CN110381982B - 与myomixer促进的肌细胞融合相关的组合物和方法 - Google Patents

与myomixer促进的肌细胞融合相关的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本公开内容描述了Myomixer蛋白的融合促进活性。相比于仅表达Myomaker蛋白的细胞，当该多肽在具有Myomaker蛋白的非肌细胞中表达时，该多肽能够提高所述细胞与肌细胞融合而不与其他非肌细胞融合。还描述了该蛋白质以及表达它的细胞在将外源遗传物质递送至肌细胞中的用途。

Description

与MYOMIXER促进的肌细胞融合相关的组合物和方法
优先权要求
本申请要求2017年2月24日提交的美国临时申请序列号62/463,365的优先权权益，其全部内容在此通过引用并入。
政府资助
本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号R01AR067294-01的政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。
背景技术
1.技术领域
本公开内容一般地涉及发育生物学、细胞生物学和分子生物学的领域。更具体地，其涉及Myomixer蛋白的肌细胞融合(fusogenic)促进活性。
2.相关领域的描述
骨骼肌是体内最大的组织，占人体质量的约40％。骨骼肌的形成涉及一系列事件，所述事件以Pax7和MyoD指定肌细胞命运开始，随后是表达大量建立肌肉结构和功能的基因(Bentzinger et al.,2012；Buckingham et al.,2014)。该过程的基本步骤是单个核的成肌细胞融合形成多个核的肌纤维(Rochlin et al.,2010；Demonbreun et al.,2015；Krauss et al.,2017；Simionescu et al.,2011；Abmayr&Pavlath,2012)。类似地，响应于损伤，成熟肌肉系统内的肌源性祖细胞被激活并融合以及产生新的肌纤维(Yin et al.,2013；Doles&Olwin,2015；Brack&Rnado,2012)。尽管成肌细胞融合的许多初始步骤与其他融合细胞类型的那些相似(Chen&Olson,2005)，但特定细胞类型(例如成肌细胞)融合的组分和分子基础尚未完全确定。
成肌细胞融合是骨骼肌纤维的形成所需的复杂且严格受控的过程(Chen andOlson,2005)。融合过程必须是高度地细胞类型特异的以确保融合的成肌细胞不与非肌细胞类型形成合胞体。虽然已经详细阐述了控制骨骼肌发育的转录机制(Bentzinger etal.,2012；Berkes and Tapscott,2005；Buckingham 2006；Kang and Krauss,2010)，但是对协调成肌细胞融合的机制仍然知之甚少，而且没有在任何生物体中鉴定出直接调节成肌细胞融合的肌特异性蛋白质(Abmayr&Pavlath,2012；Rochlin et al.,2010)。相反，涉及细胞-细胞黏附和肌动蛋白动力学的许多蛋白质已与成肌细胞融合密切相关(Charrasse etal.,2007；Charrasse et al.,2002；Schwander et al.,2003；Griffinet et al.,2009；Yagami-Hiromasa et al.,1995)。然而，这些蛋白质中没有一种是肌特异性、对于哺乳动物成肌细胞融合必需且足够的，这表明该过程的肌特异性成分仍有待发现。
发明内容
因此，根据本发明公开内容，提供了用编码Myomixer多肽的外源核酸转化的细胞，所述外源核酸在所述细胞中有活性的启动子的控制下。细胞可以是人细胞、非肌细胞、成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞。外源核酸可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下。细胞还可用编码Myomaker多肽的外源核酸转化，所述外源核酸在所述细胞中有活性的启动子的控制下。外源核酸可并入所述细胞的染色体中。外源核酸可由所述细胞作为附加体(episomally)携带。细胞可表达可检测标志物和/或选择标志物。可转化细胞以表达Myomixer之外的目的基因，例如治疗基因或标记基因。
在另一个实施方案中，提供了制备非肌细胞融合伴侣的方法，其包括将编码外源Myomixer蛋白的核酸转移到非肌细胞中，所述核酸在所述细胞中有活性的启动子的控制下。细胞可被稳定转化或瞬时转染。所述方法可还包括将编码或足以产生可检测标志物的核酸转移到所述细胞中。外源核酸可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下。细胞还可用编码Myomaker多肽的外源核酸转化，所述外源核酸在所述细胞中有活性的启动子的控制下。细胞可以是人细胞、成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞。外源核酸可还编码选择标志物。可转化细胞以表达Myomixer之外的目的基因，例如治疗基因或标记基因。
在另一个实施方案中，提供了非肌细胞与肌细胞融合的方法，其包括：(a)提供表达(i)所述非肌细胞中的外源Myomixer蛋白和(ii)Myomaker蛋白的非肌细胞；以及(b)使所述非肌细胞与肌肉接触，其中表达Myomixer蛋白的所述非肌细胞将与所述肌细胞融合。非肌细胞可以是人细胞、成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞。步骤(b)可在体外进行或在体内进行。非肌细胞可表达可检测标志物或选择标志物。非肌细胞还可用编码Myomaker多肽的外源核酸转化，所述外源核酸在所述细胞中有活性的启动子的控制下。肌细胞可以是分离的肌细胞，可以是位于完整的肌组织中的肌细胞，和/或可以是成肌细胞。
在另一个实施方案中，提供了向肌细胞递送目的基因的方法，其包括：(a)提供表达外源Myomixer蛋白和Myomaker蛋白的非肌细胞，其中所述非肌细胞还包含目的基因；以及(b)使所述非肌细胞与肌肉接触，其中表达Myomixer和Myomaker蛋白的所述非肌细胞将与所述肌细胞融合并将所述目的基因递送至所述肌细胞。非肌细胞可以是人细胞、成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞。步骤(b)可在体外进行或在体内进行。
非肌细胞可表达可检测标志物或选择标志物。非肌细胞还可用编码Myomaker多肽的外源核酸转化，所述外源核酸在所述细胞中有活性的启动子的控制下。肌细胞可以是分离的肌细胞，或者可位于完整的肌组织中，或者可以是成肌细胞。肌细胞可表现出病理学表型，并且所述目的基因校正所述基因型，例如其中所述病理学表型是正常基因产物的低表达或不存在，或者是缺陷基因产物的表达。
肌细胞可具有与先天性肌病、肌少症、肌萎缩侧索硬化、肌营养不良、庞贝氏症(Pompe disease)或横纹肌肉瘤相关的病理学表型。非肌细胞可递送至对象中包含所述肌肉的受影响的肌组织，例如通过肌内注射，和/或其中递送重复至少一次，和/或其中向所述对象施用第二治疗。非肌细胞可离体递送至所述肌细胞并随后植入对象中，例如其中肌细胞包含在完整的肌组织中。
在另一个实施方案中，提供了表达盒，其包含编码Myomixer多肽的外源核酸，所述外源核酸在真核细胞中有活性的启动子的控制下。外源核酸可在组成型启动子或诱导型启动子的控制下。表达盒可还包含编码Myomaker多肽的外源核酸，所述外源核酸在真核细胞中有活性的启动子的控制下。表达可还编码可检测标志物和/或选择标志物。表达盒可包含编码Myomixer或Myomaker之外的目的基因的外源核酸。表达盒可包含在可复制载体中，例如病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)，或非病毒载体(例如配制成脂质体或纳米粒的非病毒载体)。
在另一个实施方案中，提供了校正对象中的细胞中遗传缺陷的方法，其包括：(a)提供来自所述对象的非肌细胞；(b)将一个或更多个表达盒引入表达(i)所述非肌细胞中的外源Myomixer和Myomaker蛋白和(ii)一种或更多种治疗基因的所述非肌细胞中；以及(c)使所述非肌细胞与具有遗传缺陷的肌细胞接触，其中表达Myomixer和Myomaker蛋白的所述非肌细胞将与所述肌细胞融合并将所述治疗基因递送至所述肌细胞，从而校正所述遗传缺陷。非肌细胞可以是人细胞、成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞。步骤(b)和/或(c)可在体外或体内进行，或者步骤(b)可在体外进行并且步骤(c)可在体内进行。
非肌细胞可表达可检测标志物或选择标志物。治疗基因可包含Cas9和至少一种治疗sgRNA。肌细胞可以是分离的肌细胞。肌细胞可位于完整的肌组织中。遗传缺陷可以是迪谢内肌营养不良突变、先天性肌病、庞贝氏症或肌萎缩侧索硬化。可将非肌细胞递送至对象中包含所述肌肉的受影响的肌组织，例如通过肌内注射。递送可重复至少一次。可向所述对象施用第二治疗。
非肌细胞可与所述肌细胞离体接触并随后植入对象中。肌细胞可包含在完整的肌组织中。肌细胞可以是成肌细胞。表达盒可包含组成型启动子或诱导型启动子。表达盒可编码可检测标志物和/或选择标志物。表达盒可包含在可复制载体中，例如病毒载体(例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体)，或非病毒载体(例如配制成脂质体或纳米粒的非病毒载体)。
如本文说明书中所用，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或更多个/种。如本文权利要求书中所用，当与词语“包含/包括”组合使用时，没有数量词修饰的名词可意指一个/种或多于一个/种。本文中使用的“另一个/种”可意指至少第二个/种或更多个/种。根据以下详细描述，本公开内容的其他目的、特征和优点将变得明显。然而，应理解，详细描述和具体实例尽管指出了本公开内容的一些优选实施方案但是仅以举例说明的方式给出，因为通过该详细描述，在本公开内容的精神和范围内的多个变化和修改对于本领域技术人员而言将是明显的。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分，并且被包括在内以进一步说明本公开内容的某些方面。通过参考这些附图中的一个或更多个并结合本文中给出的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容。
图1A至1F.Myomixer是一种膜蛋白并且对于成肌细胞融合是必需的。(图1A)将WT和Myomixer KO原代成肌细胞分化一周，并用MY32抗体(肌球蛋白)和Hoechst染色，示出对于成肌细胞融合需要Myomixer。比例尺，50μm。(图1B)WT和Myomixer KO原代成肌细胞培养物中核的定量(n＝3)(图形键是从上到下/从左到右)。(图1C)Western印迹，其示出了在DM中4天之后在WT或Myomixer KO原代成肌细胞培养物中的Myomixer、肌球蛋白和Gapdh表达。(D)Myomixer的氨基酸序列和跨物种同源性(SEQ ID NO:9至31)。碱性残基为蓝色；酸性残基为红色并且亮氨酸为黄色。突出显示了保守氨基酸。ss，二级结构；HH，螺旋；CC，线圈。(图1E)Myomixer转染的C2C12成肌细胞的活细胞染色，其示出了具有C端FLAG标签的Myomixer的细胞表面定位。在FLAG染色和透化之后染色层黏连蛋白。(图1F)逆转录病毒-Myomixer感染的293细胞和WT C2C12细胞的细胞溶质(cytosolic，C)和膜(membrane，M)级分的Western印迹分析(分化之后第4天)。α-微管蛋白和Gapdh印迹用作细胞溶质蛋白的阳性对照。胰岛素受体β、N-钙黏着蛋白、EGF受体印迹用作膜蛋白的阳性对照。*P<0.05，***P<0.001，Student’s t检验。
图2A至2H.Myomixer在肌肉发育和成熟的肌肉再生期间特异性表达。(图2A)Western印迹，其示出了在C2C12分化期间的Myomixer、肌球蛋白和Gapdh表达。(图2B)在生长培养基(growth medium，GM)中以及转换至分化培养基(differentiation medium，DM)中2天之后，Pax7+和Twist2+骨骼肌祖细胞中Myomixer的RNA-seq数据(图形键是从上到下/从左到右)。FPKM：每百万映射读取的每千碱基转录物的片段。(图2C)通过qPCR检测的在舌肌发育期间Myomixer转录物的表达(n＝4)。(图2D)Western印迹，其示出了在指定组织中的Myomixer和Gapdh表达。SKM，骨骼肌。(图2E)原位杂交，其示出了E12.5和E15.5的小鼠胚胎横切片中的Myomixer转录物表达。比例尺，250μm(a)，500μm(b)，200μm(c)。图像c是图像b中所示的盒状区域的放大。M：肌节来源的肌肉块；Sc，肩胛前肌块；EP，伸肌原基；FP，屈肌原基；IP，肋间肌原基；I，肋间肌；TB，肱三头肌；P，深胸；ECRL，桡侧腕长伸肌；B，肱桡肌；R，桡骨；PL，掌长肌。(图2F)如通过qPCR测定的来自1个月大WT小鼠的CTX损伤的骨骼肌中Myomixer mRNA表达(n＝3)。(图2G)在第4天和第7天CTX损伤的肌肉的横截面，其示出了Myomixer(红色)和肌球蛋白(MY32：绿色)免疫染色。比例尺，20μm。(图2H)如通过qPCR检测的，与WT肌肉相比，mdx中Myomixer mRNA表达的上调(n＝4)。*P<0.05，***P<0.001，Student’s t检验。
图3A至3E.Myomixer对于肌肉发育是必需的。(图3A)将E17.5的WT和Myomixer KO胚胎解剖并剥皮以揭示Myomixer KO肢体中缺乏肌肉。(图3B)E17.5肢体肌肉的H&E染色显示Myomixer KO胚胎中缺乏肌纤维。比例尺，50μm。(图3C)使用MY32(肌球蛋白)抗体的E17.5肢体肌肉的免疫组织化学。WT肌纤维显示在Myomixer KO切片中不存在的多个成核。比例尺，50μm。(图3D)基因型分型示出了Myomixer sgRNA靶向区域中的不同类型的缺失。WT谱带为743bp。(图3E)E17.5 WT和Myomixer KO胚胎的前肢组织中Myomixer和Gapdh的Western印迹分析。
图4A至4H.Myomixer结合Myomaker并协同诱导细胞融合。(图4A)使用用表达Myomixer和/或FLAG-Myomaker的逆转录病毒感染的10T1/2细胞或C2C12成肌细胞进行免疫共沉淀测定。IP，免疫沉淀；IB，免疫印迹。(图4B)用表达Myomaker、Myomixer或两者的逆转录病毒感染的并分化4天的C2C12细胞的MY32(肌球蛋白)免疫染色。核用Hoechst复染。比例尺，50μm。(图4C)B中的C2C12细胞中核的定量(n＝3)(图形键是从上到下/从左到右)。(图4D和图4E)用表达Myomaker、Myomixer或两者的逆转录病毒感染的GFP标记的10T1/2成纤维细胞。感染之后两天，将细胞与Cherry标记的C2C12细胞混合并分化一周。GFP、RFP(Cherry)和Hoechst复染核的荧光图像。比例尺，100μm。(图4F)通过western印迹检测的10T1/2成纤维细胞中Myomixer和Myomaker的过表达。(图4G)Myomixer和Myomaker在不同细胞类型中的融合活性的总结。(图4H)用表达Myomaker和/或Myomixer的逆转录病毒感染然后分化一周的C2C12细胞(WT或Myomixer KO)和10T1/2-GFP成纤维细胞的混合培养物的GFP和MY32(肌球蛋白)免疫染色(红色)的荧光图像。核用Hoechst复染。比例尺，50μm。
图5A至5J.CRISPR筛选策略和Myomixer单指导(sg)RNA的验证。(图5A)全基因组CRISPR功能丧失筛选的示意图。用表达Cas9和sgRNA的重组慢病毒感染C2C12成肌细胞。添加嘌呤霉素选择具有病毒DNA的基因组整合从而稳定表达Cas9和sgRNA以敲除其靶基因的细胞。将细胞转换至分化培养基(低血清)一周。使用胰蛋白酶消化将肌管与成肌细胞分离。进行测序确定筛选“命中物(hit)”。如果所述基因对于C2C12成肌细胞的分化或融合是必需的，则该基因的功能丧失将阻断肌管形成，并且这些改变的细胞将出现在成肌细胞群体中。在成肌细胞中确定的sgRNA对在肌管中确定的sgRNA的比反映了其靶基因在成肌细胞分化或融合中的功能。(图5B)使用MY32抗体的Western印迹分析示出了相比于成肌细胞(高胰蛋白酶)在胰蛋白酶分离的肌管(低胰蛋白酶)中肌球蛋白重链表达的富集。(图5C)在筛选中鉴定的所选基因(“命中物”)的列表。将命中物(富集得分>2.5)与在Pax7+卫星细胞和Twist2+肌原性祖细胞分化期间上调的基因(>2.5倍)以及在C2C12分化期间上调的基因(>1.5倍)进行比较(GSE4694)。(图5D)分析染色质免疫沉淀测序数据(GSM915183、GSM915185、GSM915186、GSM915165、GSM915159、GSM915163、GSM915166、GSM915164)以示出在C2C12分化期间Myomixer启动子上Myod和肌细胞生成蛋白的占据动态。(图5E)Myomixer基因跨越三个外显子，其中ORF限于外显子3。示出了用于基因型分析的sgRNA和引物的位置。(图5F)在通过CRISPR破坏Myomixer之后，来自C2C12细胞的基因组PCR片段的测序(SEQ ID NO:50至54)。(图5G)用MY32(肌球蛋白重链)抗体和Hoechst染色对WT和Myomixer KO C2C12细胞进行免疫染色示出了融合需要Myomixer。比例尺，50μm。(图5H)WT和Myomixer KO C2C12细胞中核的定量(n＝3)(图形键是从上到下/从左到右)。(图5I)Western印迹，其示出了WT和Myomixer KO C2C12细胞中的Myomixer、肌球蛋白和Gapdh表达。(图5J)通过qPCR检测的WT和Myomixer KO C2C12细胞中指定的转录物的RNA表达(图形键是从上到下/从左到右)。*P<0.05，***P<0.001，Student’s t检验。
图6.在C2C12细胞分化期间的基因表达。从在指定时间分化的C2C12细胞分离RNA，并通过qPCR测量肌细胞生成蛋白或Myomixer表达(n＝3)(图形键是从上到下/从左到右)。
图7.来自Myomixer KO胚胎的基因组DNA的序列。分离E17.5的Myomixer KO胚胎，并从尾部DNA确定基因组DNA序列。(SEQ ID NO：55至57)
图8A至8B.测量Myomaker表达。使用qPCR，在(图8A)WT和Myomixer KO C2C12细胞(n＝3)和(图8B)WT和Myomixer KO E17.5小鼠后肢(对于WT n＝6，并且对于KO为9)中测量Myomaker表达。对于两个图，图形键是从上到下/从左到右。
图9.Myomaker蛋白和DNA序列。
图10.Myomixer蛋白和DNA序列。
具体实施方式
有多种类型的膜融合，包括病毒-细胞融合、胞内囊泡融合和细胞-细胞融合(Chenand Olson 2005)。不同的融合机制之间存在相似性，但相比于其他融合方法，对细胞-细胞融合的了解相对较少，特别是对于直接合并胞间膜的融合蛋白。
骨骼肌形成通过成肌细胞的融合发生以形成多个核的肌纤维。从成肌细胞融合和肌细胞生成所需的基因的全基因组CRISPR功能丧失筛选，本发明人发现了一种他们称为Myomixer的小的肌特异性肽。Myomixer表达与体外和体内成肌细胞分化一致，并且对于胚胎发生期间的融合和骨骼肌形成是必需的。Myomixer定位于质膜，在那里其通过与Myomaker(一种融合膜蛋白)结合促进细胞-细胞融合。本发明人得出结论，Myomixer-Myomaker对控制肌肉发育期间肌纤维形成的关键步骤。
Myomixer的发现建立在本发明人先前的Myomaker为有效的成肌细胞融合蛋白的发现之上。增强Myomaker活性的能力进一步促进了这种潜在的基本细胞方法的利用，并增强了Myomaker驱动非肌细胞与肌细胞融合的能力，这代表了一种吸引人的用于增强肌肉修复的策略。以下描述本公开内容的这些和另一些方面。
I.Myomaker和Myomixer
A.Myomaker
命名为Myomaker的跨膜蛋白8c(Transmembrane protein 8c，Tmem8c)，是一种在脊椎动物中高度保守的221个残基的表征不佳的蛋白质。该基因位于人类染色体9q34.2上。其包含6个约20个氨基酸的推定螺旋区域，均匀分布在整个蛋白质中。小鼠Myomaker的DNA和蛋白质序列分别作为SEQ ID NO:1和2提供，人Myomaker的DNA和蛋白质序列分别作为SEQID NO:3和4提供。
Myomaker在成肌细胞融合期间瞬时表达，并且对于在体内和体外驱动质膜的合并都是必需和充足的。Myomaker是在成肌细胞融合的时间期间特异性表达的肌特异性质膜蛋白，并且是形成多个核的肌纤维所必需的。尽管已经表明表面糖蛋白，包括钙黏着蛋白、β-1整联蛋白、MOR23和Adam12(Charrasse et al.,2007,Charrasse et al.,2002,Schwanderet al.,2003,Griffinet et al.,2009和Yagami-Hiromasa et al.,1995)影响成肌细胞融合，但Myomaker是确定的对于体内成肌细胞融合是绝对必需的唯一肌特异性蛋白质。在Myomaker-/-小鼠中缺少多个核的肌纤维表明对于所有骨骼肌的形成需要这种膜蛋白。
成肌细胞融合是一个多步骤过程，需要紧密的细胞-细胞相互作用，然后是膜聚结，伴随着驱动细胞合并的肌动蛋白-细胞骨架动力学。Myomaker明确地参与膜融合反应，如其刺激成肌细胞融合和成纤维细胞与成肌细胞融合的能力所证明的。Myomaker单独不能诱导成纤维细胞的融合表明，它可能需要激活或另外的成肌细胞蛋白质来发挥其融合活性，可能反映了需要紧密的膜并置以允许膜合并。进一步证明融合需要另外的成肌细胞蛋白质是本发明人发现WT成肌细胞可以与Myomaker-/-成肌细胞融合。在成肌细胞融合期间对立细胞上膜蛋白之间相互作用的要求已在斑马鱼和果蝇中得到证实(Abmayr and Pavlath2012and Powell and Wright2011)，表明成肌细胞融合的分子调节不同于主要需要表达融合蛋白的病毒-细胞融合的分子调节(Oren-Suissa&Podbilewicz)。肌动蛋白-细胞骨架中的变化对于细胞-细胞融合是所需的(Wilson and Snell 1998；Shilagardi et al.,2013)。与此范例一致，松胞菌素D和拉春库林B消除了Myomaker的活性，这破坏了融合所需的细胞骨架事件，表明Myomaker依赖于细胞骨架来发挥其功能。
B.Myomixer
小鼠Myomixer是长度为84个氨基酸的微肽(图1D)。Myomixer的种间同源物在不同的脊椎动物物种中是保守的(图1D)。Myomixer的小尺寸使其置于特征为未加工的ORF小于100个氨基酸的微肽的类别中(Marquez-Medina et al.,2015)。值得注意的是，在这一点上，迄今鉴定的大多数微肽嵌入膜中(Anderson et al.,2015；2016)。小鼠Myomixer的蛋白质和DNA序列分别在SEQ ID NO:5和6中列出。人Myomixer的蛋白质和DNA序列分别在SEQ IDNO:7和8中列出。
Myomixer氨基酸序列未在鱼或两栖动物中注释，可能是因为小于100个氨基酸的ORF通常不注释。然而，本发明人在鱼、蛙和龟基因组中鉴定了推定的Myomixer种间同源物，其具有几个残基的保守性，尤其是许多精氨酸和两亲性残基(图1D)。来自不同物种的蛋白质包含N端疏水性区段，接着是带正电荷的螺旋和相邻的疏水性螺旋。来自哺乳动物和有袋类动物的Myomixer蛋白还包含其他生物体缺失的独特的C端螺旋(图1D)。
本发明人没有在果蝇中发现Myomixer相关的基因，其也缺乏明显的Myomaker种间同源物，表明Myomixer-Myomaker蛋白伴侣关系是高等脊椎动物的发明。也许脊椎动物的大的肌肉的形成需要这种强大的融合机制叠加在更简单的生物体(例如果蝇)的基本细胞-细胞融合事件上。
本发明人注意到Myomixer与心脏特异性微肽DWORF(矮的开放阅读框)之间的惊人的相似性，DWORF定位于心肌细胞的肌浆网，在那里其与SERCA钙ATPase结合并刺激其活性(Nelson et al.,2016)。本发明人推测许多膜蛋白的活性可通过与尚未鉴定的微肽结合来控制。
因为N端包含延伸的疏水性区段，因此可以代表推定的膜锚。表达在C端具有FLAG标签的Myomixer的完整C2C12成肌细胞的免疫染色揭示了细胞表面上所述蛋白质的存在(图1E)。与这些发现一致，将C2C12肌管分级成膜和胞质级分示出了Myomixer定位于膜(图1F)。类似地，在用表达Myomixer的逆转录病毒感染的293细胞中，所述蛋白质优先定位于膜上(图1F)。
II.肽和多肽
在某些实施方案中，本公开内容可涉及Myomixer蛋白分子。本文中使用的“蛋白质”或“多肽”通常是指全长蛋白质。相反，肽定义为通常为约3至约100个氨基酸。上述所有“蛋白质的”术语可在本文中互换使用。人Myomixer多肽序列在SEQ ID NO:7中提供，而小鼠Myomixer多肽序列在SEQ ID NO:5中提供。
在某些实施方案中，蛋白质组合物包含至少一种蛋白质、多肽或肽。在另一些实施方案中，蛋白质组合物包含生物相容性的蛋白质、多肽或肽。本文中使用的术语“生物相容的”是指当物质根据本文中所述的方法和量应用于或施用于给定生物体时不产生显著的不良作用。这样的不良或不期望的作用是例如显著毒性或不良免疫反应的那些。在一些优选的实施方案中，包含生物相容性蛋白质、多肽或肽的组合物通常是哺乳动物蛋白质或肽或合成蛋白质或肽，各自基本上不含毒素、病原体和有害免疫原。
可通过本领域技术人员已知的任何技术制备蛋白质组合物，包括通过标准分子生物学技术表达蛋白质、多肽或肽，从天然来源分离蛋白质化合物，或化学合成蛋白质物质。先前已经公开了多种基因的核苷酸和蛋白质、多肽和肽序列，并且可在本领域普通技术人员已知的计算机化数据库中找到。一个这样的数据库是国家生物技术信息中心的Genbank和GenPept数据库(National Center for Biotechnology Information’s Genbank andGenPept database)(全球范围网址为ncbi.nlm.nih.gov)。可使用本文中公开的或本领域普通技术人员已知的技术扩增和/或表达这些已知基因的编码区。或者，蛋白质可以重组产生或从天然来源纯化。根据常规技术，可以在溶液中或在固体支持物上合成较短的肽分子。多种自动合成仪是可商购的并且可根据已知的协议使用。参见，例如，Stewart and Young(1984)；Tam et al.(1983)；Merrifield(1986)；和Barany and Merrifield(1979)，各自通过引用并入本文。
在某些实施方案中，可以纯化蛋白质化合物。通常，“纯化的”是指特定的或已经经过分级以除去多种其他蛋白质、多肽或肽的蛋白质、多肽或肽组合物，并且该组合物基本上保留其对于特定的或期望的蛋白质、多肽或肽的活性，如可例如通过如本领域普通技术人员已知的蛋白质测定评价的。
III.核酸
在本公开内容的某些实施方案中，提供了源自或编码Myomixer和Myomaker的核酸。在某些方面，核酸可包含这些基因的野生型或经修饰的形式。在特定方面，核酸编码或包含转录的核酸。在另一些方面，核酸包含SEQ ID NO:6或8的核酸区段或其生物学功能等同物。在特定方面，核酸编码蛋白质、多肽或肽。
术语“核酸”是本领域公知的。本文中使用的“核酸”通常是指包含核碱基的DNA、RNA或其衍生物或类似物的分子(即链)。核碱基包括，例如，在DNA(例如，腺嘌呤“A”、鸟嘌呤“G”、胸腺嘧啶“T”或胞嘧啶“C”)或RNA(例如，“A”、“G”、尿嘧啶“U”或“C”)中发现的天然存在的嘌呤或嘧啶碱基。术语“核酸”涵盖术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”，各自作为术语“核酸”的亚属。术语“寡核苷酸”是指长度为约3至约100个核碱基的分子。术语“多核苷酸”是指长度大于约100个核碱基的至少一个分子。
这些定义通常是指单链分子，但在一些具体实施方案中还涵盖与所述单链分子部分地、基本上或完全互补的另外的链。因此，核酸可涵盖双链分子或三链分子，其包含含有分子的特定序列的一个或更多个互补链或“互补体”。本文中使用的单链核酸可用前缀“ss”表示，双链核酸用前缀“ds”表示，并且三链核酸用前缀“ts”表示。
1.核酸的制备
核酸可通过本领域普通技术人员已知的任何技术制备，例如化学合成、酶促产生或生物学产生。合成的核酸(例如，合成的寡核苷酸)的一些非限制性实例包括：使用例如EP266 032(通过引用并入本文)中描述的磷酸三酯、亚磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术通过体外化学合成制备的核酸，或者通过Froehler et al.(1986)和美国专利5,705,629(各自通过引用并入本文)描述的脱氧核苷H-膦酸酯中间体制备的核酸。在本公开内容的方法中，可使用一种或更多种寡核苷酸。在例如美国专利4,659,774、4,816,571、5,141,813、5,264,566、4,959,463、5,428,148、5,554,744、5,574,146、5,602,244(其各自通过引用并入本文)中已经公开了寡核苷酸合成的多种不同机制。
酶促产生的核酸的一些非限制性实例包括通过扩增反应例如PCRTM(参见例如美国专利4,683,202和美国专利4,682,195，各自通过引用并入本文)或美国专利5,645,897(通过引用并入本文)中描述的寡核苷酸合成中的酶产生的核酸。生物学产生的核酸的一些非限制性实例包括在活细胞中产生(即复制)的重组核酸，例如在细菌中复制的重组DNA载体(参见例如Sambrook et al.2001，通过引用并入本文)。
2.核酸的纯化
核酸可以在聚丙烯酰胺凝胶、氯化铯离心梯度上或通过本领域普通技术人员已知的任何其他方法纯化(参见例如Sambrook et al.,2001，通过引用并入本文)。
在某些方面，本公开内容涉及是分离的核酸的核酸。本文使用的术语“分离的核酸”是指已经从一种或更多种细胞的总基因组和转录的核酸的块(bulk)中分离或以其他方式脱离的核酸分子(例如，RNA或DNA分子)。在某些实施方案中，“分离的核酸”是指已经从细胞组分或体外反应组分(例如大分子例如脂质或蛋白质、小的生物学分子等)的块中分离或以其他方式脱离的核酸。
3.核酸区段
在某些实施方案中，核酸是核酸区段。本文中使用的术语“核酸区段”是核酸的较小片段，例如作为一些非限制性实例，仅编码Myomixer的一部分的那些。因此，“核酸区段”可包含基因序列的任何部分，其为约10个核苷酸至Myomixer基因的全长。在某些实施方案中，核酸区段可以是探针或引物。本文中使用的“探针”通常是指用于检测方法或组合物的核酸。本文中使用的“引物”通常是指用于延伸或扩增方法或组合物的核酸。
4.核酸互补体
本公开内容还涵盖与编码Myomixer的核酸互补的核酸。在一些具体实施方案中，本公开内容涵盖与SEQ ID NO:6或8中所示的序列互补的核酸或核酸区段。当核酸能够根据标准的Watson-Crick、Hoogsteen或反向Hoogsteen结合互补规则与另一核酸碱基配对时，则它是另一核酸的“互补体”或与另一核酸是“互补的”。本文中使用的“另一核酸”可指相同分子或相同分子的空间分离序列。
本文中使用的术语“互补的”或“互补体”还指包含连续核碱基或半连续核碱基(例如一个或更多个核碱基部分不存在于所述分子中)之序列的能够与另一核酸链或双链体杂交(即使少于所有的核碱基不与配对物核碱基碱基配对也是如此)的核酸。在某些实施方案中，“互补的”核酸包含其中约70％、约71％、约72％、约73％、约74％、约75％、约76％、约77％、约77％、约78％、约79％、约80％、约81％、约82％、约83％、约84％、约85％、约86％、约87％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％、至约100％、以及其中可衍生的任何范围的核碱基序列在杂交期间能够与单链或双链核酸分子碱基配对的序列。在某些实施方案中，术语“互补的”是指可在严格条件下与另一核酸链或双链体杂交的核酸，如本领域普通技术人员将理解的。
在某些实施方案中，“部分互补的”核酸包含可在低严格条件下与单链或双链核酸杂交的序列，或包含其中少于约70％的核碱基序列在杂交期间能够与单链或双链核酸分子碱基配对的序列。
5.表达构建体
在某些实施方案中，表达构建体将用于表达Myomixer。表达需要在载体中提供合适的信号，所述载体包含多种调节元件，例如来自病毒和哺乳动物来源的增强子/启动子，其驱动接受者细胞中Myomixer的表达。还定义了设计用于优化宿主细胞中信使RNA稳定性和可翻译性的元件。还提供了使用许多显性药物选择标记来建立表达产物的永久性稳定细胞克隆的条件，以及将药物选择标记的表达与多肽表达联系起来的元件。
在整个申请中，术语“表达构建体”意在包括含有编码Myomixer的核酸的任何类型的遗传构建体，其中部分或全部核酸编码序列能够被转录。术语“载体”用于指载体核酸分子，其中可插入核酸序列以引入到其可在那里进行复制的细胞中。核酸序列可以是“外源的”，这意味着其对于引入载体的特定细胞是外来的，或者该序列与细胞中的序列同源但在宿主细胞核酸内该序列通常不存在的位置中。载体包括质粒、黏粒、病毒(噬菌体、动物病毒和植物病毒)和人工染色体(例如，YAC)。本领域技术人员可通过标准重组技术熟练地构建载体，所述技术在Sambrook et al.(2001)和Ausubel et al.(1994)(二者均通过引用并入本文)中描述。
术语“表达载体”是指包含编码能够被转录的基因产物的至少一部分的核酸序列的载体。在一些情况下，随后将RNA分子翻译为蛋白质、多肽或肽。在另外的情况下，这些序列不翻译，例如在反义分子或核酶的产生中。表达载体可包含多种“控制序列”，其是指在特定宿主生物体中转录并可以翻译可操作连接的编码序列所需的核酸序列。除了控制转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可包含用于其他功能的核酸序列，并且在下文中描述。
“启动子”是控制序列，其是控制转录的起始和速率的核酸序列的区域。启动子可包含可结合调节蛋白和分子(例如RNA聚合酶和其他转录因子)的基因元件。短语“有效地定位”、“有效地连接”、“在控制下”和“在转录控制下”意指启动子处于相对于核酸序列的正确的功能位置和/或取向以控制该序列的转录起始和/或表达。启动子可与或可不与“增强子”结合使用，“增强子”是指参与核酸序列的转录激活的顺式作用调控序列。
启动子可以是与基因或序列自然缔合的启动子，因为其可通过分离位于编码区段和/或外显子上游的5’非编码序列获得。这样的启动子可被称为“内源性”的。类似地，增强子可以是与核酸序列自然缔合、位于该序列的上游或下游的增强子。或者，通过将编码核酸区段定位在重组或异源启动子的控制下将获得某些优势，所述启动子指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的启动子。重组或异源增强子也是指在其自然环境中通常不与核酸序列缔合的增强子。这样的启动子或增强子可包括其他基因的启动子或增强子，从任何其他原核、病毒或真核细胞中分离的启动子或增强子以及非“天然存在”的启动子或增强子(即包含不同转录调节区的不同元件和/或改变表达的突变)。除了合成地产生启动子和增强子的核酸序列之外，可结合本文中公开的组合物使用重组克隆和/或核酸扩增技术(包括PCRTM)产生序列(参见美国专利4,683,202、美国专利5,928,906，各自通过引用并入本文)。此外，预期也可以使用指导在非核细胞器(例如线粒体、叶绿体等)内的序列转录和/或表达的控制序列。
当然，利用有效指导DNA区段在选择用于表达的细胞类型、细胞器和生物体中进行表达的启动子和/或增强子将是非常重要的。分子生物学领域的技术人员通常知道使用启动子、增强子和细胞类型组合来进行蛋白质表达，例如参见Sambrook et al.(2001)，通过引用并入本文。所使用的启动子可以是组成型、组织特异性、诱导型和/或在合适的条件下有用的以指导引入的DNA区段的高水平表达，例如有利于大规模生产重组蛋白和/或肽。启动子可以是异源的或内源的。
组织特异性启动子或元件的特性以及表征其活性的测定法是本领域技术人员公知的。这样的区域的一些实例包括：人LIMK2基因(Nomoto et al.1999)、生长抑素受体2基因(Kraus et al.,1998)、小鼠附睾视黄酸结合基因(Lareyre et al.,1999)、人CD4(Zhao-Emonet et al.,1998)、小鼠α2(XI)胶原(Tsumaki,et al.,1998)、D1A多巴胺受体基因(Lee,et al.,1997)、胰岛素样生长因子II(Wu et al.,1997)、人血小板内皮细胞黏附分子-1(Almendro et al.,1996)。
编码序列的有效翻译也可需要特定的起始信号。这些信号包括ATG起始密码子或邻近序列。可能需要提供包括ATG起始密码子的外源翻译控制信号。本领域普通技术人员将能够容易地对此进行确定并提供所需信号。众所周知，起始密码子必须与期望的编码序列的阅读框“同框”以确保整个插入物的翻译。外源翻译控制信号和起始密码子可以是天然的或合成的。通过包含合适的转录增强子元件可增强表达效率。
在本公开内容的某些实施方案中，使用内部核糖体进入位点(internal ribosomeentry site，IRES)元件用来产生多基因或多顺反子信息(message)。IRES元件能够绕过5’甲基化Cap依赖性翻译的核糖体扫描模型并在内部位点开始翻译(Pelletier andSonenberg,1988)。已经描述了来自细小核糖核酸病毒科的两个成员(脊髓灰质炎和脑心肌炎)的IRES元件(Pelletier and Sonenberg,1988)，以及来自哺乳动物信息的IRES(Macejak and Sarnow,1991)。IRES元件可与异源开放阅读框连接。多个开放阅读框架可以一起转录，每个由IRES分隔开，从而产生多顺反子信息。凭借IRES元件，每个开放阅读框是核糖体可及的以进行有效翻译。使用单个启动子/增强子转录单个信息，多基因可以有效表达(参见美国专利5,925,565和5,935,819，通过引用并入本文)。
载体可包含多克隆位点(multiple cloning site，MCS)，其是包含多个限制酶位点的核酸区域，其中任一个可与标准重组技术结合使用来消化载体。参见Carbonelli etal.,1999,Levenson et al.,1998,and Cocea,1997，通过引用并入本文。“限制酶消化”是指用仅在核酸分子中的特定位置发挥功能的酶对核酸分子进行催化切割。这些限制酶中的许多是可商购的。这样的酶的使用是本领域技术人员广泛理解的。通常，使用在MCS内切割的限制性酶将载体线性化或片段化，以使外源序列能够连接至载体。“连接”是指在两个核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程，所述两个核酸片段可彼此连续或可不连续。涉及限制酶和连接反应的技术是重组技术领域普通技术人员所公知的。
大多数转录的真核生物RNA分子将经历RNA剪接以从初级转录物除去内含子。包含基因组真核序列的载体可能需要供体和/或接受体剪接位点以确保转录物的正确加工用于蛋白质表达(参见Chandler et al.,1997，通过引用并入本文)。
本公开内容的载体或构建体将通常包含至少一种终止信号。“终止信号”或“终止子”由通过RNA聚合酶参与RNA转录物的特异性终止的DNA序列构成。因此，在某些实施方案中，考虑了结束RNA转录物产生的终止信号。终止子可能是在体内达到期望信使水平所必需的。
在真核生物系统中，终止子区域还可包含特异性DNA序列，该序列允许新转录物的位点特异性切割以暴露多腺苷酸化位点。其发出信号使特化的内源聚合酶将一段约200个A残基(polyA)的序列添加至转录物的3’端。用这种poly A尾部修饰的RNA分子似乎更稳定并且更有效地翻译。因此，在涉及真核生物的另一些实施方案中，优选地，终止子包含用于RNA切割的信号，并且更优选地，终止子信号促进信使的多腺苷酸化。终止子和/或聚腺苷酸化位点元件可用来提高信息水平和/或使从该盒通读到其他序列中减至最小。
预期用于本公开内容的终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何已知的转录终止子，包括但不限于例如基因的终止序列，例如牛生长激素终止子或病毒终止序列，例如SV40终止子。在某些实施方案中，终止信号可能缺少可转录或可翻译的序列，例如由于序列截短。
在表达中，特别是在真核生物表达中，通常将包含多腺苷酸化信号以实现转录物合适的多腺苷酸化。不认为多腺苷酸化信号的性质是成功实践本公开内容的关键，和/或可采用任何这样的序列。一些优选的实施方案包括SV40多腺苷酸化信号和/或牛生长激素多腺苷酸化信号，其在多种靶细胞中是方便的和/或已知能发挥良好的功能。多腺苷酸化可提高转录物的稳定性或可促进胞质运输。
为了在宿主细胞中增殖载体，其可包含一个或更多个复制起始位点(一般被称为“ori”)，其是在此处起始复制的特异性核酸序列。或者，如果宿主细胞是酵母，则可以使用自主复制序列(autonomously replicating sequence，ARS)。
在本公开内容的某些实施方案中，可通过在表达载体中包含标志物来体外或体内鉴定包含本公开内容的核酸构建体的细胞。这样的标志物将赋予细胞可鉴定的变化，从而允许容易地鉴定包含表达载体的细胞。一般来说，选择标志物是赋予允许选择的特性的标志物。阳性选择标志物是其中标志物的存在允许其选择的标志物，而阴性选择标志物是其中标志物的存在阻止其选择的标志物。阳性选择标志物的一个实例是抗药性标志物。
通常包含药物选择标志物有助于转化体的克隆和鉴定，例如赋予针对新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、博来霉素(zeocin)和组氨醇之抗性的基因是有用的选择标志物。除了赋予允许基于条件实施来区分转化体之表型的标志物之外，还预期了其他类型的标志物，包括筛选性标志物，例如GFP，其基础是比色分析。或者，可利用筛选性酶，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase，tk)或氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase，CAT)。本领域技术人员还知道如何使用免疫标志物，可能与FACS分析结合。认为所使用的标志物不重要，只要其能够与编码基因产物的核酸同时表达即可。选择标志物和筛选性标志物的另外的实例是本领域技术人员公知的。
IV.肌肉疾病
本公开内容发现了在分析和治疗肌肉病症中的特别的相关性。特别是肌细胞不能产生正常功能所需的足够(或任何)基因产物或者其中产生异常蛋白质的、非常需要使用体细胞融合来递送基因或蛋白质的肌肉病症。
以下是可根据本公开内容解决的一些病症的一般性讨论。
A.肌营养不良
肌营养不良(Muscular Dystrophy，MD)是使肌肉骨骼系统变弱并阻碍移动的一组肌肉疾病。肌营养不良的特征在于进行性骨骼肌无力、肌肉蛋白质缺陷以及肌细胞和组织的死亡。
在19世纪60年代，在医学期刊中对逐渐变弱、失去行走能力和早年死亡的男孩的描述变得更加突出。在接下来的十年中，法国神经病学家纪尧姆·迪谢内(GuillaumeDuchenne)全面描述了13名患有该疾病最常见和最严重形式的男孩，所述疾病现在都以他的名字命名-迪谢内肌营养不良。
很快就发现所述疾病有多于一种的形式。另一些主要形式是：贝克肌营养不良、肢带型肌营养不良、先天性肌营养不良、面肩肱型肌营养不良、强直性肌营养不良、眼咽肌营养不良、远端肌营养不良和Emery-Dreifuss肌营养不良。尽管雌性可能是疾病基因的携带者，但这些疾病主要影响雄性。大多数类型的MD是在身体系统(包括心脏、胃肠系统、神经系统、内分泌腺、眼和脑)中表现的多系统病症。
除了上面列出的九种主要类型的肌营养不良之外，还鉴定了几种MD样病症。在具有其他形式的MD和MD样病症的个体中察觉到正常的智力、行为、肠和性功能。患有易感性智力缺陷的受MD影响的个体通过分子特征诊断，但不是通过与失能相关的问题来诊断。然而，严重受DMD影响的患者的三分之一可能有认知缺陷、行为、视力和言语问题。
这些病症通常是遗传的，并且不同的肌营养不良遵循不同的遗传模式。然而，在受到DMD影响的人的约33％中，在产前阶段也可能有肌养蛋白基因突变和营养缺陷(没有遗传史)。迪谢内和贝克类型的肌营养不良的主要原因是正确地产生功能性蛋白质肌养蛋白和肌养蛋白相关的蛋白质复合物的肌组织的细胞骨架损伤。
肌养蛋白蛋白质在肌纤维膜中发现；它的螺旋性使它像弹簧或减震器一样起作用。肌养蛋白连接称为肌膜的肌细胞质膜的肌动蛋白(细胞骨架)和肌养蛋白聚糖(胞外)。除了机械稳定之外，肌养蛋白还调节钙水平。
肌营养不良的诊断基于肌肉活检、肌酸磷酸激酶(creatine phosphokinase，CpK3)增多、肌电图、心电图和DNA分析的结果。
身体检查和患者的病史将帮助医生确定肌营养不良的类型。特定的肌肉群受不同类型的肌营养不良的影响。
通常，肌肉量减少(消耗)，这可能很难看到，因为一些类型的肌营养不良会导致脂肪和结缔组织的积聚，使肌肉看起来更大。这被称为假性肥大。
尽管用反义寡核苷酸取得了显著的进展，但没有已知的肌营养不良的治疗方法。物理治疗、作业治疗、矫正干预(例如踝足矫形器)、言语治疗和矫形器械(例如轮椅和站立支架)可能是有帮助的。不活动(例如卧床休息、久坐)和增加肌纤维肥大的健美运动努力会使疾病恶化。
对于任何形式的肌营养不良都没有特定的治疗。物理治疗、有氧训练、低强度蛋白同化甾类、泼尼松补充剂可有助于预防挛缩和保持肌张力。在一些情况下，可能需要矫形器(用于支撑的矫形器具)和矫正整形外科手术以改善生活质量。Emery-Dreifuss肌营养不良和强直性肌营养不良引起的心脏问题可能需要起搏器。在强直性肌营养不良中发生的肌强直(强烈收缩之后肌肉的延迟松弛)可用药物(例如奎宁、苯妥英或美西律)治疗，但是未发现实际的长期治疗。
作业治疗有助于患有MD的个体尽可能在最独立的水平参与他/她的日常生活活动(自我给食、自我护理活动等)和休闲活动。这可通过使用自适应设备或使用能量守恒技术来实现。作业治疗可以在家庭或工作中实现人的环境的改变以提高个体的功能和可达性。作业治疗师还解决了可能伴随MD的社会心理变化和认知下降，以及为家庭和个体提供关于疾病的支持和教育。
建议高膳食摄入瘦肉、海鲜食品、豆类、橄榄油、抗氧化剂；例如绿叶蔬菜和青椒，以及水果如蓝莓、樱桃等。还建议减少摄入精制食品、反式脂肪、含咖啡因和酒精饮料；同样地检查任何食物过敏。
在患者的整个生命跨度中，诊断、神经病学、GI-营养、呼吸护理、心脏护理、整形、心理社会、康复和口腔护理形成疾病管理不可或缺的一部分。
患有肌营养不良的人的预后根据病症的类型和进展而变化。一些病例可能是轻微的，并且在正常生命跨度中进展非常缓慢，而另一些产生严重的肌无力、功能失能和行走能力丧失。一些患有肌营养不良的儿童在婴儿期死亡，而另一些生活到成年期，只有中度失能。受影响的肌肉各不相同，但可以在骨盆、肩膀、脸或其他地方周围。肌营养不良可以影响成年人，但更严重的形式倾向于发生在早期儿童时期。
B.肌萎缩侧索硬化
肌萎缩侧索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，有时称为Lou Gehrig’病，在任何给定时间都会影响多达20,000名美国人，其中每年在美国诊断出5,000例新病例。ALS影响所有种族和民族背景的人。男性被诊断患有该疾病的可能性是女性的约1.5倍。ALS在生命的全盛时期出现，最常诊断出的人的年龄为40至70岁。然而，个体可能在较小年龄和较大年龄时被诊断出来。大约90％至95％的ALS病例随机发生，这意味着个体没有该疾病的家族史，并且其他家庭成员并不处于感染该疾病的提高的风险之中。在约5％至10％的ALS病例中，存在该疾病的家族史。
ALS是一种进行性神经病学疾病，攻击控制随意肌肉的神经元。在ALS中丧失的运动神经元是位于脑、脑干和脊髓中的特异化神经细胞。这些神经元充当从神经系统到身体肌肉的连接，并且它们的功能是正常肌肉运动所需的。肌萎缩侧索硬化导致脑和脊髓中的运动神经元退化，从而丧失启动和向身体肌肉发送信息的能力。当肌肉变得无法发挥作用时，它们会逐渐萎缩和痉挛。肌萎缩侧索硬化可从非常微妙的症状(例如受影响的肌肉中的无力)开始。这种无力最初出现的地方因人而异，但随着疾病的进展，无力和萎缩会延伸至身体的其他部分。
最初的症状可能只影响一条腿或手臂，导致行走或跑步时的笨拙和跌撞。对象也可遭受难以抬起物体或进行需要手灵巧性的任务。最终，个体将无法站立或行走或使用手和手臂进行日常生活活动。在疾病的后期阶段，当膈肌和胸壁中的肌肉变得太弱时，患者需要呼吸机来呼吸。大多数患有ALS的人通常在被诊断之后3至5年死于呼吸衰竭；然而，一些人在诊断之后存活了10年或更长时间。
也许ALS最具讽刺意味的是，它不损害人的思维，因为这种疾病只影响运动神经元。个性、智力、记忆和自我意识不受影响，视觉、嗅觉、触觉、听觉和味觉也不受影响。然而与此同时，ALS导致个体大声且清晰地说话的能力的严重缺陷，并最终完全阻止说话和发声。早期与言语相关的症状包括鼻音语言特性、难以发音和难以交谈。随着呼吸的肌肉变弱，对于患者来说，说话足够大声到被理解变得困难，并且最终，广泛的肌肉萎缩完全消除了说话的能力。患者还经历咀嚼和吞咽困难，其随着时间的推移而增进到需要饲管的程度。
C.庞贝氏症
糖原贮积病II型(也称为庞贝氏症或酸性麦芽糖酶缺乏症)是一种常染色体隐性代谢病症，其破坏全身的肌肉和神经细胞。其是由溶酶体酸α-葡糖苷酶缺乏导致的溶酶体中糖原积累引起。其是唯一一种具有溶酶体代谢缺陷的糖原贮积病，并且也是1932年由荷兰病理学家J.C.Pompe鉴定的第一种糖原贮积病。糖原的积累导致全身的进行性肌无力(肌病)，并影响多种身体组织，特别是在心脏、骨骼肌、肝和神经系统中。
也有例外，但α-葡糖苷酶的水平决定了个体可能具有的GSD II的类型。在个体的肌肉中存在更多的α葡糖苷酶意味着症状在生命的较后期出现并且进展更慢。基于症状发生的年龄，GSD II大致分为两种发病形式。婴儿期发病形式通常在4至8个月时诊断出来；肌肉看起来正常，但是松弛且虚弱，阻止他们抬起头或翻身。随着疾病的进展，心肌变厚并逐渐衰竭。在没有治疗的情况下，通常会因心力衰竭和呼吸衰弱而死亡。晚/较晚发病形式比婴儿期发病形式晚一至两年发生并且进展更慢。最初的症状之一是从腿部开始的肌力逐渐降低并且移动至躯干和手臂中的较小肌肉，例如膈肌和呼吸所需的其他肌肉。呼吸衰竭是最常见的死因。心肌和节律紊乱的扩大并不是重要的特征，但在一些情况下确实会发生。
婴儿期形式通常在生命的最初几个月内就医。通常呈现的特征是心脏增大(92％)、肌张力低下(88％)、心肌病(88％)、呼吸窘迫(78％)、肌无力(63％)、给食困难(57％)和无法成长(53％)。主要临床发现包括松弛的婴儿外观、延迟的运动里程碑、和给食困难。可存在中度肝肿大。面部特征包括巨舌症、张开的嘴巴、睁大的眼睛、鼻翼扩张(由于呼吸窘迫)和面部肌肉张力差。心肺受累表现为呼吸速率提高、使用副肌呼吸、复发性胸部感染、左下区空气进入减少(由于心脏增大)、心律失常和心力衰竭的证据。未治疗病例的死亡中位年龄为8.7个月，并且通常是由于心肺衰竭。
这种形式与婴儿期不同主要在于相对缺乏心脏受累。发病更加隐伏并且具有更缓慢的进展。心脏受累可能发生，但比婴儿期形式更温和。骨骼受累在下肢中更为突出。晚发病的特征包括：咳嗽受损、复发性胸部感染、肌张力低下、进行性肌无力、延迟的运动里程碑、吞咽或咀嚼困难以及肺活量降低。预后取决于症状的发病年龄，较好的预后与晚发病有关。
诊断方法包括胸部X射线、心电图和超声心动图显像。典型的发现是具有非特异性传导缺陷的心脏增大的那些。生化研究包括血清肌酸激酶(通常提高10倍)和血清醛缩酶、天冬氨酸转氨酶、丙氨酸转氨酶和乳酸脱氢酶升高较少。通过估计皮肤活组织检查(成纤维细胞)、肌肉活组织检查(肌细胞)或白细胞中的酸性α葡糖苷酶活性来进行诊断。样品的选择取决于诊断实验室中可获得的设施。在晚发病形式中，研究的结果与婴儿期形式的那些类似，但需要注意的是肌酐激酶在一些情况下可能是正常的。诊断是通过估计合适样品中的酶活性来进行的。
该疾病是由染色体17长臂上17q25.2至q25.3(碱基对75,689,876至75,708,272)处的基因突变(酸性α-葡糖苷酶：也称为酸性麦芽糖酶)引起的。目前描述的突变数量(2010年)为289个，其中67个为非致病性突变并且197个为致病突变。其余的仍在被评价他们与疾病的关系。该基因跨越约20kb并且包含20个外显子，其中第一个外显子是非编码的。推定的催化位点结构域的编码序列在中间被101bp的内含子中断。启动子具有“管家”基因的特征。GC含量很高(80％)并且缺乏明显的TATA和CCAAT基序。
大多数病例似乎是由于三种突变。转换(T→G)突变是患有这种病症的成年人中最常见的。这种突变中断RNA剪接位点。该基因编码一种蛋白质-酸性α-葡糖苷酶-其是一种溶酶体水解酶。该蛋白质是通常降解糖原、麦芽糖和异麦芽糖中的α-1,4和α-1,6键的酶并且是降解1％至3％细胞糖原所需的。这种酶的缺乏导致受影响个体中溶酶体和细胞质中结构正常的糖原的积累。溶酶体内过多的糖原贮积可能会阻止其他细胞器的正常功能并导致细胞损伤。
对症治疗心脏和呼吸系统并发症。物理和作业治疗可能对一些患者有益。饮食的改变可能会暂时改善，但不会改变疾病的进程。遗传咨询可以为家庭提供有关未来怀孕风险的信息。
2006年4月28日，美国食品和药物管理局(US Food and Drug Administration)批准了肌酶(Myozyme)(alglucosidase alfa,rhGAA)的生物许可申请(Biologic LicenseApplication，BLA)，这是杜克大学研究人员团队开发的第一种用于患有庞贝氏症的患者的治疗。这是基于使用在中国仓鼠卵巢细胞中产生的生物活性重组人alglucosidase alfa的酶替代治疗。肌酶属于FDAOrphan药物指定并在优先审查下获得批准。FDA批准肌酶用于通过静脉输注溶液进行施用。肌酶的安全性和有效性在39名患有庞贝氏症的婴儿期发病患者中在两个单独的临床试验中评价，所述患者第一次输注时的年龄为1个月至3.5岁。肌酶治疗明显延长无呼吸机存活和总体存活。早期诊断和早期治疗可导致好得多的结果。所述治疗并非没有副作用，所述副作用包括发烧、脸红、皮疹、心率加快甚至休克；但是，这些病症通常是可以控制的。
这种疾病的新治疗方案称为Lumizyme。Lumizyme和肌酶具有相同的通用成分(Alglucosidase Alfa)和制造商(Genzyme Corporation)。这两种产品之间的区别在于制造过程。当今，肌酶使用160升生物反应器制造，而Lumizyme使用4000升生物反应器。由于制造过程的不同，FDA声称这两种产品在生物学上是不同的。此外，Lumizyme是FDA批准的，作为用于晚发病(非婴儿期)的庞贝氏症的替代治疗而没有8岁及以上患者的心脏增大证据。肌酶被FDA批准用于婴儿期发病的庞贝氏症的替代治疗。患有庞贝氏症的个体的预后根据症状的发病和严重程度而变化。在没有治疗的情况下，该疾病在婴儿和幼儿中特别致命。
有助于分解葡萄糖的肌酶(alglucosidase alfa)是人酶酸性α-葡糖苷酶的重组形式，并且目前也用于替代缺失的酶。在包含用酶替代治疗(enzyme replacementtherapy，ERT)进行治疗的患有庞贝氏症的患者的最大队列的研究中，迄今为止的结果表明，与未经治疗的历史对照群体相比，肌酶治疗明显延长了患有婴儿期发病的庞贝氏症患者的无呼吸机存活和总体存活。此外，该研究表明，在6个月大之前开始ERT(这可以通过新生儿筛查来推进)显示出降低与这种破坏性病症相关的死亡率和失能的巨大希望。中国台湾和美国的几个州已开始进行新生儿筛查，这样的方案在早期诊断和早期开始治疗中的结果显著改善了该疾病的结果；这些婴儿中的许多已达到正常的运动发育里程碑。
影响治疗反应的另一个因素是针对输注酶的抗体的产生，其在完全缺乏酸性α-葡糖苷酶的庞贝氏婴儿中特别严重。消除这些抗体的免疫耐受治疗改善了治疗效果。
晚发病治疗研究(Late Onset Treatment Study，LOTS)于2010年发表。该研究旨在评价aglucosidase alfa在患有庞贝氏症的青少年和成年患者中的安全性和有效性。LOTS是一项随机、双盲、安慰剂对照研究，在美国和欧洲的8个主要地点招募了90名患者。参与者每隔一周接受一次aglucosidase alfa或安慰剂，持续18个月。研究参与者的平均年龄为44岁。结果显示，在78周时，与在6分钟内的行走距离减少3米的安慰剂组相比，用aglucosidase alfa治疗的患者在6分钟内的行走距离平均增多约25米(P＝0.03)。安慰剂组未显示出与基线相比的任何改善。在两组中在6分钟内行走的平均基线距离为约325米。用aglucosidase alfa治疗的患者的组中预测的用力肺活量百分比在78周时提高了1.2％。相比之下，在安慰剂组中降低了约2.2％(P＝0.006)。
D.横纹肌肉瘤
横纹肌肉瘤，通常称为RMS，是一种癌症类型，特别是肉瘤(结缔组织癌)，其中癌细胞被认为是由骨骼肌祖细胞产生的。还可发现其附着于肌组织、包裹在肠周围或在任何解剖学位置中。大多数发生在天然缺乏骨骼肌的区域，例如头、颈和泌尿生殖道。
其两种最常见的形式是胚胎性横纹肌肉瘤和肺泡横纹肌肉瘤。在较年幼的儿童中更常见的前者中，癌细胞类似于典型的6至8周胚胎的那些。在较大的儿童和青少年中更常见后者中，癌细胞类似于典型的10至12周胚胎的那些。
横纹肌肉瘤是一种相对罕见的癌症。其在1至5岁的儿童中最常见，并且在15至19岁的青少年中也有发现，尽管这更为罕见。这种癌症也是成人癌症，但很罕见。St.Jude儿童研究医院报告，横纹肌肉瘤是儿童中最常见的软组织肉瘤。软组织肉瘤占儿童癌症的约3％。
横纹肌肉瘤的诊断由病理学家做出，他或她将在显微镜下检查肿瘤的活组织检查，并基于肿瘤细胞的形态(外观)和免疫组织化学染色的结果得出横纹肌肉瘤的诊断。横纹肌肉瘤的诊断取决于对朝向骨骼肌细胞的分化的识别。蛋白质myoD1和肌细胞生成蛋白是通常在发育中的骨骼肌细胞中发现的转录因子蛋白质，其在肌肉成熟并且变得受神经支配之后消失。因此，myoD1和肌细胞生成蛋白通常未在正常骨骼肌中被发现，并且用作横纹肌肉瘤的有用的免疫组织化学标志物。早期表现可被误诊为对类固醇治疗无反应的假瘤。
显微照片显示由透明纤维状隔膜分离的肿瘤细胞结节(50×，HE染色)。插图：具有深染的核和微少的细胞质的松散的大肿瘤细胞(200×，HE染色)。诊断为耳后先天性肺泡横纹肌肉瘤。存在数种不同的横纹肌肉瘤组织学亚型，每种亚型具有不同的临床和病理学特征。肿瘤的预后和临床表现也部分依赖于组织学亚型。已经提出了多种分类系统用于对这些肿瘤进行细分。最近的分类系统“横纹肌肉瘤的国际分类(InternationalClassification of Rhabdomyosarcoma)”是由组间横纹肌肉瘤研究(IntergroupRhabdomyosarcoma Study)创建。该系统试图组合先前系统的元件并将这些与基于肿瘤类型的预后相关联。
存在数种另外的横纹肌肉瘤亚型，其不适合于国际分类方案。多形性横纹肌肉瘤通常发生在成人中而不是儿童中，因此不包含在该系统中。硬化性横纹肌肉瘤是一种罕见的横纹肌肉瘤亚型，最近由Folpe,et al.表征；它不包含在该系统中。虽然葡萄状和梭状细胞横纹肌肉瘤通常被认为是胚胎性横纹肌肉瘤的亚型，但它们比经典的胚胎性横纹肌肉瘤具有更有利的临床表现和预后。
横纹肌肉瘤的治疗由化疗、放射治疗和有时手术组成。取决于肿瘤的位置，手术以移除肿瘤可能是困难的或不可能的。如果没有转移的证据，则手术联合化疗和放疗提供最佳的预后。肿瘤未转移的患者通常具有良好的长期存活机会，这取决于肿瘤的亚型。StJude的儿童研究医院报告，超过70％被诊断有局限性横纹肌肉瘤的儿童长期存活。
E.肌少症
肌少症(来自希腊语，意为“肉体贫乏”)是骨骼肌量(25岁以后每年损失0.5％至1％)、质量和与衰老相关的力量的退化性损失。肌少症是虚弱综合征(frailty syndrome)的一个组成。截至2009年，医学文献中没有普遍接受的肌少症定义。
肌少症首要特征在于肌肉萎缩(肌肉尺寸减小)、以及肌组织“质量”降低，这是由这样的因素引起：肌纤维替换为脂肪、纤维化增多、肌肉代谢变化、氧化应激和神经肌肉接头的退化。结合起来，这些变化导致肌肉功能逐渐丧失和虚弱。
目前认为缺乏运动是肌少症的重要风险因素。不仅肌肉而且整个肌肉骨骼系统的肌肉、神经肌肉响应性、内分泌功能、血管毛细血管通路、腱、关节、韧带和骨取决于定期和终身运动以保持完整性。运动和活动的增多已被证明在肌少症的情况下是有益的，即使在非常老龄中也是如此。然而，即使是训练有素的运动员也会经历肌少症的影响。即使是在整个成年生活中继续训练和比赛的大师级运动员，也表现出肌肉量和力量的逐渐丧失，并且速度和力量事件的记录在30岁之后逐渐下降。
简单的周长测量不能提供足够的数据来确定个体是否遭受严重的肌少症。肌少症的特征还在于不同类型的肌纤维的周长减少。骨骼肌具有不同的纤维类型，其特征在于表达不同的肌球蛋白变体。在肌少症期间，“2型”纤维周长(II型)减少，“I型”纤维周长(I型)几乎没有减少，而失神经2型纤维通常通过慢1型纤维运动神经的神经再支配术转化为1型纤维。
卫星细胞是与肌纤维相邻的小的单个核的细胞。卫星细胞通常在受伤或运动时被激活。然后这些细胞分化并融合到肌纤维中，有助于维持肌纤维功能。一种理论是肌少症部分地由卫星细胞激活失败引起。因此，修复受损的肌肉或响应于营养信号的能力受损。
极度肌肉损失通常是由合成代谢信号(例如生长激素和睾酮)的减少以及分解代谢信号(例如促炎性细胞因子)的提升而导致。
由于体力活动减少和工业化人口寿命延长，肌少症正在成为一个主要的健康问题。肌少症可发展至老年人可能丧失其独立生活能力的程度。此外，肌少症是基于人群的研究中失能的重要独立预测因子，与差的平衡、步态速度、跌倒和骨折有关。肌少症可被认为是骨质疏松症的肌类似物，骨质疏松症是骨流失，也是由于不活动和运动阻碍造成的。骨质疏松症和肌少症的组合导致老年群体中经常可见的显著虚弱。
运动被认为在肌少症的治疗中非常引人注意。数项报告显示，骨骼肌在短期阻力运动中合成蛋白质的能力和容量提高。此外，报道了运动可改善老年对象的身体性能(力量和移动性)。然而，没有足够的研究证明这样的发现是长期的。
目前，没有批准用于治疗肌少症的药剂。可能的治疗策略包括使用睾酮或合成代谢类固醇，尽管考虑到前列腺症状的问题在男性中长期使用这些药剂存在争议，以及考虑到男性化的问题在女性中是基本上禁忌的。最近的实验结果显示睾酮治疗可诱发不良心血管事件。其他已被批准的药物已被证明在这种情况下几乎没有效果，包括药剂例如DHEA和人类生长激素。临床开发中的新的治疗在该领域具有很大的前景，包括选择雄激素受体调节剂(selective androgen receptor modulator，SARM)，如最近的研究所证明的。非类固醇SARM特别引人注意，因为它们在睾酮对肌肉的合成代谢作用之间表现出显著的选择，但似乎几乎没有促雄性作用，例如男性中的前列腺刺激或女性中的男性化。
V.基因转移
根据本公开内容，非肌细胞将经历Myomixer基因和任选的Myomaker基因和/或另外的目的基因(例如治疗基因)的基因转移。基因转移方法通常分为两大类：病毒和非病毒。这些方法的适用性将取决于主题的特定限制，例如被转移基因的大小和结构、以及遗传物质将被递送至其中的细胞的类型。本领域技术人员可从通常使用的无数不同的系统中作出适当的选择，其中许多系统是可商购的。以下是两种类型方法的一般讨论。
A.病毒转化
某些病毒载体有效感染或进入细胞、整合到宿主细胞基因组中并稳定表达病毒基因的能力已导致许多不同病毒载体系统的开发和应用(Robbins et al.,1998)。目前正在开发的病毒系统用作离体和体内基因转移的载体。例如，目前正在评价腺病毒、单纯疱疹病毒、逆转录病毒和腺相关病毒载体用于治疗疾病，例如癌症、囊性纤维化、戈谢病、肾病和关节炎(Robbins and Ghivizzani,1998；Imai et al.,1998；美国专利5,670,488)。根据具体的基因治疗应用，下面描述的多种病毒载体呈现特定的优点和缺点。
腺病毒载体。腺病毒包含线性双链DNA，其基因组大小为30至35kb(Reddy et al.,1998；Morrison et al.,1997；Chillon et al.,1999)。根据本公开内容的腺病毒表达载体包含腺病毒的基因工程化形式。腺病毒基因转移的优点包括感染广泛多种细胞类型(包括非分裂细胞)的能力、中等大小的基因组、易于操作、高感染性和生长至高滴度的能力(Wilson,1996)。此外，宿主细胞的腺病毒感染不会导致染色体整合，因为腺病毒DNA可以以附加体的方式复制，而没有与其他病毒载体相关的潜在遗传毒性。腺病毒也是结构上稳定的(Marienfeld et al.,1999)并且在广泛扩增之后未检测到基因组重排(Parks et al.,1997；Bett et al.,1993)。
腺病毒基因组的突出特征是早期区域(E1、E2、E3和E4基因)、中间区域(pIX基因、Iva2基因)、晚期区域(L1、L2、L3、L4和L5基因)、主要晚期启动子(major late promoter，MLP)、末端反向重复序列(inverted-terminal-repeat，ITR)和一个ψ序列(Zheng,et al.,1999；Robbins et al.,1998；Graham and Prevec,1995)。早期基因E1、E2、E3和E4在感染之后由病毒表达，并且编码调节病毒基因表达、细胞基因表达、病毒复制和细胞凋亡抑制的多肽。此外，在病毒感染期间，MLP被激活，导致晚期(L)基因的表达，编码腺病毒衣壳化所需的多肽。中间区域编码腺病毒衣壳的组分。腺病毒的末端反向重复序列(ITR；长度为100至200bp)是顺式元件，起复制起点的作用并且是病毒DNA复制所需的。腺病毒基因组的包装需要ψ序列。
产生用作基因转移载体的腺病毒的通用方法是缺失E1基因(E1-)，其参与E2、E3和E4启动子的诱导(Graham and Prevec,1995)。随后，可以重组插入治疗基因来代替E1基因，其中治疗基因的表达由E1启动子或异源启动子驱动。然后，E1-，复制缺陷型病毒在反式提供E1多肽的“辅助”细胞系(例如人胚胎肾细胞系293)中增殖。因此，在本公开内容中，可以方便地将转化构建体引入已经去除E1编码序列的位置。然而，构建体在腺病毒序列内的插入位置对于本公开内容并不重要。或者，可以删除E3区域、E4区域的部分或两者，其中将在真核细胞中可操作启动子的控制下的异源核酸序列插入腺病毒基因组中用于基因转移(美国专利5,670,488；美国专利5,932,210，各自通过引用明确并入本文)。
逆转录病毒载体。在本公开内容的某些实施方案中，考虑了使用逆转录病毒进行基因递送。逆转录病毒是包含RNA基因组的RNA病毒。当宿主细胞被逆转录病毒感染时，基因组RNA被逆转录成DNA中间体，其整合到感染细胞的染色体DNA中。这种整合的DNA中间体被称为原病毒。逆转录病毒的一个特别的优点是它们可以通过整合到宿主DNA中用目的基因(例如治疗基因)稳定地感染的分裂细胞，而不表达免疫原性病毒蛋白。理论上，整合的逆转录病毒载体将在感染的宿主细胞的生命内维持，表达目的基因。
逆转录病毒基因组和原病毒DNA具有三个基因：gag、pol和env，其以两个长末端重复(long terminal repeat，LTR)序列为侧翼。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)，并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。
本公开内容的重组逆转录病毒可以以这样的方式进行遗传修饰：天然病毒的一些结构感染基因已经被去除并替换为待递送至靶细胞的核酸序列(美国专利5,858,744；美国专利5,739,018，各自通过引用并入本文)。在用病毒感染细胞之后，病毒将其核酸注入细胞中，并且逆转录病毒遗传物质可整合到宿主细胞基因组中。然后转移的逆转录病毒遗传物质在宿主细胞内被转录并翻译成蛋白质。与其他病毒载体系统一样，在载体生产期间或在治疗期间具有复制能力的逆转录病毒的产生是一个主要问题。适用于本公开内容的逆转录病毒载体通常是有缺陷的逆转录病毒载体，所述有缺陷的逆转录病毒载体能够感染靶细胞、逆转录其RNA基因组、并将逆转录的DNA整合到靶细胞基因组中，但不能在靶细胞内复制以产生感染性的逆转录病毒颗粒(例如，转移到靶细胞中的逆转录病毒基因组的gag(编码病毒粒子结构蛋白的基因)和/或pol(编码逆转录酶的基因)是有缺陷的)。因此，原病毒和组装体转录成感染性病毒在合适的辅助病毒的存在下或在包含能够进行衣壳化而不会同时产生污染的辅助病毒的合适序列的细胞系中发生。
疱疹病毒载体。I型和II型单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus，HSV)包含约150kb的双链线性DNA基因组，编码70至80个基因。野生型HSV能够溶解地感染细胞并在某些细胞类型(例如神经元)中建立潜伏期。与腺病毒类似，HSV也可以感染多种细胞类型，包括肌肉(Yeung et al.,1999)、耳(Derby et al.,1999)、眼(Kaufman et al.,1999)、肿瘤(Yoon et al.,1999；Howard et al.,1999)、肺(Kohut et al.,1998)、神经元(Garrido etal.,1999；Lachmann and Efstathiou,1999)、肝(Miytake et al.,1999；Kooby et al.,1999)和胰岛(Rabinovitch et al.,1999)。
HSV病毒基因由细胞RNA聚合酶II转录并暂时受到调节，导致大约三个可辨别的阶段或动力学类别的基因产物的转录和随后的合成。这些基因阶段被称为立即早期(Immediate Early，IE)或α基因，早期(Early，E)或β基因和晚期(Late，L)或γ基因。在病毒基因组到达新感染的细胞的核之后，立即转录IE基因。这些基因的有效表达不需要先前的病毒蛋白质合成。需要IE基因的产物来激活转录并调节病毒基因组的剩余部分。
为了用于递送治疗基因，必须使HSV复制缺陷。已经描述了用于产生复制缺陷型HSV无辅助病毒细胞系的方案(美国专利5,879,934；美国专利5,851,826，各自通过引用整体明确并入本文)。一种IE蛋白，感染细胞多肽4(Infected Cell Polypeptide 4，ICP4)，也称为α4或Vmw175，对于病毒感染性和从IE转录到后期转录都是绝对需要的。因此，由于其复杂、多功能的性质以及在HSV基因表达调节中的核心作用，ICP4通常是HSV遗传研究的对象。
缺失ICP4的HSV病毒的表型研究表明这样的病毒可能对基因转移的目的有用(Krisky et al.,1998a)。删除ICP4使其成为基因转移理想选择的病毒的一个特性是它们只表达五个其他IE基因：ICP0、ICP6、ICP27、ICP22和ICP47(DeLuca et al.,1985)，而不表达编码指导病毒DNA合成的蛋白质以及病毒的结构蛋白的病毒基因。这种特性对于使基因转移之后对宿主细胞代谢或免疫应答的可能有害影响最小化是理想的。除ICP4之外，IE基因ICP22和ICP27的进一步缺失显著改善了HSV细胞毒性的降低并且阻止了早期和晚期病毒基因表达(Krisky et al.,1998b)。
已经在多种体外模型系统和体内中证明了HSV在基因转移中对于疾病例如以下的治疗潜力：帕金森病(Yamada et al.,1999)、视网膜母细胞瘤(Hayashi et al.,1999)、脑内和皮内肿瘤(Moriuchi et al.,1998)、B细胞恶性肿瘤(Suzuki et al.,1998)、卵巢癌(Wang et al.,1998)和迪谢内肌营养不良(Huard et al.,1997)。
腺相关病毒载体。腺病毒相关病毒(Adeno-associated virus，AAV)是细小病毒家族的成员，是一种越来越多地用于基因递送治疗的人病毒。AAV具有数个在其他病毒系统中未发现的有利特征。第一，AAV可以感染多种宿主细胞，包括非分裂细胞。第二，AAV可以感染来自不同物种的细胞。第三，AAV未与任何人或动物疾病相关，并且在整合时似乎不改变宿主细胞的生物学特性。例如，估计人群体的80％至85％暴露于AAV。最后，AAV在不同的物理和化学条件下都是稳定的，这适合于其自身生产、储存和运输要求。
AAV基因组是包含4681个核苷酸的线性单链DNA分子。AAV基因组通常包含内部非重复基因组，其在每个末端以长约145bp的末端反向重复序列(ITR)为侧翼。ITR具有多种功能，包括DNA复制的起源以及病毒基因组的包装信号。基因组的内部非重复部分包含两个大的开放阅读框，称为AAV复制(rep)和衣壳(cap)基因。rep和cap基因编码病毒蛋白质，其允许病毒复制并将病毒基因组包装成病毒粒子。从AAV rep区域Rep 78、Rep 68、Rep 52和Rep40(根据它们的表观分子量命名)表达家族的至少四种病毒蛋白质。AAV cap区域编码至少三种蛋白质，VP1、VP2和VP3。
AAV是辅助依赖性病毒，需要与辅助病毒(例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘)共感染以形成AAV病毒粒子。在没有与辅助病毒共感染的情况下，AAV建立了潜伏状态，其中病毒基因组插入宿主细胞染色体中，但不产生感染性病毒粒子。由辅助病毒进行的随后感染“拯救”整合的基因组，允许其复制并将其基因组包装成感染性AAV病毒粒子。尽管AAV可以感染来自不同物种的细胞，但是辅助病毒必须与宿主细胞是同一物种(例如，人AAV将在用犬腺病毒共感染的犬细胞中复制)。
已经通过删除AAV基因组的内部非重复部分并在ITR之间插入异源基因来工程化AAV以递送目的基因。异源基因可以与能够在靶细胞中驱动基因表达的异源启动子(组成型、细胞特异性或诱导型)功能性连接。为了产生包含异源基因的感染性重组AAV(rAAV)，用包含异源基因的rAAV载体转染合适的生产细胞系。生产细胞用具有AAV rep和cap基因的第二质粒在其各自的内源启动子或异源启动子的控制下同时转染。最后，用辅助病毒感染生产细胞。
慢病毒载体。慢病毒是复杂的逆转录病毒，其除了常见的逆转录病毒基因gag、pol和env之外还包含具有调节或结构功能的其他基因。较高的复杂性使病毒能够调节其生命周期，就像在潜伏感染过程中一样。慢病毒的一些实例包括人免疫缺陷病毒：HIV-1、HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过对HIV毒力基因进行多次减毒(例如，缺失基因env、vif、vpr、vpu和nef)产生慢病毒载体，使得载体在生物学上是安全的。
重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞并且可以用于体内和离体基因转移和核酸序列的表达二者。慢病毒基因组和原病毒DNA具有在逆转录病毒中发现的三种基因：gag、pol和env，其以两个长末端重复(LTR)序列为侧翼。gag基因编码内部结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白质；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)、蛋白酶和整合酶；并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5’和3’LTR用于促进病毒粒子RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所需的所有其他顺式作用序列。慢病毒具有另外的基因，包括vif、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx。
与5’LTR相邻的是基因组逆转录(tRNA引物结合位点)和病毒RNA有效衣壳化成颗粒(Psi位点)所需的序列。如果从病毒基因组中缺失衣壳化(或将逆转录病毒RNA包装成感染性病毒粒子)所需的序列，则顺式缺陷会阻止基因组RNA的衣壳化。然而，所得的突变体仍然能够指导所有病毒粒子蛋白质的合成。
慢病毒载体是本领域中已知的；参见Naldini et al.,(1996)；Zufferey et al.,(1997)；美国专利6,013,516；和5,994,136。通常，载体是基于质粒或基于病毒的，并且被配置为携带并入外来核酸所必需的序列，用于选择和将核酸转移到宿主细胞中。目的载体的gag、pol和env基因也是本领域中已知的。因此，将相关的基因克隆到所选择的载体中，然后用于转移目的靶细胞。
其他病毒载体。用于基因递送的病毒载体的开发和功用正在不断改进和发展。其他病毒载体例如痘病毒；例如牛痘病毒(Gnant et al.,1999；Gnant et al.,1999)，α病毒；例如，辛德毕斯病毒，赛姆利基森林病毒(Lundstrom,1999)，呼肠孤病毒(Coffey et al.,1999)和甲型流感病毒(Neumann et al.,1999)预期用于本公开内容并且可以根据目标系统的需求特性进行选择。
嵌合病毒载体。正在开发嵌合或杂交病毒载体用于治疗基因递送，并且预期用于本公开内容。已经描述了嵌合痘病毒/逆转录病毒载体(Holzer et al.,1999)、腺病毒/逆转录病毒载体(Feng et al.,1997；Bilbao et al.,1997；Caplen et al.,2000)和腺病毒/腺相关病毒载体(Fisher et al.,1996；美国专利5,871,982)。
这些“嵌合”病毒基因转移系统可以利用两种或更多种亲本病毒物种的有利特征。例如，Wilson et al.提供了嵌合载体构建体，其包含腺病毒的部分，AAV 5’和3’ITR序列和所选择的转基因，如下所述(美国专利5,871,983，通过引用明确并入本文)。
B.非病毒转化
认为用于转化用于本公开内容的细胞或组织的核酸递送的合适方法实际上包括可以引入核酸(例如DNA)的任何方法，如本文中所述或如本领域普通技术人员已知的。这样的方法包括但不限于直接递送DNA，例如通过注射(美国专利5,994,624、5,981,274、5,945,100、5,780,448、5,736,524、5,702,932、5,656,610、5,589,466和5,580,859，各自通过引用并入本文)，包括显微注射(Harland and Weintraub,1985；美国专利5,789,215，通过引用并入本文)；通过电穿孔(美国专利5,384,253，通过引用并入本文)；通过磷酸钙沉淀(Graham and Van Der Eb,1973；Chen and Okayama,1987；Rippe et al.,1990)；通过使用DEAE葡聚糖，然后使用聚乙二醇(Gopal,1985)；通过直接声波加载(Fechheimer et al.,1987)；通过脂质体介导的转染(Nicolau and Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolauet al.,1987；Wong et al.,1980；Kaneda et al.,1989；Kato et al.,1991)；通过微粒轰击(PCT申请号WO 94/09699和95/06128；美国专利5,610,042；5,322,783、5,563,055、5,550,318、5,538,877和5,538,880，并且各自通过引用并入本文)；通过与碳化硅纤维搅拌(Kaeppler et al.,1990；美国专利5,302,523和5,464,765，各自通过引用并入本文)；或通过PEG介导的原生质体的转化(Omirulleh et al.,1993；美国专利4,684,611和4,952,500，各自通过引用并入本文)；通过干燥/抑制介导的DNA摄取(Potrykus et al.,1985)。通过应用诸如这些的技术，细胞器、细胞、组织或生物体可以被稳定或瞬时转化。
注射：在某些实施方案中，可通过一次或更多次例如皮下、皮内、肌内、静脉内或腹膜内注射(即针注射)将核酸递送至细胞器、细胞、组织或生物体。注射疫苗的方法是本领域普通技术人员公知的(例如，注射包含盐水溶液的组合物)。本公开内容的另一些实施方案包括通过直接显微注射引入核酸。已经使用直接显微注射将核酸构建体引入非洲爪蟾卵母细胞(Harland and Weintraub,1985)。
电穿孔。在本公开内容的某些实施方案中，通过电穿孔将核酸引入细胞器、细胞、组织或生物体中。电穿孔涉及将细胞和DNA的混悬液暴露于高压放电。在该方法的一些变体中，使用某些细胞壁降解酶(例如果胶降解酶)，使靶接受者细胞比未处理的细胞更易于通过电穿孔转化(美国专利5,384,253，通过引用并入本文)。或者，可以使接受者细胞更易受通过机械伤害的转化的影响。
使用电穿孔转染真核细胞已经相当成功。已经以这种方式用人κ免疫球蛋白基因转染了小鼠前B淋巴细胞(Potter et al.,1984)，并且用氯霉素乙酰转移酶基因转染了大鼠肝细胞(Tur-Kaspa et al.,1986)。
为了通过电穿孔在细胞(例如植物细胞)中进行转化，可以使用易碎组织，例如细胞混悬培养物或胚性愈伤组织，或者可以直接转化未成熟胚胎或其他有机组织。在该技术中，通过将所选细胞暴露于果胶降解酶(果胶酶)或以受控的方式进行机械伤害，可部分降解所选细胞的细胞壁。已通过对完整细胞的电穿孔进行转化的一些物种的实例包括玉米(美国专利5,384,253；Rhodes et al.,1995；D’Halluin et al.,1992)、小麦(Zhou etal.,1993)、番茄(Hou and Lin,1996)、大豆(Christou et al.,1987)和烟草(Lee et al.,1989)。
也可使用原生质体进行植物细胞的电穿孔转化(Bates,1994；Lazzeri,1995)。例如，Dhir和Widholm在国际专利申请号WO 9217598(通过引用并入本文)中描述了通过对子叶来源的原生质体进行电穿孔来产生转基因大豆植物。已描述原生质体转化的物种的其他实例包括大麦(Lazerri,1995)、高粱(Battraw and Hall,1991)、玉米(Bhattacharjee etal.,1997)、小麦(He et al.,1994)和番茄(Tsukada,1989)。
磷酸钙。在本公开内容的另一些实施方案中，使用磷酸钙沉淀将核酸导入细胞。已经使用这种技术用腺病毒5DNA转染了人KB细胞(Graham and Van Der Eb,1973)。同样以这种方式，用新霉素标志物基因(Chen and Okayama,1987)转染了小鼠L(A9)、小鼠C127、CHO、CV-1、BHK、NIH3T3和HeLa细胞，并用多种标志物基因转染了大鼠肝细胞(Rippe et al.,1990)。
DEAE-葡聚糖：在另一个实施方案中，使用DEAE-葡聚糖，然后使用聚乙二醇将核酸递送到细胞中。以这种方式，将报告质粒导入了小鼠骨髓瘤和红白血病细胞(Gopal,1985)。
超声加载。本公开内容的另外的实施方案包括通过直接声波加载引入核酸。已经通过超声加载用胸苷激酶基因转染LTK-成纤维细胞(Fechheimer et al.,1987)。
脂质体介导的转染。在本公开内容的另一个实施方案中，核酸可以包载在脂质复合物(例如脂质体)中。脂质体是以磷脂双层膜和内部水性介质为特征的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分离的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水溶液中时，它们自发形成。脂质组分在形成封闭结构之前经历自身重排并包载脂双层之间的水和溶解的溶质(Ghoshand Bachhawat,1991)。还考虑了与Lipofectamine(Gibco BRL)或Superfect(Qiagen)复合的核酸。
脂质体介导的核酸递送和外来DNA的体外表达已经非常成功(Nicolau and Sene,1982；Fraley et al.,1979；Nicolau et al.,1987)。还已经证明了培养的鸡胚胎、HeLa和肝癌细胞中外来DNA的脂质体介导的递送和表达的可行性(Wong et al.,1980)。
在本公开内容的某些实施方案中，脂质体可以与血凝素病毒(HVJ)复合。已显示这有助于与细胞膜融合并促进脂质体包封的DNA进入细胞(Kaneda et al.,1989)。在另一些实施方案中，脂质体可以与核非组蛋白染色体蛋白(HMG-1)复合或联合使用(Kato et al.,1991)。在另一些实施方案中，脂质体可以与HVJ和HMG-1两者复合或联合使用。在另一些实施方案中，递送载剂可以包含配体和脂质体。
受体介导的转染：更进一步地，核酸可通过受体介导的递送载剂递送至靶细胞。这些利用大分子的选择摄取，其通过将在靶细胞中发生的受体介导的内吞作用进行。鉴于不同受体的细胞类型特异性分布，该递送方法为本公开内容补充了另一程度的特异性。
某些受体介导的基因靶向的载剂包含细胞受体特异性配体和核酸结合剂。另一些包含已与待递送的核酸有效连接的细胞受体特异性配体。已经将数种配体用于受体介导的基因转移(Wu and Wu,1987；Wagner et al.,1990；Perales et al.,1994；Myers,EPO0273085)，其确立了该技术的可操作性。已经描述了在另一哺乳动物细胞类型的背景下的特异性递送(Wu and Wu,1993；通过引用并入本文)。在本公开内容的某些方面，将选择配体以对应于在靶细胞群体上特异性表达的受体。
在另一些实施方案中，细胞特异性核酸靶向的载剂的核酸递送载剂组分可包含与脂质体组合的特异性结合配体。待递送的核酸容纳在脂质体内，并且特异性结合配体功能性地并入脂质体膜中。因此，脂质体将特异性结合靶细胞的受体并将内容物递送至细胞。已经显示这样的系统是功能性使用的系统，其中例如表皮生长因子(epidermal growthfactor，EGF)用于受体介导地将核酸递送至表现出EGF受体上调的细胞。
在另一些实施方案中，靶向的递送载剂的核酸递送载剂组分可以是脂质体本身，其优选包含一种或更多种指导细胞特异性结合的脂质或糖蛋白。例如，乳糖基神经酰胺(一种半乳糖末端脱唾液酸神经节苷脂)已并入脂质体中，并观察到肝细胞对胰岛素基因的摄取增多(Nicolau et al.,1987)。预期本公开内容的组织特异性转化构建体可以以类似的方式特异性地递送至靶细胞中。
C.接受者细胞
非肌接受者细胞实际上可以是任何细胞类型，但特别地可以是成纤维细胞(在皮肤、毛发等中丰富)或红细胞(理想的是循环和与肌肉接触)。还考虑了骨髓细胞和脂肪干细胞，因为这些细胞也是高度丰富的。另外，可以使用肌前体细胞，因为它们是与肌肉融合的“正常”细胞类型。
VI.治疗性治疗
本公开内容考虑使用表达Myomixer(和Myomaker)的非肌细胞将治疗基因递送至肌组织来治疗肌肉疾病。根据本发明人的知识，这是使用非肌细胞载体驱动肌特异性细胞融合的技术第一次变得可用。
在某些实施方案中，设想表达Myomixer/Myomaker和治疗基因的非肌细胞将被递送至对象中的位点或其附近，在那里肌细胞和/或组织缺乏一种或更多种基因产物，导致疾病表型。或者，可以使用组织相容性细胞来源或来自患者的细胞离体融合细胞，并且将其随后注射到疾病部位、部位的局部或部位的区域。在两种情况下，非肌细胞与肌细胞的融合都将治疗基因以及因此其基因产物递送至缺乏该基因产物的肌细胞，从而逆转或减少疾病表型。也可以全身地施用这些转化细胞。例如，可以收集骨髓细胞并强制Myomixer/Myomaker和治疗基因的表达，然后将这些细胞移植到患者中(即骨髓移植)。
A.CRISPR/Cas9
在本公开内容中特别目的是使用CRISPR/Cas9系统来校正DMD和其他遗传缺陷。CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)是包含碱基序列的短重复的DNA基因座。每个重复之后是来自先前暴露于病毒的“间隔区DNA”的短区段。在约40％测序的真细菌基因组和90％测序的古细菌中发现CRISPR。CRISPR通常与编码与CRISPR相关的蛋白质的cas基因相关。CRISPR/Cas系统是原核免疫系统，其赋予针对外来遗传元件(例如质粒和噬菌体)的抗性，并且提供获得性免疫的形式。CRISPR间隔区识别这些外源遗传元件(例如真核生物体中的RNAi)并使其沉默。
在1987年首次描述了细菌大肠杆菌(Escherichia coli)的重复序列。在2000年，在另外的细菌和古细菌中鉴定出类似的成簇重复序列，并称为短规则间隔重复序列(ShortRegularly Spaced Repeat，SRSR)。SRSR在2002年被重命名为CRISPR。发现其中一些编码推定的核酸酶或解旋酶蛋白的一组基因(cas或CRISPR相关基因)与CRISPR重复序列相关。
在2005年，三个独立的研究人员表明，CRISPR间隔区示出与几个噬菌体DNA和染色体外DNA(例如质粒)的同源性。这表明CRISPR/cas系统可在细菌的适应性免疫中起作用。Koonin和同事提出，间隔区充当RNA分子的模板，类似于使用称为RNA干扰的系统的真核细胞。
2007年，Barrangou,Horvath(Danisco的食品工业科学家)和另一些人表明，他们可以用间隔区DNA改变嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)对噬菌体攻击的抗性。Doudna和Charpentier独立地探索CRISPR相关蛋白以了解细菌如何在其免疫防御中部署间隔区。他们共同研究了一种更简单的CRISPR系统，其依赖于一种称为Cas9的蛋白质。他们发现细菌通过将间隔区和回文DNA转录为长RNA分子而对入侵噬菌体作出应答，然后细胞使用tracrRNA和Cas9将长RNA分子切割成称作crRNA的片段。
在2012年首次表明CRISPR在人细胞培养物中用作基因组工程/编辑工具。它已经被用于多种生物体，包括面包酵母(S.cerevisiae)、斑马鱼、线虫(C.elegans)、植物、小鼠和几种其他生物体。此外，CRISPR已被修饰从而制备使科学家们能够靶向和激活或沉默特定基因的可编程转录因子。现在可得到数以万计的引导RNA的文库。
2014年3月展示了CRISPR可以逆转活体动物中疾病症状的第一个证据，当时MIT研究人员治愈了罕见肝脏疾病的小鼠。自2012年以来，CRISPR/Cas系统已被用于基因编辑(沉默、增强或改变特定基因)，其甚至在真核生物像小鼠和灵长类动物中起作用。通过插入含有cas基因和特异性设计的CRISPR的质粒，可以在任何期望的位置切割生物体的基因组。
CRISPR重复序列的大小为24至48个碱基对。它们通常显示一些二重对称，这意味着形成二级结构例如发夹，但不是真正的回文结构。重复序列被相似长度的间隔区分开。一些CRISPR间隔区序列与来自质粒和噬菌体的序列完全匹配，尽管一些间隔区与原核生物的基因组匹配(自靶向间隔区)。响应于噬菌体感染，可以迅速添加新的间隔区。
CRISPR相关(cas)基因通常与CRISPR重复-间隔区阵列相关。截至2013年，已描述了超过四十个不同的Cas蛋白家族。在这些蛋白家族中，Cas1似乎在不同的CRISPR/Cas系统中是普遍存在的。cas基因和重复序列结构的特定组合已用于限定8种CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中一些与编码重复序列相关神秘蛋白(repeat-associated mysterious protein，RAMP)的另外的基因模块相关。在单个基因组中可存在多于一种CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的不规律分布表明该系统在微生物进化过程中经历水平基因转移。
外源DNA似乎由Cas基因编码的蛋白质加工成小元件(长度为约30个碱基对)，然后以某种方式将其插入靠近前导序列的CRISPR基因座中。来自CRISPR基因座的RNA组成型表达，并且被Cas蛋白加工成由具有侧翼重复序列的单独外源衍生序列元件构成的小RNA。RNA引导其他Cas蛋白在RNA或DNA水平上沉默外源遗传元件。证据表明CRISPR亚型之间的功能多样性。Cse(Cas亚型Ecoli)蛋白(在大肠杆菌(E.coli)中称为CasA-E)形成功能复合体Cascade，其将CRISPR RNA转录本加工成Cascade保留的间隔区-重复序列单元。在另一些原核生物中，Cas6加工CRISPR转录本。有趣的是，大肠杆菌中基于CRISPR的噬菌体灭活需要Cascade和Cas3，但不需要Cas1和Cas2。在激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和另一些原核生物中发现的Cmr(Cas RAMP模块)蛋白与小的CRISPR RNA形成功能性复合体，其识别和切割互补靶RNA。RNA引导的CRISPR酶被分类为V型限制酶。
还参见美国专利公开2016/0058889，其通过引用整体并入。
B.组合治疗
本公开内容的细胞还可与一种或更多种其他“标准”治疗组合使用。当组合提供时，这些组合物通常以有效实现一种或更多种疾病参数降低的组合量施用于对象。该过程可涉及使对象同时与药剂/治疗两者接触，例如使用包含两种药剂的单一组合物或药理学制剂，或使对象同时与两种不同的组合物或制剂接触。或者，一种治疗可以以数分钟至数周的间隔在其他治疗之前或之后进行。通常应保证每次递送之间的有效时期不会过期，从而使治疗仍能够对细胞/对象产生有利的组合作用。在这种情况下，预期可以在彼此约12至24小时内、彼此约6至12小时内或仅约12小时的延迟时间内使细胞与两种形式接触。然而，在一些情况下，可能希望显著延长治疗期，其中各施用之间时间相隔数天(2、3、4、5、6或7天)至数周(1、2、3、4、5、6、7或8周)。还可以想到，治疗的多于一次施用是期望的。
C.药物组合物和施用
在考虑治疗应用的情况下，制备适合于预期应用的形式的药物组合物是必要的。通常，这将需要制备基本上不含致热原(pyrogen)以及可能对人或动物有害的其他杂质的药物组合物。
通常期望使用适合的盐和缓冲剂来使递送载体稳定并允许递送载体被靶细胞摄取以及培养细胞用于融合。当重组细胞引入到患者中时也将使用缓冲剂。本公开内容的水性组合物包含溶解或分散在可药用载体或水性介质中的有效量的针对细胞的载体。这种组合物也被称作接种物。短语“可药用或药理学上可接受的”是指当向动物或人施用时不会产生不利的、过敏的、或其他不良反应的分子实体和组合物。本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与本公开内容的载体或细胞不相容，否则其在治疗组合物中的使用均被考虑。还可将补充活性成分并入到组合物中。
本公开内容的活性组合物可包括经典药物制剂。根据本公开内容的这些组合物的施用将通过任何常见途径，只要靶组织通过该途径可及即可。这样的途径包括经口、经鼻、口含、经直肠、经阴道或表面途径。或者，施用可通过原位、皮内、皮下腹膜内或静脉内注射。肌内注射将是优选的。这样的组合物通常会作为可药用组合物施用。
活性化合物还可胃肠外或腹膜内施用。作为游离碱或者可药用盐的活性化合物的溶液可在与表面活性剂(例如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可在甘油、液体聚乙二醇、及其混合物中和在油中制备分散体。在普通储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物的生长。
适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。在所有情况下，所述形式必须是无菌的，并且必须是流体的，程度为存在易注射性。其必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须防止微生物(例如细菌和真菌)的污染作用而保存。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。例如，可通过使用涂层(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下保持所需要的粒径和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。可通过多种抗细菌剂和抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来实现防止微生物的作用。在许多情况下，其将优选包括等张剂，例如糖或氯化钠。通过在组合物中使用延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可实现可注射组合物的延长吸收。
通过将适当溶剂中所需量的活性化合物与上面列举的多种其他成分根据需要合并、随后过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常来说，通过将多种无菌活性成分并入到包含基础分散介质和来自上面列举的那些所需其他成分的无菌载剂中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，这由其经预先无菌过滤溶液产生活性成分加任何另外的期望成分的粉末。
本文中使用的“可药用载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质的用途在本领域中是公知的。除非任何常规介质或试剂与活性成分不相容，否则其在治疗组合物中的使用均被考虑。还可将补充活性成分并入到组合物中。
对于经口施用，本公开内容的多肽可以并入赋形剂并且以不可摄取的漱口剂和洁齿剂的形式使用。漱口剂可通过将所需量的活性成分并入合适溶剂(例如硼酸钠溶液(Dobell溶液))中来制备。或者，可将活性成分并入包含硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的抗菌洗剂(antiseptic wash)中。活性成分也可分散在洁齿剂中，包括：凝胶剂、糊剂、散剂和浆料。活性成分可以以治疗有效量添加至糊状洁齿剂，其可包含水、黏合剂、摩擦剂(abrasive)、矫味剂、发泡剂和润湿剂。
在配制之后，溶液将以与剂量制剂相容的方式并且以例如治疗有效的量施用。制剂容易地以多种剂型施用，例如可注射溶液、药物释放胶囊剂等。对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，如果需要的话，溶液应适当缓冲，并且液体稀释剂首先用足够的盐水或葡萄糖使其等张。在这个方面，可使用的无菌水性介质是本领域技术人员根据本公开内容已知的。例如，可将一个剂量溶解在1ml等张NaCl溶液中，并将其添加至1000ml的皮下输注流体(hypodermoclysis fluid)，或者注射在建议的输注部位(参见例如“Remington’sPharmaceutical Sciences,”15th Ed.,1035-1038and1570-1580)。根据待治疗对象的状况，将必然会发生剂量上的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员将确定用于个体对象的适当剂量。此外，对于人施用，制剂应符合FDA生物制品标准局(FDAOffice ofBiologicsstandards)要求的无菌性、致热原性、一般安全性和纯度标准。
VIII.药盒
为了在本文中描述的应用中使用，药盒也在本公开内容的范围内。这样的药盒可包含载体、包装或容器，其被分隔以容纳一个或更多个容器，例如小瓶、管等，每个容器包含待用于所述方法的单独元件之一，特别地，Myomixer表达构建体或包含其的转化细胞任选地还包含Myomaker表达构建体或包含其的转化细胞。本公开内容的药盒通常包含上述容器和一个或更多个其他容器，所述其他容器包含从商业终端使用者角度期望的物质，包括缓冲剂、稀释剂、过滤器、针、注射器和具有使用说明的包装插页。此外，可在容器上提供标签以指示该组合物用于特定治疗应用，并且还可指示体内或体外用途的指导，例如上述的那些。指导和/或其他信息也可包含在药盒所包含的插页上。
IX.实施例
包含以下实施例来进一步说明本公开内容的多种方面。本领域技术人员应该理解，以下实施例中公开的技术代表发明人发现的在本公开内容的实践中很好地发挥作用的技术和/或组合物，并因此其可被认为是构成其实践的一些优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应理解，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对所公开的具体实施方案进行多种改变并仍然获得相同或相似的结果。
实施例1-方法
慢病毒文库的产生和C2C12细胞的感染。小鼠GeCKOv2 CRISPR敲除合并的文库由Feng Zhang惠赠(Addgene质粒#1000000052)(Sanjana et al.,2014)。对于文库慢病毒产生，将1.8×107Lenti-X 293T细胞(Clontech,目录号632180)在25ml DMEM(包含1％青霉素/链霉素，10％FBS)中置于15cm组织培养板中。12小时之后，使用FuGENE6(Promega，#E2692)和16.9μg psPAX2质粒、5.6μg pMD2.G质粒和22.5μg GeCKO质粒文库进行转染。两天之后，将包含慢病毒的上清液通过0.45μm过滤器过滤，并按照制造商的方案用Lenti-XConcentrator(Clontech，PT4421-2)浓缩。psPAX2载体由Didier Trono惠赠(Addgene质粒#12260)。pMD2.G载体由Didier Trono惠赠(Addgene质粒#12259)。将一部分新鲜制备的慢病毒用于测量滴度。简而言之，将C2C12细胞用不同体积的病毒储液感染两天，然后再用嘌呤霉素选择(2μg/ml)两天。测量细胞存活并将其称为感染率。基于病毒滴度，使用调整量的病毒储液感染C2C12细胞，目标MOI为0.2，确保大多数细胞并入少于2个慢病毒颗粒。感染之后两天，添加最终浓度为2μg/ml的嘌呤霉素(Invitrogen)来选择感染的细胞2天。选择之后，将细胞转换至DMEM(包含1％青霉素/链霉素)中的2％马血清以分化一周，在分化的第3天更换新鲜的培养基。在分化之后，通过在37℃下用0.00625％胰蛋白酶(在PBS中稀释)孵育5分钟将肌管从板上分离，并用PBS轻轻洗涤板两次，从中将分离的细胞合并并在300xg下离心5分钟。然后用0.25％胰蛋白酶分离成肌细胞并用PBS洗涤两次以收集所有的细胞，将其在300xg下离心5分钟。
基因组DNA纯化和制备用于读出测序的文库。根据制造商的说明使用MasterPureTM DNA纯化试剂盒(MC85200)纯化来自成肌细胞和肌管的基因组DNA。本发明人使用Herculase II Fusion DNA聚合酶(Agilent，#600675)(Sanjana et al.，2014)进行了两个连续的PCR反应(第一个反应18个循环，第二个反应12个循环)来添加条形码、错开和Illumina测序引物。通过Agencourt AMPure XP磁珠来纯化PCR产物，并通过Qubit荧光定量来分析DNA。纯化的PCR产物在Hiseq 2500上进行测序，具有75bp的单读取。
测序数据分析。从Addgene(全球范围网址addgene.org/pooled-library/zhang-mouse-gecko-v2/)下载文库中GeCKO sgRNA序列的参考列表，并使用Bowtie 2将多路解编的FASTQ文件映射到参考文件中，要求独特的对齐而没有错配。使用sgRSEA(bchen4.github.io/sgrsea/)进行sgRNA定量和基因得分计算(gene scorecalculation)。
在培养的细胞中的Myomixer CRISPR sgRNA敲除实验。将靶向Myomixer ORF区域的两个指导(#1：5’-GCTGCTGCCTGTTGCCCGCC-3’(SEQ ID NO：32)和#2：5’-AGGCCTCTCCAGAATCCGG-3’(SEQ ID NO：33))分别克隆到由Feng Zhang惠赠的lenti-CRISPRv2载体(Addgene质粒#52961)(Sanjana et al.，2014)中。制备Myomixer CRISPR-sgRNA和-对照(空lenti-CRISPR v2)慢病毒并用于感染C2C12或原代成肌细胞，然后通过与对于慢病毒CRISPR文库所进行的类似的操作进行嘌呤霉素选择。在选择之后，将细胞转换至分化培养基一周，然后进行免疫染色、RNA、蛋白质和基因组DNA提取和分析。为了验证在这些细胞中Myomixer的靶向，用扩增靶向区域的引物扩增基因组DNA(正向：5’-AGTTCAGGCTTCAGGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：34)，反向：5’-GCTAGGGGAGTGGGAACTGT-3’(SEQ IDNO：35)，对于非靶细胞，PCR产物大小为743bp)。对PCR产物进行凝胶纯化，将其克隆到pCRIITopo载体(ThermoFisher，K460001)中并进行测序。
定量实时PCR(qPCR)。用TRIZOL(Invitrogen)从培养的细胞或小鼠组织中提取总的RNA，并使用iScriptTM逆转录Supermix(1708841)合成cDNA。使用标准qPCR方法用KAPASYBR FAST qPCR Master Mix(KK4605)评价基因表达。使用以下Sybr引物在StepOnePlus实时PCR系统(Applied Biosystems)上进行分析：
Myomixer-F：5’-GTTAGAACTGGTGAGCAGGAG-3’(SEQ ID NO：36)，
Myomixer-R：5’-CCATCGGGAGCAATGGAA-3’(SEQ ID NO：37)，
Myomaker-F：5’-CCTGCTGTCTCTCCCAAG-3’(SEQ ID NO：38)，
Myomaker-R：5’-AGAACCAGTGGGTCCCTAA-3’(SEQ ID NO：39)，
Myod1-F：5’-CCACTCCGGGACATAGACTTG-3’(SEQ ID NO：40)，
Myod1-R：5’-AAAAGCGCAGGTCTGGTGAG-3’(SEQ ID NO：41)，
肌细胞生成蛋白-F：5’-GAGACATCCCCCTATTTCTACCA-3’(SEQ ID NO：42)，
肌细胞生成蛋白-R：5’-GCTCAGTCCGCTCATAGCC-3’(SEQ ID NO：43)，
Myh8-F：5’-GGAGAGGATTGAGGCCCAAAA-3’(SEQ ID NO：44)，
Myh8-R：5’-CACGGTCACTTTCCCTCCATC-3’(SEQ ID NO：45)，
18S-F：5’-ACCGCAGCTAGGAATAATGGA-3’(SEQ ID NO：46)，
18S-R：5’-GCCTCAGTTCCGAAAACCA-3’(SEQ ID NO：47)。
2ΔΔCt方法用于分析针对18S rRNA表达归一化的基因表达的相对变化。
Pax7+和Twist2+肌祖细胞分离和RNA-seq分析。Twist2+肌祖细胞不同于Pax7+卫星细胞，并代表在肌肉稳态和再生期间促进特定的纤维类型的肌源性祖细胞群体(Liu etal.,2017)。通过FACS分选从8周龄Twist2-CreERT2(他莫昔芬注射之后10天的R26-tdTO小鼠)的骨骼肌组织中新鲜分离Twist2+肌祖细胞。通过FACS分选将Pax7+卫星细胞分离为整联蛋白7阳性和CD45/CD31/Sca1阴性群体。通过Agilent 2100验证RNA质量。使用UTSWGenomics和Microarray Core Facility的Illumina HiSeq 2500进行生物分析和RNA-seq。
逆转录病毒表达。Myomixer编码序列寡核苷酸由Integrated DNA Technologies合成，并用In-HD克隆Plus试剂盒(Clontech，#638910)连接到pMXs-Puro逆转录病毒载体(Cell Biolabs，#RTV-012)(Kitamura et a.,2003)。在通过测序验证正确的插入之后，将质粒在Stable3细胞中过夜培养来扩增，然后使用/>Xtra Maxi柱(#740414.10)进行质粒制备。使用表达N端标记的信号FLAG(Signal FLAG，SF)Myomaker的逆转录病毒质粒来过表达Myomaker(Millay et al.,2016)。使用FuGENE 6(Promega，#E2692)将10微克逆转录病毒质粒DNA转染到Platinum-E细胞(Cell Biolabs，#RV-101)中，Platinum-E6细胞在转染之前12小时以每个培养皿5×106个细胞的密度平板接种在10cm细胞培养皿上。在转染之后两天，将病毒培养基通过0.45μm纤维素注射器过滤器过滤，并与最终浓度为6μg/ml的聚凝胺(Sigma)混合。在感染之后两天，将细胞用PBS洗涤两次。对于融合实验，将病毒感染的C2C12和10T1/2细胞混合(每孔5×104个C2C12细胞和2×105个成纤维细胞)并平板接种在6孔板上。平板接种之后12小时，将细胞转换至成肌细胞分化培养基(含有1％青霉素/链霉素的DMEM中的2％马血清)一周，在分化的第3天更换培养基。
细胞培养和荧光蛋白标记。将10T1/2成纤维细胞和C2C12细胞维持在DMEM中的10％FBS和1％青霉素/链霉素中。如上所述制备表达GFP的慢病毒和表达Cherry的逆转录病毒。慢病毒GFP的包装载体是由Miguel Ramalho-Santos惠赠的pLove-GFP(Addgene质粒#15949)(Blelloch et al.,2007)，并且逆转录病毒Cherry的是pMXs-Cherry(CellBiolabs，#RTV-012)。在感染之前12小时，将细胞以2×106的密度接种在10-cm培养皿中。在用于实验之前将细胞感染两天。
膜分级。用Mem-PERTM Plus膜蛋白提取试剂盒(ThermoFisher，#89842)进行膜分级。简而言之，通过用细胞刮刀刮下板的表面将细胞混悬在PBS中。在将细胞混悬液以300×g离心5分钟之后，将细胞沉淀洗涤两次，并在4℃下持续混合10分钟进行透化。在16,000×g下在4℃下离心15分钟之后收集胞质溶胶级分(上清液)。通过在4℃下持续混合30分钟将膜级分(沉淀)重悬并溶解。在4℃下16,000×g离心15分钟之后收集膜级分作为上清液。将蛋白质样品与4x Laemmli样品缓冲液混合并通过western印迹分析进行分析。
免疫沉淀和western印迹分析。将细胞用冰冷的PBS洗涤，并在补充有完全蛋白酶抑制剂(Sigma)和PhoSTOP磷酸酶抑制剂(Sigma)的IP-A缓冲液(50mM TRIS，150mM NaCl，1mM EDTA，1％Triton X-100)中裂解15分钟。通过使细胞裂解物通过25G 5/8针来机械破碎细胞裂解物，然后在4℃下持续混合1小时。然后将裂解物在20,817×g下离心15分钟并弃去沉淀。将总裂解物的10％用作输入，并将剩余体积用于共免疫沉淀。根据制造商的说明书，将抗FLAG M2亲和树脂(Sigma，A220)在IP-A缓冲液中进行平衡。每个样品使用100μl树脂。以2ml的总体积在4℃下在持续混合下进行共免疫沉淀12小时。将树脂在高盐(700mM NaCl)中洗涤，并在室温下在持续混合下用最终浓度为200μg/mL的FLAG肽(Sigma，F390)进行洗脱6小时。如下所述进行SDS-PAGE。
使用RIPA缓冲液(Sigma，R0278)从细胞或组织中分离蛋白质。使用BCA蛋白质分析试剂(ThermoFisher Scientific，23225)然后用NanoDrop测量来确定蛋白质浓度。将蛋白质样品与4x Laemmli样品缓冲液(BIO-RAD，#161-0747)混合，加载20至40μg蛋白质并通过Mini-TGXTM预制凝胶(Precast Gel)分离，并转移至聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore)，在室温下在5％无脂乳液中封闭1小时，然后在4℃下用在5％乳液中稀释的以下一抗孵育过夜：Gapdh(Thermofisher，MA5-15738)、N-钙黏着蛋白(Santa Cruz Biotechnology，sc7939)、胰岛素受体β(Cell SignalingTechnology，#3020)、EGF受体(Cell Signaling Technology，#2646)、微管蛋白(Sigma，T-6199)、Myomixer(R&D Systems，#AF4580)、FLAG(Sigma，F3165)、肌球蛋白(Sigma，M4273)。HRP缀合的二抗：驴抗绵羊IgG-HRP(Santa Cruz Biotechnology，sc-2473)、山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP缀合物(BIO-RAD，#170-6516)和山羊抗兔IgG(H+L)-HRP缀合物(BIO-RAD，#170-6515)以1:5,000稀释。使用Western印迹Luminol试剂(Santa Cruz Biotechnology，sc2048)进行免疫检测。
免疫染色。将细胞在4％PFA/PBS中固定10分钟，并用在PBS中的0.2％Triton X-100透化，并在室温下用3％BSA/PBS封闭1小时。将细胞用一抗在4℃下孵育过夜，然后如下所示用Alexa Fluor缀合的二抗孵育。对于活细胞膜染色，首先用冰冷的PBS洗涤细胞，并在冰上在3％BSA/PBS中封闭15分钟。然后使用针对FLAG的抗体(M2小鼠抗FLAG，sigma，F3165，在冰冷的1％BSA/PBS中以1:500稀释)在冰上进行一抗孵育30分钟。在一抗孵育之后，将细胞用冰冷的PBS洗涤，并在室温下用4％PFA/PBS固定10分钟。然后将细胞用Alexa-Fluor二抗(ThermoFisher，A21422)在室温下孵育30分钟。对于层黏连蛋白染色，将细胞用在PBS中的0.2％Triton X-100透化，并用3％BSA/PBS封闭1小时。将细胞用一抗孵育(兔抗层黏连蛋白1:500，在室温下1小时)，然后用二抗(ThermoFisher，A21206)孵育和用Hoechst复染核。
对于肌肉切片的免疫染色，将8μm原始包埋的冷冻切片用4％PFA固定10分钟，用0.01％Triton X-100透化15分钟，然后用M.O.M封闭试剂盒(Vector Laboratories)孵育切片1小时以防止内源性小鼠Ig的背景染色。随后将切片在PBS和0.01％Triton X-100中制备的10％正常驴血清中封闭30分钟，并用绵羊抗myomixer(R&D，AP4580，1:100稀释)和小鼠抗MY32一抗在4℃下孵育过夜。用Alexa Fluor 568和488(Life Technologies，1:500)使一抗可见。用DAPI(Sigma，1μg/mL)进行核复染。在Zeiss LSM780共聚焦显微镜上观察染色。
对于组织化学，将小鼠抗骨骼肌球蛋白(MY-32克隆；1:200稀释)连同小鼠-小鼠封闭和免疫检测试剂盒和辣根过氧化物酶(Vector Laboratories，Burlingame，CA)用于石蜡切片。根据先前描述的免疫过氧化物酶方法(Cianga et al.,1999；Borvak et al.,1998)，用二氨基联苯胺致色剂(diamonobenzedine chromagen)(DAKO-Agilent，Carpinteria，CA)检测结合的肌球蛋白抗体和用苏木精复染的载玻片。
Myomixer突变体小鼠的产生。所有动物操作均由德克萨斯大学西南医学中心的动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee at theUniversity of Texas Southwestern Medical Center)批准。B6C3F1小鼠用作卵母细胞供体。将超排卵的雌性B6C3F1小鼠(6周龄)与B6C3F1种鼠雄性配对。收获合子并将其在37℃下在M16培养基(Brinster’s培养基用于卵子培养，具有100U/ml青霉素和50mg/ml链霉素)中保持1小时。将合子转移至M2培养基(M16培养基和20mM HEPES)。将Cas9 mRNA和MyomixersgRNA(#1和#2)注射到原核和细胞质中。将注射的合子在M16培养基中在37℃培养1小时，然后转移到假孕ICR雌性小鼠的输卵管中。收集E17.5胚胎并进行处理用于组织学和基因表达测定。提取尾部基因组DNA并用于用扩增靶向区域的引物进行基因分型(正向：5’-AGTTCAGGCTTCAGGTCAGAG-3’(SEQ ID NO：48)，反向：5’-GCTAGGGGAGTGGGAACTGT-3’(SEQ IDNO：49)，野生型小鼠的PCR产物大小为743bp)。
组织收获和制备。从怀孕的母鼠收集用于原位杂交(in-situhybridization，ISH)、免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)和常规组织学的小鼠胚胎，将其进行严格成像，并在4％多聚甲醛中浸没固定。随后的石蜡加工、包埋、切片和H&E染色通过标准方法进行(Shehan&Hrapchak，1980；Woods&Ellis，1996)。
RNA原位杂交。将对应于Myomixer ORF的探针模板克隆到pCRII-TOPO(Invitrogen，ThermoFisher，K460001)中。通过使用Maxiscript试剂盒(Ambion，Inc，Austin，TX)的体外转录，从线性化cDNA模板分别通过Sp6和T7 RNA聚合酶产生35S标记的有义和反义探针。如前所述进行放射性同位素原位杂交(Shelton et a.，2000)。在自动射线照相暴露14天之后显示信号。
显微术。使用Optronics Macrofire数字CCD相机和PictureFrame 2.0软件(Optronics，Goleta，CA)在Zeiss Stemi SV-11立体光学解剖镜上获得总的胚胎图像。所有组织学制剂的检查和摄影在配备有明视场和入射角暗场照明的Nikon E600显微镜(NikonUSA，Mellville，NY)上进行。使用Nikon Elements 4.20.00软件以1.25x、4x、10x(ISH)和20x(IHC，H&E)物镜放大率捕获图像。
实施例2-结果
为了鉴定肌细胞生成的新调节物，本发明人对小鼠C2C12肌细胞的分化和融合所需的基因进行了全基因组CRISPR功能丧失筛选，如图5A所示。简而言之，他们用慢病毒文库感染了6千万个C2C12成肌细胞，该文库包含130,209个单指导(sg)RNA库(pool)和用于CRISPR基因编辑的Cas9(Sanajan et al.，2014)。在多重感染下进行慢病毒感染以保留文库的460倍表现。在两天的嘌呤霉素选择之后，将成肌细胞培养物转换至分化培养基(DM)一周以促进肌管形成。用低胰蛋白酶(0.00625％)对培养物进行短暂暴露，这促进了肌管的分离，使单个核的成肌细胞附着在培养皿上。用0.25％胰蛋白酶进行随后处理，允许成肌细胞释放。作为肌管和成肌细胞群体分离的对照，本发明人通过western印迹分析检出了在肌管群体中高度富集的肌球蛋白重链(图5B)。
通过高通量测序来对成肌细胞和肌管群体中的sgRNA表达计数，并且对多个成肌细胞富集的sgRNA靶向的基因基于它们的相对丰度进行评分。该分析揭示了被多个在成肌细胞中富集的独立CRISPR sgRNA靶向的许多基因。因为本发明人试图鉴定成肌细胞分化或融合特异性所需的基因，所以他们通过将这些基因与在C2C12成肌细胞(Chen et al.,2006)以及Pax7+卫星细胞和Twist2+肌原性祖细胞(Liu et al.,2017)分化期间上调的转录物进行比较来缩小该列表(图5C)。五个基因满足这些标准(图5C)。列表中的一个新基因，注释为Gm7325，在初始筛选中被3个独立的sgRNA靶向，并且在C2C12成肌细胞和Pax7+和Twist2+肌祖细胞的分化期间作为未知功能的最上调基因而突出(图5C)。该基因还与肌原性转录因子MyoD和肌细胞生成蛋白的基因组结合的保守峰相关(图5D)(Yue等，2014))，并且被鉴定为MyoD的推定靶标(Fong et al.,2012)。
有一篇出版物描述了Gm7325作为在胚胎干(embryonic stem，ES)细胞和生殖细胞中表达的基因，但功能尚未阐明(Chen et a.,2005)。在此，本发明人表明Gm7325是成肌细胞融合所需的并促进细胞膜的混合；因此，他们将这种蛋白质命名为Myomixer。在随后的实验中，本发明人证明了该蛋白质在控制成肌细胞融合和肌肉形成中的关键作用。
小鼠Myomixer基因跨越三个外显子，在外显子3中具有开放阅读框(open readingframe，ORF)(图5E)。为了证实Myomixer对于成肌细胞融合的必要性，本发明人用慢病毒破坏了C2C12细胞和小鼠原代成肌细胞中的基因，所述慢病毒表达Cas9和在Myomixer ORF中被122个碱基对(bp)分开的一对sgRNA(图5E)。对用来自这些稳定选择的细胞培养物的以sgRNA靶序列为侧翼的引物产生的基因组PCR片段进行测序揭示了许多破坏Myomixer ORF的插入缺失(indel)突变(图5F)。
Myomixer基因的破坏阻止了C2C12细胞和原代小鼠成肌细胞的融合，但不影响肌球蛋白重链(分化标志物)的表达(图5G至5I和图1A至C)。单个核的细胞和多个核的细胞中肌核(myonuclei)百分比的定量显示，在转移至DM 7天之后，用Myomixer sgRNA对靶向的约89％的成肌细胞是单个核的(图1B)。本发明人从未在Myomixer敲除(knockout，KO)培养物中观察到具有多于五个核的肌管，而野生型(wild type，WT)培养物中约82％的肌核包含在具有多于5个核的肌管中(图1B)。Western印迹分析了证实在KO培养物中不存在Myomixer蛋白(图5I和图1C)。MyoD和肌细胞生成蛋白在分化的Myomixer KO细胞中正常表达，Myh8(肌球蛋白重链8)也是如此(图5J)，表明成肌细胞融合的选择阻断不依赖于肌肉分化。
小鼠Myomixer的ORF编码长度为84个氨基酸的微肽(图1D)。通过western印迹分析用针对氨基酸24至84的抗体检测蛋白质(图1C)。Myomixer的种间同源物在不同的脊椎动物物种中是保守的(图1D)。Myomixer氨基酸序列未在鱼或两栖动物中注释，可能是因为小于100个氨基酸的ORF通常不注释。然而，本发明人在鱼、蛙和龟基因组中鉴定了推定的Myomixer种间同源物，其具有几个残基的保守性，尤其是许多精氨酸和两亲性残基(图1D)。来自不同物种的蛋白质包含N端疏水性区段，接着是带正电荷的螺旋和相邻的疏水性螺旋。来自哺乳动物和有袋类动物的Myomixer蛋白还包含其他生物体缺失的独特的C端螺旋(图1D)。
因为N端包含延伸的疏水性区段，本发明人推测它可以充当膜锚。实际上，表达在C端具有FLAG标签的Myomixer的完整C2C12成肌细胞的免疫染色揭示了细胞表面上所述蛋白质的存在(图1E)。与这些发现一致，将C2C12肌管分级成膜和胞质级分示出了Myomixer定位于膜(图1F)。类似地，在用表达Myomixer的逆转录病毒感染的293细胞中，本发明人发现所述蛋白质优先定位于膜上(图1F)。
Myomixer蛋白表达在C2C12成肌细胞分化期间上调，并在成肌细胞融合之后下降(图2A)。类似地，Myomixer在分离的Pax7+卫星细胞和Twist2+成熟肌祖细胞的分化期间强烈上调，这有助于肌肉再生(图2B)。在产前和产后肌肉发育期间，Myomixer转录物示出了E14.5的表达最高点并且此后下降(图2C)。Western印迹分析揭示了在来自E13.5的小鼠胚胎的肢体组织中和在产后第2天的骨骼肌中存在Myomixer蛋白，而在正常小鼠的成熟肌肉或非肌组织中未检测到所述蛋白质(图2D)。E12.5和E15.5的小鼠胚胎切片的原位杂交显示，Myomixer仅在整个肢体和体壁的正在发育的骨骼肌中强烈表达(图2E)。响应于成熟肌肉的心脏毒素(cardiotoxin，CTX)损伤，Myomixer表达迅速上调，在损伤之后第3天达到最高点并且此后下降(图2F)。CTX处理的肌肉的免疫染色也显示Myomixer在肌球蛋白阳性肌细胞中在再生区域中强烈表达(图2G)。与其在肌肉再生中的潜在作用一致，Myomixer表达在mdx小鼠的肌肉中上调，所述mdx小鼠在肌营养不良的进展期间经历肌肉退化和再生(图2H)。
为了评价Myomixer在体内肌肉形成中的潜在参与，本发明人通过CRISPR-Cas9诱变使用相同的sgRNA对在小鼠胚胎发生过程中使基因灭活，所述sgRNA对显示有效靶向C2C12细胞和原代成肌细胞中的基因。向受精的合子注射Cas9 mRNA和sgRNA，然后将其植入假孕雌性小鼠中。在胚胎第17.5天(E17.5)收获胚胎并进行分析。从分析的65个胚胎中，本发明人获得了9个看起来缺乏骨骼肌并且几乎透明使得内部器官和骨明显的静止胚胎(图3A)。
通过肢体、体壁和膈肌肌肉系统的组织切片揭示了在Myomixer KO胚胎中不存在多个核的肌纤维(图3B)。相反，推定的肌肉形成区域由对于肌球蛋白表达染色的单个核的细胞填充(图3C)。在这些胚胎中，除肌肉以外的组织显现正常。在Myomixer基因的第三个外显子中，两个sgRNA的切割位点相隔122个碱基对。用扩增该区域的引物进行的PCR显示突变体小鼠具有107至470bp的缺失，反映了不同的插入缺失(图3D和图7)。后肢的western印迹证实KO胚胎中不存在Myomixer蛋白(图3E)。
Myomixer突变体小鼠的肌肉表型让人联想到缺乏Myomaker(一种融合的肌肉蛋白质)的小鼠(Millay et al.,2016；2013)，表明这两种成肌细胞融合调节物之间的功能性相互作用。实际上，在共免疫沉淀测定中，FLAG标记的Myomaker在10T1/2成纤维细胞和分化的C2C12细胞中与Myomixer共免疫沉淀(图4A)。
为了进一步评价在成肌细胞融合中Myomixer和Myomaker之间的功能性相互作用，本发明人在C2C12成肌细胞中逆转录病毒表达每种蛋白质并监测肌管形成。如图4B中所示，Myomixer显著增强了C2C12细胞的融合。此外，当Myomixer和Myomaker在C2C12细胞中一起过表达时，它们促进大量的多个核的肌管形成，指示它们的协同活性(图4B和图4C)。
Myomaker可以诱导10T1/2成纤维细胞与成肌细胞的融合(Millay et al.,2016；2013)。为了测试Myomixer是否可以与Myomaker协同促进异源细胞融合，本发明人用Myomaker和Myomixer逆转录病毒感染GFP标记的10T1/2细胞(图4D)。值得注意的是，在10T1/2细胞中Myomixer和Myomaker一起表达诱导了与C2C12肌管的大量融合，使得仅有少数单个核的GFP标记的成纤维细胞保留在培养物中(图4E)。值得注意的是，尽管表达Myomaker的10T1/2细胞与C2C12细胞融合，但表达Myomixer的10T1/2细胞未融合(图4E)。此外，Myomixer或Myomaker一起的强制表达，无论是在相同细胞中以顺式表达还是在分开的细胞中以反式表达，都不会诱导单独的10T1/2细胞的融合(数据未示出)。western印迹证实了Myomaker和Myomixer在适当细胞中的表达(图4F)。本发明人观察到任一蛋白质对另一种蛋白质的表达水平没有影响，表明它们的协同作用不反映对任一蛋白质的稳定性的影响。Myomixer和Myomaker对融合的影响的总结示出在图4G中。
为了测试对于细胞融合，Myomaker对Myomixer的功能依赖性，本发明人将表达Myomaker的10T1/2细胞与WT或Myomixer-KO C2C12成肌细胞混合，并将它们转换至DM一周，之后将它们肌球蛋白染色。引人注目的是，尽管表达Myomaker的10T1/2细胞与WT C2C12细胞融合，但它们不能与Myomixer KO C2C12细胞融合(图4H)。这意味着对于反式细胞融合，Myomaker依赖Myomixer。实际上，Myomaker在Myomixer KO成肌细胞和胚胎中正常表达，表明对于正常的肌肉融合和发育，Myomaker依赖Myomixer(图8)。
Myomixer在体内和体外融合成肌细胞的需求，它与Myomaker一起协同促进融合的能力，以及这些蛋白质之间的物理和功能的相互作用，表明它们控制着骨骼肌多成核的关键步骤。尽管Myomixer和Myomaker的组合显著刺激成纤维细胞与成肌细胞的融合，但这些蛋白质不能诱导单独的成纤维细胞的融合(图4G)。因此，另外的肌源性伴侣可能有助于成肌细胞融合的特异性。
本发明人没有在果蝇中发现Myomixer相关的基因，其也缺乏明显的Myomaker种间同源物，表明Myomixer-Myomaker蛋白伴侣关系是高等脊椎动物的发明。也许脊椎动物的大的肌肉的形成需要这种强大的融合机制叠加在更简单的生物体(例如果蝇)的基本细胞-细胞融合事件上。
Myomixer的小尺寸使其置于特征为未加工的ORF小于100个氨基酸的微肽的类别中(Marquez-Medina et al.,2015)。值得注意的是，在这一点上，迄今鉴定的大多数微肽嵌入膜中(Anderson et al.,2015；2016)。本发明人注意到Myomixer与心脏特异性微肽DWORF(矮的开放阅读框)之间的惊人的相似性，DWORF定位于心肌细胞的肌浆网，在那里其与SERCA钙ATPase结合并刺激其活性(Nelson et al.,2016)。本发明人推测许多膜蛋白的活性可通过与尚未鉴定的微肽结合来控制。
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Glu Ala Met Val Tyr Leu Phe Thr Met Phe Phe Val Ala Phe Ser His
35 40 45
Ala Cys Asp Gly Pro Gly Leu Ser Val Leu Cys Phe Met Arg Arg Asp
50 55 60
Ile Leu Glu Tyr Phe Ser Ile Tyr Gly Thr Ala Leu Ser Met Trp Val
65 70 75 80
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Thr Met Leu Gly Val Leu Thr Ile Ala Val Arg Thr Phe His Asp Arg
100 105 110
Trp Gly Tyr Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ile Gly Thr Ala Thr Leu Ile
115 120 125
Ile Ala Val Lys Trp Leu Lys Lys Met Lys Glu Lys Lys Gly Leu Tyr
130 135 140
Pro Asp Lys Ser Ile Tyr Thr Gln Gln Ile Gly Pro Gly Leu Cys Phe
145 150 155 160
Gly Ala Leu Ala Leu Met Leu Arg Phe Phe Phe Glu Glu Trp Asp Tyr
165 170 175
Thr Tyr Val His Ser Phe Tyr His Cys Ala Leu Ala Met Ser Phe Val
180 185 190
Leu Leu Leu Pro Lys Val Asn Lys Lys Ala Gly Asn Ala Gly Ala Pro
195 200 205
Ala Lys Leu Thr Phe Ser Thr Leu Cys Cys Thr Cys Val
210 215 220
<210> 2
<211> 666
<212> DNA
<213> 小鼠肌
<400> 2
atggggacag ttgtagccaa actgctcctg cctaccctca gcagcctggc cttcctcccg 60
acagtgagca tcgctaccaa gaggcgtttc tacatggagg ccatggtcta cctcttcacc 120
atgttctttg tggcgttctc ccatgcctgt gatgggcctg gtttgtctgt gctgtgcttc 180
atgcgccgtg acattctgga gtacttcagc atctatggaa cagccctgag catgtgggtc 240
tccctgatgg cactggccga ctttgatgaa ccccagagat cgaccttcac aatgcttggc 300
gtccttacca tcgctgtgcg gacttttcat gaccgctggg gttacggggt atactccggt 360
cccataggca cggccaccct catcattgct gtaaagtggc tgaagaagat gaaagagaag 420
aagggcctgt accccgacaa gagcatctac acccagcaga taggccccgg cctgtgcttt 480
ggggccctgg ccctgatgct tcgattcttc tttgaggaat gggattacac ctacgtccac 540
agcttctacc actgtgccct ggccatgtcc tttgtcctgc tgctgcccaa ggtcaacaag 600
aaggctggga acgcaggggc ccccgccaag ctgaccttct ccaccctctg ctgcacttgt 660
gtctga 666
<210> 3
<211> 221
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Gly Thr Leu Val Ala Lys Leu Leu Leu Pro Thr Leu Ser Ser Leu
1 5 10 15
Ala Phe Leu Pro Thr Val Ser Ile Ala Ala Lys Arg Arg Phe His Met
20 25 30
Glu Ala Met Val Tyr Leu Phe Thr Leu Phe Phe Val Ala Leu His His
35 40 45
Ala Cys Asn Gly Pro Gly Leu Ser Val Leu Cys Phe Met Arg His Asp
50 55 60
Ile Leu Glu Tyr Phe Ser Val Tyr Gly Thr Ala Leu Ser Met Trp Val
65 70 75 80
Ser Leu Met Ala Leu Ala Asp Phe Asp Glu Pro Lys Arg Ser Thr Phe
85 90 95
Val Met Phe Gly Val Leu Thr Ile Ala Val Arg Ile Tyr His Asp Arg
100 105 110
Trp Gly Tyr Gly Val Tyr Ser Gly Pro Ile Gly Thr Ala Ile Leu Ile
115 120 125
Ile Ala Ala Lys Trp Leu Gln Lys Met Lys Glu Lys Lys Gly Leu Tyr
130 135 140
Pro Asp Lys Ser Val Tyr Thr Gln Gln Ile Gly Pro Gly Leu Cys Phe
145 150 155 160
Gly Ala Leu Ala Leu Met Leu Arg Phe Phe Phe Glu Asp Trp Asp Tyr
165 170 175
Thr Tyr Val His Ser Phe Tyr His Cys Ala Leu Ala Met Ser Phe Val
180 185 190
Leu Leu Leu Pro Lys Val Asn Lys Lys Ala Gly Ser Pro Gly Thr Pro
195 200 205
Ala Lys Leu Asp Cys Ser Thr Leu Cys Cys Ala Cys Val
210 215 220
<210> 4
<211> 666
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
atggggacgc tggtggccaa gctgctcctg cccaccctca gcagcctggc cttcctcccc 60
actgtcagca tcgcggccaa gaggcggttc cacatggagg ccatggtcta cctcttcacc 120
ctgttcttcg tggcgctcca ccatgcctgc aatggacccg gcttgtctgt gctgtgcttc 180
atgcgtcacg acatcctgga gtatttcagt gtctacggga cagccctgag catgtgggtc 240
tcgctgatgg cactggccga cttcgacgaa cccaagaggt caacatttgt gatgttcggc 300
gtcctgacca ttgctgtgcg gatctaccat gaccgatggg gctacggggt gtactcgggc 360
cccatcggca cagccatcct catcatcgcg gcaaagtggc tacagaagat gaaggagaag 420
aagggcctgt acccagacaa gagcgtctac acccagcaga taggccccgg cctctgcttc 480
ggggcgctgg ccctgatgct acgcttcttc tttgaggact gggactacac ttatgtccac 540
agcttctacc actgtgccct ggctatgtcc tttgttctgc tgctgcccaa ggtcaacaag 600
aaggctggat ccccggggac cccggccaag ctggactgct ccaccctgtg ctgtgcttgt 660
gtctga 666
<210> 5
<211> 84
<212> PRT
<213> 小鼠肌
<400> 5
Met Pro Val Pro Leu Leu Pro Met Val Leu Arg Ser Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Val Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ser Ser Gln Asp Met Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Ser Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Gln Gln Pro Pro Asp
50 55 60
Ser Gly Glu Ala Ser Arg Val Asp His Ser Gln Arg Lys Glu Arg Leu
65 70 75 80
Gly Pro Gln Lys
<210> 6
<211> 255
<212> DNA
<213> 小鼠肌
<400> 6
atgcccgttc cattgctccc gatggtgctt cgatcgctgc tgtcccgcct gctgctgcct 60
gttgcccgcc tggcccggca gcacctcctg cccttgctgc gccggctggc ccgccgactg 120
agctcccaag acatgagaga ggctctgctg agctgtctgc tctttgtcct cagccagcaa 180
cagccaccgg attctggaga ggcctccaga gtggaccact cccagaggaa ggagagattg 240
ggcccccaga agtga 255
<210> 7
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 7
Met Pro Thr Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Ser Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln Tyr Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Met Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Ile Leu Ser Gln Arg His Ser Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Arg Val Asp Arg Leu Glu Arg Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Gly Pro Gln Lys
<210> 8
<211> 255
<212> DNA
<213> 智人
<400> 8
atgcccacgc cactgctccc gctgctgctt cgattgctgc tgtcctgcct gctgctgcct 60
gctgcccgcc tggcccgcca atacctcctg cccctgctgc gccgattggc ccgccgcctg 120
ggctcccagg acatgcgaga ggctttgctg ggctgtctgc tgttcattct cagccagcga 180
cactcgccag acgctgggga ggcctcaaga gtggaccgcc tggagaggag ggagaggtta 240
ggcccccaaa agtga 255
<210> 9
<211> 84
<212> PRT
<213> 智人
<400> 9
Met Pro Thr Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Leu Leu Leu Ser Cys
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln Tyr Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Met Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Ile Leu Ser Gln Arg His Ser Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Arg Val Asp Arg Leu Glu Arg Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Gly Pro Gln Lys
<210> 10
<211> 84
<212> PRT
<213> 小鼠肌
<400> 10
Met Pro Val Pro Leu Leu Pro Met Val Leu Arg Ser Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Val Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ser Ser Gln Asp Met Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Ser Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Gln Gln Pro Pro Asp
50 55 60
Ser Gly Glu Ala Ser Arg Val Asp His Ser Gln Arg Lys Glu Arg Leu
65 70 75 80
Gly Pro Gln Lys
<210> 11
<211> 84
<212> PRT
<213> 黑鼠
<400> 11
Met Pro Val Pro Leu Leu Pro Leu Met Leu Arg Ser Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Val Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ser Ser Gln Asp Val Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Ser Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Gln Gln Pro Pro Asp
50 55 60
Ser Gly Glu Thr Ser Arg Val Asp His Ser Gln Arg Lys Glu Arg Leu
65 70 75 80
Gly Pro Arg Lys
<210> 12
<211> 85
<212> PRT
<213> 穴兔
<400> 12
Met Pro Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Gln Arg Leu Gly Ser Gln Gly Thr Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg Gln Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Ser Gly Glu Ala Ser Arg Val Asp Pro Pro Glu Arg Lys Glu Arg
65 70 75 80
Leu Gly Arg Gln Lys
85
<210> 13
<211> 84
<212> PRT
<213> 山羊
<400> 13
Met Pro Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ala Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg Arg Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Arg Val Ala Arg Leu Glu Arg Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gln Lys
<210> 14
<211> 84
<212> PRT
<213> 短喙真海豚
<400> 14
Met Pro Thr Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ala Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Arg His Phe Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Val His Arg Leu Gly Ser Gln Asp Met Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg His Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Arg Val Ala Arg Leu Glu Arg Arg Asp Arg Leu
65 70 75 80
Ala Ser Gln Lys
<210> 15
<211> 85
<212> PRT
<213> 单峰驼
<400> 15
Met Pro Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ala
1 5 10 15
Arg Leu Leu Met Pro Ala Val Arg Leu Ala Arg Arg His Leu Leu Pro
20 25 30
Leu Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Met Arg Glu
35 40 45
Ala Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Ile Leu Ser Gln Arg His Gln Pro
50 55 60
Asp Ala Gly Glu Pro Ser Lys Val Ala Arg Leu Glu Arg Arg Glu Arg
65 70 75 80
Leu Ala Pro Gln Lys
85
<210> 16
<211> 84
<212> PRT
<213> 豹
<400> 16
Met Pro Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Thr Leu Met Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Thr Arg Leu Ala Arg Arg His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Val Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Ile Leu Ser Gln Ser Arg Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Glu Glu Val Ser Arg Val Ala Gly Gln Glu Arg Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Ala Pro Pro Lys
<210> 17
<211> 84
<212> PRT
<213> 马来穿山甲
<400> 17
Met Pro Val Pro Leu Leu Pro Met Leu Val Arg Thr Leu Leu Ala Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Gln Arg Leu Gly Ser His Asp Met Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg His Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Glu Glu Ala Ser Arg Val Ala Arg Pro Glu Arg Arg Gly Arg Leu
65 70 75 80
Ser Pro Gln Lys
<210> 18
<211> 84
<212> PRT
<213> 大熊猫
<400> 18
Met Pro Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Thr Leu Met Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Val Ala Arg Met Ala Arg Arg His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Cys Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Val Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Val Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg Arg Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Glu Val Ala Ser Arg Val Ala Gly Gln Glu Arg Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Ala Pro Pro Lys
<210> 19
<211> 84
<212> PRT
<213> 吸血蝠
<400> 19
Met Pro Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Met Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Leu Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Ser Cys Leu Leu Phe Ile Leu Ser Gln Arg His Gln Pro Asp
50 55 60
Thr Gly Glu Ala Ser Arg Val Ala Arg Pro Glu Arg Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gln Lys
<210> 20
<211> 84
<212> PRT
<213> 非洲象
<400> 20
Met Pro Val Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Arg Ala Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Met Arg Gln Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Gln His Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Arg Glu Ala Leu Ser Glu Arg Arg Gly Arg Leu
65 70 75 80
Ala Pro Gln Lys
<210> 21
<211> 84
<212> PRT
<213> 美洲海牛
<400> 21
Met Pro Ala Pro Leu Leu Ser Leu Leu Leu Arg Ala Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Ile Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg His Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Arg Val Ala Leu Ser Glu Arg Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Asp Pro Gln Lys
<210> 22
<211> 84
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 无尾猬
<400> 22
Met Pro Ala Pro Leu Leu Ser Val Leu Leu Arg Ala Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Asp Val Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg His Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Ala Val Ala Arg Ser Glu Lys Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Ala Pro Arg Lys
<210> 23
<211> 84
<212> PRT
<213> 褐喉三趾树懒
<400> 23
Met Pro Ala Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Ser Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln His Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Ala Ala Gln Asp Met Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Phe Val Leu Ser Gln Arg His Pro Pro Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Pro Ser Arg Val Ala His Pro Glu Lys Arg Glu Arg Leu
65 70 75 80
Ala Pro Ser Lys
<210> 24
<211> 79
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 犰狳
<400> 24
Met Pro Val Pro Leu Leu Gln Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Ala Ala Arg Leu Ala Arg Gln Arg Leu Leu Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Gly His Leu Ile Ser Gln Asn Thr Arg Glu Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Leu Ala Ile Leu Asn His Arg Gln Pro Glu Asp
50 55 60
Ala Gly Glu Ala Ser Gly Val Pro Arg Pro Glu Arg Arg Glu Gly
65 70 75
<210> 25
<211> 75
<212> PRT
<213> 北美负鼠
<400> 25
Met Pro Val Pro Leu Leu Pro Leu Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ser Arg
1 5 10 15
Leu Leu Leu Pro Thr Ala Arg Leu Ala Arg Lys His Leu Val Pro Leu
20 25 30
Leu Arg Arg Leu Ala Arg Arg Leu Gly Ser Gln Glu Thr Arg Gln Ala
35 40 45
Leu Leu Gly Cys Leu Ile Tyr Ala Leu Gly Leu Arg His Gln Pro Asp
50 55 60
Ala Glu Arg Asn Gly Val Glu Ser Lys Gly Gly
65 70 75
<210> 26
<211> 62
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 龟鳖
<400> 26
Met Pro Ala Pro Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu Arg Thr Leu Leu Ala
1 5 10 15
Arg Leu Leu Leu Leu Ala Arg Lys Arg Leu Leu Pro Leu Leu Arg Arg
20 25 30
Leu Gly Ala Arg Leu Gly Ser Arg Glu Ser Arg Glu Ala Val Leu Thr
35 40 45
Cys Leu Leu Cys Ile Leu Asn Leu Arg Lys Lys Ala Asp Asp
50 55 60
<210> 27
<211> 62
<212> PRT
<213> 原鸡
<400> 27
Met Pro Ala Val Pro Leu Ala Ala Pro Leu Leu Arg Ala Leu Leu Ala
1 5 10 15
Arg Leu Leu Gln Leu Ala Arg Lys Arg Leu Leu Pro Pro Leu Arg Arg
20 25 30
Leu Gly Arg Arg Leu Arg Ser Arg Glu Ser Arg Gln Ala Leu Leu Thr
35 40 45
Cys Leu Leu Cys Ile Leu Asn Leu His Lys Lys Ala Asp Ala
50 55 60
<210> 28
<211> 80
<212> PRT
<213> 热带爪蟾
<400> 28
Met Pro Val Pro Phe Leu Leu Leu Arg Thr Leu Leu Val Arg Ala Ala
1 5 10 15
Gly Ser Arg Leu Ala Val Ser Gly Ala Arg Gln Leu Thr Lys Gly Ala
20 25 30
Arg Trp Ala Arg Ser His Leu Leu Val Leu Leu Gln Arg Leu Trp Ala
35 40 45
Arg Ile Thr Ser Glu Glu Thr Arg Gln Ala Leu Leu Gly Cys Val Leu
50 55 60
Cys Leu Leu Asn Leu Gln His Lys Ser Asn Thr Asp Thr Gly Ala His
65 70 75 80
<210> 29
<211> 75
<212> PRT
<213> 鲐
<400> 29
Met Pro Ala Val Phe Leu Leu Leu Arg Ser Leu Val Val Arg Leu Phe
1 5 10 15
Gly Ser Arg Leu Ala Ala Ser Gly Val Gln Leu Leu Arg Arg Ile Leu
20 25 30
Thr Thr Ala Thr Gly His Leu Gly Thr Val Leu Arg Asn Ile Trp Glu
35 40 45
Arg Ile Ser Ser Gln Gln Ser Lys Glu Ala Ile Leu Gly Cys Val Leu
50 55 60
Cys Leu Leu Asn Met His Lys Lys Val Asp Asn
65 70 75
<210> 30
<211> 75
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 空棘鱼
<400> 30
Met Pro Ala Leu Phe Leu Leu Leu Arg Thr Leu Phe Ile Arg Leu Leu
1 5 10 15
Gly Ser Gln Leu Ala Val Ser Ala Gly Leu Phe Leu Arg Arg Ser Leu
20 25 30
Ala Ala Ala Gly Gly Arg Leu Ala Ala Leu Leu Arg Arg Val Trp Asp
35 40 45
Arg Ile Arg Ser Glu Glu Ser Arg Gln Val Ala Leu Ser Cys Val Leu
50 55 60
Cys Ile Leu Asn Leu His Lys Lys Val Asp Glu
65 70 75
<210> 31
<211> 75
<212> PRT
<213> 未知
<220>
<223> 银鲛鱼
<400> 31
Met Cys Ala Leu Leu Cys Leu Arg Ala Leu Leu Leu Arg Ile Leu Arg
1 5 10 15
Ser Lys Leu Thr Ala Ser Ala Leu Glu Phe Ile Arg Arg Arg Ser Leu
20 25 30
Ala Ala Gly Ser Arg Leu Gly Ser Leu Leu Arg Ala Gly Trp Ser Arg
35 40 45
Leu Thr Arg Glu Arg Ser Arg Ala Ala Val Leu Ser Cys Val Leu Cys
50 55 60
Leu Leu Asp Met His Lys Arg Asp Thr Asp Lys
65 70 75
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 32
gctgctgcct gttgcccgcc 20
<210> 33
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 33
aggcctctcc agaatccgg 19
<210> 34
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 34
agttcaggct tcaggtcaga g 21
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 35
gctaggggag tgggaactgt 20
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 36
gttagaactg gtgagcagga g 21
<210> 37
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 37
ccatcgggag caatggaa 18
<210> 38
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 38
cctgctgtct ctcccaag 18
<210> 39
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 39
agaaccagtg ggtccctaa 19
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 40
ccactccggg acatagactt g 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 41
aaaagcgcag gtctggtgag 20
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 42
gagacatccc cctatttcta cca 23
<210> 43
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 43
gctcagtccg ctcatagcc 19
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 44
ggagaggatt gaggcccaaa a 21
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 45
cacggtcact ttccctccat c 21
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 46
accgcagcta ggaataatgg a 21
<210> 47
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 47
gcctcagttc cgaaaacca 19
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 48
agttcaggct tcaggtcaga g 21
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的引物
<400> 49
gctaggggag tgggaactgt 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 50
ctgcctgttg ccgcctggcc 20
<210> 51
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 51
ctgcctgttg cctggcccg 19
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 52
ctgcctgttg ccgcctggcc 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 53
gccagcaaca gattctggag 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 54
ctgttgcccg attctggaga 20
<210> 55
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 55
ggttctggaa gaggaccact gg 22
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 56
aacagccacc agtgggcgaa 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的寡核苷酸
<400> 57
ctgctgcctg gaggaaggag 20

Claims (58)

1.非肌细胞在制备用于向肌细胞递送目的基因以校正病理学表型的方法的药物中的用途，所述方法包括：
(a)提供表达外源Myomixer蛋白和外源Myomaker蛋白的非肌细胞，其中所述非肌细胞还包含目的基因，其中所述非肌细胞是成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞；以及
(b)使所述非肌细胞与肌细胞接触，
其中表达Myomixer和Myomaker蛋白的所述非肌细胞将与所述肌细胞融合并将所述目的基因递送至所述肌细胞，其中所述目的基因校正所述表型。
2.权利要求1所述的用途，其中所述非肌细胞是人细胞。
3.权利要求1所述的用途，其中所述非肌细胞是成纤维细胞。
4.权利要求1所述的用途，其中所述非肌细胞是骨髓细胞。
5.权利要求1所述的用途，其中所述非肌细胞是血细胞。
6.权利要求1所述的用途，其中步骤(b)在体外进行。
7.权利要求1所述的用途，其中步骤(b)在体内进行。
8.权利要求1所述的用途，其中所述非肌细胞表达可检测标志物或选择标志物。
9.权利要求1所述的用途，其中所述肌细胞是分离的肌细胞。
10.权利要求1所述的用途，其中所述肌细胞位于完整的肌组织中。
11.权利要求1所述的用途，其中所述病理学表型是正常基因产物的低表达或不存在。
12.权利要求1所述的用途，其中所述病理学表型是缺陷基因产物的表达。
13.权利要求1所述的用途，其中所述病理学表型与先天性肌病、肌少症、肌萎缩侧索硬化、肌营养不良、庞贝氏症或横纹肌肉瘤相关。
14.权利要求1所述的用途，其中使所述非肌细胞与肌细胞接触是通过递送至对象中包含所述肌肉的受影响的肌组织来进行的。
15.权利要求14所述的用途，其中通过肌内注射进行递送。
16.权利要求14所述的用途，其中递送重复至少一次。
17.权利要求14所述的用途，其中所述方法包括向所述对象施用第二治疗。
18.权利要求1所述的用途，其中所述非肌细胞离体递送至所述肌细胞并将所述肌细胞随后植入对象中。
19.权利要求18所述的用途，其中所述肌细胞包含在完整的肌组织中。
20.权利要求1所述的用途，其中所述肌细胞是成肌细胞。
21.非肌细胞在制备用于校正对象中的细胞中遗传缺陷的方法的药物中的用途，所述方法包括：
(a)提供来自所述对象的非肌细胞，其中所述非肌细胞是成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞；
(b)将一个或更多个表达盒引入所述非肌细胞中，其中所述一个或更多个表达盒表达(i)外源Myomixer蛋白和外源Myomaker蛋白，和(ii)一种或更多种治疗基因；以及
(c)使所述非肌细胞与具有遗传缺陷的肌细胞接触，
其中表达Myomixer和Myomaker蛋白的所述非肌细胞将与所述肌细胞融合并将所述治疗基因递送至所述肌细胞，从而校正所述遗传缺陷。
22.权利要求21所述的用途，其中所述非肌细胞是人细胞。
23.权利要求21所述的用途，其中所述非肌细胞是成纤维细胞。
24.权利要求21所述的用途，其中所述非肌细胞是骨髓细胞。
25.权利要求21所述的用途，其中所述非肌细胞是血细胞。
26.权利要求21所述的用途，其中步骤(b)和/或(c)在体外或体内进行。
27.权利要求21所述的用途，其中步骤(b)在体外进行并且步骤(c)在体内进行。
28.权利要求21所述的用途，其中所述非肌细胞表达可检测标志物或选择标志物。
29.权利要求21所述的用途，其中所述治疗基因包含Cas9和至少一种治疗sgRNA。
30.权利要求21所述的用途，其中所述肌细胞是分离的肌细胞。
31.权利要求21所述的用途，其中所述肌细胞位于完整的肌组织中。
32.权利要求21所述的用途，其中所述遗传缺陷是迪谢内肌营养不良突变。
33.权利要求21所述的用途，其中所述遗传缺陷是先天性肌病。
34.权利要求21所述的用途，其中所述遗传缺陷是庞贝氏症。
35.权利要求21所述的用途，其中所述遗传缺陷是肌萎缩侧索硬化。
36.权利要求27所述的用途，其中使所述非肌细胞与所述肌细胞接触包括将所述非肌细胞递送至对象中包含所述肌肉的受影响的肌组织。
37.权利要求36所述的用途，其中通过肌内注射递送。
38.权利要求36所述的用途，其中递送重复至少一次。
39.权利要求36所述的用途，其中所述方法包括向所述对象施用第二治疗。
40.权利要求27所述的用途，其中所述非肌细胞与所述肌细胞离体接触并随后植入对象中。
41.权利要求36所述的用途，其中所述肌细胞包含在完整的肌组织中。
42.权利要求21所述的用途，其中所述肌细胞是成肌细胞。
43.权利要求21所述的用途，其中所述表达盒包含组成型启动子或诱导型启动子。
44.权利要求21所述的用途，其中所述表达盒编码可检测标志物和/或选择标志物。
45.权利要求21所述的用途，其中所述表达盒包含在可复制载体中。
46.权利要求45所述的用途，其中所述可复制载体是病毒载体。
47.权利要求46所述的用途，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒载体。
48.权利要求45所述的用途，其中所述可复制载体是非病毒载体。
49.权利要求48所述的用途，其中所述非病毒载体配制成脂质体或纳米粒。
50.使非肌细胞与肌细胞融合的体外或离体方法，其包括：
(a)提供表达(i)所述非肌细胞中的外源Myomixer蛋白和(ii)所述非肌细胞中的外源Myomaker蛋白的非肌细胞，其中所述非肌细胞是成纤维细胞、骨髓细胞或血细胞；以及
(b)使所述非肌细胞与肌肉接触，其中所述接触在体外或离体进行，其中表达Myomixer蛋白的所述非肌细胞将与所述肌细胞融合。
51.权利要求50所述的方法，其中所述非肌细胞是人细胞。
52.权利要求50所述的方法，其中所述非肌细胞是成纤维细胞。
53.权利要求50所述的方法，其中所述非肌细胞是骨髓细胞。
54.权利要求50所述的方法，其中所述非肌细胞是血细胞。
55.权利要求50所述的方法，其中所述非肌细胞表达可检测标志物或选择标志物。
56.权利要求50所述的方法，其中所述肌细胞是分离的肌细胞。
57.权利要求50所述的方法，其中所述肌细胞位于完整的肌组织中。
58.权利要求50所述的方法，其中所述肌细胞是成肌细胞。
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