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとを含む、方法を提供する。

いくつかの態様において、対象は、心筋症に罹患しているまたは心筋症のリスクを有する。1つの態様において、心筋症は拡張型心筋症（DCM）である。いくつかの態様において、対象は、心筋梗塞に罹患しているまたは心筋梗塞のリスクを有する。1つの態様において、心筋梗塞は慢性心筋梗塞である。1つの態様において、心筋梗塞は急性心筋梗塞である。

いくつかの態様において、rAAVビリオンは、静脈内または冠動脈内注射により投与される。いくつかの態様において、rAAVは心臓細胞に形質導入する。いくつかの態様において、rAAVは心筋細胞に形質導入する。

いくつかの態様において、rAAVの形質導入は対象の心臓におけるDWORFポリペプチド発現を増加させる。

いくつかの態様において、rAAVの形質導入はSERCA活性を強化する。

いくつかの態様において、rAAVビリオンは血清型AAV9のrAAVビリオンである。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも98％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも99％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO: 14のポリペプチド配列を含むカプシドタンパク質を含む。

いくつかの態様において、プロモーターはニワトリ心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターである。いくつかの態様において、ニワトリcTnTプロモーターは、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ニワトリcTnTプロモーターは、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも98％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ニワトリcTnTプロモーターは、SEQ ID NO: 11のポリヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様において、DWORFポリペプチドはマウスDWORFポリペプチドである。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも98％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9のポリペプチド配列を含む。

いくつかの態様において、発現カセットはAAV逆位末端反復（ITR）に隣接している。いくつかの態様において、ITRはAAV2 ITRである。いくつかの態様において、ITRは、SEQ ID NO: 12またはSEQ ID NO: 13のポリヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様において、対象は、投与後にMCDに関連する症状の改善を経験する。いくつかの態様において、症状の改善は、収縮性の強化、倦怠感の減少、呼吸困難の減少、浮腫の減少、胸痛の減少、不整脈の減少、血栓の減少、心臓弁機能の改善、および心雑音の減少のうちの1つまたは複数である。

1つの局面において、本開示は、AAVカプシドとプロモーターに機能的に連結されたDWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとを含む組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンならびに薬学的に許容される担体を提供する。

1つの態様において、rAAVビリオンは血清型AAV9のrAAVビリオンである。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも98％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも99％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO: 14のポリペプチド配列を含むカプシドタンパク質を含む。

いくつかの態様において、プロモーターは心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターである。いくつかの態様において、心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターは、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターは、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも98％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターは、SEQ ID NO: 11のポリヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様において、DWORFポリペプチドはDWORFポリペプチドである。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも98％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9のポリペプチド配列を含む。

別の局面において、本開示は、上記請求項のいずれか1つ記載の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は約5x10¹³個のビリオンを含む。

別の局面において、本開示は、本明細書に記載される薬学的組成物を収容する容器を含むキットを提供する。

本発明のさらなる局面および態様は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。

添付の図面は、本明細書の一部をなしており、本開示の特定の局面をさらに示すために含まれている。本開示は、本明細書に示されている具体的態様の詳細な説明と合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによりより理解され得る。
AAV逆位末端反復に隣接するcTnTプロモーターおよびDWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットである、例示的な態様の略図である。 AAV送達から4週間後のAAV-tdTomatoまたはAAV-DWORF処置マウス由来の組織溶解産物のウェスタンブロット分析を示している。tdTomatoの発現は、赤色蛍光タンパク質（RFP）に対する抗体を用いて評価した。Quad、大腿四頭筋；GP、足底腓腹筋。 8週齢マウスにおける心臓の機能および寸法の心エコー図分析を示している。収縮（s）および拡張（d）期の左室内径（LVID）を測定した。データは、n=8～12匹のマウスにおける平均±SDとして表されている。P値 MLP KO/AAV-tdTomatoに対して^**p<0.01または^***p<0.005。示されている遺伝子型および処置のマウス由来の組織学的切片の代表的なヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）染色を示している。手術から12週後のAAV-tdTomatoまたはAAV-DWORF処置されたシャムまたはMIマウス由来の心臓溶解産物のウェスタンブロット分析を示している。基準時（0週）ならびにシャムまたはMI手術後1、2、4、8および12週に心エコー図により評価された心臓の機能および寸法を示している。データは、n=4匹のシャムマウスまたはn=6～8匹のMIマウスにおける平均±SDとして表されている。P値 MI/AAV-tdTomatoに対して^*p<0.05、^**p<0.01または^***p<0.005。シャムまたはMI手技から12週後のマウス由来の連続心臓切片に対するマッソントリクローム染色を示している。マウスを、示されているようにAAV-tdTomatoまたはAAV-DWORFで処置した。切片は、0.5μm増分で採取した。

詳細な説明
概要
異常なカルシウムハンドリングは心筋症の共通の特徴であり、筋小胞体／小胞体カルシウムATPase（SERCA）の活性の低下はこの疾患の開始および進行の両方において中心的な役割を果たしている。SERCAは、心臓細胞、例えば心筋細胞におけるCa²⁺イオンの取り込み、維持および循環を促進するカルシウムポンプである。SERCA活性は、阻害性ペプチドであるホスホランバンにより調節される。このSERCA阻害性ペプチドであるホスホランバンの直接的な排除を通じてSERCA活性を強化するDWarfオープンリーディングフレーム（DWORF）と呼ばれるポリペプチドの量を増加させることによりSERCAの活性を増加させることが、大いに注目を集めている。DWORFをSERCAと接触させることが、細胞内でSERCA活性を増加させるための戦略である。

本開示は、DWORFポリペプチドまたはその機能的変種をコードするポリヌクレオチドを含む組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオン、ならびにその使用方法を提供する。いくつかの態様において、本明細書に記載されるrAAVビリオンは、例えば、心臓細胞特異的プロモーター領域に機能的に連結されたDWORFポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドを宿主細胞ゲノムに導入することにより心臓細胞に形質導入し得る。いくつかの態様において、標的とされた心臓細胞はDWORFポリペプチドを発現し、かつ、増加したSERCA活性を有し得る。本明細書に記載されるrAAVビリオンを含む薬学的組成物もまた本開示で提供される。1つの局面において、本開示は、本開示のrAAVビリオンおよび薬学的組成物を用いて心筋症と診断されたまたは心筋症のリスクを有する対象を処置する方法を提供する。

発現カセット
本開示のrAAVビリオンは、発現カセットを含み得る（図1）。発現カセットは、任意でプロモーターに機能的に連結された、DWORFポリペプチドまたはその機能的変種をコードするポリヌクレオチド、任意でポリアデニル化シグナル、および任意で転写終結シグナルを含み得る。発現カセットは、逆位末端反復（ITR）に隣接し得る。これらの要素は、宿主細胞がこのrAAVビリオンにより標的とされた後に導入遺伝子を発現する機能を提供する。プロモーター配列は、存在する場合、DWORFポリペプチドまたはその機能的変種をコードするポリヌクレオチドの発現を制御する。プロモーターは細胞型特異的であり得る。構成性プロモーターが発現カセットにおいて使用され、例えば、ニワトリβ-アクチンプロモーターに融合されたサイトメガロウイルスエンハンサー（CAG）、シミアンウイルス40（SV40）プロモーター、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（HSV-TK）プロモーターであり得る（Damdindorj et al. PLoS One. 9:e106472 (2014)）。他の細胞型特異的プロモーターもまた使用され得る。心臓細胞特異的プロモーターは、例えば、MLC2vプロモーター（Phillips et al. Hypertension 39:651-5 (2002)）および心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーター（Konkalmatt et al. Circ Cardiovasc Imaging. 6:478-486 (2013)）であり得る。発現カセット内の導入遺伝子ポリヌクレオチド配列は、例えば、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームであり得る。発現カセット内のITRは、発現カセットのウイルスパッケージングに使用されるマーカーとして機能する（Clark et al. Hum Gene Ther. 6:1329-41 (1995)）。

いくつかの態様において、発現カセットは、SEQ ID NO: 16に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有する。

（表１）発現カセットの配列

いくつかの態様において、本開示の発現カセットは、DWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、発現カセットは、心臓細胞におけるDWORFポリペプチドの増加した発現を提供する。いくつかの態様において、心臓細胞は心筋細胞である。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドの発現は、未処置対象におけるDWORFポリペプチド因子の発現と比較して5％、10％、15％、20％、または25％増加し得る。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドの発現は、未処置対象におけるDWORFポリペプチドの発現と比較して1倍、2倍、3倍、4倍、または5倍増加し得る。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは心臓細胞において任意の検出可能なレベルで発現され得る一方で、DWORFポリペプチドは未処置対象においては発現されない場合があるまたは検出不可能なレベルで発現され得る。換言すると、rAAVビリオンが投与される心臓細胞は、DWORFポリペプチドの内因性（すなわち、ネイティブ）発現のみを有する心臓細胞におけるよりも多量にDWORFポリペプチドを発現し得る。

DWORFポリペプチドは、心臓の収縮性の調節における望ましい薬物標的であるSERCAカルシウムポンプ活性の内因性エンハンサーである。DWORFはまた、非常に小さなタンパク質であり、このことがそれをrAAVビリオンによる標的細胞または組織への送達における良い候補にしている。DWORFは内因性タンパク質なので、ヒトにおけるDWORFの発現は免疫原性でなく、そのため長期的投与および発現が可能であると考えられる。DWORFポリペプチドの構造的特徴は以下の通りである。第1に、このポリペプチドは、マウスおよびヒトを含む哺乳動物種の第3染色体に位置する5～35連続残基のDWarfオープンリーディングフレーム（DWORF）を有し得る（Nelson et al. Science. 351: 271-275 (2016)；米国特許第10,570,183号）。したがって、「X以下の連続残基を有するペプチド」という用語は、「含む」という用語を含む場合でさえも、それより多い数の連続残基を含むと理解されることはできない。繰り返すが、20以下の連続残基のDWORFを含む当該ペプチドは、通常、35残基またはそれ未満であろう。その全長は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、または35残基であり得る。5～34/35残基、6～34/35残基、7～50残基、7～25残基、5～20残基、6～20残基、7～20残基、および7～15残基のペプチド長の範囲が想定される。連続するDWORF残基の数は、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20であり得る。5～20残基、5～20残基、6～20残基、7～20残基および5～15残基、5～15残基、6～15残基または7～15残基の連続残基の範囲が想定される。

いくつかの態様において、DWORFポリペプチドはヒトDWORFポリペプチドである。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも98％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの態様において、DWORFポリペプチドは、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9のポリペプチド配列を含む。

（表２）DWORF配列

いくつかの態様において、本開示の発現カセットはプロモーターを含む。「プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、RNAポリメラーゼを結合させ、それによってRNA合成を促進するDNA配列、すなわち、転写を実行するのに十分な最小配列を表す。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は、幅広い細胞、組織および種において強い活性を有することを意味する、偏在的なものであり得、または細胞型特異的、組織特異的もしくは種特異的であり得る。プロモーターは、継続的に活性であることを意味する、「構成性」であり得、またはそのプロモーターが生物因子もしくは非生物因子の存在もしくは非存在により活性化もしくは脱活性化され得ることを意味する、「誘導性」であり得る。プロモーター配列と連続的である場合もそうでない場合もあるエンハンサー配列もまた、本発明の核酸構築物またはベクターに含まれる。エンハンサー配列は、プロモーター依存的な遺伝子発現に影響し、ネイティブ遺伝子の5'または3’領域に配置され得る。

様々なプロモーターが使用され得る。有利には、プロモーターは、任意でエンハンサーと共に、標的細胞におけるDWORFポリペプチドまたはその機能的変種をコードするポリヌクレオチドの発現。いくつかの態様において、発現カセットは、細胞型特異的プロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは特異的に、心臓細胞においてDWORFポリペプチドまたはその機能的変種をコードするポリヌクレオチドの発現を促進する。いくつかの態様において、プロモーターは特異的に、心筋細胞においてDWORFポリペプチドまたはその機能的変種をコードするポリヌクレオチドの発現を促進する。

いくつかの態様において、プロモーターはニワトリ心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターである。いくつかの態様において、ニワトリcTnTプロモーターは、ニワトリcTnTプロモーター（SEQ ID NO:11）に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

（表３）ニワトリcTnTプロモーター配列

いくつかの態様において、発現カセットは、AAV2逆位末端反復（ITR）に隣接する。いくつかの態様において、ITRは、SEQ ID NO:12および／またはSEQ ID NO:13に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

（表４）ITR配列

いくつかの態様において、発現カセットは、ポリアデニル化（ポリ(A)）シグナルを含む。いくつかの態様において、ポリ(A)シグナルは、SEQ ID NO:17に対して少なくとも90％、95％、96％、97％、98％、99％、または100％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む。

（表５）ポリアデニル化配列

組換えAAVビリオン
本開示のいくつかの局面において、rAAVビリオンは、例えば心筋症を処置するために、本明細書に記載される発現カセットを対象の心臓細胞に送達するために使用される。したがって、本開示は、AAVカプシドおよびプロモーターに機能的に連結されたDWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットを含むrAAVビリオンならびに薬学的に許容される担体を提供する。

本開示のrAAVビリオンは、カプシドタンパク質を含む。カプシドタンパク質は、発現カセットを含むrAAVビリオンの二十面体の組み立てられたパッケージングを構成する構造タンパク質である。カプシドタンパク質は、その血清型により分類される。rAAVビリオンにおける野生型カプシド血清型は、例えば、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、またはAAV12であり得る（Naso et al. BioDrugs 31:317-334 (2017)）。改変されたカプシド型は、キメラカプシドおよびモザイクカプシドを含む（Choi et al. Curr Gene Ther. 5: 299-310 (2005)）。カプシドは、特定の組織または細胞型に形質導入するそれらの能力に基づき、rAAVビリオンのために選択される（Liu et al. Curr Pharm Des. 21:3248-56 (2015)）。

本明細書に記載される導入遺伝子の送達のための心臓細胞へのrAAVビリオンの形質導入を促進し得る任意のカプシドタンパク質が使用され得る。高発現をもたらす心臓細胞への導入遺伝子の送達のためにrAAVビリオンにおいて使用されるカプシドタンパク質は、AAV4、AAV6、AAV7、AAV8、およびAAV9を含む（Zincarelli et al. Mol. Ther. 16:P1073-1080 (2008)）。

いくつかの態様において、rAAVビリオンは、血清型AAV9のrAAVビリオンである。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO:14に対して少なくとも90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、AAVカプシドをコードするポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:15に対して少なくとも90％、95％、98％、99％または100％の同一性を有する。いくつかの態様において、AAVカプシドは、SEQ ID NO:14のポリペプチド配列を含むカプシドタンパク質を含む。

（表６）AAVカプシド配列

いくつかの態様において、rAAVは、そのrAAVビリオンが独立してそのゲノムをさらに複製およびパッケージングできない点で、複製欠損性である。例えば、rAAVビリオンにより心臓細胞が標的とされる場合、DWORFポリペプチドは標的とされた心臓細胞において発現されるが、しかしながら、標的とされた心臓細胞がAAV repおよびcap遺伝子ならびにアクセサリー機能遺伝子を欠如しているという事実のためにrAAVは複製することができない。

いくつかの態様において、本明細書に記載される発現カセットをカプセル化した本開示のrAAVビリオンは、ヘルパーフリー産生を用いて産生され得る。rAAVは複製欠損性ウイルスであり、通常、感染性rAAVビリオンのパッケージングのために、宿主細胞内で生きたヘルパーウイルス、例えばアデノウイルスからの成分を必要とする。rAAVヘルパーフリー産生システムは、生きたヘルパーウイルスを使用しない感染性rAAVビリオンの産生を可能にする。このヘルパーフリーシステムにおいて、宿主パッケージング細胞株は3つのプラスミドを同時トランスフェクトされる。第1のプラスミドは、rAAVビリオンのパッケージングに必要とされるアデノウイルス遺伝子産物（例えば、E2A、E4、およびVA RNA遺伝子）を含み得る。第2のプラスミドは、必要とされるAAV遺伝子（例えば、REPおよびCAP遺伝子）を含み得る。第3のプラスミドは、ITRに隣接する関心対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列およびプロモーターを含む。宿主パッケージング細胞株は、例えば、AAV-293宿主細胞であり得る。適切な宿主細胞は、これらのプラスミドによって供給されない感染性rAAVビリオンをパッケージングするために必要とされる追加成分を含む。いくつかの態様において、CAP遺伝子は、例えば、本明細書に記載されるAAVカプシドタンパク質をコードし得る。いくつかの態様において、プロモーターは、本明細書に記載されるプロモーター配列である。いくつかの態様において、プロモーター配列は、cTnTプロモーター配列である。いくつかの態様において、関心対象のポリペプチドは、DWORFポリペプチドである。

使用方法
1つの局面において、rAAVビリオンは、疾患を処置するために使用され得る（Wang et al. Nat Rev Drug Discov. 18:358-378 (2019)）。rAAVビリオンは、対象内の細胞に導入遺伝子を送達し得、それはその後、細胞内で発現される。rAAVビリオンにより送達された導入遺伝子は、標的とされた細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより導入遺伝子産物の潜在的に長期的な発現が可能となる。他のウイルス導入遺伝子送達システム、例えばアデノウイルスと比較して、rAAVビリオンは、低免疫原性という利点を有する。rAAVビリオンは、眼、血液、肝臓、心臓、関節組織、筋肉、脳、腎臓または肺細胞を含む多くの細胞型に対して形質導入しそれらに導入遺伝子を送達するために、使用することができる（米国特許第10,308,957号；米国特許第9,803,218号）。rAAVビリオンは、最大で約5.2キロ塩基（kb）のゲノムを含むことができ、宿主細胞に組み込むことができるポリヌクレオチドのサイズは約4.4 kbに制限される（Choi et al. Mol Brain. 7:1 (2014)）。処置に関して、rAAVビリオンは、マイクロジストロフィン（Chamberlain et al. Mol Ther. 25:1125-1131 (2017)）、グリア細胞株由来神経栄養因子（McFarthing et al. J Parkinsons Dis. 9:251-264 (2019)）、および第IX因子（Nathwani et al. N Engl J Med. 371:1994-2004 (2014)）等のポリペプチドをコードする導入遺伝子を送達するために使用されている。

rAAVベースの導入遺伝子送達を用いて心不全を処置する様々な戦略がインビボで研究されている。心不全のブタモデルでは、収縮性の調節因子であるβ-アドレナリン受容体が、β-アドレナリン受容体シグナル伝達の破壊を間接的に防ぐ低分子ペプチドβARKctの送達によって、標的とされた（Raake et al. Eur Heart J. 34:1437-47 (2013)）。イヌモデルでは、心筋細胞の生存性が、rAAVベースの血管内皮成長因子(VEGF）アイソフォーム送達により強化された。ヒト臨床試験では、心臓へのSERCAカルシウムポンプのアイソフォームであるSERCA2aの、rAAVベースの送達が、心不全の処置として試験された。SERCA、または筋小胞体／小胞体Ca²⁺-ATPaseまたはSR Ca²⁺-ATPaseは、カルシウムATPase型P-ATPaseである。SERCAは、筋細胞内の筋小胞体（SR）に存在する。それは、筋弛緩時にATP加水分解を通じて細胞の細胞質ゾルからSRの内腔にCa²⁺を転移させるCa²⁺ ATPaseである。SERCA活性は、心臓の適切な収縮機能に必要とされる。しかし、rAAVベースのSERCA2aアイソフォーム送達によるSERCA活性の直接的置換は、臨床試験において有意な効果を示さなかった（Bass-Stringer et al. Heart, Lung and Circulation. 27:1285-1300 (2018)）。心臓の疾患、例えば心不全および心筋症の処置のために、代替戦略を用いたSERCA活性の強化が望まれている。

SERCAの細胞質側には、触媒部位を形成するリン酸化ドメインおよびヌクレオチド結合ドメイン、ならびに主要な立体構造変化の移行に関与するアクチュエータードメインという3つの主要なドメインが存在する。SERCAがSR膜をまたいでCa²⁺を移動させる比率は、調節性タンパク質ホスホランバン（PLB/PLN）により制御され得る。SERCAは通常、それに緊密に結合するPLBにより阻害される。β-アドレナリン刺激の増加は、PKAによるPLBのリン酸化によりSERCAとPLBの間の結合性を低下させる。PLBがSERCAと結合しているとき、Ca²⁺移動の比率は低下し、PLBの離脱により、Ca²⁺の移動が増加する。

SERCA2aアイソフォームを送達することによるSERCA活性の強化に対する代替戦略は、PLBを取り除くことによるネイティブ発現されたSERCAの活性の強化である。上で詳述されているSERCAとDWORFポリペプチドの接触は、PLBを取り除き、SERCA活性を強化し得る。

1つの局面において、本開示は、その必要がある対象において心不全を処置する方法であって、AAVカプシドとプロモーターに機能的に連結されたDWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとを含む有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを投与する工程を含む、方法を提供する。

本明細書に記載される対象を処置する方法において、「処置する」または「状態またはその必要がある対象の処置」とは、（1）症状の減少などの臨床結果を含む有益なもしくは所望の結果を得るための手順を行うこと、（2）疾患を予防すること、例えば、その疾患の臨床症状を、その疾患に対する素因を有している可能性があるが、その疾患の症状を未だ経験もしくは示していない患者において進行させないようにすること、（3）その疾患を抑制すること、例えば、その疾患もしくはその臨床症状の進行を停止させるもしくは減少させること、（4）その疾患を緩和すること、例えば、その疾患もしくはその臨床症状の寛解に導くこと、または（5）その疾患を遅らせること、を表す。本明細書に記載される方法の目的上、有益なまたは所望の臨床結果は、心不全、心筋症、拡張型心筋症、心筋梗塞、急性心筋梗塞、および慢性心筋梗塞に関連する症状の減少を含むがこれらに限定されない。

本開示の組成物および方法を用いた処置を必要とする対象は、心不全に罹患しているまたはそのリスクを有する対象を含むがこれらに限定されない。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、例えば、心筋症を処置するのに有用である。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、例えば、拡張型心筋症を処置するのに有用である。いくつかの態様において、対象は、心筋症に罹患しているまたはそのリスクを有する。1つの態様において、心筋症は、拡張型心筋症（DCM）である。いくつかの態様において、対象は、心筋梗塞に罹患しているまたはそのリスクを有する。いくつかの態様において、心筋梗塞は慢性心筋梗塞である。いくつかの態様において、心筋梗塞は急性心筋梗塞である。

いくつかの局面において、本明細書に記載される方法は、rAAVビリオンの投与前の心臓病の症状と比較して、心臓病の1つまたは複数の症状を軽減する。本方法の心臓病は、心不全、心筋症、拡張型心筋症、心筋梗塞、慢性心筋梗塞、および急性心筋梗塞であるがこれらに限定されない。本明細書で使用される場合、「症状」は、本明細書に記載される心臓病に関連する任意の診断基準または症状を含む。症状および診断結果の重症度および変化は、評価を与えてそのような評価の結果を分析する資格を有する医療専門家により、決定される。本開示のいくつかの態様において、症状は、本開示のrAAVおよび組成物の投与後に軽減される。

心臓病を有するまたは心臓病を発症するリスクを有する対象における一般的症状は、倦怠感、呼吸困難、浮腫、胸痛、不整脈、血栓、心臓弁機能の障害、および心雑音である。いくつかの態様において、対象は、本開示のrAAVビリオンおよび組成物の投与後に本明細書に記載される心臓病に関連する症状の減少を経験する。本明細書に記載される方法のいくつかの態様において、症状の改善は、収縮性の強化、倦怠感の減少、呼吸困難の減少、浮腫の減少、胸痛の減少、不整脈の減少、血栓の減少、心臓弁機能の改善、および心雑音の減少のうちの1つまたは複数である。

心収縮性の評価は、急性および慢性形態の心不全を評価するために使用され得る。心収縮性は、侵襲的血液動態モニタリング、連続ECGモニタリング、中心静脈圧、腎機能、パルスオキシメトリー、動脈圧モニタリング、肺動脈カテーテル、および／または経食道心エコー図を用いることによりモニタリングされ得る（Kuhn C, Werdan K. Surgical Treatment: Evidence-Based and Problem-Oriented. Munich: Zuckschwerdt; 2001. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK6895/）。

本明細書に記載される心臓病に関連する呼吸困難および倦怠感は、問診を用いて測定され得る。例えば、肺機能状況および呼吸困難に関する質問票改訂版（Modified Pulmonary Functional Status and Dyspnea Questionnaire） (PFSDQ-M) 第10版（Huang et al. Am J Crit Care. 17:436-442 (2008)）およびミネソタ心不全質問票（MLHFQ）第11版（Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire (MLHFQ)11）（Bilbao et al. Health Qual Life Outcomes. 14:23 (2016)）が、本明細書に記載される心臓病を有する対象を測定するために使用され得る。これらの問診票は、自問式であり、呼吸困難、倦怠感、および他の心臓の健康に関連する症状に関する症状の重症度を評価するために使用されるスコアを与える。

心筋症、心筋梗塞および心臓弁機能は、運動負荷試験、心電図、心エコー図、胸部X線、心臓CT走査、または血管造影図の1つまたは複数を、心臓カテーテル検査、心臓MRI、血中B型ナトリウム利尿ペプチド（BNP）レベル、および／または遺伝子スクリーニングと共に用いて評価され得る。心筋症、心筋梗塞、または心臓弁機能障害の具体的タイプを診断するためにはさらなる試験が必要とされる。

拡張型心筋症(DCM）は、慢性的な圧および／またはボリューム負荷の非存在下でのチャンバーの拡大および左室の収縮機能障害により特徴づけられる心筋の進行性疾患である。DCMは、主として心エコー図を用いて診断される。

2D/MモードのPLAX像による心エコー図検査を用いて、LVIDd/s、IVSd、LVPWd、および短縮率を含む様々なパラメータを測定する。これらのパラメータを用いて、左室の内腔サイズ、壁厚、および短軸方向（radial）機能を評価する。DCMの診断基準は、年齢および体表面積（BSA）で補正した112％（2 S.D）超のLVIDd/sを含む。25％未満の短縮率は、拡張した心室の存在下でのDCMの診断の基準である（Mathew et al. Echo Res Pract. 4:G1-G13 (2017)）。

短軸方向および長軸方向（longitudinal）機能ならびに局所壁運動異常を特別に参照する左室および右室の構造および機能の定量的評価は、2Dモードでの心尖部四腔断面（A4C）像による心エコー図検査により評価される。駆出率（EF）は、2断面シンプソンズ法を用いて推算される。45％未満のEFは、拡張した心室の存在下でのDCMの診断基準である（Mathew et al. Echo Res Pract. 4: G1-G13 (2017)）。

投与
本開示のrAAVビリオンおよび組成物は、全身適用により、例えば、動物モデルにおいて示されたのと同様にベクターの静脈内、動脈内または腹腔内送達により、その必要がある対象に投与され得る（Katz et al., Gene Ther 19:659-669 (2012)）。いくつかの態様において、本開示のrAAVビリオンおよび組成物は、心不全を処置または予防する。いくつかの態様において、心筋症、ここでベクターは全身投与される。いくつかの態様において、rAAVビリオンは、静脈内または冠動脈内注射により投与される。

いくつかの態様において、rAAVは心臓細胞に形質導入する。いくつかの態様において、rAAVビリオンは心筋細胞に形質導入する。

いくつかの態様において、rAAVの形質導入は、対象の心臓においてDWORFポリペプチド発現を増加させる。「増加したDWORFポリペプチド発現」は典型的に、当該ベクターで処置されていない対照対象または組織と比較して少なくとも5％、10％、15％、20％またはそれより高い発現を表す。いくつかの態様において、検出可能な発現は、無ベクター対照より1.5倍、2倍、2.5倍、または3倍高い発現を意味する。発現は、以下の実施例に記載されるようにウェスタンブロット、もしくは酵素連結免疫吸着アッセイ（ELISA）、または当技術分野で公知の他の方法により評価され得る。いくつかの例において、発現は、標準曲線を用いて定量的に測定される。標準曲線は、実施例に記載されるまたは当技術分野で公知の方法により、精製されたタンパク質、例えば精製されたDWORFポリペプチドを用いて作成され得る。あるいは、治療遺伝子産物の発現は、対応するmRNAの定量により評価され得る。

いくつかの態様において、心臓組織における増加したDWORF発現は、3×10¹⁴ vg/kgもしくはそれ未満、2×10¹⁴ vg/kgもしくはそれ未満、1×10¹⁴ vg/kgもしくはそれ未満、9×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、8×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、7×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、6×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、5×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、4×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、3×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、2×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満、または1×10¹³ vg/kgもしくはそれ未満の対象のキログラム体重（kg）あたりのベクターゲノム数（vg）の量で起こる。

薬学的組成物およびキット
本開示のrAAVビリオンは、通常、薬学的組成物として対象に送達される。薬学的組成物は、薬学的に許容される溶媒（例えば水等）および1つもしくは複数の賦形剤を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、おおよそ中性のpH（pH 5、6、7、8、または9）の緩衝剤を含む。いくつかの態様において、薬学的組成物は、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、約7のpHのPBS）を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容される塩を含み得る。塩の濃度は、薬学的組成物が標的組織に対して等張性またはほぼ等張性であることが確実なように選択され得る。

様々な態様において、本明細書に記載される組成物は、注射可能な製剤について薬学的に許容されるビヒクル（例えば、担体、希釈剤および賦形剤）を含む。これらは特に、等張性で滅菌性の生理食塩水溶液（リン酸一ナトリウムもしくは二ナトリウム、塩化ナトリウム、カリウム、カルシウムもしくはマグネシウム等またはそのような塩の混合物）、または、状況に応じて滅菌水もしくは生理学的食塩水を添加すると注射可能な溶液を構成することになる、乾燥した、特に凍結乾燥された組成物であり得る。注射用途に適した例示的な薬学的形態は、例えば、滅菌水溶液または分散物、ゴマ油、ピーナツ油または水性プロピレングリコールを含む製剤、および滅菌注射可能溶液または分散物の即時調製用の滅菌粉末を含む。

様々な態様において、本開示の薬学的組成物は、1ミリリットルあたり約1 x 10⁸ゲノムコピー（GC/mL）、約5 x 10⁸ GC/mL、約1 x 10⁹ GC/mL、約5 x 10⁹ GC/mL、約1 x 10¹⁰ GC/mL、約5 x 10¹⁰ GC/mL、約1 x 10¹¹ GC/mL、約5 x 10¹¹ GC/mL、約1 x 10¹² GC/mL、約5 x 10¹² GC/mL、約5 x 10¹³ GC/mL、または約1 x 10¹⁴ GC/mLのウイルスベクター（例えば、rAAVビリオン）を含む。様々な態様において、本開示の薬学的組成物は、1ミリリットルあたり約1 x 10⁸ゲノムコピー（GC/mL）、約5 x 10⁸ GC/mL～約1 x 10⁹ GC/mL、約1 x 10⁹ GC/mL～約5 x 10⁹ GC/mL、約5 x 10⁹ GC/mL～約1 x 10¹⁰ GC/mL、約1 x 10¹⁰ GC/mL～約5 x 10¹⁰ GC/mL、約5 x 10¹⁰ GC/mL～約1 x 10¹¹ GC/mL、約1 x 10¹¹ GC/mL～約5 x 10¹¹ GC/mL、約5 x 10¹¹ GC/mL～約1 x 10¹² GC/mL、約1 x 10¹² GC/mL～約5 x 10¹² GC/mL、約5 x 10¹² GC/mL～約5 x 10¹³ GC/mL、または約5 x 10¹³ GC/mL～約1 x 10¹⁴ GC/mLのウイルスベクター（例えば、rAAVビリオン）を含む。様々なさらなる態様において、本開示の薬学的組成物は、約5 x 10⁸ GC/mL～約5 x 10⁹ GC/mL、約5 x 10⁹ GC/mL～約5 x 10¹⁰ GC/mL、約5 x 10¹⁰ GC/mL～約5 x 10¹¹ GC/mL、約5 x 10¹¹ GC/mL～約5 x 10¹² GC/mL、または約5 x 10¹² GC/mL～約1 x 10¹⁴ GC/mLのウイルスベクター（例えば、rAAVビリオン）を含む。なおさらなる態様において、本開示の薬学的組成物は、約5 x 10⁸ GC/mL～約5 x 10¹⁰ GC/mL、約5 x 10¹⁰ GC/mL～約5 x 10¹² GC/mL、または約5 x 10¹² GC/mL～約1 x 10¹⁴ GC/mLのウイルスベクター（例えば、rAAVビリオン）を含む。

いくつかの態様において、本開示の薬学的組成物は、約10μL、約20μL、約30μL、約40μL、約50μL、約60μL、約70μL、約80μL、約90μL、約100μL、約110μL、約120μL、約130μL、約140μL、約150μL、約160μL、約170μL、約180μL、約190μL、または約200μLの総体積で投与される。いくつかの態様において、本開示の薬学的組成物は、約10μL～約20μL、約20μL～約30μL、約30μL～約40μL、約40μL～約50μL、約50μL～約60μL、約60μL～約70μL、約70μL～約80μL、約80μL～約90μL、約90μL～約100μL、約100μL～約110μL、約110μL～約120μL、約120μL～約130μL、約130μL～約140μL、約140μL～約150μL、約150μL～約160μL、約160μL～約170μL、約170μL～約180μL、約180μL～約190μL、または約190μL～約200μLの総体積で投与される。

1ミリリットルあたりのゲノムコピー数は、既知の濃度のこのウイルスのポリヌクレオチドゲノムを有する参照サンプルを用いて作成された標準曲線を用いる定量ポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）により決定され得る。AAVの場合、使用される参照サンプルは、多くの場合、rAAVビリオンの生成において使用されるトランスファープラスミドであるが、他の参照サンプルも使用され得る。

代替的または追加的に、ウイルスベクターの濃度は、細胞株に対するベクターの力価を測定することにより決定され得る。ウイルスの力価は典型的に、単位体積あたりのウイルス粒子数（vp）（例えば、vp/mL）として表される。様々な態様において、本開示の薬学的組成物は、1ミリリットルあたり約1 x 10⁸ウイルス粒子（vp/mL）、約5 x 10⁸ vp/mL、約1 x 10⁹ vp/mL、約5 x 10⁹ vp/mL、約1 x 10¹⁰ vp/mL、約5 x 10¹⁰ vp/mL、約1 x 10¹¹ vp/mL、約5 x 10¹¹ vp/mL、約1 x 10¹² vp/mL、約5 x 10¹² vp/mL、約5 x 10¹³ vp/mL、または約1 x 10¹⁴ vp/mLのウイルスベクター（例えば、rAAVビリオン）を含む。様々なさらなる態様において、本開示の薬学的組成物は、1ミリリットルあたり約1 x 10⁸ウイルス粒子（vp/mL）～約5 x 10⁸ vp/mL、約5 x 10⁸ vp/mL～約1 x 10⁹ vp/mL、約1 x 10⁹ vp/mL～約5 x 10⁹ vp/mL、約5 x 10⁹ vp/mL～約1 x 10¹⁰ vp/mL、約1 x 10¹⁰ vp/mL～約5 x 10¹⁰ vp/mL、約5 x 10¹⁰ vp/mL～約1 x 10¹¹ vp/mL、約1 x 10¹¹ vp/mL～約5 x 10¹¹ vp/mL、約5 x 10¹¹ vp/mL～約1 x 10¹² vp/mL、約1 x 10¹² vp/mL～約5 x 10¹² vp/mL、約5 x 10¹² vp/mL～約5 x 10¹³ vp/mL、または約5 x 10¹³ vp/mL～約1 x 10¹⁴ vp/mLのウイルスベクター（例えば、rAAVビリオン）を含む。

1つの態様において、本開示は、本明細書に記載される薬学的組成物を収容する容器を含むキットを提供する。

以下の実施例および図面は、本開示の好ましい態様を示すために含まれている。これらの実施例または図面に開示される技術は、本開示の実施にあたって十分に機能することが本発明者らにより見出された技術であり、したがってその実施における好ましい様式を構成するとみなすことができることが当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示される具体的態様において多くの変更を行うことができ、それでもなお同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。

実施例1
結果. 心不全におけるDWORF遺伝子療法の治療能力を調査するため、インビボ遺伝子送達に関して安全かつ効果的であるアデノ随伴ウイルス（AAV）アプローチを構築した（Lin et al. Circ Res. 115:354-63 (2014)）。その心臓向性の特性からAAV血清型9（AAV9）を選択し、心筋細胞特異的発現を駆動するために心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターを用いた（Addgeneプラスミド#69915）（Lin et al. Circ Res. 115:354-63 (2014)）。AAV9-cTnT-DWORF（AAV-DWORF）および対照AAV9-cTnT-tdTomato（AAV-tdTomato）ウイルスを、生後5日（P5）における5x10¹³ウイルスゲノム／キログラムの腹腔内注射による送達によりマウスにおいて検証した。タンパク質発現を4週間後にウェスタンブロット分析により評価し、DWORF（16.9±2.4倍）およびtdTomatoの心臓特異的過剰発現を観察した（図2A）。AAV-DWORF遺伝子療法の効果を、筋特異的LIMタンパク質（MLP、Cspr3遺伝子によりコードされる）の遺伝子欠失に起因するDCMのマウスモデルにおいて評価した。MLPノックアウト（KO）マウスにおけるDWORFのトランスジェニック過剰発現を通じて以前に観察された保護的効果（Makarewich et al. Elife. 7 (2018)）と同様、P5にAAV-DWORFで処置されたMLP KOマウスの心エコー図は、8週齢の対照MLP KO/AAV-tdTomatoマウスと比較して心臓機能の有意な改善を示した（図2B）。さらに、心室壁薄厚化、チャンバー拡張および心臓重量対脛骨長比（heart weight to tibia length measurements）の増加により特徴づけられる有害な心臓リモデリングが、MLP KO/AAV-tdTomato動物と比較してMLP KO/AAV-DWORFマウスにおいて軽減された（図2Bおよび図2C）。MLP KO/AAV-DWORFマウスにおいて観察された心臓保護の程度は、MLP KO/DWORF Tgマウスと比較して小さかった（Makarewich et al. Elife. 7 (2018)）が、これはAAV送達により達成されたDWORF過剰発現のレベル（16.9±2.4倍）がDWORF Tg過剰発現（58.5±14.7倍）と比較して低いことによるものと考えられる（図2A）。そうであったとしても、これらの結果は、DWORF遺伝子療法を通じたSERCA活性の強化が有効であり、見込みのある治療戦略であることを示している。

次に、心不全の心筋梗塞（MI）モデルにおいて心臓の結果を改善する上でのDWORF遺伝子療法の能力を試験した。マウスは、P5にAAV-DWORFまたはAAV-tdTomatoのいずれかの遺伝子療法を受け、8週齢でシャム手術または左冠動脈の恒久的結紮によるMIに供され、心不全の誘導および進行が12週間モニタリングされた。心不全の他のモデルにおける以前の観察（Makarewich et al. Elife. 7 (2018); Nelson et al. Science. 351;271-275 (2016)）と同様、内因性DWORFタンパク質の発現は、ウェスタンブロット分析により検出されたようにMIに応答して心臓で減少し（3.4±1.0倍の減少）（図2D）、これは心不全の原因となるSERCA活性の減少に寄与していると考えられる。ウェスタンブロット分析はまた、手術後12週の最終時点でのシャム（14.9±1.0倍）およびMIサンプル（17.0±4.8倍）の両方におけるAAVを通じたDWORFの過剰発現を示した（図2D）。基準時（手術前）およびMI後に、マウスにおいて心臓機能を心エコー図により評価した（図2E）。MI/AAV-tdTomatoマウスと比較して、MI/AAV-DWORFマウスは、短縮率により測定される心室機能の有意な改善を示し（図2D）、また、心臓の拡張の顕著な減少も示した（図2Eおよび図2F）。マッソントリクローム染色による心臓の組織学的分析は、グループ間で梗塞サイズに関して有意差を示さなかった（図2F）。AAV-DWORFが心臓機能を完全に回復できないことは、虚血により心筋細胞が恒久的に失われ、そのためDWORFの有益な効果が生きている心筋細胞に制限されることを反映していると考えられる。

考察. 心不全臨床試験において使用された以前のSERCA遺伝子療法アプローチ（Penny et al. Hum Gene Ther. 28:378-384 (2017)）と比較して、AAV-DWORFは、様々な理由から治療的に優位であり得る。第1に、DWORFマイクロペプチドの小さなサイズ（34アミノ酸）は、それよりずっと大きな（1,000アミノ酸近い）複数回膜貫通タンパク質であるSERCAと比較して、それがより効率的に翻訳されることを可能にする。さらに、以前の研究は、DWORFが、阻害性ペプチドであるホスホランバンよりもSERCAに対してより高い見かけ上の親和性を有し、ホスホランバントランスジェニックマウス3におけるSERCAの超阻害に対応することができ、したがってDWORFの過剰発現は、ホスホランバン対SERCA比の上昇により誘導される心不全においてSERCAの阻害を減少させると考えられる（Kranias et al. Circ Res. 110:1646-1660 (2012)）。さらに、ヒト心不全ならびに遺伝性および獲得性心筋症の様々なマウスモデルにおいてはDWORF発現それ自体が減少しており（Makarewich et al. Elife. 7 (2018); Nelson et al. Science. 351;271-275 (2016)）、これはカルシウム調節障害に直接的に寄与し、したがってDWORF発現を増加させることは、疾患におけるカルシウム恒常性の回復にとって重要な要素であり得る。この実施例は、DWORFを、SERCA活性および心筋細胞の収縮性を強化することができる可能性がある分子強心薬と特徴付け、心臓病における治療標的としてのその潜在的な臨床的妥当性のさらなる証拠を提供している。まとめると、本明細書に示されるデータは、DWORF遺伝子療法が新たな心不全療法としての可能性を有しており、以前のSERCAレベルの操作と比較して新しいアプローチであることを示している。

本明細書に記載される実施例および態様は例示を目的としたものにすぎないこと、およびこれらに照らして様々な改変または変更が当業者に示唆され、それらは本願の精神および範囲ならびに添付の特許請求の範囲に包含されるべきことが理解される。本明細書で引用されているすべての刊行物、特許、および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。

Claims

その必要がある対象を処置する方法であって、有効量の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンを投与する工程を含み、rAAVビリオンが、AAVカプシドとプロモーターに機能的に連結されたDWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとを含む、方法。
心不全を処置する、請求項1記載の方法。
心不全を予防する、請求項1記載の方法。
対象が、心筋症に罹患しているまたは心筋症のリスクを有する、請求項1記載の方法。
対象が、拡張型心筋症に罹患しているまたは拡張型心筋症のリスクを有する、請求項1記載の方法。
対象が、心不全の遺伝性リスク対立遺伝子を有する、請求項1記載の方法。
心不全が心筋梗塞である、請求項1記載の方法。
心不全が、駆出率が低下した心不全（HFrEF）である、請求項1記載の方法。
心不全が、駆出率が保たれた心不全（HFpEF）である、請求項1記載の方法。
対象が、心筋梗塞に罹患しているまたは心筋梗塞のリスクを有する、請求項1～9のいずれか1項記載の記載の方法。
心筋梗塞が慢性心筋梗塞である、請求項10記載の方法。
心筋梗塞が急性心筋梗塞である、請求項10記載の方法。
対象が、心不全の遺伝性リスク対立遺伝子を有する、請求項1～12のいずれか1項記載の方法。
対象の心臓において、DWORFポリペプチドの発現をもたらす、請求項1～13のいずれか1項記載の方法。
心臓を除く、対象の筋肉においてDWORFポリペプチドの検出可能な発現をもたらさない、請求項1～14のいずれか1項記載の方法。
対象の肝臓においてDWORFポリペプチドの検出可能な発現をもたらさない、請求項1～15のいずれか1項記載の方法。
心筋細胞においてDWORFポリペプチドの発現をもたらす、請求項1～16のいずれか1項記載の方法。
心臓線維芽細胞においてDWORFポリペプチドの検出可能な発現をもたらさない、請求項1～17のいずれか1項記載の方法。
心臓機能の1つまたは複数の指標、任意で短縮率および／または左室内径（LVID）、を改善する、請求項1～18のいずれか1項記載の方法。
心臓機能の改善が2～12週目で観察される、請求項18記載の方法。
心臓リモデリングを減少させる、請求項1～20のいずれか1項記載の方法。
心筋梗塞に罹患している対象においてDWORF発現の減少を防ぐ、請求項1～21のいずれか1項記載の方法。
rAAVビリオンが、静脈内または冠動脈内注射により投与される、請求項1～22のいずれか1項記載の方法。
SERCA活性を増加させる、請求項17記載の方法。
rAAVビリオンが、血清型AAV9のrAAVビリオンである、請求項1～24のいずれか1項記載の方法。
AAVカプシドが、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも98％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項1～25のいずれか1項記載の方法。
AAVカプシドが、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも99％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項1～26のいずれか1項記載の方法。
AAVカプシドが、SEQ ID NO: 14のポリペプチド配列を含むカプシドタンパク質を含む、請求項1～27のいずれか1項記載の方法。
プロモーターが、心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターである、請求項1～28のいずれか1項記載の方法。
心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターが、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項1～29のいずれか1項記載の方法。
心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターが、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも98％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項1～30のいずれか1項記載の方法。
心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターが、SEQ ID NO: 11のポリヌクレオチド配列を含む、請求項1～31のいずれか1項記載の方法。
DWORFポリペプチドが、ヒトDWORFポリペプチドである、請求項1～32のいずれか1項記載の方法。
DWORFポリペプチドが、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1～33のいずれか1項記載の方法。
DWORFポリペプチドが、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも98％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項1～34のいずれか1項記載の方法。
DWORFポリペプチドが、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9のポリペプチド配列を含む、請求項1～35のいずれか1項記載の方法。
発現カセットがAAV逆位末端反復（ITR）に隣接している、請求項1～36のいずれか1項記載の方法。
ITRがAAV2 ITRである、請求項1～37のいずれか1項記載の方法。
ITRが、SEQ ID NO: 12またはSEQ ID NO: 13のポリヌクレオチド配列を含む、請求項1～38のいずれか1項記載の方法。
対象が、投与後に症状の改善を経験する、請求項1～39のいずれか1項記載の方法。
症状の改善が、収縮性の強化、倦怠感の減少、呼吸困難の減少、浮腫の減少、胸痛の減少、不整脈の減少、血栓の減少、心臓弁機能の改善、および心雑音の減少のうちの1つまたは複数である、請求項40記載の方法。
組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンであって、AAVカプシドとプロモーターに機能的に連結されたDWORFポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットとを含む、rAAVビリオン。
血清型AAV9のrAAVビリオンである、請求項42記載のrAAVビリオン。
AAVカプシドが、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも98％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項42または43記載のrAAVビリオン。
AAVカプシドが、SEQ ID NO: 14に対して少なくとも99％の同一性を有するカプシドタンパク質を含む、請求項42～44のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
AAVカプシドが、SEQ ID NO: 14のポリペプチド配列を含むカプシドタンパク質を含む、請求項42～45のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
プロモーターが、心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターである、請求項42～46のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターが、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項42～47のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターが、SEQ ID NO: 11に対して少なくとも98％の同一性を有するポリヌクレオチド配列を含む、請求項42～48のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
心臓トロポニン-T（cTnT）プロモーターが、SEQ ID NO: 11のポリヌクレオチド配列を含む、請求項42～49のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
DWORFポリペプチドが、ヒトDWORFポリペプチドである、請求項42～50のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
DWORFポリペプチドが、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも95％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項42～51のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
DWORFポリペプチドが、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9に対して少なくとも98％の同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項42～52のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
DWORFポリペプチドが、SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 7、またはSEQ ID NO: 9のポリペプチド配列を含む、請求項42～53のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
発現カセットがAAV逆位末端反復（ITR）に隣接している、請求項42～54のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
ITRがAAV2 ITRである、請求項42～55のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
ITRが、SEQ ID NO: 12またはSEQ ID NO: 13のポリヌクレオチド配列を含む、請求項42～56のいずれか1項記載のrAAVビリオン。
請求項42～57のいずれか1項記載の組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ビリオンおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
請求項58記載の薬学的組成物を収容する容器を含む、キット。