KR20220160538A - 아데노 관련 바이러스 벡터, 조성물, 근육 재생 촉진 방법 및 치료 방법 - Google Patents

아데노 관련 바이러스 벡터, 조성물, 근육 재생 촉진 방법 및 치료 방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것으로서, 여기서 핵산 분자는 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이며 작동적으로 커플링되어 있다. 또한, AAV 벡터를 포함하는 조성물, 뿐만 아니라 손상된 근육의 근육 재생을 촉진하는 방법, 대상체의 퇴행성 골격근 손실을 치료하는 방법, 뒤센 근이영양증과 같은 대상체의 외상성 근육 손상을 예방하는 방법, 대상체의 외상성 근육 손상을 치료하는 방법, 및 대상체의 노화로 인한 근육 손실을 치료하는 방법이 개시된다.

Description

아데노-연관 바이러스 벡터, 조성물, 근육 재생 촉진 방법 및 치료 방법
본 출원은 2020년 1월 17일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제62/962,712호 및 2020년 12월 19일에 출원된 미국 가특허 출원 일련 번호 제63/128,047호의 우선권을 주장하며, 이들은 전체가 본원에 참고로 포함된다.
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 R01 AR074430-01에 따른 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
분야
본 출원은 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 렌티바이러스 벡터, 뿐만 아니라 이의 조성물 및 사용 방법에 관한 것이다.
근육 소모성 질병은 인간 질병의 주요 근원을 나타낸다. 이들은 무엇보다도 유전적 기원(주로 근이영양증), 노화 관련(근육감소증), 또는 외상성 근육 손상의 결과일 수 있다. 근병증이 있는 개체, 또는 심각한 근육 외상 또는 노화로 인한 근육량 감소(근육감소증으로 알려짐)를 겪고 있는 개체에게 사용할 수 있는 치료 옵션은 거의 없다. 근병증의 생리학은 일반적으로 끊임없는 근육 퇴화 및 재생 주기의 일반적인 병인에서 잘 이해되고 기반을 두고 있으며, 이는 전형적으로 재활성화에 실패한 근육 줄기(위성) 세포 및 그 전구 세포의 기능적 소진, 및 때로는 이들의 손실로도 이어진다(Carlson & Conboy, "Loss of Stem Cell Regenerative Capacity Within Aged Niches", Aging Cell 6(3):371-82 (2007); Shefer 등, "Satellite-cell Pool Size Does Matter: Defining the Myogenic Potency of Aging Skeletal Muscle", Dev. Biol. 294(1):50-66 (2006); Bernet 등, "p38 MAPK Signaling Underlies a Cell-autonomous Loss of Stem Cell Self-renewal in Skeletal Muscle of Aged Mice", Nat. Med. 20(3):265-71 (2014); 및 Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function", Development 142(9):1572-1581 (2015)).
연령-관련 골격근 손실 및 위축은 연령에 따른 근육량, 근력 및 지구력의 점진적인 손실을 특징으로 한다. 이는 노령 인구에서 노쇠, 골절 증가 및 사망률의 중요한 근원일 수 있다(Vermeiren 등, "Frailty and the Prediction of Negative Health Outcomes: A Meta-Analysis", J. Am. Med. Dir. Assoc. 17(12):1163.e1-1163.e17 (2016) 및 Buford, T. W., "Sarcopenia: Relocating the Forest among the Trees", Toxicol. Pathol. 45(7):957-960 (2017)). 근육 손실과 위축에 대처하기 위해 여러 전략이 조사되었지만, 규칙적인 저항 운동이 근육 손실과 위축을 늦추는 데 가장 효과적이나, 수행 및 신체적 제한이 상당한 장벽이다(Wilkinson 등, "The Age-Related loss of Skeletal Muscle Mass and Function: Measurement and Physiology of Muscle Fibre Atrophy and Muscle Fibre Loss in Humans", Ageing Res. Rev. 47:123-132 (2018)). 결과적으로, 노령화하는 전 세계 인구로 인해, 연령-관련 근육 감소를 역전시키기 위한 치료 전략은 개발되어야 할 필요가 있다.
근육 재생은 수축성 세포 다발인 횡문근 섬유(근섬유) 및 이를 둘러싸고 있는 기저판 사이에 존재하는 골격근 줄기(위성) 세포에 의해 시작된다(Carlson & Conboy, "Loss of Stem Cell Regenerative Capacity within Aged Niches", Aging Cell 6(3):371-382 (2007) 및 Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91(4):1447-1531 (2011)). 근육에 신체적 손상이 발생하면 해부학적 틈새가 파괴되고 정상적으로 휴지기의 위성 세포가 활성화되어 비대칭적으로 증식한다. 일부 위성 세포는 줄기 세포 집단을 재구성하는 반면, 대부분의 다른 위성 세포는 분화 및 융합하여 새로운 근섬유를 형성한다(Hindi 등, "Signaling Mechanisms in Mammalian Myoblast Fusion", Sci. Signal. 6(272):re2 (2013)). 연구에 따르면 근육 재생에서 위성 세포/근모세포 집단의 뛰어난 중요성이 입증되었다(Shefer 등, "Satellite-cell Pool Size Does Matter: Defining the Myogenic Potency of Aging Skeletal Muscle", Dev. Biol. 294(1):50-66 (2006); Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function", Development 142(9):1572-1581 (2015); Briggs & Morgan, "Recent Progress in Satellite Cell/Myoblast Engraftment -- Relevance for Therapy, FEBS J. 280(17):4281-93 (2013); Morgan & Zammit, "Direct Effects of the Pathogenic Mutation on Satellite Cell Function in Muscular Dystrophy", Exp. Cell Res. 316(18):3100-8 (2010); 및 Relaix & Zammit, "Satellite Cells are Essential for Skeletal Muscle Regeneration: The Cell on the Edge Returns Centre Stage", Development 139(16):2845-56 (2012)).
근섬유는 상이한 수축 및 대사 특성을 표시하는 2가지 유형, 즉 지근(유형 I) 및 속근(유형 II)으로 나뉜다. 지근 및 속근-근섬유는 이들의 수축 속도, 대사, 및 발현되는 미오신 유전자의 유형에 따라 정의된다(Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91(4):1447-1531 (2011) and Bassel-Duby & Olson, "Signaling Pathways in Skeletal Muscle Remodeling", Annu. Rev. Biochem. 75:19-37 (2006)). 지근-근섬유는 미토콘드리아가 풍부하고 산화 대사를 우선적으로 활용하며 수축 속도 대신에 피로에 대한 저항력을 제공한다. 속근-근섬유는 영양 결핍, 외상성 손상, 진행성 연령-관련 손실(근육감소증) 및 암 매개 악액질에 대한 반응으로 더 쉽게 위축하는 반면, 지근-근섬유는 더 탄력적이다(Wang & Pessin, "Mechanisms for Fiber-Type Specificity of Skeletal Muscle Atrophy", Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 16(3):243-250 (2013); Tonkin 등, "SIRT1 Signaling as Potential Modulator of Skeletal Muscle Diseases", Curr. Opin. Pharmacol. 12(3):372-376 (2012); 및 Arany, Z, "PGC-1 Coactivators and Skeletal Muscle Adaptations in Health and Disease", Curr. Opin. Genet. Dev. 18(5):426-434 (2008)). 퍼옥시좀 증식인자-활성화 수용체 감마 공동활성인자 1-알파(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma co-activator 1-alpha (PGC1α 또는 Ppargc1)는 미토콘드리아 생물발생 및 유형 I 근섬유 특이화(specification)의 주요 생리학적 조절인자이다(Lin 등, "Transcriptional Co-Activator PGC-1 Alpha Drives the Formation of Slow-Twitch Muscle Fibres", Nature 418 (6899):797-801 (2002)). PGC1α는 미토콘드리아 생합성, 미토콘드리아 전사 인자 A(Tfam)를 자극하고, 미토콘드리아 생합성 외에도, Mef2 단백질의 발현 증가를 통해 지근 근섬유 형성을 촉진하기도 하는 NRF1 및 2와 같은 핵 호흡 인자(NRF)의 발현 증가를 통해 미토콘드리아 생물발생 및 산화 대사를 자극한다(Lin 등, "Transcriptional Co-Activator PGC-1 Alpha Drives the Formation of Slow-Twitch Muscle Fibres", Nature 418 (6899):797-801 (2002); Lai 등, "Effect of Chronic Contractile Activity on mRNA Stability in Skeletal Muscle", Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299(1):C155-163 (2010); Ekstrand 등, "Mitochondrial Transcription Factor A Regulates mtDNA Copy Number in Mammals", Hum. Mol. Genet. 13(9):935-944 (2004); 및 Scarpulla, RC, "Transcriptional Paradigms in Mammalian Mitochondrial Biogenesis and Function", Physiol. Rev. 88(2): 611-638 (2008)). 중요한 것으로, PGC1α는 불사용, 특정 근병증, 기아, 근육감소증, 악액질 및 다른 원인으로 인한 위축으로부터 근육을 보호한다(Wiggs, M. P., "Can Endurance Exercise Preconditioning Prevention Disuse Muscle Atrophy?", Front. Physiol. 6:63 (2015); Wing 등, "Proteolysis in Illness-Associated Skeletal Muscle Atrophy: From Pathways to Networks", Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 48(2):49-70 (2011); Bost & Kaminski, "The Metabolic Modulator PGC-1alpha in Cancer", Am. J. Cancer Res. 9(2):198-211 (2019); 및 Dos Santos 등, "The Effect of Exercise on Skeletal Muscle Glucose Uptake in type 2 Diabetes: An Epigenetic Perspective", Metabolism 64(12):1619-1628 (2015)).
골격근은 생리적 자극, 하중 지지, 위축, 질병 및 손상에 반응하여 지근 섬유와 속근 섬유 사이에 재형성(remodel)할 수 있다(Bassel-Duby & Olson, "Signaling Pathways in Skeletal Muscle Remodeling", Annu. Rev. Biochem. 75:19-37 (2006)), involving transcriptional, metabolic, and post-transcriptional control mechanisms (Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91(4):1447-1531 (2011) 및 Robinson & Dilworth, "Epigenetic Regulation of Adult Myogenesis", Curr. Top Dev. Biol. 126:235-284 (2018)). 지근 근육을 선택적으로 촉진하는 능력은 오랜 목표였는데, 그 이유는 지구력의 지근 유형 I 근섬유가 근육 위축에 대해 더 큰 저항을 제공하고(Talbot & Maves, "Skeletal Muscle Fiber Type: Using Insights from Muscle Developmental Biology to Dissect Targets for Susceptibility and Resistance to Muscle Disease", Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 5(4):518-534 (2016)), 근육감소증, 뒤센(Duchenne) 근이영양증, 악액질 및 다른 근소모 질환에 효과적인 치료법일 수 있기 때문이다(Selsby 등, "Rescue of Dystrophic Skeletal Muscle By PGC-1alpha Involves A Fast To Slow Fiber Type Shift In The Mdx Mouse", PLoS One 7(1):e30063 (2012); von Maltzahn 등, "Wnt7a Treatment Ameliorates Muscular Dystrophy", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(50):20614-20619 (2012); 및 Ljubicic 등, "The Therapeutic Potential Of Skeletal Muscle Plasticity In Duchenne Muscular Dystrophy: Phenotypic Modifiers As Pharmacologic Targets", FASEB J. 28(2):548-568 (2014)).
뒤센 근이영양증("DMD")은 근병증으로 알려진 가장 심각한 근육 퇴화 장애 중 하나이다. X-연관 열성 방식으로 유전되는, 이 장애는 디스트로핀 유전자의 돌연변이에 의해 유발되어, 근육 세포막의 안정화에 핵심적인 역할을 하는 단백질의 부재에 가까운 발현을 초래한다(Bonilla 등, "Duchenne Muscular Dystrophy: Deficiency of Dystrophin at the Muscle Cell Surface", Cell 54(4):447-452 (1988) and Hoffman 등, "Dystrophin: The Protein Product of the Duchenne Muscular Dystrophy Locus", Cell 51(6):919-928 (1987)). 결과적으로, 돌연변이가 있는 남성만이 DMD에 걸리며, 이는 정상 출산아 3500명 중 1명에게 영향을 미친다. DMD에 대한 치유법은 없으며, 현재 승인된 접근 방식은 근육 위축의 부차적인 악영향인 염증성 면역 반응을 약화시키는 코르티코스테로이드의 제한된 사용을 수반한다. 염증 반응은 일반적으로 정상적인 근육 상처 복구 및 재생에 유익하지만, DMD에서 이 반응은 근육 손상의 만성적인 특성으로 인해 더 이상 자가-제한적이지 않다. 이로 인해 기존 근육의 괴사가 악화되고 결합 및 지방 조직에 의한 대체로 인해 근육 섬유(근섬유)가 고갈된다(Carnwath & Shotton, "Muscular Dystrophy in the mdx Mouse: Histopathology of the Soleus and Extensor Digitorum Longus Muscles", J. Neurol. Sci. 80(1):39-54 (1987); Tanabe 등, "Skeletal Muscle Pathology in X Chromosome-Linked Muscular Dystrophy (mdx) Mouse", Acta Neuropathol. 69(1-2):91-95 (1986); 및 Fairclough 등, "Pharmacologically Targeting the Primary Defect and Downstream Pathology in Duchenne Muscular Dystrophy", Curr. Gene Ther. 12(3):206-244 (2012)). 스테로이드는 단기적으로 근력을 증가시킬 수 있지만 장기적 치료는 궁극적으로 비효과적이고 질병을 악화시킬 수 있다. 스테로이드는 질병의 근본 원인을 표적으로 하지 않는다. 따라서, DMD의 주요 근본 원인인 근육 섬유 강도의 손실, 근육 줄기 세포의 손실, 근육 재생 능력의 손실, 및 근육 건강 및 완전성에 대한 병리학적 면역 반응의 악화성 파괴 영향의 약화를 해결하는 약리학적 접근 방식이 절실히 요구된다(Fairclough 등, "Pharmacologically Targeting the Primary Defect and Downstream Pathology in Duchenne Muscular Dystrophy", Curr. Gene Ther. 12(3):206-244 (2012)).
디스트로핀은 근육 세포의 세포질 중간 필라멘트에 세포외 기질을 연결하는 근초에서 디스트로글리칸 복합체를 조립하는 기능을 하여, 디스트로핀의 부재 시 쉽게 손상되는 근육 섬유에 물리적 강도 및 구조적 완전성을 제공한다(Yiu & Kornberg, "Duchenne Muscular Dystrophy", Neurol. India 56(3):236-247 (2008)). 디스트로핀 결함성 근섬유는 DMD의 작은 스트레스 및 미세 파열에 의해 매우 쉽게 손상된다. 이것은 근육 복구 및 재생의 지속적인 주기를 촉발하고, 근육 줄기 세포 집단을 고갈시키며, 연령에 따라 증가하는 파괴적 면역 반응을 유발한다(Yiu & Kornberg, "Duchenne Muscular Dystrophy", Neurol. India 56(3):236-247 (2008); Smythe 등, "Age Influences The Early Events of Skeletal Muscle Regeneration: Studies of Whole Muscle Grafts Transplanted Between Young (8 Weeks) and Old (13-21 Months) Mice", Exp. Gerontol. 43(6):550-562 (2008); Heslop 등, "Evidence for a Myogenic Stem Cell that is Exhausted in Dystrophic Muscle", J. Cell Sci. 113(Pt 12):2299-32208 (2000); Cros 등, "Muscle Hypertrophy in Duchenne Muscular Dystrophy. A Pathological and Morphometric Study", J. Neurol. 236(1):43-47 (1989); 및 Abdel-Salam 등, "Markers of Degeneration and Regeneration in Duchenne Muscular Dystrophy", Acta Myol. 28(3):94-100 (2009)). 이와 관련하여 DMD에서 근육 및 이의 재생 능력의 점진적인 손실은 근육 줄기 세포 집단(즉, 위성 세포)의 소진(활성화 불능) 및 고갈로 인해 발생하는 것으로 밝혀졌다(Carlson & Conboy, "Loss of Stem Cell Regenerative Capacity Within Aged Niches", Aging Cell 6(3):371-82 (2007); Kudryashova 등, "Satellite Cell Senescence Underlies Myopathy in a Mouse Model of Limb-girdle Muscular Dystrophy 2H", J. Clin. Invest. 122(5):1764-76 (2012); Gopinath & Rando, "Stem Cell Review Series: Aging of the Skeletal Muscle Stem Cell Niche", Aging Cell 7(4):590-8 (2008); Morgan & Zammit, "Direct Effects of the Pathogenic Mutation on Satellite Cell Function in Muscular Dystrophy", Exp. Cell Res. 316(18):3100-8 (2010); 및 Collins 등, "Stem Cell Function, Self-renewal, and Behavioral Heterogeneity of Cells From the Adult Muscle Satellite Cell Niche", Cell 122(2):289-301 (2005)). 전형적으로, 정상 근육에서 손상 후 분화하지 않는 위성 세포의 작은 풀(pool)은 단지 근육 손상 시 다시 활성화되어 분화하고 근섬유로 융합하기 위해 근육을 재집단화하고 틈새에서 휴지기 상태로 재진입한다. 틈새는 위성 세포가 근육 섬유에 인접하여 상주하는 부위로서 구조적 및 형태학적으로 정의되며, 여기서 휴지기는 라미닌 및 다른 구조 단백질에 의해 식별되는 미세 환경의 구조적 완전성에 의해 유지된다(Carlson & Conboy, "Loss of Stem Cell Regenerative Capacity Within Aged Niches", Aging Cell 6(3):371-82 (2007); Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function", Development 142(9):1572-1581 (2015); Gopinath & Rando, "Stem Cell Review Series: Aging of the Skeletal Muscle Stem Cell Niche", Aging Cell 7(4):590-8 (2008); Seale & Rudnicki, "A New Look at the Origin, Function, and "Stem-cell" Status of Muscle Satellite Cells", Dev. Biol. 218(2):115-24 (2000); Briggs & Morgan, "Recent Progress in Satellite Cell/Myoblast Engraftment -- Relevance for Therapy, FEBS J 280(17):4281-93 (2013); Collins 등, "Stem Cell Function, Self-renewal, and Behavioral Heterogeneity of Cells From the Adult Muscle Satellite Cell Niche", Cell 122(2):289-301 (2005); 및 Murphy 등, "Satellite Cells, Connective Tissue Fibroblasts and Their Interactions are Crucial for Muscle Regeneration", Development 138(17):3625-37 (2011)). 연구에 따르면 DMD에는 이 위성 세포 틈새를 파괴하는 근육에 대한 지속적인 손상이 있고, 이는 이들 줄기 세포의 재생을 방해하고 궁극적으로 이들의 기능적 소진 및 근육 복구의 중단을 야기함을 시사한다.
근발생 프로그램은 근원성 조절 인자(MRF)를 암호화하는 유전자에 의해 제어되어(Mok & Sweetman, "Many Routes to the Same Destination: Lessons From Skeletal Muscle Development", Reproduction 141(3):301-12 (2011)), 활성화된 위성 세포의 분화를 조율하여 근모세포가 되도록 하고, 이들의 증식을 저지하고, 이들이 분화하도록 하고 다핵 근섬유와 융합한다(Mok & Sweetman, "Many Routes to the Same Destination: Lessons From Skeletal Muscle Development", Reproduction 141(3):301-12 (2011)). 고유한 표현 마커는 골격근 재생을 식별하고 단계를 지정한다. PAX7은 휴지기 및 초기 활성화된 위성 세포에 의해 발현되는 전사 인자이다(Brack, A.S., "Pax7 is Back", Skelet. Muscle 4(1):24 (2014) and Gunther, S., 등, "Myf5-positive Satellite Cells Contribute to Pax7-dependent Long-term Maintenance of Adult Muscle Stem Cells", Cell Stem Cell 13(5):590-601 (2013)).
위성 세포는 노화됨에 따라, 휴지기 집단을 유지하는 이들의 능력을 상실하고(Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function", Development 142(9):1572-1581 (2015)), 노화 및 근병증 질환에서 근육감소증(근육 손실)의 주요 원인인 고갈되거나 기능적으로 소진된다(Bernet 등, "p38 MAPK Signaling Underlies a Cell-autonomous Loss of Stem Cell Self-renewal in Skeletal Muscle of Aged Mice", Nat. Med. 20(3):265-71 (2014); Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function", Development 142(9):1572-1581 (2015); Kudryashova 등, "Satellite Cell Senescence Underlies Myopathy in a Mouse Model of Limb-girdle Muscular Dystrophy 2H", J. Clin. Invest. 122(5):1764-76 (2012); 및 Silva 등, "Inhibition of Stat3 Activation Suppresses Caspase-3 and the Ubiquitin-proteasome System, Leading to Preservation of Muscle Mass in Cancer Cachexia", J. Biol. Chem. 290(17):11177-87 (2015)).
따라서, 예를 들어, 근섬유 강도의 손실, 근육 줄기 세포의 손실, 근육 재생 능력의 손실, 및 근육 건강 및 완전성에 대한 병리학적 면역 반응의 악화되는 파괴 효과의 약화를 포함하는 근병증 질환(예를 들어, 근육감소증, 뒤센 근이영양증, 외상성 근육 손상)의 주요 근본 원인을 해결하는 효과적인 치료 옵션이 절실히 요구된다.
본 출원은 본 기술 분야의 이러한 결함 및 다른 결함을 극복하는 것에 관한 것이다.
요약
본 출원의 일 측면은 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것으로서, 여기서, 핵산 분자는 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링되어 있다.
본 출원의 또 다른 측면은 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 출원의 또 다른 측면은 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 출원의 다른 측면은 근육 재생을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 근육 세포량을 증가시키고, 근육 세포 지구력을 증가시키고/시키거나 근위축의 혈청 마커를 감소시키기 위해 근육 세포에서 외인성 AUF1을 발현하기에 효과적인 조건 하에 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 본원에 기재된 조성물과 근육 세포를 접촉시키는 것을 수반한다.
본 출원의 추가 측면은 대상체에서 퇴행성 골격근 손실을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 골격근 손실에 대한 치료를 필요로 하는 대상체를 선택하고 선택된 대상체에서 골격근 재생을 유발하기에 효과적인 조건 하에 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 본원에 기재된 조성물을 선택된 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다.
본 출원의 또 다른 측면은 대상체의 외상성 근육 손상을 예방하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 외상성 근육 손상의 위험이 있는 대상체를 선택하고 선택된 대상체에게 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 본원에 기재된 조성물, 또는 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 수반하며, 여기서 핵산 분자는 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링되어 있다.
본 출원의 또 다른 측면은 대상체의 외상성 근육 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 외상성 근육 손상이 있는 대상체를 선택하고, 선택된 대상체에게 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 본원에 기재된 조성물, 또는 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 수반하며, 여기서 핵산 분자는 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링되어 있다.
종래 연구에는 AUF1이 실험적으로 결실된 동물 모델에 AUF1을 공급하면 새로운 근육 재생을 초래할 수 있음이 입증되어 있다(본원에 전체가 참고로 포함되는 PCT 공개 번호 WO 2016/196350 참조). 본 출원은 부분적으로, 유전자 전달에 의한 AUF1 보충이 AUF1 발현의 돌연변이 또는 제한이 없을 때 뒤센 근이영양증과 같은 퇴행성 근육 질환에서 근육 재생을 회복하고 기능한다는 놀라운 발견에 기반을 둔 것이다. 이는 보충성 AUF1의 제공이 정상 근육에는 영향을 미치지 않고 정상 근육의 재생을 유도하지 않는다는 사실에 비추어 볼 때 특히 놀라운 것이다.
메카니즘이 작동하는 방식에 관해 임의의 이론에 의해 국한시키려는 것은 아니지만, 본원에 제시된 데이터는, 특히 퇴행성 근육 질환의 동물 모델에서, 다음을 입증한다: (i) 뒤센 근이영양증에서 AUF1 유전자 전달은 디스트로핀 동족체 유트로핀을 상향조절함으로써 돌연변이된 디스트로핀의 손실을 보상하고 근육 기능을 회복시킴; (ii) AUF1 유전자 전달은 정상 근육의 재생을 활성화하지 않음; (iii) 유전자 전달에 의한 AUF1 보충은 상처 입은 근육에서 AUF1 발현의 정상적인 수준에도 불구하고 상처 입은 근육의 재생을 가속화하고 근육 기능을 촉진함; 및 (iv) AUF1 보충은 노화 근육에서 근육 재생, 근육량 및 기능을 회복시킴.
하기 실시예에 기재된 바와 같이, 유전자 전달에 의한 AUF1 보충은 뒤센 근이영양증과 같은 퇴행성 근육 질환에서 근육량 및 기능의 연령-관련 손실 및 외상성 근육 손상에서 근육 재생, 근육량 및 근육 기능을 회복시킨다.
본원에 개시된 실시예는 AUF1의 발현 손실이 골격근의 노화 동안 자연적으로 발생하고, 앉아만 있는 동물에서 연령-관련 근육 손실 및 위축의 기초가 되지만, AAV8-AUF1 골격근 유전자 전달에 의해 역전될 수 있음을 입증한다. AUF1 유전자 요법을 받은 마우스는 유의미하고 내구적인 골격근 질량 및 운동 지구력; 지속 가능한 근육 재생의 핵심 지표인 Pax7+ 활성화 위성 세포 및 근모세포의 증가; 그의 mRNA의 안정화를 통한 PGC1α의 발현 증가; 증가된 미토콘드리아 생물발생; 및 근육 퇴화 마커의 감소를 다시 얻는다. 본원에 개시된 실시예는 근육 세포 특이적 AUF1 유전자 요법이 뒤센 근이영양증의 마우스 모델에서 골격근 질량 및 기능을 회복시킨다는 것을 추가로 입증한다. AUF1 유전자 요법(예를 들어, 근육에 직접 렌티바이러스 벡터 전달 또는 AAV8 벡터에 의한 AUF1의 전신 전달에 의해)은 또한 (1) 근육 줄기(위성) 세포 활성화; (2) 근육 위축의 확립된 바이오마커의 발현 감소; (3) 성숙한 근육 섬유(근섬유)의 재생 가속; (4) 근육 재생 인자의 발현 향상; (5) 손상된 근육 재생의 강력한 가속화; (6) 2가지 주요 유형의 근육(즉, 지근(유형 I) 또는 속근(유형 II) 섬유)의 재생 증가; 근육량, 근력 회복 및 정상 근육 생성에 효과적인 것으로 나타난다.
AAV8-AUF1 유전자 요법은 인간의 근육 손실 및 위축을 약화시키기 위한 잠재적인 장기간 치료 개입을 제공할 수 있다.
도 1a-1l은 골격근에 AUF1 보충이 12개월 및 28개월된 마우스에서 운동 지구력을 개선한다는 것을 보여준다. 도 1a는 투여 후 40일차에 TA 근육 중 AAV GFP 대조군 및 AAV AUF1/GFP 양성 근섬유의 대표적인 염색을 보여주는 한 쌍의 사진 이미지이다. 도 1b는 AAV 투여 후 40일차에 TA 근육에서 GFP 양성 근섬유의 정량을 보여주는 그래프이다. n=5 마리 마우스. 도 1c는 AAV 투여 후 40일차에 비복근, TA, EDL 및 비장근에서 auf1 mRNA의 상대적 배수 증가된 발현을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. n=8-9 마리 마우스. 도 1d-h는 3개월 및 12개월된 마우스에서 AAV 투여 후 40일차의 근력 및 운동 지구력을 보여주는 그래프이다: 악력 시간(도 1d), 최대 속도(도 1e), 일률(도 1f), 소진 시간(도 1g) 및 소진 거리(도 1h). n=5-9 마리 마우스. 도 1i-l은 18개월된 마우스에서 AAV 투여 후 6개월차에 근력 및 및 운동 지구력을 보여주는 그래프이다: 최대 속도(도 1i), 일률(도 1j), 소진 시간(도 1k) 및 소진 거리(도 1l). n=4 마리 마우스. 5개 이상의 독립적인 연구의 평균±SEM. * P<0.05, ** P<0.01 무쌍의(unpaired) 만 휘트니(Mann-Whitney) U 테스트에 의함.
도 2a-2j는 AUF1 유전자 요법이 근섬유 용량의 증가와 함께 근육량을 유도함을 보여준다. 도 2a-b는 각각 비복근 및 TA 근육에 대한 AAV 투여 후 40일차에 총 체중에 대한 근육 중량을 보여주는 그래프이다. n=8-9마리 마우스. 도 2c-d는 AAV 투여 후 40일차에 비복근 근섬유 CSA의 빈도 분포 및 평균 면적을 보여주는 그래프이다. n=6마리 마우스/군. 도 2e-f는 AAV 투여 후 40일차에 TA 근육 CSA의 빈도 분포 및 평균 면적을 보여주는 그래프이다. n=5마리 마우스. 도 2g는 치료 후 40일차에 비복근에서 지근 근섬유(적색) 및 핵(DAPI 청색)의 대표적인 면역염색을 보여주는 한 쌍의 사진 이미지이다. 스케일 바: 200μm. 도 2h는 AAV 투여 후 40일차에 비복근에서 지근 근섬유 및 속근 근섬유의 필드(field)당 지근 근섬유 및 평균 CSA를 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 2i는 AAV AUF1-GFP 또는 AAV GFP 투여 후 40일차에 비장근에서 지근 근섬유(적색) 및 핵(청색)의 대표적인 면역염색을 보여주는 한 쌍의 사진 이미지이다. 스케일 바: 200μm. 도 2j는 AAV AUF1 또는 AAV GFP 투여 후 40일차에 지근 비장근 근섬유를 보여주는 그래프이다. 평균 횡단 표면적(CSA). 군당 n=3 마리 마우스.
도 3a-3j는 AAV8 AUF1-GFP 유전자 전달된 마우스에서 골격근 근발생의 분자 마커를 보여준다. 도 3a-b는 유전자 전달 후 40일차에 불변 핵 TATA-박스 결합 단백질(tbp) mRNA에 대해 정규화된 비복근(도 3a) 및 비장근(도 3b) 근육에서의 상대적인 myh7 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3c-d는 유전자 전달 40일차에 tbp mRNA로 정규화된 비복근(도 3c) 및 비장근(도 3d) 근육의 상대적인 속근 미오신 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3e는 유전자 전달 후 40일차에 비복근에서 나타나는 바와 같은 mRNA의 발현 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3f는 유전자 전달 후 40일차 또는 6개월차에 비복근에서 DNA 미토콘드리아 함량을 보여주는 그래프이다. 도 3g는 유전자 전달 40일 후 비복근에서의 nrf1 및 nrf2 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3h는 유전자 전달 후 40일차에 비장근에서의 nrf1 및 nrf2 mRNA 수준을 보여주는 그래프이다. 도 3i는 유전자 전달 후 40일차 및 6개월차에 비복근에서의 미토콘드리아 DNA 함량을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 3j는 유전자 전달 후 40일차에 비장근에서의 미토콘드리아 DNA 함량을 보여주는 그래프이다. 3개 이상의 독립적인 연구의 평균±SEM. 무쌍의 만-휘트니 U 테스트에 의한 * P<0.05; ** P<0.01.
도 4a-4h는 AUF1이 지근이 풍부한 비장근에서 고도로 발현되고 pgc1α mRNA를 안정화시킨다는 것을 보여준다. 도 4a는 TA, 비복근, EDL, 및 비장근에서 3개월 및 12개월된 WT 마우스의 상대적인 auf1 mRNA 발현을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. n=5-7 마리 마우스. 도 4b는 3개월된 마우스의 TA, 비복근, EDL 및 비장근에서 AUF1 단백질 수준 및 정량의 대표적인 면역블롯이다. 도 4c는 3개월된 마우스 TA, 비복근, EDL 및 비장근에서 상대적인 myh7 mRNA 발현을 보여주는 그래프이다. 도 4d는 WT C2C12 근모세포 및 AUF1 KO 근모세포에서의 상대적인 pgc1α mRNA 발현 및 단백질 수준을 보여준다. 도 4e는 치료 후 40일차에 TA, 비복근 및 EDL 근육에서, 및 6개월차에 비복근에서의 상대적인 pgc1α mRNA 발현을 보여주는 한 쌍의 그래프이다. 도 4f는 치료 후 6개월차에 2마리의 AAV8-GFP 대조군과 AAV8-AUF1 GFP 동물의 대표적인 면역블롯(왼쪽) 및 군당 3마리 동물에서 AUF1 및 PGC1α의 정량(오른쪽)이다. 도 4g는 WT C2C12 세포에서 근관세포 분화 유도 48시간 후 근모세포에서의 내인성 AUF1 단백질을 사용한 Pgc1α mRNA 면역침전을 보여주는 그래프이다. n=3. 도 4h는 WT 및 AUF1 KO C2C12 세포에서 Pgc1α mRNA 붕괴율을 보여주는 그래프이다. 3개 이상의 독립적인 연구의 평균±SEM. 패널 A 및 B: 크러스칼-월리스(Kruskall-Wallis) 테스트에 의한 **** P<0.001. 다른 모든 패널 * P<0.05, ** P<0.01, *** P<0.001, 무쌍의 만-휘트니 U 테스트에 의함.
도 5a-5h는 AUF1 발현의 손실이 지근 근섬유의 위축을 유도함을 보여준다. 도 5a는 3개월차에 WT 및 AUF1 KO 마우스의 체중을 보여주는 그래프이다. 도 5b는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 TA, 비복근, EDL 및 비장근 근육량을 보여준다. WT 및 AUF1 KO 비장근의 대표 이미지가 제시된다. 도 5c는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 비장근에서 지근(위) 또는 속근(아래) 미오신(적색) 및 라미닌(녹색)의 대표적인 면역염색의 사진 이미지를 보여준다. 스케일 바: 200μm. 도 5d-e는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 각각 필드당 지근 근섬유의 백분율 및 수를 보여주는 그래프이다. 도 5f-g는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 각각 필드당 속근 근섬유의 백분율 및 수를 보여주는 그래프이다. 도 5h는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 평균 비장근 지근 및 속근 근섬유 CSA를 보여주는 그래프이다, n=6-7마리 마우스.
도 6a-6i는 AUF1 결실이 6개월차에 지근 및 속근 근위축을 유도함을 보여준다. 도 6a는 6개월차에 WT 및 AUF1 KO 마우스의 체중을 보여주는 그래프이고, n=5-6마리 마우스이다. 도 6b는 6개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 TA, EDL, 비복근 및 비장근 중량을 보여준다. 도 6c는 6개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 절제된 근육의 대표적인 사진 이미지를 보여준다. 도 6d는 6개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 비장근에서 지근 미오신(적색) 및 라미닌(녹색)의 대표적인 면역염색을 보여주는 사진 이미지이다. 스케일 바: 500μm. 도 6e는 6개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 비장근에서 지근 및 속근 근섬유의 평균 CSA를 보여주는 그래프이다. 도 6f는 비장근에서 6개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 지근 근섬유의 백분율을 보여주는 그래프이다. 도 6g는 6개월된 WT 및 AUF1 KO 비복근에서 지근 미오신(적색) 및 라미닌(녹색)의 대표적인 염색을 보여주는 한 쌍의 사진 이미지이다. 핵은 DAPI(청색)로 염색했다, 스케일 바, 200μm. 도 6h는 6개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 비복근에서의 필드당 지근 근섬유의 수를 보여주는 그래프이다. 군당 n=4마리의 마우스. 도 6i는 6개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 지근 및 속근 근섬유의 평균 비복근 근섬유 CSA를 보여주는 그래프이다. 군당 n=4마리의 마우스. 4회 이상의 독립적인 연구의 평균±SEM. 무쌍의 만-휘트니 U 테스트에 의한 * P<0.05, ** P<0.01.
도 7a-7g는 골격근에서 AUF1 보충이 12개월(중간 연령) 및 18개월된 마우스에서 운동 지구력을 개선한다는 것을 보여준다. 도 7a는 WT 마우스에서 3개월 및 12개월차에 불변 TBP mRNA에 대해 정규화된 TA, 비복근, EDL, 및 비장근에서의 auf1 mRNA의 상대적 발현을 보여주는 그래프이다. 도 7b는 3, 12, 및 18개월된 WT 마우스의 TA 근육에서 AUF1 단백질 수준의 대표적인 면역블롯 및 정량을 보여준다. GAPDH는 로딩 대조군이다. 레인당 군당 n=3마리의 마우스. 도 7c는 총 체중에 대해 정규화된 3, 12, 및 18개월된 WT 마우스에서 TA, 비복근, EDL 근육량 및 비장근을 보여주는 그래프이다. 도 7d는 AAV8 투여 후 40일차에 도 7a에서와 같은 TA 근육의 AUF1 및 β-튜불린의 면역블롯이다. 도 7e는 AAV8 AUF1-GFP 또는 AAV8 GFP 대조군 투여 후 40일차에 12개월된 마우스의 다양한 기관에서의 불변 gapdh mRNA에 대해 정규화된 auf1 mRNA 발현을 보여주는 그래프이다. 도 7f는 AAV8 AUF1-GFP 또는 AAV8 GFP 대조군 벡터 투여 후 40일차에 12개월된 마우스의 TA 근육에서의 대표적인 Pax7 염색을 보여준다. 스케일 바, 100μm. Pax7 mRNA 발현의 정량은 AAV8 AUF1-GFP 또는 AAV8 GFP 대조군 벡터 투여 후 40일차에 12개월된 마우스의 TA 근육에서의 불변 TBP mRNA에 대해 정규화했다. 마우스 군당 n=8-9마리. 도 7g는 AAV 투여 후 40일차에 TBP mRNA에 대해 정규화된 TA 근육에서의 Trim63 및 Fbxo32 mRNA의 상대적 발현을 보여주는 그래프이다. 3회 이상의 독립적인 연구의 평균±SEM. 도 7a-b: 크러스칼-월리스 테스트에 의한 *P<0.05, **P<0.01. 다른 모든 패널은 무쌍의 만 휘트니 U 테스트에 의해 *P<0.05, **P<0.01.
도 8a-8b는 AUF1이 미오신 및 MEF2C 발현을 제어함을 보여준다. 도 8a의 그래프는 분화(48시간)성 WT 근관세포 및 AUF1 KO C2C12 세포에서 gapdh mRNA에 대해 정규화된 속근 및 지근 미오신 mRNA의 상대적 발현을 보여준다. 군당 n=5마리의 마우스. 도 8b는 AAV AUF1-GFP 또는 AAV GFP 주사 후 6개월차에 비복근에서의 TBP mRNA에 대해 정규화된 mef2c mRNA 발현을 보여주는 그래프이다. 군당 n=5마리의 마우스. 5회 이상의 독립적인 연구로부터의 평균±SEM. *P<0.05, 무쌍의 만-휘트니 U 테스트에 의함.
도 9a-9g는 AUF1 결실이 어린 연령에서 지근 근육 위축을 유도함을 보여준다. 도 9a는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 TA, EDL 및 비복근의 대표적인 사진 이미지를 보여준다. 도 9b는 WT 및 AUF1 KO 마우스의 비장근에서 지근 및 속근 미오신(적색) 근섬유의 대표적인 면역염색 이미지를 보여준다. 핵의 DAPI 염색(청색), 세포외 기질의 라미닌(녹색) 염색. 스케일 바: 500μm. 도 9c는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 비복근에서 지근 미오신(적색) 및 라미닌(녹색)의 대표적인 염색 사진 이미지를 보여준다(스케일 바, 200μm). 도 9d-e는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 비복근에서 필드당 지근 근섬유의 백분율 및 수를 각각 보여주는 그래프이다. 도 9f는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스에서 지근 및 속근 근섬유의 평균 비복근 근육 면적을 보여주는 그래프이다. 군 당 n=4마리 마우스. 도 9g는 3개월된 WT 및 AUF1 KO 마우스의 비복근 및 비장근에서 PGC1α, AUF1 및 대조군 GAPDH 단백질의 수준을 보여준다. 각 레인은 하나의 마우스에 해당한다. AUF1 비복근 레인에서 하위 밴드는 비특이적 단백질이다. 3회 이상의 독립적인 연구의 평균 ± SEM. 무쌍의 만-휘트니 U 테스트에 의한 *P<0.05. ns,(유의미하지 않음).
도 10a-10c는 AAV8 발현 벡터의 개발을 예시한 것이다. 도 10a는 AAV8 발현 벡터 개발의 개략도이다. 뮤린 p40AUF1 cDNA의 cDNA는 tMCK 프로모터 하에 AAV8 벡터에 클로닝했다(AAV8-tMCK-AUF1-IRES-eGFP)(Vector Biolabs). tMCK 프로모터는 높은 근육 특이성을 유도하는 MCK(근육 크레아틴 키나제) 프로모터의 절두된 조절 영역에 결찰된 3중 직렬의 2RS5 인핸서 서열(3-Ebox)을 첨가함으로써 생성되었고, 이는 높은 근육 특이성을 유도한다(Blankinship 등, "Efficient Transduction of Skeletal Muscle Using Vectors Based on Adeno-associated Virus Serotype 6", Mol. Ther. 10(4):671-8 (2004), 이는 전체가 본원에 참고로 포함됨). AAV8 벡터는 AUF1 및 GFP(AUF1-GFP, GFP가 HCV IRES에 의해 동일한 mRNA로부터 해독됨)를 발현하거나, 또는 대조군으로서 GFP만을 발현한다. 두 유전자의 발현은 골격근 세포에서 선택적으로 활성인 크레아틴 키나제 tMCK 프로모터에 의해 제어된다. AAV8-tMCK-IRES-eGFP 작제물은 대조군 벡터로서 사용되었다. 도 10b는 도 10a에서 AAV8 벡터에 의해 형질도입된 세포에서 발현되는 암호화된 p40AUF1 이소형(isoform)(서열번호 27)의 아미노산 서열을 보여준다. 도 10c는 p40AUF1 이소형의 암호화 영역의 뉴클레오타이드 서열(서열번호 28)을 보여준다.
도 11a-11b는 mdx 마우스에서의 AAV8 형질도입 빈도를 보여준다. AAV8 AUF1-GFP 및 AAV8 GFP 대조군 벡터 처리된 mdx 마우스는 전방 경골(TA) 근육 GFP 염색에 의해 보여지는, 유사한 벡터 형질도입 및 보유율을 표시했다. 도 11a는 AAV8 형질도입 효율을 강조하기 위한 TA 근육의 GFP 면역형광 염색(녹색) 및 근육 섬유 구조 및 완전성을 강조하기 위한 라미닌-a2 염색(적색)의 대표적인 사진 이미지를 보여준다. 도 11b는 TA 근육에서 AAV8 GFP 형질도입에 대한 조건당 3마리 동물의 정량을 보여주는 그래프이다. 대조군 AAV8 GFP와 AAV8 AUF1 GFP 처리군 간의 형질도입 효율에 통계적 차이(ns)는 없다.
도 12a-12f는 AUF1 유전자 요법이 mdx 마우스에서 근육량 및 지구력을 향상시킨다는 것을 보여준다. 1개월된 C57BL/10ScSn 수컷 DMD 마우스(본원에서는 mdx 마우스, JACS)에게 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8 GFP의 2x1011 게놈 카피를 2.5x1011 AAV 입자를 함유하는 50 μl의 단일 안와후 주사로서 투여했다. AAV8 투여 2개월 후, AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군으로서 AAV8 GFP로 형질도입된 mdx 마우스를 운동 성능에 대한 표준 절차로 테스트했다(하기 실시예 참조). 도 12a는 3개월차에 AAV8 GFP만을 투여받은 mdx 대조군 마우스가 야생형(WT) C57BL 마우스의 30gm에 비해 29gm의 평균 체중을 가졌음을 보여주는 그래프이다. 대조적으로, 대조군 AAV8 GFP 처리된 mdx 마우스와 비교할 때, AAV8 AUF1-GFP 보충된 mdx 마우스는 대조군 mdx 마우스와 비교하여 유의미한 증가인 31gm의 평균 체중을 가졌다. 도 12b는 체중에 대해 정규화되었을 때, 그리고 유전자 요법 형질도입 후 2개월차에, AAV8 AUF1-GFP 처리된 mdx 마우스가 전방 경골(TA) 근육량의 10% 증가, 장지신근(extensor digitorum longus: EDL) 근육량의 11% 증가, 및 비복근 근육량의 8.5% 증가를 입증함을 보여주는 그래프이다. 비장근 근육량에는 차이가 없었다. 대조군 AAV8 GFP 처리된 mdx 마우스와 비교하여, AUF1 보충된 mdx 마우스는 지대형(limb-girdle) 골격근 근력 및 지구력의 척도인 그리드 매달림(grid hanging) 시간의 약 40% 개선을 보여주었다(도 12c). 트레드밀로 테스트했을 때, AAV AUF1-GFP mdx 마우스는 16% 더 높은 최대 속도(도 12d), 35% 더 긴 소진 시간(도 12e), 및 37% 증가된 소진 거리(도 12f)를 표시했다. 이들 데이터는 AUF1 유전자 전달의 결과로서 mdx 마우스에서의 운동 성능 및 지구력의 실질적이고 통계적으로 유의미한 증가를 입증한다. 모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트에 의해 분석했다. *,P<0.05.
도 13a-13d는 AUF1 유전자 요법이 WT 근육량 또는 지구력을 증가시키지 않는다는 것을 보여준다. mdx 마우스와 동일한 배경인 정상 WT C57BL 마우스는 도 12a-12f에 기재된 바와 같이 1개월차에 AAV8 GFP 대조군 또는 AAV8 AUF1-GFP를 2x1011 게놈 카피로 안와후 주사에 의해 투여하였다. 마우스는 유전자 전달 후 3개월차에 분석하였다. 이러한 데이터는 mdx 마우스에서 발견되는 근육량 및 운동 지구력의 유의미한 증가와는 대조적이다. 오히려, 동일한 유전자 배경의 대조군 AAV8 GFP 마우스와 비교하여, AAV8 AUF1-GFP가 투여된 WT 마우스는 체중(도 13a), 트레드밀 소진 시간(도 13b), 최대 속도(도 13c), 및 소진 거리(도 13d)에서 통계적으로 유의미한 증가를 보이지 않는다. 모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트로 분석했다. 결과는 P<0.05에서 유의미하게 상이한 것으로 발견되지 않았다.
도 14는 AAV8 AUF1 유전자 요법이 mdx 마우스에서 혈청 크레아틴 키나제 수준을 감소시킨다는 것을 보여준다. 1개월된 mdx 마우스에 도 12a-12f에 기재된 바와 같은 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8 GFP를 투여하였다. 3개월차에, 근초 누출 및 근육 위축의 척도인 혈청 크레아틴 키나제(CK) 활성 수준에 대해 마우스를 테스트했다. 상단: WT 대조군, AAV8 GFP 벡터 단독으로 처리된 mdx 마우스, 및 AAV8 AUF1 GFP로 처리된 mdx 마우스에 대한 혈청 CD 활성 결과를 보여주는 미가공 데이터. 하단: 3마리 마우스 각각에 대한 3회 반복 연구의 정량. 대조군 AAV8 GFP mdx 마우스는 높은 수준의 혈청 CK 활성을 표시했고, AAV8 AUF1-GFP 유전자 요법을 투여받은 mdx 마우스는 혈청 CK 활성이 4배 초과로 감소하여, 매우 유의미한 감소를 보였다. WT C57BL 마우스에서는 검출 가능한 수준의 혈청 CK 활성이 없었다. ND, 검출되지 않음. 모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트로 분석했다. **, P<0.01; *** P<0.001.
도 15a-15b는 AAV8 AUF1 유전자 요법이 mdx 마우스 횡경막에서 근육 괴사 및 섬유증을 감소시킨다는 것을 보여준다. 1개월된 mdx 마우스에 도 12a-12f에 기재된 바와 같은 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8 GFP를 투여하였다. 3개월차에, 횡격막은 AAV8 GFP 대조군 및 AAV8 AUF1-GFP 마우스로부터 감소되었고, FFPE에 매립되고 H&E로 염색되었다(도 15a). 퇴행성 횡격막 근육의 퍼센트를 채점했고, AUF1 유전자 전달에 의해 74% 감소된 것으로 발견되었다. WT C57BL 마우스 횡격막은 대조군으로서 제공했다. mdx 마우스의 횡격막 근육은 Masson Trichome으로 염색하여 근육 섬유증을 정량했다(도 15b). 대표적인 근육 절편이 제시된다. AUF1 유전자 전달은 대조군 AAV8 GFP 처리 동물과 비교하여 섬유증을 2배 감소시켰다. 모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트에 의해 분석했다. **, P<0.01. 그렇지 않으면 나타낸 바와 같이, 피셔 정확도(Fisher Exact) 테스트에 의해 분석했다.
도 16a-16b는 AAV8 AUF1 유전자 요법이 근육 면역 세포 침입을 감소시킨다는 것을 보여준다. 1개월차의 mdx 마우스에 도 12a-12f에 기재된 바와 같은 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8 GFP를 투여했다. 3개월차에 횡경막을 AAV8 GFP 대조군 및 AAV8 AUF1-GFP 처리된 마우스로부터 절제하고, FFPE에 매립시키고, 적색 형광 마커 Alexa Fluor 555가 커플링된 대식세포 바이오마커 CD68에 대한 항체로 염색했다. 대표적인 이미지는 AAV8 GFP 대조군에 비해 AAV8 AUF1-GFP 처리된 동물에서 대식세포 CD68 염색의 강력한 감소를 보여준다(도 16a). CD68 염색의 경우 군당 3마리의 마우스로부터의 표본당 5개 필드의 정량(도 16b). 모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트로 분석했다. *, P<0.05.
도 17a-17e는 AAV8 AUF1 유전자 요법이 mdx 마우스에서 배아 미오신 중쇄(eMHC)의 발현을 억제한다는 것을 보여준다. eMHC는 DMD에서 근육 퇴화의 임상 마커이다. 1개월차의 mdx 마우스에 도 12a-12f에 기재된 바와 같은 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8 GFP를 투여하였다. 3개월차에 횡격막 근육을 제거하고 FFPE에 고정시키고, eMHC(녹색), 핵(DAPI, 청색) 및 라미닌(적색)에 대한 항체로 염색했다. 면역형광을 수행했고 대표적인 이미지는 WT C57BL6 마우스와 비교하여 나타내었다(도 17a). AAV8 AUF1-GFP 유전자 전달은 횡격막에서 eHMC 발현을 강력하게 감소시켰다. 도 17a에서와 같이 염색된 횡격막의 고배율은 AUF1 유전자 전달에 의한 eMHC 발현의 강한 감소를 보여준다(도 17b). 근섬유에서 eMHC 염색의 정량은 AUF1 유전자 전달에 의한 eMHC 발현의 75% 감소를 보여준다(도 17c). 필드당 근섬유당 중심 핵 퍼센트는 정상 근섬유 성숙의 척도로서 정량했다(도 17d). AUF1 유전자 전달은 AAV8 GFP 대조군과 비교하여 중심핵의 백분율을 52% 감소시켰다. 근섬유 단면적(CSA)을 정량했다(도 17e). AUF1 유전자 전달은 성숙한 재생 근육을 나타내는 더 큰 근섬유의 CSA를 강력하게 증가시켰다. 모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군의 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트로 분석했다. 다중 군 비교는 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 수행했다. 비모수적 크러스칼-월리스 테스트에 이어, Dunn의 쌍 비교가 적절한 경우 군을 분석하는 데 사용되었다. *,P<0.05; *** P<0.001.
도 18a-18c는 AAV8 AUF1 유전자 전달이 mdx 마우스에서 내인성 유트로핀-A의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다. 1개월차에 mdx 마우스에 도 12a-12f에 기재된 바와 같이 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8 GFP를 투여했다. 비복근을 3개월차에 제거하고 FFPE로 고정하고 DAPI(핵은 청색, 유트로핀에 대한 항체(적색) 및 라미닌(녹색))로 염색했다(도 18a). 각 군에 대한 3마리 마우스의 대표적인 이미지가 제시된다. AUF1 유전자 요법은 유트로핀의 발현을 강력하게 증가시켰고 근섬유 완전성의 정상화에 대한 증거를 보여주었다(라미닌 염색). 유트로핀, AUF1 및 GAPDH(불변 대조군) 단백질에 대한 면역블롯 분석은 3개월된 3마리 AAV8 GFP 및 3마리 AAV8 AUF1-GFP mdx 마우스의 비복근에 대해 수행했다(도 18b). 비복근 유트로핀 단백질 수준은 AUF1 유전자 요법을 투여받은 동물에서 평균 20배 증가했다. AUF1 단백질 수준은 평균 3 내지 4배 증가했다. 유트로핀 mRNA 수준은 qRT-PCR에 의해 정량했고, 불변 TBP mRNA에 대해 정규화했다(도 18c). 샘플 간에 통계적으로 유의미한 차이는 없었다. 각 조건에 대해 동물 n=3마리.
도 19a-19c는 AAV8 AUF1 유전자 전달이 mdx 마우스에서 위성 세포 활성화 유전자 Pax7, 주요 근육 재생 유전자 pgc1α 및 mef2c, 지근 결정 유전자의 발현 및 미토콘드리아 DNA 함량을 증가시킨다는 것을 보여준다. 1개월차의 mdx 마우스에 도 12a-12f에 기재된 바와 같은 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조용 AAV8 GFP를 투여했다. 비복근을 3개월차에 제거하고 mRNA를 추출하고 불변 tbp mRNA에 상대적인 qRT-PCR로 정량했다. AUF1 유전자 요법은 벡터만을 투여받은 대조군에 비해 mdx 마우스의 비복근에서 pgc1α, mef2c 및 Pax7 mRNA의 발현을 증가시켰다(도 19a). 야생형 비-mdx 동물(WT)은 연령 일치 동물의 정상 근육 수준에 대한 대조군으로서 역할을 했다. AAV8 AUF1 유전자 요법은 WT 수준에 가깝게 회복하거나, 유전자 발현의 WT 수준을 초과했다. AUF1 유전자 요법은 벡터 단독을 투여받은 대조군에 비해 mdx 동물의 비복근에서 지근 계통 결정 미오신 mRNA의 발현을 증가시켰다(도 19b). AAV8 AUF1 유전자 요법은 WT 수준에 가깝게 회복시키거나 유전자 발현의 WT 수준을 초과했다. AUF1 유전자 요법은 mdx 마우스의 비복근에서 미토콘드리아 DNA의 발현을 증가시켰고, 이는 지근 근육량의 증가와 일치했다(도 19c). 모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군의 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트로 분석했다. *, P<0.05; **, P<0.01; *** P<0.001.
도 20은 게놈 전체의 전사체 및 해독체 연구가 C2C12 근모세포 근육 섬유 발달의 AUF1 활성화를 입증함을 보여준다. 증식성 C2C12 마우스 심장 근모세포를 렌티바이러스 대조군 벡터 또는 p45 AUF1을 발현하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입시키고, 이하 실시예에 기재된 바와 같이 분화 배지에서 배양함으로써 근관세포로 분화하도록 유도했다. 증식성 근모세포는 p38 MAPK 및 근발생을 촉진하는 다른 신호전달 경로에서 활성화되기 때문에 사용했으며, 이는 부상으로 인한 근육 손상 후 근육 세포의 활성화된 상태 및 집단, 또는 뒤센 근이영양증(DMD)에서 발생하는 만성 재생 시도와 같은 근원성 질환에서 근육 상태를 대표한다. 실험 접근 방식의 개요. 48시간째, 근관세포가 형성되기 시작하면, 폴리리보솜은 잘 해독되지 않은(2 및 3개 리보솜) 분획 및 잘 해독된(4개 이상의 폴리솜) 분획에 상응하는 수크로스 침강에 의해 분리되었고, 총 mRNA 및 폴리리보솜 분획 중 mRNA는 독립적으로 정제되었고(rRNA가 없는 polyA+ 분획), 박테리아 라이브러리를 생성하여 2개의 독립적인 연구에서 RNAseq를 사용하여 심층 시퀀싱을 수행했다. 게놈 전체 mRNA 풍부도는 해독된/총 mRNA의 log2 비율을 사용했다. 분석에 사용된 절차 및 생물정보학 파이프라인은 이하 실시예에 설명된다.
도 21a-21b는 AUF1 보충이 주요 근육 발달 경로의 발현을 자극하고, 염증성 사이토카인, 염증, 세포 증식, 세포 사멸 및 항-근육 재생 경로의 발현을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 20 게놈 전체 mRNA 발현 및 해독 분석의 데이터. C2C12 근모세포에서 AUF1 보충에 의한 전사, 해독 또는 둘 모두의 수준의 주요 상향조절된 경로(도 21a). KEGG에 의해 분석됨. C2C12 근모세포에서 AUF1 보충에 의한 전사, 해독 또는 둘 모두의 수준의 주요 하향조절된 경로(도 21b). KEGG에 의해 분석됨.
도 22a-22b는 C2C12 근모세포의 AUF1 보충이 근육 발달 및 재생에서 주요 생물학적 과정 및 분자 기능에 대한 경로를 상향조절함을 보여준다. 도 20 게놈 전체 mRNA 발현 및 해독 분석의 데이터. C2C12 근모세포에서 AUF1 보충에 의한 전사, 해독 또는 둘 모두의 수준의 주요 상향조절된 생물학적 과정(도 22a). KEGG에 의해 분석됨. C2C12 근모세포에서 AUF1 보충에 의해 전사, 해독 또는 둘 모두의 수준의 주요 상향조절된 분자 기능(도 22b). KEGG에 의해 분석됨.
도 23a-23b는 C2C12 근모세포의 AUF1 보충이 근육 염증, 염증성 사이토카인, 및 근육 재생에 대항하는 신호전달 경로를 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 20 게놈 전체 mRNA 발현 및 해독 분석의 데이터. C2C12 근모세포에서 AUF1 보충에 의한 전사, 해독 또는 둘 모두의 수준에서 주요 하향조절된 생물학적 과정(도 23a). KEGG에 의해 분석됨. C2C12 근모세포에서 AUF1 보충에 의한 전사, 해독 또는 둘 모두의 수준의 주요 하향조절된 분자 기능(도 23b). KEGG에 의해 분석됨.
도 24는 C2C12 근모세포의 AUF1 보충이 섬유증의 발달과 연관된 근육 유전자의 발현을 감소시킨다는 것을 보여준다. 도 20 게놈 전체 mRNA 발현 및 해독 분석의 데이터. C2C12 근모세포에서 AUF1 보충에 의한 전사, 해독 또는 둘 모두의 수준의 주요 하향조절된 경로 및 기능. KEGG에 의해 분석됨.
도 25a-25d는 마우스에서 p45 AUF1을 사용한 손상된 TA 근육의 렌티바이러스 형질도입이 위성 세포를 활성화하고 근육 위축의 바이오마커를 감소시키는 것을 보여준다. CMV 프로모터의 제어 하에 p45 AUF1에 대한 cDNA를 발현하는 렌티바이러스 벡터는 개발되었다(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-mediated Stage-specific Degradation of Fate-determining Checkpoint mRNAs", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 116:11285-90 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 3개월된 수컷 마우스에게 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 AUF1 벡터(1x108 게놈 카피)(총 부피 100μl)와 함께 멸균 식염수 중 여과된 1.2% BaCl2 50μl의 근육내 주사를 왼쪽 전방 경골(TA) 근육 내로 투여했다(도 25a). 오른쪽 TA 근육은 대조군으로서 미손상 상태로 남겨두었다. 주사 후 7일차에 마우스를 희생시켰다. TA 근육을 절제하고, 중량을 재고, 그램 단위의 마우스 체중에 대해 정규화했다. TA 손상은 TA 중량을 27% 감소시켰으며, 이는 동시 AUF1 유전자 요법에 의해 거의 미손상 수준으로 회복되었다. 도 25b에서, AUF1의 면역블롯 분석은 도 25a에서와 같이 렌티바이러스 p45 AUF1 투여 후 7일차에 TA 근육에 대한 불변 GAPDH 단백질로 정규화했다. 독립적인 동물에서 동시 p45 AUF1 유전자 요법에 의한 대표적인 미손상, 2개의 손상 및 손상된 TA 근육이 제시된다. 렌티바이러스 p45 AUF1 유전자 전달은 p45AUF1 이소형의 수준을 강력하게 증가시켰지만, 암호화되지 않은 p42AUF1 및 p40AUF1은 증가시키지 않았다(p37AUF1은 검출 불가). 도 25c에서, 도 25a에서와 같은 TA 근육은 근육 위성(줄기) 세포 활성화의 바이오마커인 Pax7 mRNA 수준에 대해 qRT-PCR에 의해 탐침되었고, 불변 TATA-박스 결합 단백질(TBP) mRNA에 대해 정규화되었다. AUF1 유전자 요법은 Pax7 발현을 3배 초과로 증가시켰다. 도 25d에서, 도 25a에서와 같은 TA 근육은 TBP mRNA에 대해 정규화된 근육 위축 바이오마커 유전자 TRIM63 및 Fbxo32의 발현에 대해 qRT-PCR에 의해 탐침되었다. TA 근육 손상은 TRIM63 및 Fbxo32 mRNA의 발현을 강력하게 유도했으며, 이는 p45AUF1 유전자 요법에 의해 미손상 TA 근육 수준으로 하향조절되었고, 이는 AUF1 근육내 투여로 인한 근육 손상의 강력한 중단을 시사한다. 통계적 차이는 없었다(ns). 모든 결과는 조건당 동물 3마리 이상의 적어도 3회의 독립적인 실험에 의한 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트에 의해 분석되었다. *, P<0.05; **, P<0.01; ***, P<0.001.
도 26a-26d는 p45 AUF1 렌티바이러스 형질도입이 TA 근육 손상 후 근육 재생 인자(MRF)의 발현을 향상시킨다는 것을 보여준다. 3개월된 수컷 마우스에게 BaCl2로 TA 근육에 손상을 입히고 대조용 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 AUF1 벡터의 근육내 주사로 투여했다(도 25a-d 참조). 주사 후 7일차에 마우스를 희생시켰다. TA 근육은 불변 TBP mRNA로 정규화된 식별된 mRNA에 대해 qRT-PCR에 의해 탐침되었다. 도 26a에서, 근모세포 활성화, 분화 및 근육 재생의 바이오마커인 미오게닌 및 MyoD mRNA 수준(Zammit, "Function of the Myogenic Regulatory Factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in Skeletal Muscle, Satellite Cells and Regenerative Myogenesis", Semin. Cell. Dev. Biol. 72:19-32(2017), 본원에 전체가 참고로 포함됨)은 손상된 대조군 벡터 표본에 비해 AUF1 유전자 요법에 의해 약 2배 증가했다. 도 25b에서, 근육 재생 동안 성인 근육에서 유일하게 발현되는 배아 미오신이며 유트로핀 공동 발현의 마커인 myh8 mRNA(Guiraud 등, "Embryonic Myosin is a Regeneration Marker to Monitor Utrophin-based Therapies for DMD", Hum. Mol. Genet. 28:307-19(2019), 본원에 전체가 참고로 포함됨)는 손상된 대조군 벡터 표본에 비해 손상 근육에서 AUF1 유전자 요법에 의해 5배 발현이 증가했다. 도 26c에서, 지근 근육을 특정하는 미오신인 myh7 mRNA(Zammit, "Function of Myogenic Regulatory Factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in Skeletal Muscle, Satellite Cells and Regenerative Myogenesis", Semin. Cell. Dev. Biol. 72:19-32(2017), 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)는 손상된 대조군 벡터 표본에 비해 손상 근육에서 AUF1 유전자 요법에 의해 발현이 약 2배 증가했다. 도 26d에서, 속근 근육을 특정하는 미오신인 myh4 mRNA(Zammit, "Function of Myogenic Regulatory Factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in Skeletal Muscle, Satellite Cells and Regenerative Myogenesis", Semin. Cell. Dev. Biol. 72:19-32(2017), 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨)는 손상된 대조군 벡터 표본에 비해 손상 근육에서 AUF1 유전자 요법에 의해 발현이 약 2배 증가했다. 모든 결과는 조건당 동물 3마리 이상에 대한 적어도 3회의 독립적인 시험에 의한 평균±SEM으로서 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트에 의해 분석되었다. *, P<0.05; **, P<0.01.
도 27a-27d는 p45 AUF1 렌티바이러스 유전자 요법이 손상된 근육의 빠른 재생을 촉진함을 보여준다. 3개월된 수컷 마우스에 BaCl2로 TA 근육을 손상시키고, 도 25a-25d에서와 같이, 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 AUF1 벡터를 근육내 주사로 투여했다. 마우스는 손상 후 3일 및 7일차에 희생시켰다. 도 27a는 렌티바이러스 AUF1 유전자 요법이 투여된 동물에서 근섬유의 가속화되었지만 정상적인 근육 재생에 대한 증거를 제공하는 근육 섬유의 사진 이미지를 보여준다. OCT의 TA 근육은 라미닌 알파 2(적색)에 대한 면역형광 현미경 분석을 위해 절편화하고 염색했으며, 핵은 DAPI(청색)로 염색한다. 특히, 렌티바이러스 AUF1 유전자 요법이 투여된 손상된 TA 근육에 비해 벡터 단독으로 처리된 손상된 TA 근육의 붕괴된 근섬유 구조 및 높은 수준의 중심 핵은 가속화된 근육 재생 및 성숙한 근섬유와 일치한다는 점을 주목한다. 스케일 바, 200 μm. 도 27b는 손상 후 3일 및 7일차에 희생 시 측정된, 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 p45 AUF1을 투여받은 손상 근육 또는 미손상 대조군과 비교하여 손상 TA 근육에서 결정된 근육 손실(위축) 또는 증가(질량 증가) 퍼센트를 보여주는 그래프이다. 모의 유전자 요법을 투여받은 손상 TA 근육은 손상 후 3일차까지 20% 질량 손실이 지속되었고, 7일차에 단지 근소하게 개선되었다. 대조적으로, AUF1 유전자 요법을 투여받은 손상 TA 근육은 3일차까지 더 적은 위축 경향을 보여주었고, 이는 7일차에 거의 완전히 회복되어 거의 정상 질량을 입증했다. 도 27c는 높은 수준의 근관 중심 핵이 미성숙 근섬유 발달의 마커임을 보여주는 그래프이다(Yin 등, "Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche", Physiol. Rev. 93:23-67(2013) and Schiaffino & Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91:1447-531(2011), 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). p45 AUF1 유전자 요법이 투여된 손상 후 7일차에 분석된 TA 근육은 벡터 단독 대조군 손상 근육과 비교하여 중심 핵이 있는 근섬유의 퍼센트가 절반으로 감소했다. 이것은 AUF1 유전자 전달에 의해 제공되는 가속화된 근육 재생과 일치하는 것이다. 도 27d는 중심 핵의 수가 적은 근섬유의 더 넓은 단면적(단면적, CSA)이 성숙한 근섬유 발달을 시사함을 보여주는 그래프이다(Yin 등, "Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche", Physiol. Rev. 93:23-67(2013) 및 Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91:1447-531(2011), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨). 손상된 TA 근육에서 AUF1 유전자 전달은 성숙한 근섬유의 생성과 일치하는, 근섬유당 감소된 중심 핵을 갖는 CSA의 현저한 증가를 생성했다. 모든 결과는 조건당 동물 3마리 이상에 대한 적어도 3회의 독립적인 실험에 의한 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트에 의해 분석했다. *, P<0.05; **, P<0.01, ***, P<0.001.
도 28a-28f는 AUF1이 손상 근육의 복구를 촉진하는 데 필수적이며 AAV8 유전자 전달에 의해 전달될 때 손상 보호 이점을 제공할 수 있음을 보여준다. 도 28a는 본원에 기재된 기술의 당사자로서 개발된 AUF1 조건부 녹아웃 마우스의 개략도이다. AUF1 유전자에서 엑손 3 LoxP 부위 삽입의 개략도가 도시된다. Lox 부위는 AUF1의 엑손 3 측면으로 클로닝되었고, 이는 모든 4개의 AUF1 이소형에서 유지되며, RNA 결합 도메인을 함유한다. AUF1Flox/Flox 마우스가 유도되었고, 형제를 생성된 동종 순도에 교미시킨 다음, Pax7cre ERT2(B6;129-Pax7 tm2.1(cre/ERT2)Fan /J 마우스)(Jackson Labs)와 교미시켰다. 이것은 PAX7+를 발현하는 근육 위성 및 근모세포에서만 타목시펜 투여에 의한 cre 재조합효소 유도를 제공한다. 도 28b는 매일 5회 타목시펜(3 mg/kg)의 i.p. 주사로 인해 cre 발현을 유도한 3개월된 마우스의 결과를 보여주는 그래프이다. cre-유도 마우스의 체중에 변화는 없었다. 도 28c는 마우스의 미손상 골격근의 중량이 미유도 및 타목시펜 유도된 cre 마우스에서와 유의미하게 상이하지 않음을 보여주는 그래프이다. 도 28d는 3개월 동안 cre의 타목시펜 유도가 골격근에서 auf1 유전자를 특이적으로 결실시키고 골격근 AUF1 단백질 발현을 폐지한다는 것을 보여준다. 대표적인 면역블롯은 cre 유도 5일 후 대조군 AUF1Flox/Flox 및 AUF1Flox/Flox x PAX7cre ERT2 마우스에서 불변 GAPDH에 대해 정규화되고 7일차에 분석된, TA 골격근 및 신장에서의 AUF1 수준을 보여준다. 근육에서 Pax7-특이적 cre 유도 후 AUF1의 발현에 대한 증거는 없는 반면, 풍부한 AUF1은 신장에 존재한다. 도 28e는 1개월된 AUF1Flox/Flox x PAX7cre ERT2 마우스에 상기와 같이 모의 주사하거나 5일 동안 타목시펜을 주사한 후, 5개월 동안 매일 500 mg/kg(Envigo)씩 경구 타목시펜을 포함하는 식이요법을 유지했음을 보여주는 그래프이다. 야생형(WT) BL6 마우스 및 AUF1Flox/Flox x PAX7creERT2 마우스는 cre-발현에 대해 유도되지 않았거나(AUF1fl/fl/Pax7로 표지됨), 5개월 동안 유도되고 AUF1 유전자가 결실되었다(ΔAUF1fl/fl/Pax7로 표지됨). 5개월 동안 cre 발현에 대해 유도된 1세트의 ΔAUF1fl/fl/Pax7 마우스에 또한 1개월차에 2.0x1011 AAV8 AUF1 입자(2x1011 게놈 카피)를 50 μl의 단일 안와후 주사로 투여했다. 그 다음, 모든 마우스는 도 25a-d에 기재된 바와 같이 TA 근육에 1.2% BaCl2 주사로 손상을 입혔다. AUF1은 골격근 세포에서 선택적으로 활성인 크레아틴 키나제 tMCK 프로모터에 의해 제어된다. TA 근육을 BaCl2 주사 후 7일차에 절제하고 근육 위축의 퍼센트는 중량으로 결정했다. AUF1을 발현하는 AUF1Flox/Flox x PAX7creERT2 마우스 및 AUF1을 발현하는 WT 마우스(cre에 대해 유도되지 않음)의 TA 근육은 통계적으로 상이하지 않은 16 내지 18% 위축을 보여주었다. 대조적으로, AUF1 유전자의 결실은 TA 근육의 위축을 강력하게 증가시켜 위축 수준을 35%로 2배화했다. 하지만, AUF1 유전자가 결실되었지만 AAV8 AUF1 유전자 요법을 예방적으로 투여받은 동물은 평균 약 3%의 급감된 TA 근육 위축 수준을 입증하였다. 도 28f는 AUF1 대조군 및 cre-유도된 골격근 AUF1 결실된 마우스가 지대형 골격근 근력 및 지구력의 척도인 악력에 대해 5개월차에 테스트되었음을 보여주는 그래프이다. AUF1이 결실된 마우스는 악력의 약 50% 감소를 보여주었다. 종합적으로, 이러한 데이터는 AUF1이 손상 후 근력 및 근육 재생의 유지에 필수적이며, AUF1 유전자 요법이 외상성 손상에도 불구하고 근육 재생을 촉진하고 광범위한 손상으로부터 근육을 보호하는 놀라운 능력을 제공한다는 것을 입증한다. 모든 결과는 조건당 동물 3마리 이상에 대한 적어도 3회의 독립적인 실험에 의한 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트로 분석했다. *, P<0.05.
본 출원의 일 측면은 근육 세포-특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터에 관한 것으로서, 여기서, 핵산 분자는 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링된다.
"벡터"라는 용어는 "발현 벡터"와 상호교환적으로 사용된다. 용어 "벡터"는 서열의 전부 또는 일부가 전사되도록 "숙주 세포"로 지칭되는 세포로 형질감염될 수 있는 바이러스성 또는 비바이러스성, 원핵 또는 진핵의 DNA 또는 RNA 서열을 지칭할 수 있다. 전사체는 반드시 발현되어야 할 필요는 없다. 또한, 벡터는 암호화 서열을 갖는 전이유전자를 반드시 포함해야 할 필요는 없다. 벡터는 상이한 바이러스, 박테리아, 또는 포유동물 유전자에서 유래되는 요소의 합성체(composite)로서 종종 조립된다. 벡터는 다양한 암호 및 비암호 서열, 예컨대, 선택 가능한 마커를 암호화하는 서열, 박테리아에서 전파를 용이하게 하는 서열, 또는 특정 세포 유형에서만 발현되는 하나 이상의 전사 단위를 함유한다. 예를 들어, 포유동물 발현 벡터는 박테리아에서 벡터의 전파를 용이하게 하는 원핵세포 서열 및 진핵세포에서만 발현되는 하나 이상의 진핵세포 전사 단위를 모두 종종 함유한다. 본 기술분야의 기술자는 발현 벡터의 설계가 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 달라질 수 있음을 알고 있을 것이다.
"프로모터"라는 용어는 "프로모터 요소" 및 "프로모터 서열"과 상호교환적으로 사용된다. 마찬가지로, "인핸서"라는 용어는 "인핸서 요소" 및 "인핸서 서열"과 상호교환적으로 사용된다. 용어 "프로모터"는 전이유전자의 암호 서열의 전사를 개시하기에 충분한 전이유전자의 최소 서열을 지칭한다. 프로모터는 구성적이거나 유도성일 수 있다. 구성적 프로모터는 거대세포바이러스 프로모터(CMV)와 비슷한 수준으로 전이유전자의 발현을 유도한다면, 강력한 프로모터인 것으로 간주된다(Boshart 등, "A Very Strong Enhancer is Located Upstream of an Immediate Early Gene of Human Cytomegalovirus", Cell 41:521(1985), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 프로모터는 합성적, 변형된 또는 혼성 프로모터일 수 있다. 프로모터는 적절한 세포내 조절 인자에 결합될 때 프로모터-의존적 전사를 향상("인핸서") 또는 억제("억제인자")하는 다른 조절 서열/요소와 커플링될 수 있다. 프로모터, 인핸서 또는 억제인자는 그러한 요소(들)가 전이유전자 전사 속도 또는 효율을 제어하거나 영향을 미칠 때 전이유전자에 "작동가능하게 연결된" 것이라고 한다. 예를 들어, 전이유전자 암호 서열의 5' 말단에 근접하게 위치한 프로모터 서열은 일반적으로 전이유전자와 작동가능하게 연결된다. 본원에 사용된 용어 "조절 요소"는 "조절 서열"과 상호교환적으로 사용되며 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 제어 요소, 또는 이러한 요소의 임의의 조합을 지칭한다.
프로모터는 이들이 제어하는 유전자에 대해 5'(상류)에 위치한다. 많은 진핵 프로모터는 인식 서열의 2가지 유형, 즉 TATA 박스 및 상류 프로모터 요소를 함유한다. 전사 개시 부위의 25-30 bp 상류에 위치한 TATA 박스는 정확한 부위에서 RNA 합성을 시작하도록 RNA 폴리머라제 II를 유도하는데 관여하는 것으로 생각된다. 대조적으로, 상류 프로모터 요소는 전사가 개시되는 속도를 결정한다. 이러한 요소는 이들의 배향에 관계없이 작동할 수 있지만, TATA 박스의 100 내지 200bp 상류 내에 위치해야 한다.
인핸서 요소는 연결된 동종 또는 이종 프로모터로부터 최대 1000배까지 전사를 자극할 수 있다. 인핸서 요소는 배향이 역전될지라도 활성을 종종 유지한다(Li 등, "High Level Desmin Expression Depends on a Muscle-Specific Enhancer", J. Bio. Chem. 266(10):6562-6570(1991), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 또한, 프로모터 요소와 달리, 인핸서는 전사 개시 부위의 하류, 예를 들어 인트론 내 또는 프로모터로부터 상당한 거리에 배치될 때 활성일 수 있다(Yutzey 등, "An Internal Regulatory Element Controls Troponin I Gene Expression", Mol. Cell. Bio. 9(4):1397-1405(1989), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
용어 "근육 세포-특이적"은 작동적으로 연결된 핵산 분자(예를 들어, AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자)의 발현을 근육 세포 또는 근육 조직에서 독점적으로 또는 우선적으로 유도하는, 프로모터 및 인핸서와 같은 조절 요소의 능력을 지칭한다.
본원에 개시된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 근육 세포 특이적 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 근육 세포 특이적 프로모터는 AUF1 단백질 또는 이의 단편의 세포 특이적 및/또는 조직 특이적 발현을 매개한다. 프로모터는 포유동물 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 인간 프로모터, 뮤린 프로모터, 돼지 프로모터, 고양이 프로모터, 개 프로모터, 양 프로모터, 비-인간 영장류 프로모터, 말 프로모터, 소 프로모터 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
일부 실시양태에서, 근육 세포 특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, C5-12 프로모터, CK6-CK9 프로모터, dMCK 프로모터, tMCK 프로모터, 평활근 22(SM22) 프로모터, myo-3 프로모터, Spc512 프로모터, 크레아틴 키나제(CK) 8 프로모터, 크레아틴 키나제(CK) 8e 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, 데스민 프로모터, Pitx3 프로모터, 골격 알파-액틴 프로모터, MHCK7 프로모터 및 Sp-301 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 근육 세포-특이적 프로모터 서열은 본 기술분야에 잘 알려져 있고 이하 표 1에 제공된다(Malerba 등, "PABPN1 Gene Therapy for Oculopharyngeal Muscular Dystrophy", Nat. Commun. 8:14848 (2017); Wang 등, "Construction and Analysis of Compact Muscle-Specific Promoters for AAV Vectors", Gene. Ther. 15:1489-1499(2008); Piekarowicz 등, "A Muscle Hybrid Promoter as a Novel Tool for Gene Therapy", Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 15:157-169 (2019); Salva 등, "Design of Tissue-Specific Regulatory Cassettes for High-Level rAAV-Mediated Expression in Skeletal and Cardiac Muscle", Mol. Ther. 15(2):320-329 (2007); Lui 등, "Synthetic Promoter for Efficient and Muscle-Specific Expression of Exogenous Genes", Plasmid 106:102441 (2019), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
Figure pct00001
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일부 실시양태에서, 근육 세포-특이적 프로모터는 근육 크레아틴-키나제("MCK") 프로모터이다. 근육 크레아틴 키나제(MCK) 유전자는 모든 횡문근에서 매우 활성적이다. 크레아틴 키나제는 수축계 및 이온수송계 내에서 ATP 재생에 중요한 역할을 한다. 이는 포스포크레아틴으로부터 포스페이트 기를 ADP로 전달하여 ATP를 형성함으로써 해당작용이나 호흡이 없을 때 근육 수축을 허용한다. 크레아틴 키나제에는 4개의 알려진 이소형이 있다: 뇌 크레아틴 키나제(CKB), 근육 크레아틴 키나제(MCK), 및 2개의 미토콘드리아 형태(CKMi). MCK는 모든 골격근 섬유 유형에서 발현되고 심근에서도 매우 활성적인 가장 풍부한 비-미토콘드리아 mRNA이다. MCK 유전자는 근모세포에서 발현되지 않지만, 근모세포가 근세포로 말기 분화에 투입될 때 전사적으로 활성이 된다. MCK 유전자 조절 영역은 횡문근 특이적 활성을 표시하며 생체내 및 시험관내에서 광범위하게 특성화되었다. MCK 유전자에서 알려진 주요 조절 영역은 마우스에서 전사 시작 부위의 5' 약 1.1kb에 위치한 근육 특이적 인핸서 및 358bp 근접 프로모터를 포함한다. MCK 발현을 조절하는 추가 서열은 전사 시작 부위의 5' 3.3kb 영역 전체에 걸쳐, 그리고 3.3kb 첫 인트론에 분포되어 있다. 인간 및 마우스 프로모터 및 인핸서 요소를 포함하는 포유동물 MCK 조절 요소는 Hauser 등, "Analysis of Muscle Creatine Kinase Regulatory Elements in Recombinant Adenoviral Vector", Mol. Therapy 2:16-25(2000)에 기재되어 있으며, 이의 전체는 본원에 참고로 포함된다. 적합한 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터로는 야생형 MCK 프로모터, dMCK 프로모터, 및 tMCK 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(Wang 등, "Construction and Analysis of Compact Muscle-Specific Promoters for AAV Vectors", Gene Ther. 15(22):1489-1499(2008), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
세포 자극에 대한 신속한 반응에 관여하는 유전자는 고도로 조절되며, 전형적으로 단백질 발현을 신속하게 종결하고 세포를 재프로그래밍하기 위해 선택적으로 빠르게 분해되는 mRNA를 암호화한다(Moore 등, "Physiological Networks and Disease Functions of RNA-binding Protein AUF1", Wiley Interdiscip. Rev. RNA 5(4):549-64 (2014), 이는 그 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이들로는 성장 인자, 염증성 사이토카인(Moore 등, "Physiological Networks and Disease Functions of RNA-binding Protein AUF1", Wiley Interdiscip Rev RNA 5(4):549-64 (2014) 및 Zhang 등, "Purification , Characterization, and cDNA Cloning of an AU-rich Element RNA-binding Protein, AUF1", Mol. Cell. Biol. 13(12):7652-65(1993), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨), 및 5 내지 30분의 매우 짧은 반감기를 갖는 조직 줄기 세포 운명 결정 mRNA(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity", Cell Rep. 16(5):1379-90(2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)를 포함한다.
수명이 짧은 mRNA는 전형적으로 빠른 붕괴를 부여하는, 반복 서열 AUUUA를 갖는, mRNA의 3' 비해독 영역("3'UTR") 중 AU-풍부 요소("ARE")를 함유한다(Moore 등, "Physiological Networks and Disease Functions of RNA-binding Protein AUF1", Wiley Interdiscip Rev. RNA 5(4):549-64(2014), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). ARE는 안정성 및 일부 경우에 mRNA의 해독을 제어하는 AU 풍부 결합 단백질(AUBP)로 알려진 조절 단백질의 결합 부위로서 역할을 한다(Moore 등, "Physiological Networks and Disease Functions of RNA-binding Protein AUF1", Wiley Interdiscip. Rev. RNA 5(4):549-64(2014); Zhang 등, "Purification, Characterization, and cDNA Cloning of an AU-rich Element RNA-binding Protein, AUF1", Mol. Cell. Biol. 13(12):7652-65(1993); 및 Halees 등, "ARED Organism: Expansion of ARED Reveals AU-rich Element Cluster Variations between Human And Mouse", Nucleic Acids Res 36(Database issue):D137-40 (2008), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1; HNRNPD)은 mRNA의 대략 5%에서 발견되는 3' 비해독 영역("3'UTR")에 위치하는 반복된 AU 풍부 요소("ARE")에 높은 친화도로 결합한다. AUF1은 전형적으로 잘 이해되어 있지는 않지만, 빠른 분해를 위해 ARE-mRNA를 표적으로 할지라도, 일부 ARE-mRNA의 해독을 반대로 안정화 및 증가시킬 수 있다(Moore 등, "Physiological Networks and Disease Functions of RNA-Binding Protein AUF1", Wiley Interdiscip.Rev.RNA 5(4):549-564(2014), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). AUF1 결핍 마우스가 근발생 프로그램의 수행 불능으로 인해 근육량의 가속화된 손실을 겪는다는 것은 이전에 보고되어 있다(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity", Cell Rep. 16(5):1379-90(2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 또한, AUF1 발현은 연령에 따라 골격근에서 심각하게 감소되며, 이는 근육의 손실 및 위축, 근육량의 손실 및 근력 감소에 유의적으로 기여하는 것으로도 밝혀졌다(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-mediated Stage-specific Degradation of Fate-determining Checkpoint mRNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116(23):11285-11290(2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 또한, AUF1은 근육 발달의 각 다음 단계로의 진입을 차단하는 주요 분화 체크포인트 mRNA의 빠른 분해를 선택적으로 표적화하여, 위성 세포 활성화 및 계통 유지(lineage commitment)로 시작하는 골격근 발달의 모든 주요 단계를 제어하는 것으로도 밝혀졌다.
AUF1에는 단일 pre-mRNA의 차별적 스플라이싱에 의해 유래되는, 분자량에 따라 식별되는 4가지 관련 단백질 이소형(p37AUF1, p40 AUF1, p42 AUF1, p45 AUF1)이 있다(Moore 등, "Physiological Networks and Disease Functions of RNA-binding protein AUF1", Wiley Interdiscip. Rev. RNA 5(4):549-564(2014); Chen & Shyu, "AU-Rich Elements: Characterization and Importance in mRNA Degradation", Trends Biochem. Sci. 20(11):465-470(1995); 및 Kim 등, "Emerging Roles of RNA and RNA-Binding Protein Network in Cancer Cells", BMB Rep. 42(3):125-130(2009), 이들의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 4개의 이소형 각각은 RNA 결합을 매개하는 2개의 중심에 위치한, 직렬로 배열된 RNA 인식 모티프("RRM")를 포함한다(DeMaria 등, "Structural Determinants in AUF 1 Required for High Affinity Binding to A+U-rich Elements", J. Biol. Chem. 272:27635-27643 (1997), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
RRM의 일반적인 조직은 α-나선으로 뒷받침되는 역평행 β-시트의 β-α-β-β-α-β RNA 결합 플랫폼이다(Zucconi & Wilson, "Modulation of Neoplastic Gene Regulatory Pathways by the RNA-binding Factor AUF1", Front. Biosci. 16:2307-2325(2013); Nagai 등, "The RNP Domain: A Sequence-specific RNA-binding Domain Involved in Processing and Transport of RNA", Trends Biochem. Sci. 20:235-240(1995), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). NMR에 의해 분해된 개별 AUF1 RRM 도메인의 구조는 이러한 전체 3차 접힘과 대체로 일치하는 것이다(Zucconi & Wilson, "Modulation of Neoplastic Gene Regulatory Pathways by the RNA-binding Factor AUF1", Front. Biosci. 16:2307-2325(2013); Nagata 등, "Structure and Interactions with RNA of the N-terminal UUAG-specific RNA-binding Domain of hnRNP D0", J. Mol. Biol. 287:221-237(1999); 및 Katahira 등, "Structure of the C-terminal RNA-binding Domain of hnRNP D0 (AUF1), its Interactions with RNA and DNA, and Change in Backbone Dynamics Upon Complex Formation with DNA," J. Mol. Biol. 311:973-988 (2001), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
AUF1의 돌연변이 및/또는 다형성은 인간 지대형 근이영양증(LGMD) 유형 1G에 연관된 것이며(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity", Cell Rep. 16(5):1379-1390(2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨), 이는 출생 후 골격근 재생 및 유지에 있어서 AUF1의 중대한 필요성을 시사한다.
주어진 폴리펩타이드 서열(예를 들어, AUF1)과 관련하여 본원에서 사용되는 경우, 용어 "단편" 또는 "부분"은 주어진 폴리펩타이드의 전체 서열보다 짧은 주어진 폴리펩타이드 서열의 연속적인 아미노산 스트레치를 지칭한다. 폴리펩타이드의 단편은 이의 처음 위치와 최종 위치로 정의될 수 있으며, 여기서 처음 위치 및 최종 위치는 각각 주어진 전체 길이의 폴리펩타이드의 서열 내의 위치에 상응한다. 처음 위치에 상응하는 서열 위치는 최종 위치에 상응하는 서열 위치에 대해 N-말단에 위치한다. 단편 또는 부분의 서열은 처음 위치에 상응하는 서열 위치에서 시작하여 최종 위치에 상응하는 서열 위치에서 끝나는 주어진 폴리펩타이드 중의 연속적인 아미노산 서열 또는 아미노산 스트레치이다. 기능적 또는 활성 단편은, 예를 들어, 천연 서열 또는 다른 기준 서열의 기능적 특성을 보유하는 단편이다. 전형적으로, 활성 단편은 야생형 단백질과 실질적으로 동일한 활성을 보유하는 단편이다. 단편은, 예를 들어, 수용체 또는 리간드 결합에 중요한 도메인과 같은 기능적으로 중요한 도메인을 함유할 수 있다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 AUF1의 기능적 단편은 적어도 하나의 RNA 인식 도메인("RRM") 도메인을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 AUF1의 기능적 단편은 2개의 RRM 도메인을 포함한다.
본원에 기재된 AUF1 또는 이의 기능적 단편은 포유동물 AUF1로부터 유래될 수 있다. 일 실시양태에서, AUF1 또는 이의 기능적 단편은 인간 AUF1 또는 이의 기능적 단편이다. 또 다른 실시양태에서, AUF1 또는 이의 기능적 단편은 뮤린 AUF1 또는 이의 기능적 단편이다. 본원에 기재된 실시양태에 따른 AUF1 단백질은 AUF1 이소형 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1, 및 p45AUF1 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 각각의 인간 및 마우스 이소형의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열에 상응하는 GenBank 수탁 번호는 이하 표 2에서 발견되며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다.
Figure pct00004
표 2에 지칭된 서열은 하기에 재현된다.
GenBank 수탁 번호 NM_001003810.1의 인간 p37AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 9)은 다음과 같다:
Figure pct00005
GenBank 수탁 번호 NP_001003810.1의 인간 p37AUF1 아미노산 서열(서열번호 10)은 다음과 같다:
Figure pct00006
GenBank 수탁 번호 NM_002138.3의 인간 p40AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 13)은 다음과 같다:
Figure pct00007
Figure pct00008
GenBank 수탁 번호 NP_002129.2의 인간 p40AUF1 아미노산 서열(서열번호 14)은 다음과 같다:
Figure pct00009
GenBank 수탁 번호 NM_031369.2의 인간 p42AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 17)은 다음과 같다:
Figure pct00010
GenBank 수탁 번호 NP_112737.1의 인간 p42AUF1 아미노산 서열(서열번호 18)은 다음과 같다:
Figure pct00011
GenBank 수탁 번호 NM_031370.2의 인간 p45AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 21)은 다음과 같다:
Figure pct00012
Figure pct00013
GenBank 수탁 번호 NP_112738.1의 인간 p45AUF1 아미노산 서열(서열번호 22)은 다음과 같다:
Figure pct00014
GenBank 수탁 번호 NM_001077267.2의 마우스 p37AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 11)은 다음과 같다:
Figure pct00015
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
GenBank 수탁 번호 NP_001070735.1의 마우스 p37AUF1 아미노산 서열(서열번호 12)은 다음과 같다:
Figure pct00019
GenBank 수탁 번호 NM_007516.3의 마우스 p40AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 15)은 다음과 같다:
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
GenBank 수탁 번호 NP_031542.2의 마우스 p40AUF1 아미노산 서열(서열번호 16)은 다음과 같다:
Figure pct00024
GenBank 수탁 번호 NM_001077266.2의 마우스 p42AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 19)은 다음과 같다:
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
GenBank 수탁 번호 NP_001070734.1의 마우스 p42AUF1 아미노산 서열(서열번호 20)은 다음과 같다:
Figure pct00029
GenBank 수탁 번호 NM_001077265.2의 마우스 p45AUF1 뉴클레오타이드 서열(서열번호 23)은 다음과 같다:
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
GenBank 수탁 번호 NP_001070733.1의 마우스 p45AUF1 아미노산 서열(서열번호 24)은 다음과 같다:
Figure pct00034
본원에 기재된 서열은, 예를 들어, 암호 서열 또는 단백질 서열을 추가 서열 요소 또는 부분(예를 들어, 리더 서열, 태그, 미성숙 부분, 조절 영역 등)의 유무 하에 포함하는 수탁 번호와 관련하여 기재될 수 있음을 유의한다. 따라서, 이러한 서열 수탁 번호 또는 상응하는 서열 식별 번호에 대한 언급은 본원에 충분히 기재된 서열 또는 이의 부분(예를 들어, 본원에 기재된 기술에 대한 관심 단백질 또는 폴리펩타이드를 암호화하는 부분(예를 들어, AUF1 또는 이의 기능적 단편); 더 긴 아미노산 서열 내에 기재된 성숙한 단백질 서열; 본원에 기재된 더 긴 서열 내에 개시된 관심 있는 조절 영역(예를 들어, 프로모터 서열 또는 조절 요소); 등)을 지칭한다. 유사하게, 본원에 기재된 수탁 번호 및 상응하는 서열 식별 번호의 변이체 및 이소형이 또한 고려된다.
따라서, 특정 실시양태에서, 본원에 지칭된 AUF1 단백질은 표 2에 제시된 아미노산 서열 및 본원에 개시된 서열을 갖거나, 또는 이의 기능적 단편이다. 일 실시양태에서, 본원에 지칭된 기능적 단편은 본원에 개시된 아미노산 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 AAV 벡터는 표 2에 제시된(또는 본원에 기재된) 뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 핵산 분자, 또는 상기 기재된 바와 같은 AUF1 단백질의 기능적 단편을 암호화하는 그의 부분을 포함한다.
하기에 더 상세히 기재된 바와 같이, 본 출원에 따른 조성물은 생체외 및 생체내 기술 모두를 포함하는 유전자 요법에 유용할 수 있다. 따라서, 숙주 세포는 핵산 분자(또는 폴리뉴클레오타이드)를 사용하여 생체외에서 유전적으로 조작될 수 있으며, 조작된 세포는 그 다음 치료될 환자에게 제공된다. 본원에 기재된 조성물의 활성제의 생체내 전달은 관심 분자(예를 들어, AUF1 단백질 또는 이의 기능적 단편)를 치료되는 세포 또는 조직 내로 효과적으로 도입시키는 과정을 수반할 수 있다. 폴리펩타이드 기반의 활성제인 경우, 이는 직접적으로 수행할 수 있거나, 또는 대안적으로 활성 폴리펩타이드 암호 서열이 발현되고 폴리펩타이드가 세포 기구에 의해 생성되도록 전사적으로 활성인 DNA를 살아있는 세포로 형질감염시킴으로써 수행될 수 있다. 전사적으로 활성인 DNA는 전기천공, 미세주입, 인산칼슘 공침전, DEAE 덱스트란 촉진 형질감염, 양이온성 리포솜 및 레트로바이러스를 포함하나, 이에 제한되지 않는 형질감염 방법을 사용하여 치료되는 세포 또는 조직, 예를 들어 근육 내로 전달될 수 있다. 특정 실시양태에서, 형질감염될 DNA는 벡터 내로 클로닝된다.
대안적으로, 세포는 본 기술분야에 공지된 기술을 사용하여 폴리뉴클레오타이드를 투여함으로써 생체내에서 조작될 수 있다. 예를 들어, "네이키드(naked)" 폴리뉴클레오타이드(Felgner 등, "Gene Therapeutics", Nature 349:351-352(1991); 미국 특허 제5,679,647호; Wolff 등, "The Mechanism of Naked DNA Uptake and Expression," Adv. Genet. 54:3-20(2005), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨) 또는 세포에 의한 폴리뉴클레오타이드의 흡수를 촉진하는 하나 이상의 다른 표적화 요소와 함께 조성물에 제형화된 폴리뉴클레오타이드의 직접 주사에 의해.
본원에 기재된 벡터와 함께 사용될 수 있는 숙주 세포는 근세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 용어 "근세포"는 적절한 조건 하에 근육-특이적 표현형을 발현할 수 있도록 전구 근모세포로부터 분화된 세포를 지칭한다. 최종 분화된 근세포는 서로 융합하여 근섬유의 주요 구성요소인 근관세포를 형성한다. "근세포"라는 용어는 또한 역분화된 근세포를 지칭하기도 한다. 이 용어는 생체내 세포 및 이러한 세포가 원발성 또는 계대성인지 여부에 관계없이 생체외에서 배양된 세포를 포함한다. 근세포는 모든 근육 유형, 예를 들어 골격근, 심장 근육, 평활근 등에서 발견된다. 근세포는 인간, 오랑우탄, 원숭이, 침팬지, 개, 고양이, 래트, 토끼, 마우스, 말, 소, 돼지, 코끼리 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 임의의 척추동물 종으로부터 발견되고 단리될 수 있다. 대안적으로, 숙주 세포는 원핵 세포, 예를 들어, 벡터를 전파시키기 위해 사용되는, E. 콜라이(E. coli)와 같은 박테리아 세포일 수 있다.
특정 상황에서는 완전히 분화된 근모세포보다 중간엽 전구 세포 또는 근모세포와 같은 근세포 전구 세포를 활용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 세포가 단리될 수 있는 조직의 예로는 태반, 탯줄, 골수, 피부, 근육, 골막 또는 연골막을 포함한다. 근세포는 이러한 세포로부터, 예를 들어, 조직 배양 중에 이들의 분화를 유도함으로써 유래될 수 있다. 본 출원은 근세포 전구체/전구 세포, 뿐만 아니라, 지방세포 및 섬유아세포와 같은 근세포로 트랜스-분화될 수 있는 세포도 포괄한다.
또한, 본원에 기재된 핵산 분자를 포함하는 발현 시스템이 포함된다. 일반적으로, 재조합 발현 시스템의 사용은 원하는 펩타이드의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 분자를 이 분자가 이종성(즉, 천연에 존재하지 않거나 정상적으로 존재하지 않음)인 발현 시스템에 삽입하는 것을 수반한다. 본원에 기재된 펩타이드(예를 들어, AUF1)를 암호화하는 하나 이상의 원하는 핵산 분자는 벡터 내로 삽입될 수 있다. 다중 핵산 분자가 삽입되는 경우, 다중 핵산 분자는 동일하거나 상이한 펩타이드를 암호화할 수 있다. 이종 핵산 분자는 프로모터 및 임의의 다른 5' 조절 분자에 대해 적절한 센스(5'→3') 배향, 및 정확한 판독 프레임으로 발현 시스템 또는 벡터에 삽입된다.
핵산 작제물의 제조는 전체가 본원에 참고로 포함되는 Joseph Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Harbor 2012)에 기재된 바와 같이 본 기술분야에 잘 알려진 표준 클로닝 절차를 사용하여 수행될 수 있다. Cohen 및 Boyer의 미국 특허 제4,237,224호(전체가 본원에 참고로 포함됨)는 제한 효소 절단 및 DNA 리가제에 의한 결찰을 사용하는 재조합 플라스미드 형태의 발현 시스템의 생산을 기재하고 있다. 그 다음 이러한 재조합 플라스미드는 형질전환을 통해 도입되고 적합한 숙주 세포에서 복제된다.
근육 세포 특이적 프로모터(예를 들어, 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터)에 작동적으로 커플링되고 AUF1 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자는 추가 요소, 예를 들어, 제한 없이, 리더 서열, 숙주 또는 특정 매질에서 전사를 허용하는 적합한 3' 조절 영역, 및/또는 리포터 또는 마커 유전자와 같은 임의의 추가의 원하는 성분을 포함할 수 있다. 이러한 추가 요소는 전체가 본원에 참고로 포함되는, Joseph Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (Cold Springs Harbor 2012); Frederick M. Ausubel, SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Wiley 2002); 및 Cohen 및 Boyer의 미국 특허 제4,237,224호에 기재된 것과 같은, 본 기술분야의 표준 클로닝 절차를 사용하여 선택 벡터에 클로닝될 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스 벡터는 리포터 단백질을 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 리포터 단백질은, 예를 들어, β-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 루시퍼라제 및 형광 단백질로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 리포터 단백질은 형광 단백질이다. 적합한 형광 단백질로는 녹색 형광 단백질(예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreenl), 황색 형광 단백질(예를 들어, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow), 청색 형광 단백질(예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색 형광 단백질(예를 들어, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyanl, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질(mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-Monomer, HcRed-Tandem, HcRedl, AsRed2, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 오렌지색 형광 단백질(mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 제한없이 포함한다. 특정 실시양태에서, 리포터 단백질은 녹색 형광 단백질(GFP), 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP), 및 황색 형광 단백질(YFP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 형광 단백질이다.
일부 실시양태에서, 리포터 단백질은 루시퍼라제이다. 본원에 사용된 용어 "루시퍼라제"는 광 생성을 초래하는 반응을 촉매하는 효소 부류의 구성원을 지칭한다. 루시퍼라제는 무엇보다도 반딧불이, 방아벌레, 바다 팬지(레닐라), 해양 요각류 및 박테리아를 비롯한, 다양한 유기체에서 식별되고 클로닝되었다. 리포터 단백질로 사용될 수 있는 루시퍼라제의 예로는, 예를 들어, 레닐라(예를 들어, 레닐라 레니포미스(Renilla reniformis) 루시퍼라제, 가우시아(예를 들어, 가우시아 프린셉스(Gaussia Princeps) 루시퍼라제), 메트리디아 루시퍼라제(Metridia luciferase), 반딧불이(예를 들어, 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis) 루시퍼라제), 방아벌레(예를 들어, Pyrearinus termitilluminans) 루시퍼라제, 심해 새우(예를 들어, Oplophorus gracilirostris) 루시퍼라제)를 포함한다. 루시퍼라제 리포터 단백질은 자연 발생 단백질 및 증가된 광안정성, 증가된 pH 안정성, 증가된 형광 또는 광 출력, 감소된 이량체화, 올리고머화, 응집체화 또는 세포에 독성인 경향, 변경된 방출 스펙트럼, 및/또는 변경된 기질 활용성과 같이, 자연 발생의 단백질에 비해 하나 이상의 변경된 성질을 갖도록 설계된 조작된 변이체를 모두 포함한다.
퓨린-풍부 요소 결합 단백질 β(Purβ)는 성장 활성화된 혈관 평활근 세포에서 평활근 α-액틴(SMA) 유전자 발현의 전사 억제인자이다. 일부 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스 벡터는 퓨린-풍부 요소 결합 단백질 β(Purβ) 저해제를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
siRNA는 길이가 대략 20 내지 25개 뉴클레오타이드이고 양쪽 말단에 짧은 2 내지 3개의 뉴클레오타이드 3' 돌출부(overhang)가 있는 이중 가닥 합성 RNA 분자이다. 이중 가닥 siRNA 분자는 표적 mRNA 분자의 일부, 이 경우에는 Purβ mRNA의 일부의 센스 및 안티센스 가닥을 나타낸다. Purβ mRNA의 서열은 본 기술분야에 용이하게 알려져 있고 siRNA 및 shRNA 올리고뉴클레오타이드를 설계할 목적으로 본 기술분야의 기술자에게 입수용이하다.
siRNA 분자는 전형적으로 시작 코돈으로부터 대략 50 내지 100개의 뉴클레오타이드 하류에 있는 mRNA 표적 영역을 표적화하도록 설계된다. 표적 mRNA 서열에 기초하여 적합한 siRNA 서열을 설계하기 위한 방법 및 온라인 도구는 본 기술분야에서 용이하게 입수가능하다(예를 들어, Reynolds 등, "Rational siRNA Design for RNA Interference", Nat. Biotech. 2:326-330(2004); Chalk 등, "Improved and Automated Prediction of Effective siRNA", Biochem. Biophys. Res. Comm. 319(1):264-274(2004); Zhang 등, "Weak Base Pairing in Both Seed and 3' Regions Reduces RNAi Off-targets and Enhances si/shRNA Designs", Nucleic Acids Res. 42(19):12169-76(2014), 이들의 전문은 본원에 참고로 포함됨). 세포에 도입되면, siRNA 복합체는 내인성 RNA 간섭(RNAi) 경로를 유발하여 표적 mRNA 분자의 절단 및 분해를 초래한다.
짧거나 작은 헤어핀 RNA("shRNA") 분자는 기능 면에서 siRNA 분자와 유사하지만, 단단한 헤어핀 턴을 만드는 더 긴 RNA 서열을 포함한다. shRNA는 세포 기구에 의해 siRNA로 절단되고 유전자 발현은 세포 RNA 간섭 경로를 통해 침묵한다. 표적 mRNA 서열(예를 들어, Purβ mRNA 서열)에 기초하여 적합한 shRNA 서열을 설계하기 위한 방법 및 도구는 본 기술분야에서 용이하게 이용가능하다(예를 들어, Taxman 등, "Criteria for Effective Design, Constructions, and Gene Knockdown shRNA Vectors", BMC Biotech. 6:7(2006) 및 Taxman 등, "Short Hairpin RNA(shRNA): Design, Delivery, and Assessment of Gene Knockdown", Meth. Mol. Biol. 629: 139-156(2010), 그 전체가 본원에 참고로 포함됨).
Purβ를 저해하기 위한 목적으로 본원에 개시된 재조합 작제물에 의해 암호화될 수 있는 다른 적합한 작용제로는 마이크로RNA("miRNA")를 포함한다. miRNA는 주로 3' 비해독 영역(UTR)에 결합하여 표적 mRNA의 발현을 제어하는 작은 조절성 비암호화 RNA 분자이다. 단일 UTR은 많은 miRNA에 대한 결합 부위 또는 단일 miRNA에 대한 다중 부위를 가질 수 있으며, 이는 이러한 조절 RNA에 의해 발휘되는 유전자 발현의 복잡한 전사 후 제어를 시사한다(Shulka 등, "MicroRNAs: Processing, Maturation, Target Recognition and Regulatory Functions", Mol. Cell. Pharmacol. 3(3):83-92(2011), 이의 전체는 본원에 참고로 포함됨). 성숙한 miRNA는 초기에 pri-miRNA로 알려진 1차 전사체로 발현되며, 이는 세포 핵에서 마이크로프로세서 복합체에 의해 pre-miRNA라고 불리는 70개 뉴클레오타이드 줄기-루프 구조로 프로세싱된다. pre-miRNA의 dsRNA 부분은 Dicer에 의해 결합 및 절단되어 RISC 복합체로 통합될 수 있는 성숙한 22bp 이중 가닥 miRNA 분자를 생성하며; 이에 따라, miRNA 및 siRNA는 초기 프로세싱의 하류에 있는 동일한 세포 기구를 공유한다.
Purβ 분자의 발현을 저해하는 것으로 알려진 마이크로RNA는 본 기술분야에 공지되어 있고 본원에 기재된 재조합 유전자 작제물 내로 혼입되기에 적합하다. 예를 들어, miR-22, miR-208b 및 miR-499는 Purβ의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다(예를 들어, Gurha 등, "Targeted Deletion of MicroRNA-22 Promotes Stress-Induced Cardiac Dilation and Contractile Dysfunction", Circulation 125(22):2751-2761(2012) 및 Simionescu-Bankston & Kumar, "Noncoding RNAs in the Regulation of Skeletal Muscle Biology in Health and Disease", J. Mol. Med. 94(8):853-866(2017), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
유전자 발현의 많은 수준(예를 들어, DNA 전사 및 메신저 RNA("mRNA") 해독)을 제어하는 다양한 유전자 신호 및 프로세싱 이벤트는 단백질 생산을 최대화하기 위해 핵산 작제물에 혼입될 수 있다. 원하는 단백질을 암호화하는 클로닝된 핵산 서열을 발현시키기 위한 목적에는 높은 전사 수준을 얻기 위해 강력한 프로모터를 사용하는 것이 유리하다.
단백질 생산을 최대화하기 위해 핵산 작제물에는 진핵 세포에서 효율적인 유전자 전사 및 해독에 필요한 다른 특정 개시 신호가 포함될 수 있다. 활용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라, 구성적, 유도성 및 억제성 프로모터 뿐만 아니라 최소 5' 프로모터 요소, 인핸서 또는 리더 서열을 포함하는 임의의 수의 적합한 전사 및/또는 해독 요소가 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, Purβ 저해제는 폴리펩타이드이다. 보다 구체적인 실시양태에서, Purβ 저해제는 항체이다. 본원에 사용된, 용어 "항체"는 천연 공급원 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 온전한 면역글로불린, 뿐만 아니라 온전한 면역글로불린의 면역반응성 부분(즉, 항원 결합 부분)을 포함하는 것을 의미한다. 항체는, 예를 들어, 다클론 항체, 단클론 항체, 세포내 항체, 항체 단편(예를 들어, Fv, Fab 및 F(ab)2), 단일 사슬 항체(scFv), 단일 도메인 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체를 비롯한 다양한 형태로 존재할 수 있다(Ed Harlow 및 David Lane, USING ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); Houston 등, "Protein Engineering of Antibody Binding Sites: Recovery of Specific Activity in an Anti- Digoxin Single-Chain Fv Analogue Produced in Escherichia coli", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988); Bird et al, "Single-Chain Antigen-Binding Proteins", Science 242:423-426(1988), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
아데노-연관 바이러스 벡터 및 재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 전체가 본원에 참고로 포함되는 Shi 등, "Therapeutic Expression of an Anti-Death Receptor-5 Single-Chain Fixed Variable Region Prevents Tumor Growth in Mice," Cancer Res. 66:11946-53 (2006); Fukuchi 등, "Anti-Aβ Single-Chain Antibody Delivery via Adeno-Associated Virus for Treatment of Alzheimer's Disease," Neurobiol. Dis. 23:502-511 (2006); Chatterjee 등, "Dual-Target Inhibition of HIV-1 In Vitro by Means of an Adeno-Associated Virus Antisense Vector," Science 258:1485-1488 (1992); Ponnazhagan 등, "Suppression of Human Alpha-globin Gene Expression Mediated by the Recombinant Adeno-associated Virus 2-based Antisense Vectors," J. Exp. Med. 179:733-738 (1994)에 기재된 바와 같이, 핵산 분자를 세포로 전달하도록 작제되어 사용될 수 있는 잘 알려진 전달 비히클이다. 이러한 비히클의 생체내 사용은 본원에 전체가 참고로 포함되는 Flotte 등, "Stable In Vivo Expression of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator With an Adeno-Associated Virus Vector," Proc. Nat'l. Acad. Sci. 90:10613-10617 (1993)에 기재되어 있다.
재조합 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 골격근에서 매우 장기간(수년) 지속되는 유전자를 안정적으로 형질도입하고 발현하고, 이를 AAV 벡터 혈청형 및 이의 변형에 따라, 국소 근육내 주사를 사용하든, 전신 전달 경로를 사용하든 간에 높은 근육 향성 및 선택성으로 수행하도록 하는 능력을 제공한다(Phillips 등, "Systemic Gene Transfer to Skeletal Muscle Using Reengineered AAV Vectors", Methods Mol. Biol. 709:141-51 (2011) 및 Muraine 등, "Transduction Efficiency of Adeno-Associated Virus Serotypes After Local Injection in Mouse and Human Skeletal Muscle", Hum. Gene Ther. 31(3-4):233-240 (2020), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 더욱이, 특정 AAV 혈청형 및 조작된 변이체, 특히 AAV8 및 이의 조작된 변이체의 경우, 마우스에서의 연구는 골격근 전달 및 발현에 대한 임상 시험에서 발견된 것처럼, 인간 골격근 형질도입 및 유전자 발현에 예측적인 것으로 밝혀졌다(Phillips 등, "Systemic Gene Transfer to Skeletal Muscle Using Reengineered AAV Vectors," Methods Mol. Biol. 709:141-51 (2011) 및 Muraine 등, "Transduction Efficiency of Adeno-Associated Virus Serotypes After Local Injection in Mouse and Human Skeletal Muscle," Hum. Gene Ther. 31(3-4):233-240 (2020), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨).
본원에 기재된 AAV 벡터는 혈청형 1(AAV1), 2(AAV2), 3(AAV3), 4(AAV4), 5(AAV5), 6(AAV6), 7(AAV7), 8(AAV8), 9(AAV9), 10(AAV10), 11(AAV11) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 재조합 벡터이다.
하나의 특정 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV8이다. 짧은 꼬리 원숭이에서 유래된 AAV8은 면역원성이 매우 낮아, 암호화된 전이유전자의 장기간 발현(수년 동안)을 초래하고, 인간 및 마우스 모두에서 높은 향성 및 선택성으로 골격근을 효율적으로 형질도입시킨다(Phillips 등, "Systemic Gene Transfer to Skeletal Muscle Using Reengineered AAV Vectors," Methods Mol. Biol. 709:141-51 (2011); Muraine 등, "Transduction Efficiency of Adeno-Associated Virus Serotypes After Local Injection in Mouse and Human Skeletal Muscle," Hum. Gene Ther. 31(3-4):233-240 (2020); Blankinship 등, "Efficient Transduction of Skeletal Muscle Using Vectors Based on Adeno-associated Virus Serotype 6," Mol. Ther. 10(4):671-8 (2004); 및 Gregorevic 등, "Viral Vectors for Gene Transfer to Striated Muscle," Curr. Opin. Mol. Ther. 6(5):491-8 (2004), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨). AAV8은 본질적으로 간 향성을 보이지 않으며, 골격 섬유 및 위성 세포에 대해 주로 특이적이며, 신체 전체에 걸쳐 골격근을 형질도입하는 것으로 나타났다(Wang 등, "Construction and Analysis of Compact Muscle-specific Promoters for AAV Vector", Gene Ther. 15(22):1489-99(2008), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일 실시양태에 따르면, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 서열번호 25의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 AAV8 벡터이다.
AAV8 AUF1 작제물 서열(서열번호 25)
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
본 출원의 또 다른 측면은 본원에 기재된 바와 같은 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 조성물은 완충 용액을 추가로 포함한다.
본 출원의 조성물은 하나 이상의 표적화 요소를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 표적화 요소는 제한 없이 사포닌 또는 양이온성 폴리아미드(예를 들어, 전체가 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,739,118호 및 제5,837,533호 참조); 마이크로입자, 마이크로캡슐, 리포솜, 또는 다른 소포; 지질; 세포 표면 수용체; 형질감염제; 펩타이드(예를 들어, 핵에 들어가는 것으로 알려진 것); 또는 리간드(예컨대, 수용체 매개 세포내이입되는 것)와 같은 작용제를 포함한다. 이러한 표적화 요소를 사용하기에 적절한 수단은 다음을 제한 없이 포함한다: 마이크로입자 충격; 지질, 세포 표면 수용체 또는 형질감염제에 의한 폴리뉴클레오타이드의 코팅; 리포솜, 마이크로입자 또는 마이크로캡슐에 폴리뉴클레오타이드의 캡슐화; 핵에 들어가는 것으로 알려진 펩타이드에 연결된 폴리뉴클레오타이드의 투여; 또는 수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하는데 사용될 수 있는 수용체 매개 세포내이입되는 리간드에 연결된 폴리뉴클레오타이드의 투여(예를 들어, Wu 등, "Receptor-Mediated in vitro Gene Transformation by a Soluble DNA Carrier System", J. Biol. Chem. 262:4429-4432(1987) 참조, 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드-리간드 복합체는 특이적 수용체를 표적화함으로써 생체내에서 세포 특이적 흡수 및 발현에 대해 폴리뉴클레오타이드가 표적화되도록 형성될 수 있다(예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO 92/06180, WO 92/22635, WO 92/203167, WO 93/14188, 및 WO 93/20221 참조, 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
따라서, 일부 실시양태에서, 조성물은 형질감염 시약을 추가로 포함한다. 형질감염 시약은 양하전된 형질감염 시약일 수 있다. 적합한 형질감염 시약은 본 기술분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Lipofectamine® RNAiMAX(Invitrogen™), Lipofectamine® 2000(Invitrogen™), Lipofectamine® 3000(Invitrogen™), Invivofectamine™ 3.0(Invitrogen™), Lipofectamine™ MessengerMAX™(Invitrogen™), Lipofectin™(Invitrogen™), siLentFet™(Bio-Rad), DharmaFECT™(Dharmacon), HiPerFect(Qiagen), TransIT-X2®(Mirus), jetMESSENGER®(Polyplus), Trans-Hi™, JetPEI®(Polyplus), 및 ViaFect™(Promega)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 수성 조성물이다. 본 출원의 수성 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 수성 매질에 용해되거나 분산된 유효량의 벡터를 포함한다.
본 출원의 추가 측면은 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
"약제학적으로 허용되는 담체"라는 용어는 이것이 투여되는 환자에 알레르기 반응 또는 다른 바람직하지 않은 영향을 일으키지 않고 제형 내 다른 성분과 상용성인 담체를 지칭한다. 약제학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어, 약제학적 희석제, 부형제, 또는 의도된 투여 형태와 관련하여 적절하게 선택되고 통상적인 약제학적 관행에 일치하는 담체를 포함한다. 예를 들어, 고체 담체/희석제로는 검, 전분(예를 들어, 옥수수 전분, 사전호화 전분), 당(예를 들어, 락토스, 만니톨, 수크로스, 덱스트로스), 셀룰로오스 물질(예를 들어, 미세결정질 셀룰로오스), 아크릴레이트(예를 들어, 폴리메틸아크릴레이트), 탄산칼슘, 산화마그네슘, 활석, 또는 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 약제학적으로 허용되는 담체는 본원에 기재된 핵산 분자의 저장 수명 또는 유효성을 향상시키는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충제와 같은 보조 물질의 소량을 추가로 포함할 수 있다.
본원에 개시된 벡터(들)(즉, 본원에 개시된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및/또는 렌티바이러스 벡터) 및/또는 약제학적 조성물(들)은 임의의 이용가능한 통상적인 방법에 따라 제형화될 수 있다. 바람직한 투여 형태의 예로는 정제, 산제, 미립제, 과립제, 코팅정, 캡슐제, 시럽제, 트로키제, 흡입제, 좌제, 주사제, 연고제, 안연고제, 안점적액, 점비액, 귀약, 습포제, 로션 등을 포함한다. 제형에는 일반적으로 사용되는 첨가제, 예컨대, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 착색제, 향미제, 및 필요하다면, 안정제, 유화제, 흡수 향상제, 계면활성제, pH 조정제, 방부제, 산화방지제 등이 사용될 수 있다.
또한, 약제학적 조성물의 제형화는 약제학적 제형의 원료로 일반적으로 사용되는 조성물을 통상적인 방법에 따라 조합하여 수행할 수 있다. 이러한 조성물의 예로는 예를 들어, (1) 대두 오일, 우지 및 합성 글리세라이드와 같은 오일; (2) 유동 파라핀, 스쿠알렌 및 고체 파라핀과 같은 탄화수소; (3) 옥틸도데실 미리스트산 및 이소프로필 미리스트산과 같은 에스테르 오일; (4) 세토스테아릴 알코올 및 베헤닐 알코올과 같은 고급 알코올; (5) 실리콘 수지; (6) 실리콘 오일; (7) 폴리옥시에틸렌 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 글리세린 지방산 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 고체 폴리옥시에틸렌 피마자유 및 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체와 같은 계면활성제; (8) 하이드록시에틸셀룰로오스, 폴리아크릴산, 카르복시비닐 중합체, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐피롤리돈, 및 메틸셀룰로오스와 같은 수용성 거대분자; (9) 에탄올 및 이소프로판올과 같은 저급 알코올; (10) 글리세린, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜 및 소르비톨과 같은 다가 알코올; (11) 글루코스 및 사탕수수와 같은 당; (12) 무수 규산, 알루미늄 마그네슘 실리케이트, 및 알루미늄 실리케이트와 같은 무기 분말; (13) 정제수 등을 포함한다.
상기 제형에 사용하기 위한 첨가제로는, 예를 들어, (1) 희석제로서 락토스, 옥수수 전분, 수크로스, 글루코스, 만니톨, 소르비톨, 결정질 셀룰로오스 및 이산화규소; (2) 결합제로서 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 아라비아검, 트라가칸트, 젤라틴, 쉘락, 하이드록시프로필 셀룰로오스, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 폴리프로필렌 글리콜-폴리옥시에틸렌-블록 공중합체, 메글루민, 시트르산 칼슘, 덱스트린, 펙틴 등; (3) 붕해제로서 전분, 한천, 젤라틴 분말, 결정질 셀룰로오스, 탄산칼슘, 중탄산나트륨, 시트르산칼슘, 덱스트린, 펙틱, 카르복시메틸셀룰로오스/칼슘 등; (4) 윤활제로서 스테아르산마그네슘, 활석, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 축합식물유 등; (5) 첨가가 약제학적으로 허용되는, 착색제로서 적당한 임의의 착색제; (6) 향료로서 코코아 가루, 멘톨, 방향제, 페퍼민트 오일, 계피 가루; (7) 아스코르브산 또는 알파-토페놀과 같이, 첨가가 약제학적으로 허용되는 산화방지제를 포함할 수 있다.
수성 용액 중 비경구 투여용의 경우, 예를 들어, 용액은 일반적으로 적절하게 완충되고 액체 희석제는 먼저 예를 들어 충분한 염수 또는 글루코스에 의해 등장성이 된다. 이러한 수성 용액은, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 사용될 수 있다. 바람직하게는, 멸균 수성 매질은 특히 본 출원에 비추어, 본 기술분야의 기술자에게 공지된 것으로서 사용된다. 예시적으로, 단일 용량은 등장성 NaCl 용액 1ml에 용해되고 피하주사액 1000ml에 첨가되거나, 제안된 주입 부위에 주사될 수 있다(예를 들어, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15판, 1035-1038 및 1570-1580 페이지 참조, 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 투여량의 약간의 변경은 치료 대상체의 상태에 따라 필연적으로 일어날 것이다. 투여 책임자는 어떤 경우든지, 개별 대상체에 적절한 용량을 결정할 것이다. 또한, 인간 투여용의 경우, 제제는 FDA 생물학 표준 사무실에서 요구하는 멸균, 발열성, 일반 안전성 및 순도 표준을 충족해야 한다.
연령-관련 근육 손실 및 근육감소증 근육 위축
본원에 기재된 바와 같이, 노화 및 앉아만 있는 생활 방식은 노화에 따른 매우 심각한 근육 손실 및 위축(근육감소증)을 포함하는, 노화로 인해 대체로 비가역적이 되는 유의미한 근육 손실을 촉진한다. 근육감소증 및 연령-관련 근육 손실은 노령 인구에서 이환율 및 사망률의 유의미한 근원이다. 근육 유지 및 기능을 개선시키는 효과적인 전략으로는 신체 운동만이 고려되지만, 이는 질병이 발병하기 훨씬 전에 시작해야 한다. 효과적인 치료 옵션은 거의 없다.
본 출원의 실시예는 AUF1 유전자의 골격근 발현이 마우스에서 연령에 따라 하향조절됨을 입증한다. AUF1 유전자의 골격근 발현도 인간에서 연령에 따라 하향 조절되어 연령에 따른 근육 손실에 기여할 가능성이 있다고 가정한다. 본원에 제시된 결과는 AUF1 골격근 유전자 전달이 (1) 중간 연령(12개월; 인간 50 내지 60세에 해당) 및 노령 마우스(18개월; 인간 70세 이상에 해당)의 운동 지구력을 어린 마우스(3개월; 인간 10대 후반, 20대 초에 해당)가 표시하는 수행도 수준으로 강력하게 향상시키고; (2) 속근 및 지근을 모두 자극하지만, 미토콘드리아 생물발생 및 지근 근섬유 특이화의 주요 활성인자인 유전자 pgc1a(퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 감마 공동활성인자 1-알파)의 증가하는 발현 수준에 의해 지근 계통을 특이적으로 특정하며; (3) 연령-관련 근육 손실에서 중간 연령 및 노령의 마우스의 골격근 질량 및 정상 근육 섬유 형성을 유의미하게 증가시키며; (4) 연령-관련 근육 손실에서 근육 위축 및 근육 염증의 확립된 생물마커의 발현을 감소시킨다는 것을 입증한다.
따라서, 본 출원의 다른 측면은 근육 재생을 촉진하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 근육 세포 질량을 증가시키고, 근육 세포 지구력을 증가시키고, 및/또는 근육 위축의 혈청 마커를 감소시키기 위해 근육 세포에서 외인성 AUF1을 발현시키기에 효과적인 조건 하에 근육 세포를 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 본원에 기재된 조성물과 접촉시키는 것을 수반한다.
본원에 사용된 용어 "촉진한다", "촉진" 및 "촉진하는"은 세포, 생체분자 또는 생리활성 분자의 생산, 존재, 발현, 또는 기능을 비롯한, 활성, 반응, 상태, 또는 다른 생물학적 매개변수의 증가를 지칭한다. 용어 "촉진한다", "촉진" 및 "촉진하는"은 활성, 반응 또는 상태의 개시, 뿐만 아니라 세포, 생체분자 또는 생리활성 분자의 생산, 존재, 또는 발현의 개시를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 용어 "촉진한다", "촉진" 및 "촉진하는"이라는 용어는 또한 천연 또는 대조군 수준과 비교하여, 활성, 반응 또는 상태를 측정가능하게 증가시키는 것, 또는 세포, 생체분자 또는 생리활성 분자의 생산, 존재, 발현 또는 기능을 측정가능하게 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
본 출원의 방법에 따라 사용하기에 적합한 세포는 설치류(마우스 또는 래트) 세포, 고양이 세포, 개 세포, 토끼 세포, 말 세포, 양 세포, 돼지 세포, 소 세포, 및 비인간 영장류 세포와 같은 포유동물 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다.
일부 실시양태에서, 근육 세포는 근세포, 근모세포, 골격근 세포, 심장 근육 세포, 평활근 세포, 및 근육 줄기 세포(예를 들어, 위성 세포)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
방법은 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, 방법은 외인성 AUF1을 발현하기에 효과적인 조건 하에 생체외에서 근육 세포를 배양하는 것을 추가로 수반한다.
일부 실시양태에서, 방법은 생체내에서 수행된다.
일부 실시양태에서, 방법은 근육 세포를 퓨린-풍부 요소 결합 단백질 β(Purβ) 저해제와 접촉시키는 것을 추가로 수반한다. Purβ 저해제는 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 소분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 핵산 분자는 상기에 상세하게 기재되어 있다.
본 출원의 방법에 따른 접촉은 경구 투여, 국소 투여, 경피 투여, 비경구 투여, 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 복강내 투여, 비강내 점적 투여, 강내 또는 방광내 점적, 안내 투여, 동맥내 투여, 병변내 투여, 또는 점막에의 적용에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 접촉은 대상체에 대한 근육내 투여, 정맥내 투여, 피하 투여, 경구 투여, 또는 복강내 투여에 의해 수행된다. 특정 실시양태에서, 투여는 근육내 주사에 의해 수행된다.
본 출원의 추가 측면은 대상체에서 퇴행성 골격근 손실을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 골격근 손실에 대한 치료를 필요로 하는 대상체를 선택하는 단계 및 선택된 대상체에서 골격근 재생을 유발하기에 효과적인 조건 하에 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 본원에 기재된 조성물을 선택된 대상체에게 투여하는 단계를 수반한다.
본 출원의 방법을 수행함에 있어서, "치료하는" 또는 "치료"는 특정 상태의 발병을 저해, 예방, 호전 또는 지연시키는 것을 포함한다. 치료하는 및 치료는 또한 상태 또는 장애의 하나 이상의 증상의 임의의 개선을 포괄한다. 치료하는 및 치료는 치료적 개입의 부재 하에 상태 또는 질병과 비교하여 상태 또는 질병 진행 과정에 대한 임의의 변형을 포괄한다.
본 출원의 방법에 따른 치료에 적합한 대상체는 설치류(마우스 또는 래트), 고양이, 개, 토끼, 말, 양, 돼지, 및 비인간 영장류와 같은 가축화된 동물 및 가축화되지 않은 동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 예시적인 인간 대상체는 제한 없이 유아, 어린이, 성인 및 노인 대상체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 퇴행성 근육 상태를 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "퇴행성 근육 상태"는 근육 손실, 근육 퇴화 또는 소모, 근육 약화, 및 정상적인 근육 기능, 성장 또는 유지와 연관된 단백질의 결함 또는 결핍 중 하나 이상을 특징으로 하는 상태, 장애, 질병 및 손상을 지칭한다. 특정 실시양태에서, 퇴행성 근육 상태는 근육감소증 또는 악액질이다. 다른 실시양태에서, 퇴행성 근육 상태는 근이영양증, 근육 손상, 예컨대, 급성 근육 손상, 근육 조직의 손실을 초래하는 것, 근육 위축, 소모 또는 퇴화, 근육 과사용, 근육 불사용 위축, 근육 불사용 위축, 탈신경 근육 위축, 디스펄린병(dysferlinopathy), AIDS/HIV, 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 신장 질환, 암, 노화, 자가면역 질환, 다발근염 및 피부근염 중 하나 이상이다. 따라서, 일부 실시양태에서, 대상체는 근육감소증 또는 근병증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 퇴행성 근육 상태를 갖는다.
본원에 기재된 조성물 및 방법은 주어진 질병, 손상 또는 상태에 대한 다른 공지된 치료 또는 치유 표준과 조합으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 근이영양증의 정황에서, 근육 위성 세포 확장을 촉진하기 위한 본 발명의 조성물은 CT-1, 프레그니손 또는 미오스타틴과 같은 화합물과 함께 투여될 수 있다. 치료(및 본원에 제공된 임의의 조합 치료)는 함께, 별도로 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
대상체는 기능적 AUF1 결핍에 의해 매개되는 근육 장애 또는 기능적 AUF 결핍에 의해 매개되지 않는 근육 장애를 가질 수 있다.
일부 실시양태에서, 대상체는 성인 발병 근병증 또는 근육 장애를 갖는다.
본원에 사용된 용어 "근이영양증"은, 예를 들어, 뒤센(Duchenne), 베커(Becker), 지대형(Limb-girdle), 선천성(Congenital), 안면견갑상완(Facioscapulohumeral), 근긴장성(Myotonic), 안인두(Oculopharyngeal), 원위(Distal), 및 에머리-드라이푸스(Emery-Dreifuss) 근이영양증을 포함한다. 특정 실시양태에서, 근이영양증은 적어도 부분적으로 단백질 디스트로핀의 결핍 또는 기능장애를 특징으로 한다. 이러한 근이영양증은 뒤센 근이영양증(DMD) 및 베커 근이영양증(DMD)을 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 근이영양증은 퇴행성 근육 상태, 예를 들어 근육 불사용 위축, 탈신경 근육 위축, 디스펄린병, AIDS/HIV, 당뇨병, 만성 폐쇄성 폐 질환, 신장 질환, 암, 노화, 자가면역 질환, 다발성근염, 및 피부근염과 연관이 있다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 뒤센 근이영양증(DMD)을 갖는다. 상기에 설명된 바와 같이, DMD는 매우 흔한(정상 출산 3500명 중 1명) X-연관 근육 소모성 질환이지만, 일반적으로 남성에서만 발견되지는 않고, 디스트로핀의 발현을 손상시키는 디스트로핀 유전자의 돌연변이에 의해 유발되는 바, 효과적인 것으로 밝혀진 치료 옵션이 거의 없다. 근육 위성 세포는 DMD에서 무반응성이며 기능적으로 소진되어 새로운 근육 발달 및 재생을 제한하거나 방해한다고 한다. DMD는 전형적으로 출생 후 2년차에 나타나고 이후 20 내지 30년 동안 진행하여 젊은 남성으로 사망한다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 베커 근이영양증을 갖는다. 상기에 설명된 바와 같이, 베커 근이영양증은 디스트로핀 기능이나 발현을 손상시키지만 덜 심각한 돌연변이를 수반하는 질병의 덜 심각한 형태이다. 베커 근이영양증에 대해 효과적인 것으로 밝혀진 치료 옵션은 거의 없다. DMD 또는 베커 질환에 대한 치유법은 전혀 없다.
본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 대상체는 외상성 근육 손상을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, "외상성 근육 손상"이라는 용어는 일상의 사고, 낙상, 스포츠 사고, 자동차 사고 등에서부터 전장에서의 손상에 대한 외과적 절제 등에 이르기까지 매우 다양한 사건으로부터 초래되는 상태를 지칭한다. 외상성 근육 손상의 비제한적 예로는 전장 근육 손상, 자동차 사고 관련 근육 손상 및 스포츠 관련 근육 손상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 투여는 퇴행성 골격근 손실을 갖는 대상체를 치료하는 데 효과적이다. 예를 들어, 투여는 근육 줄기 세포 활성화, 성숙한 근육 섬유(근섬유)의 재생 촉진, 근육 재생 인자의 발현 향상, 손상된 골격근 재생의 가속화, 지근(유형 I) 및/또는 속근(유형 II) 섬유의 재생 증가, 및/또는 근육량, 근력 회복, 및 선택된 대상체에서 이어지는 정상적인 근육 생성에 효과적일 수 있다.
일부 실시양태에서, 투여는 골격근 세포(예를 들어, 심장 횡격막 세포)를 형질도입하고/하거나, 선택된 대상체에서 장기간(예를 들어, 적어도 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월 이상) 근육 세포 특이적 AUF1 발현을 제공하는데 효과적이다.
다른 실시양태에서, 투여는 (i) 높은 수준의 위성 세포 및 근모세포를 활성화하고; (ii) 골격근 질량 및 정상적인 근섬유 형성을 유의적으로 증가시키고; 및/또는 (iii) 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여 선택된 대상체에서 운동 지구력을 유의적으로 향상시키는데 효과적이다.
추가 실시양태에서, 투여는 (i) 근육 위축 및 근육 세포 사멸의 바이오마커; (ii) 골격근(횡격막 포함)의 염증성 면역 세포 침입; 및/또는 (iii) 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여 선택된 대상체에서 골격근(횡격막 포함)의 근육 섬유증 및 괴사를 감소시키는데 효과적이다.
특정 실시양태에서, 투여는 (i) DMD 근육 세포에서 내인성 유트로핀의 발현을 증가시키고, 및/또는 (ii) 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여, 선택된 대상체에서 DMD에 근육 퇴화의 마커인 배아 디스트로핀의 발현을 억제하는데 효과적이다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 상기 투여는 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여, 선택된 대상체에서 내인성 유트로핀 단백질 발현을 상향조절하는데 효과적이다. 본원에 개시된 방법의 일부 실시양태에서, 상기 투여는 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여, 상기 근육 세포에서 내인성 유트로핀 단백질 발현을 상향조절하는데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 투여는 (i) 근육 발달 및 재생에 관여하는 유전자의 정상적인 발현을 증가시키고, 및/또는 (ii) 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여, 선택된 대상체에서 근육 세포 섬유증, 사멸 및 근육-발현 염증성 사이토카인에 관여하는 유전자를 억제하는데 효과적이다.
추가 실시양태에서, 투여는 정상적인 골격근에서 근육량, 지구력을 증가시키거나 위성 세포를 활성화시키지 않는다.
일부 실시양태에서, 투여는 상기 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여, 선택된 대상체에서 근육 증가를 가속화하는 데 효과적이다.
특정 실시양태에서, 투여는 퇴행성 골격근 손실을 갖는 대상체에서 근육 위축의 확립된 바이오마커의 발현을 감소시키는 데 효과적이다. 근육 위축의 적합한 바이오마커는 제한 없이 TRIM63 및 Fbxo32 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 선택된 대상체에서 근육 근모세포 활성화, 분화, 및 근육 재생의 확립된 바이오마커의 발현을 향상시키는 데 효과적이다. 근육 위축의 적합한 바이오마커로는 미오게닌 및 MyoD mRNA 수준, 근모세포 활성화, 분화 및 근육 재생의 바이오마커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(Zammit, "Function of Myogenic Regulatory Factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in Skeletal Muscle, Satellite Cells and Regenerative Myogenesis", Semin. Cell. Dev. Biol. 72:19-32 (2017), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 방법은 퓨린-풍부 요소 결합 단백질 β(Purβ) 저해제를 투여하는 단계를 추가로 수반한다. Purβ 저해제는 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 소분자일 수 있다. 일부 실시양태에서, 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 적합한 핵산 분자는 상기에 상세히 기재되어 있다.
본 출원의 방법에 따른 투여는 경구, 국소, 경피, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내 점적, 강내 또는 방광내 점적, 안내, 동맥내, 병변내, 또는 점막에 적용에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 투여는 근육내, 정맥내, 피하, 경구 또는 복강내로 수행된다. 특정 실시양태에서, 투여는 근육내 주사에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 근육내 주사에 의해 투여된다.
일부 실시양태에서, 투여는 근육내 주사에 의해 수행된다.
외상성 근육 손상
본 출원의 추가 측면은 대상체에서 외상성 근육 손상을 예방하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 외상성 근육 손상의 위험이 있는 대상체를 선택하는 단계, 및 선택된 대상체에게 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 본원에 기재된 조성물, 또는 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 핵산 분자는 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이고 이에 작동적으로 커플링되어 있다.
본 출원의 또 다른 측면은 대상체에서 외상성 근육 손상을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 외상성 근육 손상이 있는 대상체를 선택하는 단계, 및 선택된 대상체에게 본원에 기재된 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 본원에 기재된 조성물, 또는 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 핵산 분자는 근육 세포-특이적 프로모터에 이종성이고 이에 작동적으로 커플링되어 있다.
본 출원의 방법에 따른 치료에 적합한 대상체는 설치류(마우스 또는 래트), 고양이, 개, 토끼, 말, 양, 돼지, 및 비인간 영장류와 같은 가축화된 동물 및 가축화되지 않은 동물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 예시적인 인간 대상체로는 제한 없이, 유아, 어린이, 성인 및 노인 대상체를 포함한다.
상기에 기재된 바와 같이, 용어 "외상성 근육 손상"은 일상의 사고, 낙상, 스포츠 사고, 자동차 사고 등에서부터 전장에서의 손상에 대한 외과적 절제 등에 이르기까지 매우 다양한 사건으로부터 초래되는 상태를 지칭한다. 외상성 근육 손상의 비제한적 예로는 전장 근육 손상, 자동차 사고 관련 근육 손상 및 스포츠 관련 근육 손상을 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 열상, 둔기 타박상, 파편 상처, 근육 당김, 근육 파열, 화상, 급성 좌상, 만성 좌상, 체중 또는 힘에 의한 스트레스 손상, 반복적인 스트레스 손상, 박리 근육 손상, 및 구획 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 외상성 근육 손상이 발병할 위험이 있거나 치료를 필요로 한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 부피 근육 손실("VML")을 수반하는 외상성 근육 손상이 발병할 위험이 있거나 치료를 필요로 한다. "부피 근육 손실" 또는 "VML"이라는 용어는 복구 및 재생의 내인성 기전이 대상체에서 근육 기능을 완전히 회복시킬 수 없는 골격근 손상을 지칭한다. VML의 결과는 관절 운동 범위 및 골격근 강도의 실질적인 기능적 결손이고, 이는 평생 기능장애 및 장애를 초래한다.
일부 실시양태에서, 투여는 외상성 근육 손상이 발병할 위험이 있는 대상체에서 수행되고, 본 출원의 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터, 조성물 또는 렌티바이러스 벡터의 예방적 유효량이 투여된다. "예방적 유효량"이라는 용어는 원하는 예방적 결과를 달성하기 위한 투여량 및 필요한 시간 기간 동안의 효과적인 양을 지칭한다.
일부 실시양태에서, 투여는 외상성 근육 손상이 있는 대상체를 치료하기 위해 수행되고, 상기 투여는 외상성 근육 손상의 외상성 근육 손상 직후(예를 들어, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 6분, 7분, 8분, 9분, 10분, 11분, 12분, 13분, 14분, 15분, 60분, 또는 그 사이의 임의의 양의 시간)에 수행된다. 특정 실시양태에서, 상기 투여는 외상성 근육 손상의 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 11시간, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간, 또는 24시간 이내에 수행된다. 다른 실시양태에서, 상기 투여는 외상성 근육 손상의 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 또는 14일 이내에 수행된다. 추가 실시양태에서, 상기 투여는 외상성 근육 손상의 1주, 2주, 3주, 4주, 5주, 6주, 7주, 8주, 9주, 10주, 11주, 12주, 13주, 14주, 15주, 52주 이내, 또는 이들 사이의 임의의 양의 시간에 수행될 수 있다.
아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 렌티바이러스 벡터는 현재 생체내, 특히 인간 내로 외인성 유전자를 전달하기 위해 선택되는 재조합 유전자 전달 시스템이다. 이러한 벡터는 세포 내로 유전자의 효율적인 전달을 제공하고, 전달된 폴리뉴클레오타이드는 숙주의 염색체 DNA 내로 안정적으로 통합된다.
본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및/또는 렌티바이러스 벡터는 AUF1 이소형 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1, 또는 p45AUF1을 암호화할 수 있다. 적합한 AUF 이소형 핵산 및 아미노산 서열은 상기에서 식별된다. 특정 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 사용하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및/또는 렌티바이러스 벡터는 AUF 이소형 p45AUF1을 암호화한다.
일부 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 AAV8-tMCK-AUF1 또는 다른 인간 AAV, 예를 들어, 비제한적으로, AUF1(예를 들어, AUF1 이소형 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1 및/또는 p45AUF1)을 암호화하는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, 또는 AAV9 벡터이다. 다른 실시양태에서, AAV는 AAV2i8 또는 AAV2.5를 포함하나 이에 제한되지 않는 강화된 근육 특이적 향성을 위해 조작된 인간 신규 AAV 캡시드 변이체이다. 또 다른 실시양태에서, AAV 벡터는 AAVrh.8, AAVrh.10, AAVrh.43, 또는 AAVrh.74를 포함하나, 이에 제한되지 않는 비-인간 영장류 AAV 벡터이다.
일부 실시양태에서, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 p45 AUF1 벡터, 또는 또 다른 AUF1 이소형(예를 들어, p37AUF1, p40AUF1, 또는 p42AUF1) 또는 이들의 조합을 발현하는 렌티바이러스이다(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-mediated Stage-specific Degradation of Fate-determining Checkpoint mRNAs," Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 116:11285-90(2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 다른 실시양태는 유인원, 고양이 및 다른 포유동물 렌티바이러스 유전자 전달 벡터를 포함하나, 이에 제한되지 않는 비인간 렌티바이러스 벡터로부터 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1, p45AUF1, 또는 이들의 조합의 발현을 포함한다.
하나의 특정 실시양태에서, AUF1 p45 렌티바이러스 벡터는 하기 뉴클레오타이드 서열을 갖는다:
AUF1 p45 렌티바이러스 벡터 셔틀 플라스미드(서열번호 26)
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
일부 실시양태에서, 투여는 선택된 대상체에 대한 외상성 근육 손상 후 근육 위축 및/또는 근육 손실을 예방하는 데 효과적이다. 다른 실시양태에서, 투여는 선택된 대상체에 대한 외상성 근육 손상 후 근육 줄기 세포를 활성화하는 데 효과적이다. 추가 실시양태에서, 투여는 성숙한 근육 섬유(근섬유)의 재생을 가속화하고, 근육 재생 인자의 발현을 향상시키고, 손상된 근육의 재생을 가속화하고, 지근(유형 I) 및/또는 속근(유형 II) 섬유)의 재생을 증가시키고, 및/또는 근육량, 근력을 회복하고, 선택된 대상체에서 외상성 근육 손상 후 정상적인 근육을 생성하는 데 효과적이다.
일부 실시양태에서, 투여는 상기 투여가 수행되지 않은 경우와 비교하여, 선택된 대상체에서 외상성 근육 손상 후 근육 증가를 가속화하는 데 효과적이다.
특정 실시양태에서, 투여는 선택된 대상체에 대한 외상성 근육 손상 후 근육 위축의 확립된 바이오마커의 발현을 감소시키는 데 효과적이다. 근육 위축의 적합한 바이오마커는 제한 없이 TRIM63 및 Fbxo32 mRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 투여는 선택된 대상체에 대한 외상성 근육 손상 후 근육 근모세포 활성화, 분화 및 근육 재생의 확립된 바이오마커의 발현을 향상시키는 데 효과적이다. 근육 위축의 적합한 바이오마커로는 미오게닌 및 MyoD mRNA 수준, 근모세포 활성화, 분화 및 근육 재생의 바이오마커를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다(Zammit, "Function of the Myogenic Regulatory Factors Myf5, MyoD, Myogenin and MRF4 in Skeletal Muscle, Satellite Cells and Regenerative Myogenesis", Semin. Cell. Dev. Biol. 72:19-32(2017), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
일부 실시양태에서, 투여는 본원에 기재된 벡터 또는 약제학적 조성물을 대상체의 특정 조직에 전달하는 데 효과적이다. 조직은 근육 조직일 수 있다. 예를 들어, 근육 조직은 모든 유형의 골격근, 평활근 또는 심장 근육일 수 있다.
본 출원의 방법에 따른 투여는 경구, 국소, 경피, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 비강내 점적, 강내 또는 방광내 점적, 안내, 동맥내, 병변내, 또는 점막에 적용에 의해 수행될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, 투여는 근육내, 정맥내, 피하, 경구 또는 복강내로 수행된다. 특정 실시양태에서, 투여는 근육내 주사에 의해 수행된다. 일부 실시양태에서, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 근육내 주사에 의해 투여된다.
다른 실시양태에서, 투여는 전신 투여에 의해 수행된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 렌티바이러스 벡터로서, 여기서 핵산 분자는 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링되는 렌티바이러스 벡터는 전신 투여된다. 일부 실시양태에서, 전신 투여된 렌티바이러스 벡터는 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1 및/또는 p45AUF1 AUF1 벡터를 발현하는 렌티바이러스이다(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-mediated Stage-specific Degradation of Fate-determining Checkpoint mRNAs", Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 116:11285-90 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
주사용 제형은 보존제가 첨가된 단위 투여 형태, 예를 들어 앰플 또는 다회 용량 용기로 제공될 수 있다. 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼과 같은 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다.
초기 접촉 및 추가 용량 또는 순차적 접촉 단계에 적합한 요법은 모두 동일하거나 가변적일 수 있다. 적절한 요법은 본 출원의 개시내용, 본원에 인용된 문헌, 및 본 기술분야의 지식으로부터 본 기술분야의 기술자에 의해 확인될 수 있다.
본 출원의 방법에서 투여되는 투여량 단위는 다른 매개변수 중에서도 사용된 벡터, 투여 경로, 표적화되는 조직 및 세포의 유형, 및 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 치료를 위한 투여량은 본 기술분야의 표준 방법을 사용하여 용량을 결정하는 방법을 알고 있는 기술자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 게놈 카피 수에 상응하는 투여량 단위는 본원에 개시된 벡터의 약 1x101 내지 1x1011, 1x102 내지 1x1011, 1x103 내지 1x1011, 1x104 내지 1x1011, 1x105 내지 1x1011, 1x106 내지 1x1011, 1x107 내지 1x1011, 1x108 내지 1x1011, 1x109 내지 1x1011, 1x1010 내지 1x1011, 1x101 내지 1x1010, 1x102 내지 1x1010, 1x103 내지 1x1010, 1x104 내지 1x1010, 1x105 내지 1x1010, 1x106 내지 1x1010, 1x107 내지 1x1010, 1x108 내지 1x1010, 1x109 내지 1x1010, 1x101 내지 1x109, 1x102 내지 1x109, 1x103 내지 1x109, 1x104 내지 1x109, 1x105 내지 1x109, 1x106 내지 1x109, 1x107 내지 1x109, 1x108 내지 1x109, 1x101 내지 1x108, 1x102 내지 1x108, 1x103 내지 1x108, 1x104 내지 1x108, 1x105 내지 1x108, 1x106 내지 1x108, 또는 1x107 내지 1x108 게놈 카피 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 카피 수에 상응하는 투여량 단위는, 예를 들어, 1x101 내지 1x1012, 1x102 내지 1x1012, 1x103 내지 1x1012, 1x104 내지 1x1012, 1x105 내지 1x1012, 1x106 내지 1x1012, 1x107 내지 1x1012, 1x108 내지 1x1012, 1x109 내지 1x1012, 1x1010 내지 1x1012, 또는 1x1011 내지 1x1012 게놈 카피; 1x101 내지 1x1013, 1x102 내지 1x1013, 1x103 내지 1x1013, 1x104 내지 1x1013, 1x105 내지 1x1013, 1x106 내지 1x1013, 1x107 내지 1x1013, 1x108 내지 1x1013, 1x109 내지 1x1013, 1x1010 내지 1x1013, 1x1011 내지 1x1013, 또는 1x1012 내지 1x1013 게놈 카피; 1x101 내지 1x1014, 1x102 내지 1x1014, 1x103 내지 1x1014, 1x104 내지 1x1014, 1x105 내지 1x1014, 1x106 내지 1x1014, 1x107 내지 1x1014, 1x108 내지 1x1014, 1x109 내지 1x1014, 1x1010 내지 1x1014, 1x1011 내지 1x1014, 1x1012 내지 1x1014, 또는 1x1013 내지 1x1014 게놈 카피; 1x101 내지 1x1015, 1x102 내지 1x1015, 1x103 내지 1x1015, 1x104 내지 1x1015, 1x105 내지 1x1015, 1x106 내지 1x1015, 1x107 내지 1x1015, 1x108 내지 1x1015, 1x109 내지 1x105, 1x1010 내지 1x1015, 1x1011 내지 1x1015, 1x1012 내지 1x1015, 1x1013 내지 1x1015, 또는 1x1014 내지 1x1015 게놈 카피; 1x101 내지 1x1016, 1x102 내지 1x1016, 1x103 내지 1x1016, 1x104 내지 1x1016, 1x105 내지 1x1016, 1x106 내지 1x1016, 1x107 내지 1x1016, 1x108 내지 1x1016, 1x109 내지 1x1016, 1x1010 내지 1x1016, 1x1011 내지 1x1016, 1x1012 내지 1x1016, 1x1013 내지 1x1016, 1x1014 내지 1x1016, 또는 1x1015 내지 1x1016 게놈 카피; 1x101 내지 3x1016, 1x102 내지 3x1016, 1x103 내지 3x1016, 1x104 내지 3x1016, 1x105 내지 3x1016, 1x106 내지 3x1016, 1x107 내지 3x1016, 1x108 내지 3x1016, 1x109 내지 3x1016, 1x1010 내지 3x1016, 1x1011 내지 3x1016, 1x1012 내지 3x1016, 1x1013 내지 3x1016, 1x1014 내지 3x1016 , 또는 1x1015 내지 3x1016 게놈 카피의 범위; 및 이들 사이의 임의의 양으로 투여된다. 투여량은 투여 경로, 벡터를 수용할 조직 및 세포의 유형, 인간 대상체에 대한 투여 시점, 전달될 총 게놈 카피를 기반으로 하여 투여량이 결정되는지 여부, 및 투여가 체중 킬로그램당 게놈 카피에 의해 결정되는지 여부에 따라 달라질 것이다.
일부 실시양태에서, 대상체는 본원에 기재된 벡터 또는 약제학적 조성물을 1회 용량으로 투여받는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 연속적으로 2회 이상의 용량으로 본원에 기재된 벡터 또는 약제학적 조성물을 투여받는다. 일부 다른 실시양태에서, 대상체가 본원에 기재된 벡터 또는 약제학적 조성물을 1회 용량, 2회 용량 및/또는 2회 초과 용량으로 투여받는 경우, 용량은 동일하거나 상이할 수 있고, 이들 사이에 동일한 간격 또는 동일하지 않은 간격으로 투여된다.
대상체는 광범위한 시간에 걸쳐 많은 빈도로 본원에 기재된 벡터 또는 약제학적 조성물을 투여받을 수 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 1일 미만의 기간에 걸쳐 본원에 기재된 벡터 또는 약제학적 조성물을 투여받는다. 다른 실시양태에서, 대상체는 2, 3, 4, 5, 또는 6일에 걸쳐 접촉된다. 일부 실시양태에서, 접촉은 몇 주에 걸쳐 매주 1회 이상 수행된다. 다른 실시양태에서, 접촉은 1개월 내지 수개월 동안 몇 주에 걸쳐 수행된다. 다양한 실시양태에서, 접촉은 수개월에 걸쳐 수행된다. 다른 양태에서, 접촉이 1년 이상의 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 일반적으로, 치료 기간은 허혈성 질환 과정의 기간, 적용되는 치료법의 효과, 및 치료되는 대상체의 상태 및 반응에 비례적일 것이다. 일부 실시양태에 따르면, 접촉은 매일 수행된다.
본원에 기재된 벡터 또는 약제학적 조성물을 투여하기 위한 제형의 선택은 다양한 인자에 의존할 것이다. 이들 중에서 눈에 띄는 것은 대상체의 종, 치료되는 장애, 기능장애 또는 질환의 본성, 대상체에서 이의 상태 및 분포, 투여되는 다른 요법 및 작용제의 본성, 최적의 투여 경로, 경로를 통한 생존 가능성, 투약 요법, 및 본 기술분야의 기술자에게 자명할 다른 인자일 것이다. 특히, 예를 들어 적합한 담체 및 기타 첨가제의 선택은 정확한 접촉 경로 및 특정 투여 형태의 본성에 따라 달라질 것이다.
본원에 기재된 방법에서, 벡터를 투여하는 단계보다 AUF를 투여하는 다른 수단으로는 (i) 플라스미드에 의한 암호화 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1 및/또는 p45AUF1 DNA; (ii) p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1 및/또는 p45AUF1 암호화 mRNA의 직접 주사; 및/또는 (iii) AUF1 암호화 DNA 또는 mRNA의 나노입자 혼입 등에 의해 수행될 수 있다.
실시예
이하 실시예는 본 출원의 실시양태의 실행을 예시하기 위한 것이지만, 그 범위를 제한하려는 것은 결코 아니다.
실시예 1 내지 8에 대한 재료 및 방법
마우스
모든 동물 연구는 NYU 의과대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)의 승인을 받았고 IACUC 지침에 따라 수행했다. 모든 auf -/- KO 마우스 및 WT 마우스는 129/B6-배경을 가지며 auf -/- 이형접합 마우스로부터 F3 및 F4 세대로 사육되었다(Pont 등, "mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription," Molecular Cell 47(1):5-15 (2012) 및 Lu 등, "Endotoxic Shock in AUF1 Knockout Mice Mediated by Failure to Degrade Proinflammatory Cytokine mRNAs," Genes Dev. 20(22):3174-3184 (2006), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). AAV 실험 동안 AUF1 보충을 위한 12개월된 C57BL6 마우스(Jackson). 1개월된 C57BL10 및 C57BL/10ScSn-Dmd mdx /J 마우스(Jackson)는 실시예 8의 AAV 실험에 사용되었다.
세포
C2C12 세포는 미국 모식균 배양 수집소(ATCC)로부터 입수하였고, STR 프로파일링에 의해 인증되었고 마이코플라스마 오염에 대해 일상적으로 확인되었다. C2C12 세포는 DMEM(Corning), 10% FBS(Gibco) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(Life Technologies)에서 유지되었다. 세포를 분화하기 위해 배지를 96시간 동안 DMEM(Corning), 2% 말 혈청(Gibco) 및 1% 페니실린 스트렙토마이신(Life Technologies)으로 전환시켰다(Panda 등, "RNA-Binding Protein AUF1 Promotes Myogenesis by Regulating MEF2C Expression Levels", Mol. Cell Biol. 34(16): 3106-3119 (2014), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). auf1 KO C2C12 세포는 Crispr-Cas9 방법으로 생성했다(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-Mediated Stage-Specific Degradation of Fate-Determining Checkpoint mRNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116(23):11285-11290 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). mRNA 안정성을 결정하기 위해 악티노마이신 D의 존재 하에 수행되는 검정을 위해, C2C12 근모세포 세포를 0.2 μg/ml의 악티노마이신 D(Sigma)로 처리하였다. RNA 면역 침전 실험은 정상 IgG 토끼 대조군 또는 토끼-항 AUF1 항체(07-260, Millipore)를 사용하여 분화 전 및 분화 48시간째에 WT C2C12에서 수행했다.
면역형광
마우스에서 텍스트에 표시된 대로 골격근을 제거하고, OCT에 넣고, 드라이아이스로 냉각된 이소펜탄(Tissue-Tek)에서 동결하고, 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, TBS 중 3% BSA에서 차단시켰다. C2C12 세포는 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고 PBS 중 3% BSA에서 차단시켰다. 샘플은 항체를 이용하여 밤새 면역염색했다: AUF1(07-260, Millipore), 지근 미오신(NOQ7.5.4D, Sigma), 속근 미오신(MY-32, Sigma), 라미닌 알파 2(4H8-2, Sigma) 및 GFP(2956, Cell signalling). MOM 키트(Vector biolabs)를 사용하여 지근 및 속근 미오신 염색을 수행했다. Alexa Fluor donkey 488 및 555 2차 항체를 1:300으로 사용하고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 슬라이드는 DAPI(Vector)가 있는 Vectashield로 밀봉했다. ImageJ를 사용하여 이미지를 프로세싱했다.
현미경검사, 이미지 프로세싱 및 분석
주로 20X 렌즈를 가진 Zeiss LSM 700 공초점 현미경을 사용하여 이미지를 획득했다. ImageJ를 사용하여 이미지를 프로세싱했다. 필요한 경우, 실험 세트의 전체 이미지와 모든 이미지에 대해 색상 균형을 연속적으로 조정했다.
면역블롯 연구
C2C12 세포 또는 근육 조직은 완전 프로테아제 저해제 칵테일(Complete mini, ROCHE)이 보충된 용해 완충액(50mmol/L Tris-HCl, pH 7.5, 150mmol/L NaCl, 1mmol/L EDTA, 1mmol/L EGTA, 1% TritonX100)을 사용하여 용해했다. 동일한 양의 총 단백질을 폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고, 분해하여 PVDF 막으로 옮겼다. TBS-Tween 20(0.1%) 중 5% 무지방 밀크로 막을 1시간 동안 차단하고 AUF1(07-260, Millipore) 또는 PGC1alpha(Novus biologicals NBP1-04676)에 대한 항체로 탐침했다. 밴드는 퍼옥시다제 접합된 이차 항체(GE Healthcare)로 검출했고, ECL 화학발광 시스템으로 가시화했다. 면역블롯은 또한 로딩에 대한 대조군으로서, β-튜불린(Cell Signaling 2146S) 또는 GAPDH(Cell Signaling 2118S)에 대한 토끼 항체를 이용하여 탐침했다. 정량은 ImageJ에 의해 수행했다.
실시간 PCR 분석
제조사의 지시에 따라 Trizol(Invitrogen)을 사용하여 RNA를 추출하였다. DNase 처리는 체계적으로 수행했다. 추출된 RNA의 정량은 Nanodrop을 사용하여 평가했다. cDNA는 고용량 cDNA 역전사 키트(Applied Biosystems)를 사용하여 합성했다. mRNA는 iTaq Universal SYBR Green Supermix(Bio Rad) 프로브를 사용하여 실시간 PCR로 분석했다. 상대적 정량은 하우스키핑 유전자에 대해 정규화되고 대조군의 평균으로 보정된 데이터를 사용하여 비교 CT 방법으로 결정했다.
AAV-AUF1 발현/AAV AUF1 유전자 전달
AUF1은 tMCK 프로모터 하에 AAV8 벡터에 통합되었다(AAV8-tMCK-AUF1-IRES-eGFP)(Vector Biolabs)(도 10). AAV8-tMCK-IRES-eGFP를 대조군 벡터로 사용하였다. 이 프로모터는 높은 근육 특이성을 유도하는 MCK(근육 크레아틴 키나제) 프로모터의 절두된 조절 영역에 결찰된 2RS5 인핸서 서열의 3중 탠덤(3-Ebox)을 첨가하여 생성했다(Wang 등, "Construction and Analysis of Compact Muscle-Specific Promoters for AAV Vectors," Gene Ther. 15(22):1489-1499 (2008), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). C57Bl6 마우스에 50 μl의 단일 안와후 주사(최종 농도: 2.5x1011 입자)를 주사했다.
근육 기능 검사
그리드 매달림 시간. 마우스가 떨어질 경우 부상을 방지하기 위해 부드러운 침구보다 위에 30cm 높이의 그리드 중앙에 마우스를 배치했다. 그런 다음 그리드를 뒤집었다. 그리드 매달림 시간은 마우스가 그리드에서 떨어지기 전에 잡고 있던 시간의 양으로서 측정했다. 각 마우스는 마우스당 5회 반복하여 두 번 분석했다.
소진 시간, 소진 거리 및 최대 속도. 순응 1주 후, 마우스를 트레드밀에 배치하고, 속도를 3분마다 1 m/min씩 증가시켰고, 기울기는 9분마다 5cm씩 최대 15cm까지 증가시켰다. 마우스가 전기 그리드 위에 10초 이상 머물렀을 때, 소진된 것으로 간주했다. 체중 및 달리기 수행도에 기초하여, 일률을 주울(J)로서 계산했다. 각 마우스는 마우스당 5회 반복하여 두 번 분석했다.
악력 테스트에 의한 강도(실시예 8 및 9): 이 테스트에서 마우스는 동력계에 연결된 수평 높이 그리드(horizon tall grid)를 잡으며, 꼬리를 잡아당김으로써 뒤로 5회 끌어당긴다. 동물이 악력을 잃기 전에 매회 그리드에 가해진 힘을 뉴턴으로 기록한다. 그런 다음 5회 테스트의 평균을 각 마우스의 전신 중량에 대해 정규화한다. 마우스는 전형적으로 마우스당 5회 반복하여 두 번 분석한다.
Dexa 근육량 비침습적 정량 분석(실시예 7)
이중 에너지 X선 흡수계측법(DEXA)을 사용하여 순수 근육량 및 손상 또는 노화 시 근육량 변화를 이전에 공개된 바와 같이 기록했다(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity", Cell Rep. 16(5):1379-1390(2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
위성 세포의 정량(실시예 7)
근육을 절제하여 콜라게나제 유형 I로 분해시킨다. 세포 수는 Sdc4+ CD45-CD31-Sca1- 위성 세포 집단에 대해 게이트화하는 유세포 분석으로 정량한다(Shefer 등, "Satellite-Cell Pool Size Does Matter: Defining the Myogenic Potency of Aging Skeletal Muscle", Dev. Biol. 294(1):50-66(2006) 및 Brack 등, "Pax7 is Back", Skelet. Muscle 4(1):24(2014), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
근섬유 유형 분석(실시예 7)
골격근을 제거하고, OCT 화합물에 넣고, 4% 파라포름알데하이드에 고정시키고, AUF1(07-260, Millipore), 지근 미오신(NOQ7.5.4D, Sigma), 속근 미오신(MY-32, Sigma), 및 라미닌 알파 2 막 성분(4H8-2, Sigma)에 대한 항체로 면역염색했다.
근육 조직의 조직학적 연구 및 생화학적 분석(실시예 7 및 8)
근육을 제거하고 OCT 화합물에서 동결시키고, 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, TBS 중 3% BSA로 차단시켰다. 면역형광 또는 면역화학(헤마톡실린 및 에오신, Masson Trichome)을 수행했다. 콜라겐 침착 영역을 가시화하기 위해 Masson trichrome으로 근육 절편을 염색하여 섬유증을 평가하고 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 정량했다. 면역형광 이미지는 Zeiss LSM 700 공초점 현미경을 사용하여 획득했다. 이미지 및 형태측정 분석(Feret 직경, 단면적)은 최근에 설명된 바와 같이 ImageJ를 사용하여 프로세싱했다(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-Mediated Stage-Specific Degradation of Fate-Determining Checkpoint mRNAs," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116(23):11285-11290 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 면역블롯, RNAseq 및 RT-PCR 분석을 포함한 생화학적 분석을 위해 근육을 수확했다.
에반 블루(Evan Blue) 염료 분석(실시예 7)
에반 블루 염료는 근육 손상의 생체내 마커로 사용했다. 이는 손상되기 시작한 투과성 골격 근섬유를 식별한다(Wooddell 등, "Myofiber Damage Evaluation by Evans Blue Dye Injection", Curr. Protoc. Mouse Biol. 1(4):463-488(2011), 이는 전체가 본원에 참고로 통합됨).
혈청 크레아틴 키나제(CK) 활성(실시예 7)
혈청 CK는 크레아틴 키나제 활성 검정 키트(abcam)를 사용하여 표준 분광광도계 분석에 의해 37℃에서 평가했다. 결과는 mU/mL로 표현된다.
혈액 수확(실시예 7)
크레아틴 키나제 수준, 및 사이토카인, 세포 및 염증 마커의 수준을 정량하기 위해 말초 혈액을 수확했다.
정량 및 통계 분석
모든 결과는 평균±SEM으로 표현된다. 두 군 비교는 무쌍의 만-휘트니 테스트로 분석했다. 일원 분산 분석(ANOVA)을 사용하여 다중 군 비교를 수행했다. 적절한 경우 군을 분석하기 위해 비모수적 크러스칼-월리스 테스트에 이어 Dunn의 쌍 비교를 이용하였다. 0.05 미만의 P-값은 유의미한 것으로 간주되었다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism(버전 7) 소프트웨어를 사용하여 수행했다.
게놈 전반에 걸친 전사체 및 해독체 연구 및 생물정보학 데이터 분석(실시예 7)
폴리솜 분획화 및 mRNA 단리. 폴리솜 단리는 이전에 설명된 바와 같이 세포질 추출물을 사용하여 수크로스 구배 원심분리에 의해 리보솜 결합 mRNA를 분리하여 수행했다(de la Parra 등, "A Widespread Alternate form of Cap-Dependent mRNA Translation Initiation", Nat. Commun. 9(1):3068(2018) 및 Badura 등, "DNA Damage and eIF4G1 in Breast Cancer Cells Reprogram Translation for Survival and DNA Repair mRNAs", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109(46):18767-72(2012), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 분획화 후 샘플은 잘 해독되지 않은 분획 및 잘 해독된 분획에 각각 상응하는 2 내지 3개 리보솜 및 ≥4개 리보솜에 결합된 mRNA에 대한 농축을 기반으로 하여 수집했고, RNA 시퀀싱(RNAseq)에 사용했다. RNA 품질은 Bioanalyzer(Agilent Technologies)로 측정했다.
RNA 시퀀싱 및 데이터 분석. Illumina HiSeq 4000 단일 판독을 사용하여 New York University School of Medicine Genome Technology Core에서 쌍을 이룬-말단 RNA-seq(paired-end RNA-seq)를 수행했다. 낮은 품질의 판독값(20개 미만)은 Trimmomatic으로 트리밍하여(Bolger 등, "Trimmomatic: A Flexible Trimmer for Illumina Sequence Data", Bioinformatics, 30(15):2114-20 (2014), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)(버전 0.36), 35 nt 미만의 판독값은 제외했다. 생성된 서열은 STAR를 이용하여 단일 말단 모드로 hg38 기준 게놈에 대해 정렬시켰다(Dobin 등, "STAR: Ultrafast Universal RNA-Seq Aligner", Bioinformatics 29(1):15-21(2013), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)(버전 2.6.0a). 정렬 결과는 SAMtools로 분류했고(Li 등, "The Sequence Alignment/Map format and SAMtools", Bioinformatics 25(16):2078-2079(2009), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)(버전 1.9), 그 후 특징 카운트를 수득하기 위해 HTSeq에 공급했다(Anders 등, "HTSeq--A Python Framework to Work with High-Throughput Sequencing Data", Bioinformatics 31(2):166-9(2015), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)(버전 0.10.0). 여러 샘플의 특징 카운트 표를 사용자 지정 R 스크립트와 연계시켰다. 전사 및 해독의 차이를 조사하기 위해, 총 mRNA와 폴리솜 mRNA를 별도로 분위수-정규화(quantile-normalized)하였다. 전사 및 해독에 의한 조절 및 동반되는 통계 분석은 RIVET(Ernlund 등, "RIVET: Comprehensive Graphic User Interface for Analysis and Exploration of Genome-Wide Translatomics Data", BMC Genomics 19(1):809(2018), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)을 사용하여 수행했고, 여기서 유의미한 유전자는 P<0.05 및 >1 로그 배수 변화로 식별되었다. 리액톰(reactome) 경로 분석은 Metascape(Zhou 등, "Metascape Provides a Biologist-Oriented Resource for Analysis of Systems-Level Datasets", Nat. Commun. 10(1):1523 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)를 사용하여 전사 및 해독에 의해 상향 및 하향 조절된 유전자에 대해 수행했다. 전사 및/또는 해독에 의해 가장 많이 조절되는 상위 100개 유전자의 경로 분석 및 농축 플롯은 DAVID(Huang da 등, "Systematic and Integrative Analysis of Large Gene Lists Using DAVID Bioinformatics Resources", Nat. Protoc 4(1):44-57(2009), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨) 및 Metascape를 사용하여 생성했다. 100개 유전자의 동일한 목록의 전사 인자 예측은 Enrichr(Chen 등, "Enrichr: Interactive and Collaborative HTML5 Gene List Enrichment Analysis Tool", BMC Bioinformatics 14:128(2013), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)(TRANSFAC 및 JASPER PWM 프로그램) 및 PASTAA(Roider 등, "Predicting Transcription Factor Affinities to DNA from a Biophysical Model", Bioinformatics 23(2):134-41(2007), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨) 온라인 도구를 사용하여 수행했다. TFH 세포에 농축된 유전자는 GSE16697(Johnston 등, "Bcl6 and Blimp-1 are Reciprocal and Antagonistic Regulators of T Follicular Helper Cell Differentiation", Science 325(5943):1006-1010(2009), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)로부터 결정되었고, 데이터 세트 간에 유사한 유전자는 Venny를 사용하여 결정했다.
외상성 손상 동물 모델(실시예 8)
달리 언급되지 않는 한, 3개월된 수컷 마우스에 대조군 또는 렌티바이러스 AUF1 벡터(1x108 게놈 카피 수/ml)(총 부피 100μl)와 함께 멸균 식염수 중 여과된 1.2% BaCl2 50μl의 근육내 주사를 왼쪽 전방 경골(TA) 근육으로 투여했다. 오른쪽 TA 근육은 대조군으로서 손상되지 않은 상태로 남겨 두었다. 주사 후 3 또는 7일차에 마우스를 희생시켰다. 근육의 무게를 재고 면역형광 염색을 위해 OCT에서 동결시키거나, mRNA 추출을 위해 Trizol에 넣었다.
실시예 1 - 골격근 AUF1 발현은 연령에 따라 하향조절된다
auf1 유전자가 결실된 마우스는 근육량의 가속화된 손실을 겪기 때문에(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity," Cell Rep. 16(5):1379-1390 (2016); Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-Mediated Stage-Specific Degradation of Fate-Determining Checkpoint mRNAs," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116(23):11285-11290 (2019); 및 Pont 등, "mRNA Decay Factor AUF1 Maintains Normal Aging, Telomere Maintenance, and Suppression of Senescence by Activation of Telomerase Transcription," Molecular Cell 47(1):5-15 (2012), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨), 연령에 따른 AUF1의 감소된 발현이 야생형 동물에서 일어나고 연령-관련 근육 위축에 관여하는지 여부를 조사했다. 어린(3개월), 중간 연령(12개월) 및 노령 마우스(18개월)의 사지 골격근에서 AUF1의 발현을 분석했다. 3개월의 어린 마우스와 비교 시, auf1 mRNA 발현은 운동을 하지 않은 동물에서 12개월에 강력하게 하향조절되었으며, 이는 전방 경골(TA), 비복근, 장지신근(EDL) 및 비장근에서 나타났다(도 7a). 모든 연구에서 테스트 mRNA는 AUF1 발현에 관계없이 풍부도가 변하지 않는 gapdh 또는 tbp mRNA에 대해 정규화했다. TA 근육에서 나타나듯이, AUF1 단백질 수준은 mRNA 수준을 추적하여 12개월에 60% 및 18개월에 80% 감소를 입증했다(도 7b). 운동을 하지 않은 동물에서 연령에 따른 골격근 AUF1 발현 감소는 사지 근육에서 유의적인 근육량 손실과 연관이 있었고, 이는 3개월된 동물과 비교하여 12개월 및 18개월된 마우스의 TA, EDL, 비복근 및 비장근에서 나타났다(도 7c). 중요한 것으로, 18개월에 근육량 손실은 12개월 값에서 정체하기 시작했다. TA 근육의 질량은 거의 50%, EDL은 30%, 비장근은 거의 50%, 비복근은 25% 감소했다. 이러한 데이터는 12 내지 18개월차에 앉아만 있는 마우스가 운동을 하지 않거나 노화에 따라 전형적으로 관찰되는 근육 손실 및 위축에 일치하는 골격근 질량의 유의미한 감소를 겪었음을 분명하게 보여준다.
실시예 2 - AUF1 골격근 유전자 전달은 중간 연령 및 노령 마우스에서 운동 지구력을 향상시킨다
마우스에서 연령에 따른 골격 근육량의 손실이 골격근에서 AUF1의 감소된 발현의 결과인지를 조사했다. 골격근에서 AUF1을 전달하고 선택적으로 발현하기 위해 AAV8(아데노-연관 바이러스 유형 8) 벡터를 개발했다. AAV 벡터는 AUF1 및 GFP(AUF1-GFP, GFP는 HCV IRES에 의해 동일한 mRNA로부터 해독됨) 또는 대조군으로서 GFP만을 발현한다. 두 유전자의 발현은 골격근 세포에서 선택적으로 활성인 크레아틴 키나제 tMCK 프로모터에 의해 제어된다. Wang 등, "Construction and Analysis of Compact Muscle-Specific Promoters for AAV Vectors," Gene Ther. 15(22):1489-1499 (2008), 이의 전체는 본원에 참고로 포함된다). 3개월 및 12개월된 마우스에게 AAV AUF1-GFP 또는 대조군 AAV GFP 벡터(2.0 x 1011 게놈 카피)의 단일 안와후 주사를 투여했다. 12개월된 마우스에서 나타나는 바와 같이, AAV 벡터의 투여 후 40일차부터 분석했을 때, AAV AUF1-GFP 및 AAV GFP 대조군 벡터 처리된 동물은 모두 TA 근육 GFP 염색에 의해 나타나듯이, 유사한 벡터 형질도입 및 보유율을 표시했다(도 1a-1b). 골격근에서 auf1 mRNA 발현은 이 시점에서 AAV8 AUF1-GFP 투여에 의해 내인성 수준보다, 이후에 나타나는 바와 같이(도 1c), EDL에서 평균 2.5배, TA에서 6배, 비복근에서 2.5배, 및 높은 내인성 수준을 갖는 비장근에서 약간 증가하였다. TA 근육에서 나타나는 바와 같이, 골격근에서 유전자 전달된 동물 중 AUF1 단백질 수준은 mRNA 수준에 상응하는 내인성 수준에 비해 4 내지 6배 증가된 발현을 입증하였다(도 7d). 대조군 마우스(신장, 폐, 비장, 간)와 비교하여 비-근육 조직에서는 AUF1의 증가된 발현에 대한 증거가 없었으며(도 7e), 이는 tMCK 프로모터에 의한 AUF1의 골격근 발현에 대한 강력한 조직 특이성을 입증한다. 중요하게는, 근육 위성 세포 및 증식성 근모세포의 활성화에 대한 핵심 마커인 Pax7 발현도 AAV AUF1-GFP 투여에 의해 3 내지 4배 증가했다(도 7f). 이에 상응하여, trim63 및 fbxo32와 같은 근육 위축의 마커(Nilwik 등, "The Decline in Skeletal Muscle Mass with Aging is Mainly Attributed to a Reduction in type II muscle Fiber Size", Exp. Gerontol. 48(5):492-498(2013)(이의 전체 내용이 본원에 참고로 포함됨)는 AAV AUF1-GFP가 투여된 동물의 TA 근육에서 3배 하향조절되었다(도 7g). 종합적으로, 이러한 데이터는 골격근 내로 단지 중간 수준의 AUF1 유전자 전달만으로 위성 세포 및 근모세포의 활성화와 일치하는 근육 위축의 마커를 감소시키기에 충분했음을 나타낸다.
따라서, 다수의 잘 확립된 기준을 사용하여 AUF1 유전자 전달이 중간 연령 및 노령의 앉아만 있는 마우스에서 신체 지구력을 증가시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 12개월된 앉아만 있는 마우스에 AAV8 AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8 GFP를 투여한 다음, 투여 후 40일차에 테스트하였다. AUF1이 보충된 마우스는 지대형 골격근 강도 및 지구력의 척도인 그리드 매달림 시간(도 1d)에서 약 50% 개선을 보였다. 트레드밀로 테스트했을 때, AAV AUF1-GFP 마우스는 AAV GFP 대조군 마우스에 비해 최대 속도가 25% 더 높고(도 1e), 일률이 50% 증가했으며(도 1f), 뿐만 아니라 소진 시간이 25% 더 길었고, 소진까지의 거리가 30% 증가했다(도 1g, 도 1h). 대조군 AAV GFP를 투여받은 3개월된 마우스와 비교할 때, 12개월된 마우스는 어린 마우스의 수준과 동등한 신체 지구력 능력을 얻었다(도 1e-1h). 신체 지구력은 또한 12개월된 마우스의 AAV-AUF1 주사 후 6개월차에도 테스트했고, 이 때는 18개월이었고 테스트 시점까지 운동을 하지 않은 채 유지되었다. 최대 속도(도 1i), 수행된 작업(도 1j), 뿐만 아니라 소진 시간 및 소진 거리(도 1k, 도 1l)는 모두 치료후 40일차에 12개월된 마우스와 유사하게, AUF1-AAV 처리된 동물에서 모두 유의미하게 더 높았다. 이러한 결과는 근육 손실 및 위축이 있는 노령의 마우스에서 AUF1 보충에 의한 운동 지구력 향상이 치료 후 6개월차에도 지속되며, 감소의 증거는 전혀 없었음을 입증한다. 따라서, 다음으로 AUF1의 생물학적 및 분자적 특성이 골격근에서 회복되는지 여부를 조사했다.
실시예 3 - AUF1 유전자 요법은 근육량을 증가시키고 속근 근섬유보다 지근 근섬유를 증가시킨다.
골격근은 지근 및 속근 근섬유 조성(각각 유형 I 또는 II)이 다양하다. TA, EDL 및 비복근은 대부분 유형 II 속근 근섬유(거의 99% 속근, 1% 지근)로 구성되는 반면, 비장근에는 유형 I 속근 근섬유가 매우 농축되어 있다(거의 40% 지근, 60% 속근)(Augusto 등, "Skeletal Muscle Fiber Types in C57BL6J mice", J. Morphol. Sci. 21(2):89-94(2004), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 비복근 및 TA 근육의 분석은 12개월된 앉아만 있는 노령의 마우스가 AAV GFP 대조군과 비교하여 AAV AUF1-GFP가 투여된 동물의 체중 대비 근육량의 약 20%의 평균 총 증가를 얻었음을 보여주었다(도 2a, 도 2b). 증가된 근육 섬유 크기(근섬유 단면적, CSA) 및 수는 근육 재생의 확립된 특징이다(Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91(4):1447-1531(2011) 및 Yin 등, "Satellite Cells and the Muscle Stem Cell Niche", Physiol. Rev. 93(1):23-67(2013), 이들은 전체가 본원에 참고로 포함됨). GFP 대조군 마우스와 비교하여, 12개월된 AAV AUF1-GFP 마우스의 TA 및 비복근 근육에서 나타나는 바와 같이, 더 큰 근섬유의 백분율이 유의미하게 증가하였고, 특히 더 큰 근섬유(>3200μm2)에서 현저했다(도 2c-2f). 증가된 근섬유 크기는 활발하고 성숙한 근육 재생을 나타낼 수 있다. 또한, 보충성 AUF1 발현이 근섬유의 지근, 속근 또는 두 가지 유형 모두를 촉진하는지 여부를 조사했다. AUF1 보충은 비복근에서 나타나는 바와 같이, 속근 섬유와 비교하여 필드당 지근 근섬유의 수 및 크기를 거의 60% 증가시켰다(도 2g-2h). 주로 속근 근육으로 구성된 비장근에서, 근섬유 면적은 AUF1 보충에 의해 유사하게 증가했다(도 2i, 도 2j).
상이한 미오신 유형 mRNA의 발현 수준은 또한 AUF1 유전자 전달이 골격근 질량의 실제 증가를 초래했음을 뒷받침한다. 주요 지근 미오신 mRNA인 myh7은 AUF1 유전자 전달에 의해 비복근에서 6배, 및 비장근에서 2배 증가된 반면(도 3a, 도 3b), myh1, myh2 및 myh4와 같은 속근 미오신 mRNA는 통계적으로 변화하지 않았다(도 3c, 도 3d).
AUF1에 의한 증가된 근육 생성에 대해 수득된 추가 증거는 증가된 근섬유 재생, 산화 과정 및 미토콘드리아 생물발생의 특징인 발현을 갖는 여러 유전자의 mRNA 수준을 측정함으로써 뒷받침된다. 지근 근섬유에는 특히 산화적 미토콘드리아가 농축되어 있다(Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91(4):1447-1531(2011), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이 연구의 초점은 비복근에 있었는데, 그 이유는 이것이 AUF1 유전자 요법에 대해 중앙값 반응(median response)을 입증하였고, 지근 근섬유의 농축쪽으로 편향되지 않았기 때문이다. AUF1 유전자 전달은 pparα(퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 알파) 또는 six1(Sineoculus homeobox homolog 1)과 같은 비-미토콘드리아 유전자의 비복근 mRNA 수준에는 전혀 영향을 미치지 않았지만, tfam(미토콘드리아 전사 인자 A)에 대해 4배, acadvl(아실-CoA 탈수소효소 매우 긴 사슬)에 대해 6배, nrf1에 대해 3배, 및 nrf2에 대해 2배(핵 호흡 인자)로 미토콘드리아 mRNA 수준을 증가시켰다(도 3e-3h). 미토콘드리아 대 핵 DNA의 비율은 또한 AUF1 유전자 전달에 의해 비복근에서도 증가했고, 이는 유전자 전달 후 40일 및 6개월차에 모두 증가된 미토콘드리아 함량을 나타낸다(도 3i, 도 3j). 종합적으로, 이러한 결과는 AUF1이 속근 근섬유에서 지근 근섬유로의 전이를 촉진한다는 것을 보여준다.
실시예 4 - AUF1은 PGC1α 발현을 증가시켜 부분적으로 지근 근육 발달을 자극한다
증가된 수준의 지근 유형 I 근육 섬유는 증가된 근육 지구력과 연관이 있어 연령에 따른 근육 손실을 방지하기 위해 특히 추구된다. 지근의 주요 특징은 지근 근섬유가 속근 섬유보다 산화 능력이 훨씬 높기 때문에 운동 지구력을 부여한다는 것이다(Cartee 등, "Exercise Promotes Healthy Aging of Skeletal Muscle", Cell Metab. 23(6):1034-1047(2016) 및 Yoo 등, "Role of Exercise in Age-Related Sarcopenia", J. Exerc. Rehabil. 14(4):551-558(2018), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨). 따라서, 지근 근섬유와 속근 근섬유의 다양한 비율을 갖는 여러 근육에서 AUF1 발현 수준을 특성화했다. 지근 근섬유가 더 적은 다른 근육 유형에 비해, 3개월된, 그리고 앉아만 있는 12개월된 비처리 마우스의 비장근에서 auf1 mRNA의 발현 및 AUF1 단백질 수준은 현저하게 2 내지 4배 더 높은 수준이었다(도 4a, 도 4b). 따라서, 하지 골격근 중에서 비장근은 가장 지구력이 좋고, 지근 근섬유가 가장 농축되어 있으며(Schiaffino & Reggiani, "Fiber Types in Mammalian Skeletal Muscles", Physiol. Rev. 91(4):1447-1531(2011) 및 Augusto 등, "Skeletal Muscle Fiber Types in C57BL6J mice," J. Morphol. Sci. 21(2):89-94 (2004), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨), 주요 지근 근섬유 미오신인 myh7을 훨씬 높은 수준으로 발현한다(도 4c). 따라서, 상이한 수준의 미오신 mRNA의 발현에서 AUF1의 역할은 C2C12 마우스 근모세포에서 AUF1의 결실에 의해 평가되었다. AUF1의 결실은 속근 myh2 mRNA 수준의 발현을 증가시킨 반면, myh7 또는 myl2와 같은 지근 미오신 mRNA는 감소했고(도 8a), 이는 지근 근섬유 발달에 AUF1의 더 큰 특이화와 일치한다. 중요한 것으로, 전체 골격근 발달의 주요 전사 조절인자인 근세포 인핸서 인자 2(mef2c) 유전자의 발현도 AUF1 보충에 의해 증가되었다(도 8b). MEF2c는 상이한 근원성 전사 프로그램을 활성화하거나 억제할 수 있고, 그의 증가된 발현은 또한 유형 I 지근 근육의 생성 증가와도 일치하며(Lin 등, "Transcriptional Co-Activator PGC-1 Alpha Drives the Formation of Slow-Twitch Muscle Fibres," Nature 418 (6899):797-801 (2002), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨), 이는 AUF1-매개의 지근 근육 특이화에 관여함을 시사한다.
MEF2c 단백질은 PGC1α(퍼옥시좀 증식인자-활성화된 수용체 감마 공동활성인자 1 알파)의 발현을 자극하여, 지근 근섬유의 특이화 및 발달을 유도한다(Lin 등, "Transcriptional Co-Activator PGC-1 Alpha Drives the Formation of Slow-Twitch Muscle Fibres", Nature 418(6899):797-801(2002), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 근관세포로 분화하도록 유도된 C2C12 근모세포에서 auf1 유전자의 결실은 pgc1α mRNA 수준을 절반으로 감소시켰고 단백질 수준을 4배 감소시켰으며(도 4d), 이는 AUF1이 PGC1α 단백질 및 mRNA 발현을 증가시키는 작용을 한다는 것을 시사한다. 따라서, 마우스에서 AAV8-AUF1 유전자 전달은 pgc1α mRNA 수준이 비복근 및 EDL 근육에서 2 내지 3배 증가했고 12개월된 마우스의 TA 근육에서 상향조절되는 경향이 있음을 보여주었다(도 4e). 18개월된 앉아만 있는 마우스에서 AUF1 유전자 전달은 또한 비복근(도 4e)에서 나타나는 바와 같이, pgc1α mRNA 수준을 약 2.5배까지 강력하게 증가시켰으며, 이는 PGC1α 단백질 수준의 평균 5배 증가에 상응하는 것이었다(도 4f).
pgc1α mRNA는 잠재적인 AUF1-결합 부위일 수 있는 다중 ARE 모티프를 갖는 3' UTR을 함유한다(Lai 등, "Effect of Chronic Contractile Activity on mRNA Stability in Skeletal Muscle", Am. J. Physiol. Cell Physiol. 299(1):C155-163(2010), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 따라서, AUF1이 발현될 때 분화 후 48시간째 WT C2C12 근모세포로부터 대조용 IgG 또는 항-AUF1 항체에 의해 AUF1을 면역침전시켰고, 이어서 qRT-PCR에 의해 결합된 pgc1α mRNA의 수준을 정량했다(도 4g). AUF1은 분화성 C2C12 세포에서 pgc1a mRNA에 강력하게 결합했다. pgc1a mRNA 반감기에 미치는 AUF1 발현의 효과는 새로운 전사를 차단하는 악티노마이신 D의 첨가에 의해 WT 및 AUF1 KO C2C12 세포를 사용하여 결정했다(도 4h). 놀랍게도, AUF1의 부재 하에, pgc1α mRNA는 거의 3배 감소된 안정성을 표시했다. 따라서, pgc1α mRNA는 AUF1에 의해 불안정화되기보다는 안정화되는 ARE-mRNA 부류에 속하며, 이는 부분적으로 AUF1에 의한 지근 섬유 형성의 증가된 특이화 및 PGC1α 단백질 수준 증가를 설명한다. 따라서, AUF1 발현이 특히 지근 근육 손실 및 위축에 미치는 영향을 조사했다.
실시예 5 - AUF1 발현의 손실은 어린 마우스에서 지근 근육의 위축을 선택적으로 가속화한다
지근 근섬유의 형성 및 유지에서 AUF1 유전자 요법의 역할을 더 잘 이해하기 위해, WT 및 AUF1 KO 마우스의 지근 근섬유를 이영양증이 발병하기 전, 3개월차에 조사했다(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity," Cell Rep. 16(5):1379-1390 (2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 3개월차에, WT 및 auf1 KO 마우스는 유사한 체중을 갖는다(도 5a). auf1의 결실은 TA, EDL 또는 비복근의 크기, 색상(미토콘드리아 밀도, 미오글로빈 함량) 또는 중량을 변화시키지 않았지만, 비장근의 크기 및 중량은 3개월차에 절반으로 감소했고, 이는 훨신 창백했고, 이는 미토콘드리아 및 미오글로빈이 풍부한 유형 I 근섬유의 손실을 나타낸다(도 5b; 도 9a). AUF1 KO 마우스 비장근에서 지근 미오신 근섬유의 필드당 비율 및 수는 40 내지 50% 감소되었다(도 5c-5e; 도 9b). 대조적으로, 속근 미오신-발현 근섬유의 비율 및 수는 모두 AUF1 발현의 부재 하에 25% 이상 증가했다(도 5c, 도 5f, 도 5g; 도 9b). 지근 미오신의 감소된 발현은 또한 auf1 KO 마우스에서 auf1 결실된 비복근에서 관찰되었다(도 9c-9e). 또한, 평균 CSA는 비장근 및 비복근에서 나타나는 바와 같이, 지근 근섬유에서 2배 감소했지만, 속근 근섬유에서는 변화가 없었다(도 5h; 도 9f). 이러한 데이터와 일치하게, 비복근 및 비장근에서 나타나는 바와 같이, 3개월차의 AUF1 KO 마우스는 WT 마우스보다 3 내지 4배 더 낮은 수준의 PGC1α 단백질을 발현했다(도 9g). 따라서, AUF1은 지근 근육의 재생 및 유지를 특정한다.
실시예 6 - 노령의 마우스에서 AUF1의 손실은 지근 및 속근 근육 모두의 위축 및 손실을 가속화한다
6개월차에, auf1 KO 마우스는 체중의 20% 손실을 보이며, 이는 주로 골격근 질량의 손실 결과이다(도 6a). 지근 풍부 비장근이 AUF1 발현의 부재 하에 유의미한 위축을 나타내는 유일한 근육인 3개월된 마우스와 달리, 6개월된 마우스에서 속근 풍부 및 지근 풍부 근육 모두는 유의미한 위축을 입증한다. TA, EDL 및 비복근의 크기 및 중량은 WT 동물과 비교하여 auf1 KO에서 약 25% 감소했고, 비장근은 거의 50% 감소했다(도 6b). 또한, auf1 KO 마우스 골격근은 대조군 WT 마우스보다 더창백했으며, 이는 미토콘드리아 밀도가 높은 지근 근섬유의 더 큰 손실과 일치하는 것이다(도 6c). 따라서, 비장근 및 비복근에서 나타나는 바와 같이, 지근 및 속근 근섬유 둘 모두의 평균 CSA는 WT와 비교하여, auf1 KO 마우스에서 6개월에 현저한 감소를 보여주었고, 이는 전체 근섬유 위축을 나타낸다(도 6d, 도 6e). 어린 마우스에서 볼 수 있듯이, AUF1 결핍은 비장근 및 비복근에서 필드당 지근 근섬유의 백분율 및 수를 절반으로 감소시켰다(도 6f-6i). 따라서, AUF1은 지근 근육의 발달을 특정하는 한편, 이의 또 다른 활성은 지근 및 속근 근육 모두의 유지 및 재생에 필수적이며, 이는 노화 동안 근육 손실 및 위축을 겪고 있는 앉아만 있는 동물에서 증가된 전체 근육량 및 기능을 촉진하는 AUF1 유전자 전달의 능력과 일치한다.
실시예 1 내지 6에 대한 논의
이 연구는 3가지 중요한 발견 세트를 보고한다: (1) 골격근에서의 AUF1 발현은 앉아만 있는 마우스에서 노화와 함께 손실되며, 이는 연령-관련 근육 위축의 발달에 기여한다; (2) AUF1 유전자 요법은 연령에 따라 근육량과 근력의 손실을 지연시키거나 역전시키는 유망한 치료적 개입이다; (3) AUF1은 지근 및 속근 근섬유 모를 형성하는데 필요하지만, PGC1α의 mRNA의 안정화를 통해 PGC1α 수준을 증가시켜 속근에서 지근 표현형으로의 전이를 촉진한다. AUF1은 일반적으로 ARE 함유 mRNA의 빠른 붕괴를 촉진하지만, 다른 ARE-mRNA의 하위세트는 안정화할 수 있다(Moore 등, "Physiological Networks and Disease Functions of RNA-Binding Protein AUF1," Wiley Interdiscip. Rev. RNA 5(4):549-564 (2014), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 근육 재생 동안, AUF1은 따라서 수명이 짧은 근원성 체크포인트 ARE-mRNA의 선택적 분해를 통해 근육발생의 각 단계를 프로그래밍함으로써 부분적으로 위성 세포 유지 및 분화를 조절한다(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity," Cell Rep. 16(5):1379-1390 (2016) 및 Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-Mediated Stage-Specific Degradation of Fate-Determining Checkpoint mRNAs," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116(23):11285-11290 (2019), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 또한, 여기서 나타나는 바와 같이, 유전자 전달을 사용하여 앉아만 있는 마우스에서 AUF1 발현 수준을 증가시키면, AUF1은 속근 근섬유 형성 및 산화적 표현형을 촉진하는 미오신 및 산화적 미토콘드리아 유전자 발현을 증가시킨다. 또한, 노화에 의해 인간 골격근에서 AUF1 발현이 감소한다는 증거도 있지만(Masuda 등, "Tissue- and Age-Dependent Expression of RNA-Binding Proteins that Influence mRNA Turnover and Translation," Aging (Albany NY) 1:681-698 (2009), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨), 일련의 연령과 관련되지만, 정상적인 근육 표본을 수득하는 것의 일반적인 불능은 이러한 발견을 확장하는 능력을 제한한다.
AUF1이 있는 골격근의 AAV8-AUF1에 의한 유전자 요법은 유의미한 근육 손실 및 위축을 갖는 중간 연령의 운동하지 않은 마우스에서 새로운 근육량 및 운동 지구력을 유의미하게 촉진시켰다. 특히, 증가된 신체 운동 지구력의 골격근 마커를 특성화하도록 설계된 래트 모델에서 발현이 증가되는 것으로 밝혀진 2가지 주요 인자는 AUF1 및 PGC1α였다(Lai 등, "Effect of Chronic Contractile Activity on mRNA Stability in Skeletal Muscle", Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 299(1):C155-163(2010), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 더욱이, 마우스에서의 운동 연구에 따르면, 1주일의 운동은 PGC1α의 증가된 수준을 유도한 반면, 4주간의 운동 후에는 다른 ARE-결합 단백질의 변화 없이 AUF1이 50%만큼이나 증가했다(Matravadia 등, "Exercise Training Increases the Expression and Nuclear Localization of mRNA Destabilizing Proteins in Skeletal Muscle," Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 305(7):R822-831 (2013), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
흥미롭게도, pgc1α, tfam 및 nrf2 mRNA는 모두 이들의 3'URT에, AUF1을 비롯한 ARE 결합 단백질(D'Souza 등, "mRNA Stability as a Function of Striated Muscle Oxidative Capacity," Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 303(4):R408-417 (2012), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)에 의해 조절 받을 수 있는 ARE를 함유한다. 이 시기에는 당혹스러웠지만, AUF1은 안정화가 아닌 ARE-mRNA 붕괴를 일으키는 것으로만 알려져 있었다. 이러한 발견은 본원에 개시된 결과와 조합했을 때 AUF1이 pgc1αmRNA의 안정화를 통해, 그리고 다른 AUF1 활성을 통해서도 근육 재생을 촉진하는 공급물-정방향(feed-forward) 메커니즘을 프로그램한다는 것을 시사한다(Chenette 등, "Targeted mRNA Decay by RNA Binding Protein AUF1 Regulates Adult Muscle Stem Cell Fate, Promoting Skeletal Muscle Integrity," Cell Rep. 16(5):1379-1390 (2016) 및 Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-Mediated Stage-Specific Degradation of Fate-Determining Checkpoint mRNAs," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116(23):11285-11290 (2019), 이들의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 결론과 일치하는 것으로서, 본원에 사용된 AUF1 KO 마우스는 어린 나이에 지근 근섬유 크기의 감소 및 PGC1α 발현의 감소된 수준을 제시한다.
AUF1 근육 보충이 PGC1α 단백질 수준을 증가시켰다는 것은 중요하다. PGC1α는 지근 근육 섬유의 형성, 근육 피로 감소 및 더 큰 산화 대사에 필수적인 미토콘드리아 생물발생을 촉진하는 NRF 및 Tfam과 같은 하류 인자의 발현을 활성화한다(Lin 등, "Transcriptional Co-Activator PGC-1 Alpha Drives the Formation of Slow-Twitch Muscle Fibres," Nature 418(6899):797-801 (2002), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이러한 발견은 AUF1 보충에 의해 관찰된 강화된 미토콘드리아 DNA 함량과 함께, AUF1이 마우스에서 지근 근섬유 유지 및 운동 지구력 증가의 핵심 활성에 책임이 있음을 시사한다. 이전 연구는 근육 손상 복구 및 혈관형성에서 PGC1α 발현 증가의 이점을 보여주었다(Wiggs, M. P., "Can Endurance Exercise Preconditioning Prevention Disuse Muscle Atrophy?," Front. Physiol. 6:63 (2015); Wing 등, "Proteolysis in Illness-Associated Skeletal Muscle Atrophy: From Pathways to Networks," Crit. Rev. Clin. Lab. Sci. 48(2):49-70 (2011); Bost & Kaminski, "The Metabolic Modulator PGC-1alpha in Cancer," Am. J. Cancer Res. 9(2):198-211 (2019); Dos Santos 등, "The Effect of Exercise on Skeletal Muscle Glucose Uptake in type 2 Diabetes: An Epigenetic Perspective," Metabolism 64(12):1619-1628 (2015); Haralampieva 등, "Human Muscle Precursor Cells Overexpressing PGC-1alpha Enhance Early Skeletal Muscle Tissue Formation," Cell Transplant 26(6):1103-1114 (2017); 및 Janice Sanchez 등, "Depletion of HuR in Murine Skeletal Muscle Enhances Exercise Endurance and Prevents Cancer-Induced Muscle Atrophy," Nat. Commun. 10(1):4171 (2019), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨).
따라서, AUF1 골격근 유전자 전달은 근발생의 다수의 핵심 단계를 가능하게 하는 데 필요하기 때문에 근육 손실 및 위축에 대항하는 데 유익하다. AUF1은 노화된 앉아만 있는 근육에서 더 큰 근육 발달과 신체 운동 능력을 자극하며, 이는 결국 운동 자체의 결과로서의 AUF1 발현을 추가로 자극할 가능성이 있다. 또한, AUF1 유전자 전달의 효과는 장기 지속적인 것으로 보인다. 본원에 개시된 연구에서 개선된 운동 지구력은 AUF1 발현 또는 효능의 감소에 대한 증거가 전혀 없이 유전자 전달 시점(테스트된 마지막 시점) 이후로 적어도 6개월 동안 지속되는 것으로 밝혀졌다. 이와 관련하여, AUF1 보충은 또한 Pax7+ 활성화된 위성 세포 및 근모세포의 수준을 증가시켰으며, 이는 근육 줄기 세포로의 유전자 전달 및 활성 근발생 과정을 시사한다.
AUF1과는 별도로, 다른 ARE RNA-결합 단백질도 근발생 과정에 관여하는 것으로 나타났다. 본원에 개시된 연구와 특히 관련이 있는 것으로, HuR은 최근 pgc1α mRNA를 불안정하게 하여, 유형 II 근섬유의 형성을 초래하는 것으로 밝혀졌다(Janice Sanchez 등, "Depletion of HuR in Murine Skeletal Muscle Enhances Exercise Endurance and Prevents Cancer-Induced Muscle Atrophy," Nat. Commun. 10(1):4171 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). AUF1 및 HuR은 종종 본원에 개시된 발견과 일치하는, ARE-mRNA 안정성에 대해 반대 효과를 가지며, 둘 모두 근섬유 특이화의 유지에 필수적이라는 점은 주목할 만하다. 잠재적인 기능적 결과는 알려지지 않았지만, AUF1은 또한 HuR과 상호작용할 수 있으며, AUF1은 또한 AUF1 매개 mRNA 붕괴 ARE-mRNA 해독을 차단하는 TIA-1과 ARE에 결합하기 위해 경쟁할 수 있다(Pullmann 등, "Analysis of Turnover and Translation Regulatory RNA-Binding Protein Expression Through Binding to Cognate mRNAs," Mol. Cell Biol. 27(18):6265-6278 (2007), 이의 전문은 본원에 참고로 포함됨). 분명한 것으로, 근발생에서 ARE 결합 단백질의 역할은 복잡하며, 이러한 복잡성을 더 잘 이해하기 위해서는 이들의 조합된 활성에 대한 추가 조사가 필요하다. 근육 항상성이 다른 ARE 결합 단백질과 함께 AUF1에 의해 조절되는 방식은 아직 밝혀지지 않았다.
마지막으로, AUF1이 유형 I 지근 근섬유 발달을 특정하지만, 또한 전반적인 근발생 재생 프로그램을 촉진하고 재프로그래밍한다는 점을 주목하는 것이 중요하며(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-Mediated Stage-Specific Degradation of Fate-Determining Checkpoint mRNAs," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 116(23):11285-11290 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨), 이는 AUF1 골격근 유전자 전달이 비정상적인 근육 발달, 근육 섬유 유형의 비정상적인 균형 또는 근육 과성장을 초래하지 않았다는 사실에 의해 입증된다.
실시예 7 - AUF1은 뒤센 근이영양증(DMD) 마우스에서 골격근 질량 및 기능을 복원한다
뒤센 근이영양증(DMD)의 마우스 모델에서 골격근 질량 및 기능에 대한 AUF1 유전자 요법의 효과를 조사하기 위해, 모든 AUF1 기능을 수행하는 전체 길이의 p45 AUF1 이소형에 대한 cDNA를, 높은 골격근 특이성을 제공하는 MCK(근육 크레아틴 키나제) 프로모터의 절두된 조절 영역에 AAV8-tMCK-IRES-eGFP 2RS5 인핸서 서열(3-Ebox)이 결찰되어 있는, AAV8 벡터에 tMCK 프로모터(AAV8-tMCK-AUF1-IRES-eGFP)(Vector Biolabs)의 제어 하에 클로닝했다.
AAV8 AUF1-GFP 및 AAV8 GFP 대조군 벡터의 형질도입 빈도는 경골 및 근육 GFP 염색에 의해 mdx 마우스에서 평가되었다(도 11a). 대조군 AAV8 GFP와 치료 AAV8 AUF1 GFP 군 간에는 형질도입 효율의 통계적 차이가 관찰되지 않았다(도 11b).
AUF1 보충이 mdx 마우스에서 근육 질량 및/또는 지구력을 향상시키는지 여부를 결정하기 위해, 1개월된 C57Bl10 및 mdx 마우스에 AAV8-AUF1-GFP 또는 대조군 AAV8-GFP 벡터를 2x1011 게놈 카피로 안와후 주사에 의해 투여했다(도 12a-12f 및 도 13a-13d). 마우스의 체중을 재고 2개월 동안 모니터링했다. AAV8 AUF1-GFP 보충된 mdx 마우스는 대조군 mdx 마우스와 비교하여 평균 체중이 유의미하게 증가했다(도 12a). 더욱이, AAV8 AUF1-GFP 처리된 mdx 마우스는 대조군 AAV8 GFP 처리된 mdx 마우스와 비교할 때, 전방 경골(TA) 근육 질량의 10% 증가 및 장지신근(EDL) 근육 질량의 11% 증가를 입증했다(도 12b). 대조군 AAV8 GFP 처리된 mdx 마우스와 비교하여, AUF1 보충된 mdx 마우스는 지대형 골격근력 및 지구력의 척도인 그리드 매달림 시간에서 약 40% 개선을 보여주었다(도 12c). 트레드밀로 테스트했을 때, AAV AUF1-GFP mdx 마우스는 16% 더 높은 최대 속도(도 12d), 35% 더 긴 소진 시간(도 12e) 및 37% 증가된 소진 거리(도 12f)를 표시했다. 이러한 데이터는 AUF1 유전자 전달의 결과로서 mdx 마우스에서 운동 수행도 및 지구력의 실질적이고 통계적으로 유의미한 증가를 증명한다. mdx 마우스와 대조적으로, AAV8 AUF1-GFP 처리된 WT 마우스에서는 동일한 유전자 배경의 대조군 AAV8 GFP 처리된 마우스와 비교 시, 체중(도 13a), 트레드밀 소진 시간(도 13b), 최대 속도(도 13c), 또는 소진 거리(도 13d)의 유의미한 증가가 전혀 없었다.
mdx 마우스에서 AUF1 과발현은 또한 횡격막 이영양증 표현형을 호전시켰다(도 15a-15b). 퇴행성 횡격막 근육 퍼센트는 대조군 AAV8 GFP 처리된 mdx 마우스와 비교 시, AAV8 AUF1-GFP 처리된 mdx 마우스에서 74% 감소되었다(도 15a). AUF1 유전자 전달은 또한 대조군 AAV8 GFP 처리된 mdx 마우스와 비교하여 AAV8 AUF1-GFP 처리된 mdx 마우스에서 횡격막 섬유증(도 15b) 및 대식세포 침윤(도 16a-16b)을 유의미하게 감소시켰다.
근섬유 중심핵형성 및 배아 미오신 중쇄(eMHC) 발현을 포함하는 근이영양증의 조직학적 징후를 테스트하였다. mdx 마우스에서 증가된 것으로 밝혀진 중심핵 및 eMHC 양성 섬유의 퍼센트는 AUF1 보충 시 고도로 하향조절되었다(도 17a-17d). 중심핵 근섬유의 크기는 또한 AUF1 보충 시 증가하였다(도 17e).
DMD의 진단을 돕기 위해 사용된 근초 누출의 척도인 크레아틴 키나제(CK) 활성의 혈청학적 수준은 대조군 mdx 마우스에서 증가된 것으로 발견되었지만, CK 활성은 mdx 마우스에서 AUF1 보충 시 크게 감소하였다(도 14).
유트로핀 발현은 또한 시험관내 및 생체내에서 평가되었다. 시험관내에서, 근관세포로 분화된 WT C2C12 근모세포만이 유트로핀 mRNA 및 단백질의 증가를 제시한다. AUF1 유전자 요법은 유트로핀의 발현을 강력하게 증가시켰고 벡터 단독을 투여받은 대조군 mdx 마우스에 비해 mdx 마우스에서 근섬유 완전성의 정상화에 대한 증거를 보여주었다(도 18a-18c). AAV8 AUF1 유전자 전달은 벡터만을 투여받은 대조군 mdx 마우스에 비해, mdx 마우스에서 위성 세포 활성화 유전자 Pax7(도 19a), 주요 근육 재생 유전자 pgc1α 및 mef2c(도 19a), 지근 결정 유전자(도 19b) 및 미토콘드리아 DNA 함량(도 19c)의 발현을 증가시켰다.
C2C12의 AUF1 활성화가 근모세포 근육 섬유 발달을 활성화하는지 여부를 평가하기 위해 게놈 전체의 전사체 및 해독체 연구를 수행하였다(도 20). 이들 연구는 AUF1 보충이 (i) 주요 근육 발달 경로의 발현을 자극하고 염증성 사이토카인, 염증, 세포 증식, 세포 사멸 및 항-근육 재생 경로의 발현을 감소시키고(도 21a-21b); (ii) 근육 발달 및 재생에서 주요 생물학적 과정 및 분자 기능에 대한 경로를 상향 조절하고(도 22a-22b); (iii) 근육 염증, 염증성 사이토카인 및 근육 재생에 반대하는 신호전달 경로를 감소시키고(도 23a-23b); 그리고 (iv) 섬유증의 발달과 연관된 근육 유전자의 발현을 감소시킨다(도 24)는 것을 입증한다.
실시예 7의 논의
디스트로핀 유전자 요법
전술한 바와 같이 DMD는 디스트로핀 유전자의 돌연변이에 의해 유발되어 근육 세포막의 안정화에 핵심적인 역할을 하는 단백질의 부재에 가까운 발현을 초래한다(Bonilla 등, "Duchenne Muscular Dystrophy: Deficiency of Dystrophin at the Muscle Cell Surface," Cell 54(4):447-452 (1988) 및 Hoffman 등, "Dystrophin: The Protein Product of the Duchenne Muscular Dystrophy Locus," Cell 51(6):919-928 (1987), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 디스트로핀 유전자는 매우 크기 때문에 전체 유전자를 유전자 요법으로 재도입하는 것은 불가능하다. 따라서, 현행 유전자 요법 시도는 유전자 전달에 의해 "미니" 및 "마이크로" 디스트로핀 유전자, 즉 AAV 벡터에 포장된 디스트로핀 유전자의 작은 조각을 도입시키는 것을 수반한다. 지금까지 매우 효과적인 것으로 밝혀진 것은 없으며, 미니 및 마이크로 디스트로핀 유전자가 개인의 디스트로핀 유전자와 상이하기 때문에, 이들이 치료 유전자에 대한 면역 반응을 유발한다는 증거는 있다. DMD에서 디스트로핀은 돌연변이되기 때문에, 현재 중복 기능을 갖는 유트로핀으로 알려진 디스트로핀 동족체의 발현을 증가시키는 방법을 찾는 데 큰 관심이 있다. 지금까지 이것은 효과적인 것으로 볼 수 있는 치료 수준으로 달성된 적은 없다.
DMD mdx 마우스 모델
가장 널리 사용되는 DMD mdx 마우스(C57BL/10 배경)는 DMD 수컷의 대략 13%에서 발생하는 것과 유사한, 매우 큰 디스트로핀 mRNA의 엑손 23에서 넌센스 돌연변이(조기 정지 코돈)를 초래하는 자발적인 유전자 돌연변이를 가지고 있다(Bulfield 등, "X Chromosome-Linked Muscular Dystrophy (mdx) in the Mouse," Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(4):1189-1192 (1984), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이 mdx 마우스 모델은 DMD 조사 및 치료제 연구에 광범위하게 사용되었으며 DMD 연구를 위한 "최적 표준" 동물 모델인 것으로 간주된다. C57BL/10 mdx 마우스는 인간만큼 신체 근육 손상에 민감하고 특정 조직(횡격막, 심장 근육)의 인간 질환을 반영하지만, 골격근 손상에는 덜 민감하다(Moens 등, "Increased Susceptibility of EDL Muscles from mdx Mice to Damage Induced by Contractions with Stretch," J. Muscle Res. Cell. Motil. 14(4):446-451 (1993), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 인간에서와 같이, mdx 마우스에도 나이가 들수록 골격근에 질병이 진행한다(Moens 등, "Increased Susceptibility of EDL Muscles from mdx Mice to Damage Induced by Contractions with Stretch," J. Muscle Res. Cell. Motil. 14(4):446-451 (1993), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 마찬가지로 중요한 것으로, mdx 마우스에서 근병증의 표적으로서 횡격막은 인간에게서 볼 수 있는 손상 수준 및 비율을 매우 정확하게 재현하는 것으로 나타났으며 치료적 개입의 효과에 대한 탁월한 판독정보이다(Stedman 등, "The mdx Mouse Diaphragm Reproduces the Degenerative Changes of Duchenne Muscular Dystrophy," Nature 352(6335):536-539 (1991), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
중요하게는, mdx 마우스 및 DMD 환자는 둘 모두가 질병 진행을 촉진하는 근섬유의 괴사 및 재생 주기 후에 위성 세포를 고갈시킨다(Manning & O'Malley, "What has the mdx Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy Contributed to our Understanding of this Disease?" J. Muscle Res. Cell Motil. 36(2):155-167 (2015) 및 Coley 등, "Effect of Genetic Background on the Dystrophic Phenotype in mdx Mice," Hum. Mol. Genet. 25(1):130-145 (2016), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 더욱이, mdx 마우스 및 DMD 환자는 둘 모두가 질병 진행에 의해 증가하는 염증 반응을 발달시킨다(Manning & O'Malley, "What has the mdx Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy Contributed to our Understanding of this Disease?" J. Muscle Res. Cell Motil. 36(2):155-167 (2015) 및 Coley 등, "Effect of Genetic Background on the Dystrophic Phenotype in mdx Mice," Hum. Mol. Genet. 25(1):130-145 (2016), 이들 전체는 본원에 참고로 포함됨).
골격근 이영양증 질환이 인간보다 mdx 마우스에서 일반적으로 더 경증이라는 사실에도 불구하고, 이는 여전히 특히 횡격막 질환의 진행과 연계될 때 약리학적 반응에 대한 예측 모델을 제공한다. 따라서, mdx 마우스는 DMD 임상 시험을 위한 개입 작용제의 전략 개발에 유용한 것으로 입증된 동물에서 질병 진행 및 치료 반응을 따르는 신뢰할 수 있고 잘 확립된 예측 모델을 제공한다(Fairclough 등, "Davies, Pharmacologically Targeting the Primary Defect and Downstream Pathology in Duchenne Muscular Dystrophy," Curr. Gene Ther. 12(3):206-244 (2012) 및 Stedman 등, "The mdx Mouse Diaphragm Reproduces the Degenerative Changes of Duchenne Muscular Dystrophy," Nature 352(6335):536-539 (1991), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 더욱이, 연구에 따르면 mdx 마우스가 자발적인 운동(휠 러닝, 트레드밀)에 참여하게 하면, 인간과 유사한 신체적 스트레스로 인한 미세파열의 도입으로 인해 골격근 질환이 증가하는 것으로 나타났다(Smythe 등, "Voluntary Wheel Running in Dystrophin-Deficient (mdx) Mice: Relationships Between Exercise Parameters and Exacerbation of the Dystrophic Phenotype," PLoS Curr. 3:RRN1295 (2011); Nakae 등, "Quantitative Evaluation of the Beneficial Effects in the mdx Mouse of Epigallocatechin Gallate, an Antioxidant Polyphenol from Green Tea," Histochem. Cell Biol. 137(6):811-27 (2012); 및 Archer 등, "Persistent and Improved Functional Gain in mdx Dystrophic Mice after Treatment with L-Arginine and Deflazacort," FASEB J. 20(6):738-740 (2006), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 따라서, 치료 평가 및 임상 개발을 위한 모델을 구성하는 mdx 마우스에서 대표적인 인간 골격근 질환 형태를 생성하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 방법은 있다.
AUF1 유전자 요법
실시예 7의 결과는 근육 세포 특이적 AUF1 유전자 요법이 뒤센 근이영양증의 마우스 모델에서 골격근 질량 및 기능을 회복시킨다는 것을 입증한다. 특히, 제공된 DMD mdx 모델에서 근육 세포 특이적 유전자 요법의 평가는 AAV8 벡터화 AUF1 유전자 요법이 (1) 심장 횡격막을 포함하는 골격근을 효율적으로 형질도입하고 6개월(테스트된 가장 긴 시점) 동안 발현 손실의 증거 없이 장기간 AUF1 발현을 제공함; (2) 높은 수준의 위성 세포 및 근모세포를 활성화함; (3) 골격근 질량 및 정상적인 근섬유 형성을 유의미하게 증가시킴; (4) 운동 지구력을 유의미하게 향상시킴; (5) DMD 마우스에서 바이오마커 또는 근육 위축 및 근육 세포 사멸을 강력하게 감소시킴; (6) 횡격막을 포함하는 골격근에서 염증성 면역 세포 침범을 강력하게 감소시킴; (7) 횡격막을 포함한 골격근에서 근섬유증 및 괴사를 강력하게 감소시킴; (8) DMD에서 근육 퇴행의 마커인 배아 디스트로핀의 발현을 억제하면서 DMD 근육 세포에서 내인성 유트로핀의 발현을 강력하게 증가시킴; (9) 모두 근육 발달 및 재생에 관여하고 근육 세포 섬유증, 사멸 및 근육 발현 염증성 사이토카인에 관여하는 유전자를 억제하는 많은 유전자 군의 정상 발현을 증가시킴; 및 (10) 정상 골격근에서 근육량, 지구력을 증가시키거나 위성 세포를 활성화시키지 않음을 입증했다. AUF1 골격근 특이적 유전자 요법의 이상 효과는 전혀 관찰되지 않았다.
실시예 8 - AUF1 유전자 요법은 근육 손상 마우스에서 골격근 재생을 가속화한다
BaCl2 유도 괴사의 마우스 모델(Garry 등, "Cardiotoxin Induced Injury and Skeletal Muscle Regeneration," Methods Mol. Biol. 1460:61-71 (2016) 및 Tierney 등, "Inducing and Evaluating Skeletal Muscle Injury by Notexin and Barium Chloride," Methods Mol. Biol. 1460:53-60 (2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)은 AUF1 유전자 요법이 골격근 재생을 가속화하는지 여부를 조사하는 데 사용했다.
이 연구에서, 3개월된 수컷 마우스에게 대조군 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 p45 AUF1 벡터(Abbadi 등, "Muscle Development and Regeneration Controlled by AUF1-mediated Stage-specific Degradation of Fate-determining Checkpoint mRNAs," Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 116:11285-90 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨)가 있는 멸균 식염수 중 여과된 1.2% BaCl2 50μl의 근육내 주사를 왼쪽 경골 전방(TA) 근육 내로 투여했다. 오른쪽 TA 근육은 대조군으로서 손상되지 않은 상태로 유지되었다.
근육 위축은 절제된 TA 근육의 중량에 의해 결정되었다. 주사 후 7일차에 희생된 마우스에서, TA 손상은 TA 중량을 27% 감소시켰고, 이는 동시 AUF1 유전자 요법에 의해 거의 손상되지 않은 수준으로 회복되었다(도 25a). p45 AUF1 유전자 전달은 렌티바이러스 형질도입된 근육에서 AUF1 발현을 수 배 증가시켰는데(도 25b), 이는 근육 손상 후 강력하게 증가하지만 AUF1 유전자 전달에 의해 거의 손상되지 않은 수준으로 감소된, 근육 위축의 2가지 확립된 바이오마커인 TRIM63 및 Fbxo32의 감소된 발현과 연관되어 있었다(도 25d). 강력한 근육 재생은 TA 근육에서 위성 세포 활성화와 일치하는 유전자인 PAX7의 강력한 활성화와 일치했다(도 25c). p45 AUF1 유전자 전달은 또한 MyoD 및 미오게닌(도 26a), myh8(도 26b), myh7(도 26c) 및 myh4(도 26d)와 같은 근육 재생 인자(MRF)의 발현을 유의미하게 향상시켰다.
근육 섬유의 이미지는 대조군 벡터 마우스에서 볼 수 없었던 렌티바이러스 AUF1이 투여된 동물에서 근섬유의 가속화되었지만 정상적인 근육 재생에 대한 추가 증거를 제공한다. 벡터 단독의 TA 근육에서 붕괴된 근섬유 구조 및 높은 수준의 중심핵은 렌티-AUF1 보충과 비교하여 관찰되었다(도 27a). 유사하게, 모의 유전자 요법을 투여받은 손상된 TA 근육은 손상 후 3일차에 20%의 질량 손실을 지속하였고, 이는 7일차에 단지 매우 약간 개선되었다(도 27b). 대조적으로, AUF1 유전자 요법을 투여받은 손상된 TA 근육은 3일차에 위축이 감소하는 경향을 보였고, 이는 7일차에 거의 완전히 회복되어, 거의 정상 질량을 입증했다(도 27b). 가속화된 근육 재생은 CSA의 현저한 증가 및 근섬유당 중심 핵 감소에 의해 나타나는 바와 같이, 성숙한 근섬유를 생성했다(도 27c-27d).
마지막으로, 본원에 기재된 기술의 당사자로서 개발된 유도성 AUF1 조건부 녹아웃 마우스(도 28a-28d)를 사용하면, 골격근에서만 선택적 AUF1 결실이 외상성 손상 후 근육 재생을 촉진하는 데 있어 AUF1 발현이 필수 요건임을 입증하였고(도 28e), AAV8 AUF1 유전자 요법으로서 전달했을 때 광범위한 손상으로부터 근육을 보호하는 능력을 입증하였다(도 28e). 특히, 1.2% BaCl2 주사에 의해 손상된 마우스의 TA 근육은 주사 7일차에 근육 위축에 대해 평가되었다. AUF1을 발현하는 AUF1Flox/Flox x PAX7creERT2 마우스 및 AUF1을 발현하는 WT 마우스(cre에 대해 유도되지 않음)의 TA 근육은 통계적으로 상이하지 않은 16 내지 18% 위축을 나타냈다(도 28e). 대조적으로, AUF1 유전자의 결실은 TA 근육의 위축을 강력하게 증가시켜 위축 수준을 35%로 2배화시켰다(도 28e). 그러나, AUF1 유전자가 결실되었지만 AAV8 AUF1 유전자 요법이 예방적으로 투여된 동물은 평균 약 3%인 급감된 수준의 TA 근육 위축을 입증하였다(도 28e). AUF1 결실된 마우스는 지대형 골격근력 및 지구력의 척도인 악력에 대해 5개월차에 테스트했다. AUF1 결실된 마우스는 악력의 약 50% 감소를 보여주었다(도 28f).
종합적으로, 이들 데이터는 AUF1이 손상 후 근력 및 근육 재생의 유지에 필수적이며, AUF1 유전자 요법이 근육 재생을 촉진하고 외상성 손상에도 불구하고 광범위한 손상으로부터 근육을 보호하는 놀라운 능력을 제공한다는 것을 입증한다.
실시예 8의 논의
크거나, 심각하거나, 외상성 근육 손상은 선천적으로 근육을 복구하고 재생하는 신체의 기존 근육 복구 메커니즘을 압도하여, 영구적인 근육 손상, 근육 복구 능력 불량, 근육 손실 및 기능 장애를 초래하는 부피 근육 손실(VML)을 초래할 수 있다(Grogan 등, "Volumetric Muscle Loss," J. Am. Acad. Orthop. Surg. 19(Suppl 1):S35-7 (2011); Sicherer 등, "Recent Trends in Injury Models to Study Skeletal Muscle Regeneration and Repair," Bioengineering (Basel) 7 (2020); Qazi 등, "Cell Therapy to Improve Regeneration of Skeletal Muscle Injuries," J. Cachexia Sarcopenia Muscle 10:501-16 (2019); 및 Garg 등, "Volumetric Muscle Loss: Persistent Functional Deficits Beyond Frank Loss of Tissue," J. Orthop. Res. 33:40-6 (2015), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 외상성 골격근 손상은 군 복무, 스포츠 또는 일상 생활에서의 단순한 사고 여부에 관계없이 가장 흔한 손상이다(Copland 등, "Evidence-Based Treatment of Hamstring Tears," Curr. Sports Med. Rep. 8:308-14 (2009), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 외상성 손상은 전형적으로 근육 괴사 및 만성 염증을 초래하며, VML로 진행하면 20% 이상 회복 불가능하게 근육을 고갈시킬 수 있으며, 이는 섬유성 흉터 조직으로 대체되고 고착되어 장기적인 장애를 초래한다(Copland 등, "Evidence-Based Treatment of Hamstring Tears," Curr. Sports Med. Rep. 8:308-14 (2009) 및 Jarvinen 등, "Muscle Injuries: Biology and Treatment," Am. J. Sports Med. 33:745-64 (2005), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 사실, 사고 또는 군대 부상으로 인한 개방 골절은 미국 민간인 인구에서만 연간 150,000건 이상 발생하는 것으로서, 심각하고 잘 치유되지 않는 근육 부상의 대부분(65%)에 원인인 것으로, 많은 경우 인구의 8% 만큼에서 영구적인 기능 장애를 초래한다(Owens 등, "Characterization of Extremity Wounds in Operation Iraqi Freedom and Operation Enduring Freedom," J. Orthop. Trauma 21:254-7 (2007); Corona 등, "Volumetric Muscle Loss Leads to Permanent Disability Following Extremity Trauma," J. Rehabil. Res. Dev. 52:785-92 (2015); 및 Court-Brown 등, "The Epidemiology of Tibial Fractures," J. Bone Joint Surg. Br. 77:417-21 (1995), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
골격근 손상 시, 정상적으로 휴지기의 근육 위성 세포는 기저판의 틈새에서 방출되고, 활성화되어 증식하기 시작한다(Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function," Development 142:1572-81 (2015), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 전형적으로, 휴지기 위성 세포의 활성화는 근육 섬유에 대한 미세 손상으로 인해 발생하지만(Murphy 등, "Satellite Cells, Connective Tissue Fibroblasts and their Interactions are Crucial for Muscle Regeneration," Development 138:3625-37 (2011); Carlson 등, "Loss of Stem Cell Regenerative Capacity within Aged Niches," Aging Cell 6:371-82 (2007); Collins 등, "Stem Cell Function, Self-Renewal, and Behavioral Heterogeneity of Cells from the Adult Muscle Satellite Cell Niche," Cell 122:289-301 (2005); Gopinath 등, "Stem Cell Review Series: Aging of the Skeletal Muscle Stem Cell Niche," Aging Cell 7:590-8 (2008); Seale 등, "A New Look at the Origin, Function, and "Stem-Cell" Status of Muscle Satellite Cells," Dev Biol 218:115-24 (2000); 및 Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function," Development 142:1572-81 (2015), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨), 광범위한 손상 시에는 위성 세포의 만성 방출 및 활성화가 있고, 이는 기능적으로 소진되고 심지어 이러한 상황에서 고갈될 수 있다.
위성 세포는 성인 골격근 세포의 약 2 내지 4%를 포함하는 근육 세포의 작은 집단이다. 소수의 위성 세포만이 자가 재생되어 휴지기 상태로 돌아가는 반면, 나머지는 근모세포라고 하는 근육 전구 세포로 분화한다. 근모세포는 기존의 손상된 근육 섬유(근섬유)와의 융합을 포함하는 프로그램인 근발생(근육 발달)을 거쳐 새로운 근육을 복구하고 재생시킨다(Gunther 등, "Myf5-Positive Satellite Cells Contribute to Pax7-Dependent Long-Term Maintenance of Adult Muscle Stem Cells," Cell Stem Cell 13:590-601 (2013), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 그러나, 외상성 근육 손상은 손상된 근육 섬유를 복구하는 근발생 프로그램의 능력을 쉽게 초과할 수 있다.
새로 생성된 근섬유는 2가지 범주 중 하나에 속한다: 운동 속도, 대사 유형 및 미오신 유전자 발현에 따라 정의되는 지근(유형 I) 또는 속근(유형 II) 섬유. 유형 II 근섬유는 외상성 손상에 대한 반응으로 가장 먼저 위축되는 반면, 지근 근섬유는 더 탄력적이다(Arany, Z. "PGC-1 Coactivators and Skeletal Muscle Adaptations in Health and Disease," Curr. Opin. Genet. Dev. 18:426-34 (2008) 및 Wang 등, "Mechanisms for Fiber-Type Specificity of Skeletal Muscle Atrophy," Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care 16:243-50 (2013), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 일반적으로 골격근 재생을 자극하고 특히 더 탄력 있는 지근 근육을 선택적으로 촉진하는 능력은, 이것이 외상성 근육 손상 및 다양한 형태의 근이영양증에 대한 잠재적으로 효과적인 치료법일 수 있기 때문에, 재생 근육 생물학 및 임상 실습의 오랜 목표였다(Ljubicic 등, "The Therapeutic Potential of Skeletal Muscle Plasticity in Duchenne Muscular Dystrophy: Phenotypic Modifiers as Pharmacologic Targets," FASEB J. 28:548-68 (2014), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 위성 세포가 노화될 때, 또는 괴사-재생의 만성 주기를 초래하는 외상성 근육 손상 시, 위성 세포는 자신의 재생 능력을 상실하고 재활성화하기 어렵다(Bernet 등, "p38 MAPK Signaling Underlies a Cell-Autonomous Loss of Stem Cell Self-Renewal in Skeletal Muscle of Aged Mice," Nat. Med. 20:265-71 (2014); Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function," Development 142:1572-81 (2015); Kudryashova 등, "Satellite Cell Senescence Underlies Myopathy in a Mouse Model of Limb-Girdle Muscular Dystrophy 2H," J. Clin. Invest. 122:1764-76 (2012); and Silva 등, "Inhibition of Stat3 Activation Suppresses Caspase-3 and the Ubiquitin-Proteasome System, Leading to Preservation of Muscle Mass in Cancer Cachexia," J. Biol. Chem. 290: 1177-87 (2015), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
큰 손상 또는 외상성 손상에서 근육 퇴행 및 재생 주기는 기능적 소진 및 심지어 근육 재생 및 복구에 필수적인 근육 줄기 세포의 손실까지 초래할 수 있고(Carlson 등, "Loss of Stem Cell Regenerative Capacity within Aged Niches," Aging Cell 6:371-82 (2007); Shefer 등, "Satellite-Cell Pool Size does Matter: Defining the Myogenic Potency of Aging Skeletal Muscle," Dev. Biol. 294:50-66 (2006); Bernet 등, "p38 MAPK Signaling Underlies a Cell-Autonomous Loss of Stem Cell Self-Renewal in Skeletal Muscle of Aged Mice," Nat. Med. 20:265-71 (2014); 및 Dumont 등, "Intrinsic and Extrinsic Mechanisms Regulating Satellite Cell Function," Development 142:1572-81 (2015), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨), 결과적으로 근육 재생 능력의 심각한 손실, 영구 근육 손실 및 만성 장애를 초래한다(Brack, A. S., "Pax7 is Back," Skelet Muscle 4:24 (2014), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨). 결과적으로, 심각한 골격근 손상이 있는 개체에게 사용할 수 있는 새로운 근육 재생, 질량 및 근력을 증가시키는 치료 옵션은 거의 없으며, 임의의 접근 방식이 매우 특히 효과적이라는 증거도 거의 없다(Corona 등, "Pathophysiology of Volumetric Muscle Loss Injury," Cells Tissues Organs 202:180-88 (2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
신체 재활 접근 방식이 VML 손상이 있는 개체에서 기존 근육량, 근육 재생 또는 근력을 증가시키는 데 효과적인 것으로 밝혀진 적은 없다(Garg 등, "Volumetric Muscle Loss: Persistent Functional Deficits Beyond Frank Loss of Tissue," J. Orthop. Res. 33:40-6 (2015) 및 Mase 등, "Clinical Application of an Acellular Biologic Scaffold for Surgical Repair of a Large, Traumatic Quadriceps Femoris Muscle Defect," Orthopedics 33:511 (2010), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 부상으로 인한 근본적인 염증 반응을 약화시키는 데 초점을 맞춘 근육 재생 접근 방식은 새로운 근육량이나 근력의 효과적인 재생을 촉진하지 못한다(Corona 등, "Pathophysiology of Volumetric Muscle Loss Injury," Cells Tissues Organs 202:180-88 (2016) 및 Qazi 등, "Cell Therapy to Improve Regeneration of Skeletal Muscle Injuries," J. Cachexia Sarcopenia Muscle 10:501-16 (2019), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
만성 근육 손상이 있는 개체에 대한 외과적 치료는 또한 그다지 효과적이지 않고 상당한 제한이 있다. 외과적 개입은 정상적으로 자가 근육 이식 및 신체내 다른 곳의 건강한 근육으로부터의 생착을 사용하는 손상된 근육의 외과적 재건을 수반하며, 이는 이식편의 변성 및 실패, 재손상의 높은 비율을 갖고 있고, 그 자체가 상주하는 건강한 공여체 근육의 외상성 손상 및 기능 상실을 유발할 수 있다(Whiteside, L. A., "Surgical Technique: Gluteus Maximus and Tensor Fascia Lata Transfer for Primary Deficiency of the Abductors of the Hip," Clin. Orthop. Relat. Res. 472:645-53 (2014); Dziki 등, "An Acellular Biologic Scaffold Treatment for Volumetric Muscle Loss: Results of a 13-Patient Cohort Study," NPJ Regen. Med. 1:16008 (2016); Sicari 등, "An Acellular Biologic Scaffold Promotes Skeletal Muscle Formation in Mice and Humans with Volumetric Muscle Loss," Sci. Transl. Med. 6:234ra58 (2014); Hurtgen 등, "Autologous Minced Muscle Grafts Improve Endogenous Fracture Healing and Muscle Strength after Musculoskeletal Trauma," Physiol. Rep. 5 (2017); 및 Qazi 등, "Cell Therapy to Improve Regeneration of Skeletal Muscle Injuries," J. Cachexia Sarcopenia Muscle 10:501-16 (2019), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 증가된 근육 재생을 촉진하기 위해 실험적 스캐폴드 및 근육 오르가노이드(organoid)를 사용하는 다른 외과적 접근 방식은 기술적으로 복잡하며 모델 시스템에서 일관된 효능을 나타내지 않았다(Gholobova 등, "Vascularization of Tissue-Engineered Skeletal Muscle Constructs," Biomaterials 235:119708 (2020) 및 Sicherer 등, "Recent Trends in Injury Models to Study Skeletal Muscle Regeneration and Repair," Bioengineering (Basel) 7 (2020), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨).
골격 외상성 손상을 치료하기 위한 분자 접근 방식은 일반적으로 무엇보다도 간세포 성장 인자(HGF), 인슐린-유사 성장 인자(IGF), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 섬유아세포 성장 인자(FGF)의 근육내 투여 및 이식된 생체물질로부터의 방출을 비롯한 성장 인자 요법으로 이루어진다(Syverud 등, "Growth Factors for Skeletal Muscle Tissue Engineering," Cells Tissues Organs 202:169-79 (2016); Pawlikowski 등, "Regulation of Skeletal Muscle Stem Cells by Fibroblast Growth Factors," Dev. Dyn. 246:359-67 (2017); Menetrey 등, "Growth Factors Improve Muscle Healing in vivo," J. Bone Joint Surg. Br. 82:131-7 (2000); Rodgers 등, "mTORC1 Controls the Adaptive Transition of Quiescent Stem Cells from G0 to G(Alert)," Nature 510:393-6 (2014); Allen 등, "Hepatocyte Growth Factor Activates Quiescent Skeletal Muscle Satellite Cells in vitro," J. Cell Physiol. 165:307-12 (1995); Miller 등, "Hepatocyte Growth Factor Affects Satellite Cell Activation and Differentiation in Regenerating Skeletal Muscle," Am. J. Physiol. Cell Physiol. 278:C174-81 (2000); Grasman 등, "Biomimetic Scaffolds for Regeneration of Volumetric Muscle Loss in Skeletal Muscle Injuries," Acta Biomater. 25:2-15 (2015); 및 Cezar 등, "Timed Delivery of Therapy Enhances Functional Muscle Regeneration," Adv. Healthc. Mater. 6 (2017), 이들 전체가 본원에 참고로 포함됨). 이들 접근 방식은 단일 근육 성장 촉진 인자의 투여 제한을 겪으며, 이들 인자는 수명이 짧은 반면, 근육 재생은 복잡하고 근육 회복 및 재생에 효과를 나타내기 위해 정밀한 공간적 및 시간적 방식으로 경시적으로 서로 협력하여 작용해야 하는 많은 인자를 필요로 한다는 단점이 있다. 따라서, 성장 인자의 투여가 심지어 조합적인 경우에도, 외상성 근육 손상의 실험 모델에서도 상당한 근육 재생 효과를 나타내지 않았다는 것은 놀라운 일이 아니다(Pumberger 등, "Synthetic Niche to Modulate Regenerative Potential of MSCs and Enhance Skeletal Muscle Regeneration," Biomaterials 99:95-108 (2016), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
대부분의 세포 요법은 근육 재생 줄기(위성) 세포를 재집단화하고 이식된 근육 위성 세포 또는 근원성 기원의 다른 세포를 사용하여 괴사-염증을 감소시키려고 시도한다. 그러나, 이 접근 방식에는 상당한 장애물이 있다. 첫째, 사용된 세포는 새로 분리된 동종이계여야 하며, 이는 외상성 및 VML 손상이 있는 개체의 경우에 외과적으로 제거된 기존의 건강한 근육에서 수확하는 것을 의미한다. 둘째, 줄기 세포와 근원성 세포는 배양 및 확장되어야 하는데, 이는 기술적으로 어렵고 충족되지 않은 수요의 규모를 감안하면 규모조정이 불가능하다. 따라서, 자가 근육 세포 요법은 필요로 하는 대다수 환자의 치료에 임상적으로 실현 가능하지 않다(Qazi 등, "Cell Therapy to Improve Regeneration of Skeletal Muscle Injuries," J. Cachexia Sarcopenia Muscle 10:501-16 (2019), 이의 전체가 본원에 참고로 포함됨).
크고/크거나 외상성인 근육 손상의 치료에 현재 이용 가능한 치료 옵션(예를 들어, 세포 요법, 수술 요법, 성장 인자 및 호르몬 요법, 분자 요법, 및 유전자 요법)은 근육 재생, 근육량, 및 심각한 골격근 손상에 대한 근력을 증가시키는 것을 목표로 한다. 그러나, 사용 가능한 치료 옵션의 대부분은 기껏해야 매우 빈약하게만 작동한다. 실시예 8의 결과는 AUF1 유전자 요법(예를 들어, 근육에 직접적으로 렌티바이러스 벡터 전달 또는 AAV8 벡터에 의한 AUF1의 전신 전달에 의함)이 (1) 근육 줄기(위성) 세포를 활성화하고; (2) 근육 위축의 확립된 바이오마커의 발현을 감소하고; (3) 성숙한 근육 섬유(근섬유)의 재생을 가속화하고; (4) 근육 재생 인자의 발현을 향상시키고; (5) 손상된 근육의 재생을 강력하게 가속화하고; (6) 2가지 주요 유형의 근육(즉, 지근(유형 I) 또는 속근(유형 II) 섬유)의 재생을 증가시키고; 근육량, 근력을 회복하고, 정상적인 근육을 생성하는데 효과적임을 입증한다.
본원에서 바람직한 실시양태는 상세하게 묘사되고 설명되었지만, 본 발명의 사상에서 벗어남이 없이 다양한 수정, 첨가, 치환 등이 이루어질 수 있음은 관련 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이며, 따라서 이들은 다음 특허청구범위에 정의된 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주되어야 한다.
<110> NEW YORK UNIVERSITY <120> ADENO-ASSOCIATED VIRAL VECTOR, COMPOSITIONS, METHODS OF PROMOTING MUSCLE REGENERATION, AND TREATMENT METHODS <130> 147462.002201 <140> 17/152,463 <141> 2021-01-19 <150> 62/962,712 <151> 2020-01-17 <150> 63/128,047 <151> 2020-12-19 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 600 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agccagcctc agtttcccct ccactcagtc cctaggagga aggggcgccc aagcgcgggt 60 ttctggggtt agactgccct ccattgcaat tggtccttct cccggcctct gcttcctcca 120 gctcacaggg tatctgctcc tcctggagcc acaccttggt tccccgaggt gccgctggga 180 ctcgggtagg ggtgagggcc cagggggcac agggggagcc gagggccaca ggaagggctg 240 gtggctgaag gagactcagg ggccagggga cggtggcttc tacgtgcttg ggacgttccc 300 agccaccgtc ccatgttccc ggcggggggc cagctgtccc caccgccagc ccaactcagc 360 acttggtcag ggtatcagct tggtgggggg gcgtgagccc agcccctggg gcggctcagc 420 ccatacaagg ccatggggct gggcgcaaag catgcctggg ttcagggtgg gtatggtgcg 480 ggagcaggga ggtgagaggc tcagctgccc tccagaactc ctccctgggg acaacccctc 540 ccagccaata 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ctagtttcgg ttcgcggcgg cggcggcgtc ggcgggtgtc gtcttcggcg 300 gcggcagtag cactatgtcg gaggagcagt tcggagggga cggggcggcg gcggcggcaa 360 cggcggcggt aggcggctcg gcgggcgagc aggagggagc catggtggcg gcggcggcgc 420 aggggccggc ggcggcggcg ggaagcggga gcggcggcgg cggctctgcg gccggaggca 480 ccgaaggagg cagcgccgag gcagagggag ccaagatcga cgccagtaag aacgaggagg 540 atgaaggcca ttcaaactcc tccccacgac acactgaagc agcggcggca cagcgggaag 600 aatggaaaat gtttatagga ggccttagct gggacaccac aaagaaagat ctgaaggact 660 acttttccaa atttggtgaa gttgtagact gcactctgaa gttagatcct atcacagggc 720 gatcaagggg ttttggcttt gtgctattta aagagtcgga gagtgtagat aaggtcatgg 780 atcagaaaga acataaattg aatgggaaag tcattgatcc taaaagggcc aaagccatga 840 aaacaaaaga gcctgtcaaa aaaatttttg ttggtggcct ttctccagac acacctgaag 900 aaaaaataag agagtacttt ggtggttttg gtgaggttga atccatagag ctccctatgg 960 acaacaagac caataagagg cgtgggttct gttttattac ctttaaggaa gaggagccag 1020 tgaagaagat aatggaaaag aaataccaca atgttggtct tagtaaatgt gaaataaaag 1080 tagccatgtc aaaggaacag 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ggttttggtt tgttttttgt tgttttggtt ctttgttgag 3660 ccctggacaa aaacttccct agttctggtt tctacaattt aaattaaaaa cagaattcat 3720 cttagaattt ttcaccctct tccccaacta ttctaatcaa tcttaagtat gcccttcatc 3780 ttttttcctt cctaaggctt ttactgatag tgtaattccg tactcttcaa ccctgggaag 3840 gctgaagtgg attcttgagc tcatttcaag gctgacctgg gtgttggcaa gaacccagct 3900 tagaacaaac acatgcaagg ccatcttacc ttacatcctg ttgcttggac ttcttcctgc 3960 tcaaagtttt tagtggatgc taagtgatct ttgcttccac tgaggagtgg aacactttag 4020 aatgaacctc tagatagata tttttattgt ctggtgaggg ttactggagt ttcccaccct 4080 gcctgaaggg tgaatctggc ttacagtgtt ctcatctcaa agggaagaag gcagatggct 4140 gtgtccagag agagccatca cagtttgctt cagagacact agaatgggct ggaagatcta 4200 gtggtcttaa tcagacttga aacctggcct ttcttcatta cccatatgtc taccagtact 4260 tgggctaaca cttaagccat tagggccttt gtaggggtgt tttgagaccc cctccatgct 4320 aacaaatata caggtttctt aacatttgct cataaacttg taaagcttac tttctcttaa 4380 tccaccccac atttaacaag ccctggtact tagaatttca gaagagtaat ggcaggtagg 4440 tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg 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aggctctgta caccatggag gagaagctcg ctctaaaaat aaccctgtcc 360 ctggtggatc gccactacgg gtctaggctg cccatgtaag gaggcaaggc ctggggacac 420 ccgagatgcc tggttataat taaccccaac acctgctgcc cccccccccc aacacctgct 480 gcctgagcct gagcggttac cccaccccgg tgcctgggtc ttaggctctg tacaccatgg 540 aggagaagct cgctctaaaa ataaccctgt ccctggtgga tcgccactac gggtctaggc 600 tgcccatgta aggaggcaag gcctggggac acccgagatg cctggttata attaacccca 660 acacctgctg cccccccccc ccaacacctg ctgcctgagc ctgagcggtt accccacccc 720 ggtgcctggg tcttaggctc tgtacaccat ggaggagaag ctcgctctaa aaataaccct 780 gtccctggtg gatccctccc tggggacagc ccctcctggc tagtcacacc ctgtaggctc 840 ctctatataa cccaggggca caggggctgc ccccgggtca ccgctagcca aagcttctcg 900 aggctggcta gttaagctat caacaagttt gtacagaaaa gcaggcttta aaggaaccaa 960 ttcagtcgac gctagcaagc ttggtaccgg atccgaattc caccatgtcg gaggagcagt 1020 tcggagggga cggggcggcg gcggcggcaa cggcggcggt aggcggctcg gcgggcgagc 1080 aggagggagc catggtggcg gcggcggcgc aggggccggc ggcggcggcg ggaagcggga 1140 gcggcggcgg cggctctgcg gccggaggca ccgaaggagg cagcgccgag gcagagggag 1200 ccaagatcga cgccagtaag aacgaggagg atgaaggcca ttcaaactcc tccccacgac 1260 acactgaagc agcggcggca cagcgggaag aatggaaaat gtttatagga ggccttagct 1320 gggacaccac aaagaaagat ctgaaggact acttttccaa atttggtgaa gttgtagact 1380 gcactctgaa gttagatcct atcacagggc gatcaagggg ttttggcttt gtgctattta 1440 aagagtcgga gagtgtagat aaggtcatgg atcagaaaga acataaattg aatgggaaag 1500 tcattgatcc taaaagggcc aaagccatga aaacaaaaga gcctgtcaaa aaaatttttg 1560 ttggtggcct ttctccagac acacctgaag aaaaaataag agagtacttt ggtggttttg 1620 gtgaggttga atccatagag ctccctatgg acaacaagac caataagagg cgtgggttct 1680 gttttattac ctttaaggaa gaggagccag tgaagaagat aatggaaaag aaataccaca 1740 atgttggtct tagtaaatgt gaaataaaag tagccatgtc aaaggaacag tatcagcagc 1800 agcagcagtg gggatctaga ggagggtttg caggcagagc tcgcggaaga ggtggagatc 1860 agcagagtgg ttatgggaaa gtatccaggc gaggtggaca tcaaaatagc tacaaaccat 1920 actaagatat cgcggccgcc tcgaggacta caaggatgac gatgacaagg attacaaaga 1980 cgacgatgat aaggactata 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aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt 5400 attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa 5460 gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac 5520 agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt 5580 aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt 5640 cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat 5700 cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac 5760 actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg 5820 cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc 5880 ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa 5940 ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag 6000 gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct 6060 gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat 6120 ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa 6180 cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac 6240 caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 6300 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 6360 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 6420 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 6480 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 6540 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 6600 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 6660 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 6720 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 6780 ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 6840 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 6900 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 6960 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 7020 ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg t 7051 <210> 26 <211> 6697 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AUF1 p45 Lentivirus Vector Shuttle Plasmid <400> 26 cgaaaagtgc cacctgcagc ctgaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc 60 ctgccccggc tcagggccaa gaacagatgg aacagctgaa tatgggccaa acaggatatc 120 tgtggtaagc agttcctgcc ccggctcagg gccaagaaca gatggtcccc agatgcggtc 180 cagccctcag cagtttctag agaaccatca gatgtttcca gggtgcccca aggacctgaa 240 atgaccctgt gccttatttg aactaaccaa tcagttcgct tctcgcttct gttcgcgcgc 300 ttctgctccc cgagctcaat aaaagagccc acaacccctc actcggggcg ccagtcctcc 360 gattgactga gtcgcccggg tacccgtgta tccaataaac cctcttgcag ttgcatccga 420 cttgtggtct cgctgttcct tgggagggtc tcctctgagt gattgactac ccgtcagcgg 480 gggtctttca tttgggggct cgtccgggat cgggagaccc ctgcccaggg accaccgacc 540 caccaccggg aggcaagctg gccagcaact tatctgtgtc tgtccgattg tctagtgtct 600 atgactgatt ttatgcgcct gcgtcggtac tagttagcta actagctctg tatctggcgg 660 acccgtggtg gaactgacga gttctgaaca cccggccgca accctgggag acgtcccagg 720 gactttgggg gccgtttttg tggcccgacc tgaggaaggg agtcgatgtg gaatccgacc 780 ccgtcaggat atgtggttct ggtaggagac gagaacctaa aacagttccc gcctccgtct 840 gaatttttgc tttcggtttg gaaccgaagc cgcgcgtctt gtctgctgca gcgctgcagc 900 atcgttctgt gttgtctctg tctgactgtg tttctgtatt tgtctgaaaa ttagggccag 960 actgttacca ctcccttaag tttgacctta ggtcactgga aagatgtcga gcggatcgct 1020 cacaaccagt cggtagatgt caagaagaga cgttgggtta ccttctgctc tgcagaatgg 1080 ccaaccttta acgtcggatg gccgcgagac ggcaccttta accgagacct catcacccag 1140 gttaagatca aggtcttttc acctggcccg catggacacc cagaccaggt cccctacatc 1200 gtgacctggg aagccttggc ttttgacccc cctccctggg tcaagccctt tgtacaccct 1260 aagcctccgc ctcctcttcc tccatccgcc ccgtctctcc cccttgaacc tcctcgttcg 1320 accccgcctc gatcctccct ttatccagcc ctcactcctt ctctaggcgc cggccggatc 1380 catgtcggag gagcagttcg gcggggacgg ggcggcggca gcggcaacgg cggcggtagg 1440 cggctcggcg ggcgagcagg agggagccat ggtggcggcg acacaggggg cagcggcggc 1500 ggcgggaagc ggagccggga ccgggggcgg aaccgcgtct ggaggcaccg aagggggcag 1560 cgccgagtcg gagggggcga agattgacgc cagtaagaac gaggaggatg aaggccattc 1620 aaactcctcc ccacgacact ctgaagcagc gacggcacag cgggaagaat ggaaaatgtt 1680 tataggaggc cttagctggg acactacaaa gaaagatctg aaggactact tttccaaatt 1740 tggtgaagtt gtagactgca ctctgaagtt agatcctatc acagggcgat caaggggttt 1800 tggctttgtg ctatttaaag aatcggagag tgtagataag gtcatggatc aaaaagaaca 1860 taaattgaat gggaaggtga ttgatcctaa aagggccaaa gccatgaaaa caaaagagcc 1920 ggttaaaaaa atttttgttg gtggcctttc tccagataca cctgaagaga aaataaggga 1980 gtactttggt ggttttggtg aggtggaatc catagagctc cccatggaca acaagaccaa 2040 taagaggcgt gggttctgct ttattacctt taaggaagaa gaaccagtga agaagataat 2100 ggaaaagaaa taccacaatg ttggtcttag taaatgtgaa ataaaagtag ccatgtcgaa 2160 ggaacaatat cagcaacagc aacagtgggg atctagagga ggatttgcag gaagagctcg 2220 tggaagaggt ggtggcccca gtcaaaactg gaaccaggga tatagtaact attggaatca 2280 aggctatggc aactatggat ataacagcca aggttacggt ggttatggag gatatgacta 2340 cactggttac aacaactact atggatatgg tgattatagc aaccagcaga gtggttatgg 2400 gaaggtatcc aggcgaggtg gtcatcaaaa tagctacaaa ccatacgact acaaggacga 2460 cgatgacaag tgagtcgacc aattccggtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa 2520 tgtgagggcc cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc 2580 tctcgccaaa ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc 2640 ttcttgaaga caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg 2700 cgacaggtgc ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca 2760 accccagtgc cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag 2820 cgtattcaac aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct 2880 ggggcctcgg tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaacg tctaggcccc 2940 ccgaaccacg gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataatacca tgaaaaagcc 3000 tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga 3060 cctgatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg 3120 tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta 3180 tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaatttag 3240 cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc 3300 tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcagcc ggtcgcggag gccatggatg cgatcgctgc 3360 ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tcggtcaata 3420 cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc actggcaaac 3480 tgtgatggac gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tgatgctttg 3540 ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct ccaacaatgt 3600 cctgacggac aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga tgttcgggga 3660 ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt gtatggagca 3720 gcagacgcgc tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ggctccgggc 3780 gtatatgctc cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gcaatttcga 3840 tgatgcagct tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag ccgggactgt 3900 cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gtgtagaagt 3960 actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg aatagagtag 4020 atgccgaccg ggatctatcg ataaaataaa agattttatt tagtctccag aaaaaggggg 4080 gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta agtaacgcca ttttgcaagg 4140 catggaaaaa tacataactg agaatagaga agttcagatc aaggtcagga acagatggaa 4200 cagctgaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc 4260 caagaacaga tggaacagct gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 4320 gccccggctc agggccaaga acagatggtc cccagatgcg gtccagccct cagcagtttc 4380 tagagaacca tcagatgttt ccagggtgcc ccaaggacct gaaatgaccc tgtgccttat 4440 ttgaactaac caatcagttc gcttctcgct tctgttcgcg cgcttctgct ccccgagctc 4500 aataaaagag cccacaaccc ctcactcggg gcgccagtcc tccgattgac tgagtcgccc 4560 gggtacccgt gtatccaata aaccctcttg cagttgcatc cgacttgtgg tctcgctgtt 4620 ccttgggagg gtctcctctg agtgattgac tacccgtcag cgggggtctt tcacatgcag 4680 catgtatcaa aattaatttg gttttttttc ttaagtattt acattaaatg gccatagttg 4740 cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct 4800 tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 4860 tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga 4920 gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat 4980 aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac 5040 ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct 5100 gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg 5160 ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg 5220 ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt 5280 cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg 5340 attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac 5400 ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga 5460 aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt 5520 gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt 5580 tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga 5640 ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttgcggccgc aaatcaatct aaagtatata 5700 tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat 5760 ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 5820 ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc 5880 tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc 5940 aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc 6000 gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc 6060 gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 6120 ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa 6180 gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat 6240 gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata 6300 gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca 6360 tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 6420 gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc 6480 agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc 6540 aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata 6600 ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta 6660 gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccc 6697 <210> 27 <211> 306 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Met Ser Glu Glu Gln Phe Gly Gly Asp Gly Ala Ala Ala Ala Ala Thr 1 5 10 15 Ala Ala Val Gly Gly Ser Ala Gly Glu Gln Glu Gly Ala Met Val Ala 20 25 30 Ala Ala Ala Gln Gly Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gly Ser Gly Gly 35 40 45 Gly Gly Ser Ala Ala Gly Gly Thr Glu Gly Gly Ser Ala Glu Ala Glu 50 55 60 Gly Ala Lys Ile Asp Ala Ser Lys Asn Glu Glu Asp Glu Gly His Ser 65 70 75 80 Asn Ser Ser Pro Arg His Thr Glu Ala Ala Ala Ala Gln Arg Glu Glu 85 90 95 Trp Lys Met Phe Ile Gly Gly Leu Ser Trp Asp Thr Thr Lys Lys Asp 100 105 110 Leu Lys Asp Tyr Phe Ser Lys Phe Gly Glu Val Val Asp Cys Thr Leu 115 120 125 Lys Leu Asp Pro Ile Thr Gly Arg Ser Arg Gly Phe Gly Phe Val Leu 130 135 140 Phe Lys Glu Ser Glu Ser Val Asp Lys Val Met Asp Gln Lys Glu His 145 150 155 160 Lys Leu Asn Gly Lys Val Ile Asp Pro Lys Arg Ala Lys Ala Met Lys 165 170 175 Thr Lys Glu Pro Val Lys Lys Ile Phe Val Gly Gly Leu Ser Pro Asp 180 185 190 Thr Pro Glu Glu Lys Ile Arg Glu Tyr Phe Gly Gly Phe Gly Glu Val 195 200 205 Glu Ser Ile Glu Leu Pro Met Asp Asn Lys Thr Asn Lys Arg Arg Gly 210 215 220 Phe Cys Phe Ile Thr Phe Lys Glu Glu Glu Pro Val Lys Lys Ile Met 225 230 235 240 Glu Lys Lys Tyr His Asn Val Gly Leu Ser Lys Cys Glu Ile Lys Val 245 250 255 Ala Met Ser Lys Glu Gln Tyr Gln Gln Gln Gln Gln Trp Gly Ser Arg 260 265 270 Gly Gly Phe Ala Gly Arg Ala Arg Gly Arg Gly Gly Asp Gln Gln Ser 275 280 285 Gly Tyr Gly Lys Val Ser Arg Arg Gly Gly His Gln Asn Ser Tyr Lys 290 295 300 Pro Tyr 305 <210> 28 <211> 921 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 atgtcggagg agcagttcgg aggggacggg gcggcggcgg cggcaacggc ggcggtaggc 60 ggctcggcgg gcgagcagga gggagccatg gtggcggcgg cggcgcaggg gccggcggcg 120 gcggcgggaa gcgggagcgg cggcggcggc tctgcggccg gaggcaccga aggaggcagc 180 gccgaggcag agggagccaa gatcgacgcc agtaagaacg aggaggatga aggccattca 240 aactcctccc cacgacacac tgaagcagcg gcggcacagc gggaagaatg gaaaatgttt 300 ataggaggcc ttagctggga caccacaaag aaagatctga aggactactt ttccaaattt 360 ggtgaagttg tagactgcac tctgaagtta gatcctatca cagggcgatc aaggggtttt 420 ggctttgtgc tatttaaaga gtcggagagt gtagataagg tcatggatca gaaagaacat 480 aaattgaatg ggaaagtcat tgatcctaaa agggccaaag ccatgaaaac aaaagagcct 540 gtcaaaaaaa tttttgttgg tggcctttct ccagacacac ctgaagaaaa aataagagag 600 tactttggtg gttttggtga ggttgaatcc atagagctcc ctatggacaa caagaccaat 660 aagaggcgtg ggttctgttt tattaccttt aaggaagagg agccagtgaa gaagataatg 720 gaaaagaaat accacaatgt tggtcttagt aaatgtgaaa taaaagtagc catgtcaaag 780 gaacagtatc agcagcagca gcagtgggga tctagaggag ggtttgcagg cagagctcgc 840 ggaagaggtg gagatcagca gagtggttat gggaaagtat ccaggcgagg tggacatcaa 900 aatagctaca aaccatacta a 921

Claims (47)

  1. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서,
    근육 세포-특이적 프로모터 및
    AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하며, 근육 세포-특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링되는, 핵산 분자
    를 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터는 아데노-연관 바이러스 유형 8 벡터인, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 근육 세포-특이적 프로모터는 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터, C5-12 프로모터, CK6-CK9 프로모터, dMCK 프로모터, tMCK 프로모터, 평활근 22(SM22) 프로모터, myo-3 프로모터, Spc512 프로모터, 크레아틴 키나제(CK) 8 프로모터, 크레아틴 키나제(CK) 8e 프로모터, U6 프로모터, H1 프로모터, 데스민(desmin) 프로모터, Pitx3 프로모터, 골격 알파-액틴 프로모터, MHCK7 프로모터, 및 Sp-301 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 근육 세포-특이적 프로모터가 근육 크레아틴-키나제(tMCK) 프로모터인, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자가 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1, 또는 p45AUF1 중 하나 이상을 암호화하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자가 p37AUF1을 암호화하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  7. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자가 p40AUF1을 암호화하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  8. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자가 p42AUF1을 암호화하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  9. 제5항에 있어서, 상기 핵산 분자가 p45AUF1을 암호화하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    리포터 단백질을 암호화하는 핵산 분자
    를 추가로 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    퓨린-풍부한 요소 결합 단백질 β(Purβ) 저해제를 암호화하는 핵산 분자
    를 추가로 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  12. 제11항에 있어서, 상기 Purβ 저해제가 RNA 요소, 폴리펩타이드, 또는 소분자로부터 선택되는 것인, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 RNA 요소는 siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 포함하는, 조성물.
  15. 제14항에 있어서, 완충 용액을 추가로 포함하는, 조성물.
  16. 약제학적 조성물로서,
    제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및
    약제학적으로 허용되는 담체
    를 포함하는, 약제학적 조성물.
  17. 근육 재생을 촉진하는 방법으로서, 상기 방법은
    상기 근육 세포에서 외인성 AUF1을 발현시키기에 효과적인 조건 하에, 상기 근육 세포를 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 아데노 연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉하여, 근육 세포 질량을 증가시키고, 근육 세포 지구력을 증가시키고, 및/또는 근육 위축의 혈청 마커를 감소시키는 단계
    를 포함하는, 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 방법이 생체외에서 수행되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 외인성 AUF1을 발현시키기에 효과적인 조건 하에 근육 세포를 생체외에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 방법이 생체내에서 수행되는, 방법.
  21. 제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 근육 세포를 퓨린-풍부 요소 결합 단백질 β(Purβ) 저해제와 접촉시키는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 Purβ 저해제가 핵산 분자, 폴리펩타이드, 또는 소분자로부터 선택되는 것인, 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 분자가 siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  24. 대상체의 퇴행성 골격근 손실을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    골격근 손실에 대한 치료를 필요로 하는 대상체를 선택하는 단계 및
    상기 선택된 대상체에서 골격근 재생을 유발하기에 효과적인 조건 하에, 상기 선택된 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 또는 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 근육내 주사에 의해 수행되는 것인, 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 상기 대상체가 근육감소증, 근육병증, 기능적 AUF1 결핍에 의해 매개되는 근육 장애, 또는 기능적 AUF1 결핍에 의해 매개되지 않은 근육 장애를 갖는 것인, 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 성인-발병 근병증 또는 근육 장애를 갖는 것인, 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    퓨린-풍부 요소 결합 단백질 β(Purβ) 저해제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 Purβ 저해제가 핵산 분자, 폴리펩타이드 또는 소분자인, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 핵산 분자가 siRNA, shRNA 및 miRNA로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 방법.
  31. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 뒤센 근이영양증(DMD)을 갖는 것인, 방법.
  32. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 외상성 근육 손상을 갖는 것인, 방법.
  33. 제24항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 상기 선택된 대상체에서 내인성 유트로핀 단백질 발현을 상향조절하기에 효과적인 것인, 방법.
  34. 제17항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여가 상기 근육 세포에서 내인성 유트로핀 단백질 발현을 상향조절하기에 효과적인 것인, 방법.
  35. 대상체에서 외상성 근육 손상을 예방하는 방법으로서,
    외상성 근육 손상의 위험이 있는 대상체를 선택하는 단계 및
    상기 선택된 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물; 또는 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자가 상기 근육 세포-특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링되는 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계
    를 포함하는, 방법.
  36. 제35항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 투여되는 것인, 방법.
  37. 제35항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 AUF1 이소형 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1 또는 p45AUF1을 암호화하는 것인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 AUF 이소형 p45AUF1을 암호화하는 것인, 방법.
  39. 제35항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 근육내 주사에 의해 수행되는 것인, 방법.
  40. 제35항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 상기 선택된 대상체에 대한 외상성 근육 손상 이후 근육 위축 및/또는 근육 손실을 예방하는 것인, 방법.
  41. 대상체에서 외상성 근육 손상을 치료하는 방법으로서,
    외상성 근육 손상이 있는 대상체를 선택하는 단계, 및
    상기 선택된 대상체에게 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터; 제14항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 조성물; 또는 근육 세포 특이적 프로모터 및 AU-풍부 mRNA 결합 인자 1(AUF1) 단백질 또는 이의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 분자를 포함하되, 상기 핵산 분자가 상기 근육 세포 특이적 프로모터에 이종성이고 작동적으로 커플링되는 것인 렌티바이러스 벡터를 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 투여되는 것인, 방법.
  43. 제41항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 AUF1 이소형 p37AUF1, p40AUF1, p42AUF1, 또는 p45AUF1을 암호화하는 것인, 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터가 AUF 이소형 p45AUF1을 암호화하는 것인, 방법.
  45. 제41항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 근육내 주사에 의해 수행되는 것인, 방법.
  46. 제41항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 상기 선택된 대상체에서 근육 위축 및/또는 근육 손실을 치료하는 것인, 방법.
  47. 제41항에 있어서, 상기 투여하는 단계가 상기 투여하는 단계가 수행되지 않는 경우와 비교할 때 근육 증가를 가속화하는 것인, 방법.
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