CN107299077A - 一种牛脑垂体提取物的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛脑垂体提取物的提取方法，获取新鲜牛脑垂体，去除组织表面血污及杂物，并剔除外部粘连组织及白色包膜，裸露整个垂体组织；向垂体组织中加入蛋白酶抑制剂，并破碎为糊状，然后再加入蛋白提取液，在0~4℃低温条件下依次经过搅拌、离心，收集上清液；最后将上清液灭菌，即得所述牛脑垂体提取物。采用本发明方法提取的牛脑垂体提取物中蛋白含量平均可达到15mg/ml以上，既可以用于细胞培养，也可以用于组织工程培养。本发明提取方法简单，提取效率高，适于规模化生产，为牛脑垂体提取物的量产提供有力的保障。

Description

一种牛脑垂体提取物的提取方法

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种牛脑垂体提取物的提取方法。

背景技术

牛脑垂体提取物（BPE）作为一种牛血清的替代物，是无血清培养基中重要添加物，可有效去除血清中复杂成分对细胞的不利影响，尤其是血清对干细胞及具有干细胞特性类细胞的促分化、促老化作用，从而保证细胞的生物学特性。常用于角质形成细胞、黑色素细胞、口腔黏膜细胞等各种上皮样细胞、间充质类细胞等细胞的培养及含有上述细胞的组织工程产品生产中。其发挥作用的主要成分为乙醇胺、脂肪酸以及其中含有的各种蛋白类因子和激素，如生长激素（GH）、促甲状腺激素（TSH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、黑色素细胞刺激素（MSH）等，这些物质相互协同，有效发挥提高细胞活力，维持细胞生物学特性的作用，其培养效果是血清无法替代的，但是由于价格较高，加之国家对进口生物制品的管控，导致其一直无法大规模使用。随着我国生物技术的飞速发展，对BPE的需求也日益增多，开发一种高效、低廉的BPE制备方法意义重大。

目前对外公布的提取方法多以破碎后收集溶出物为主。天津医学院周肃、汤特等人对Eliis和Reichart公布的提取方法进行改良，根据蛋白可溶于酸、碱、盐溶液及蒸馏水中的原理，通过盐析使有机溶剂沉淀、透析、浓缩、冻干干燥等，分别获取生长激素（RH）、催乳素（PRL）、促卵泡成熟素（FSH）、促黄体生成素（LSH）和促甲状腺激素（TSH）等粗制品。Denis Gospodarowicz等人用牛脑垂体在酸性条件下硫酸铵沉淀蛋白，然后通过羧甲纤维素色谱法及葡聚糖凝胶过滤，最终获得7mg/kg的卵巢生长因子。上述两种方法均是针对脑垂体中特定成分进行分离，因此方法比较复杂，所需设备及技术要求也比较高，不适于规模化生产。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种牛脑垂体提取物的提取方法，解决了现有提取方法较复杂，提取效率低，无法规模化生产的问题。

本发明所采用的技术方案是，一种牛脑垂体提取物的提取方法，包括以下步骤：

步骤1，获取新鲜牛脑垂体，去除组织表面血污及杂物，并剔除外部粘连组织及白色包膜，裸露整个垂体组织；

步骤2，向垂体组织中加入蛋白酶抑制剂，并破碎为糊状，然后再加入蛋白提取液，在0~4℃低温条件下依次经过搅拌、离心，收集上清液；

步骤3，将上清液用微滤膜过滤除杂后，采用钴60辐照灭菌，辐照剂量10 KGy~30KGy，即得所述牛脑垂体提取物。

本发明的原理是：通过低温破碎处理组织，加入蛋白提取液，在低温条件下，通过低温搅拌浸提的方法，最大限度的获取组织中多种活性因子，并通过有效的灭菌方式，保证产品满足使用要求。

本发明的特点还在于：

进一步地，步骤2中蛋白酶抑制剂优选PMSF（苯甲基磺酰氟），加入垂体组织后的终浓度为10mmol/L~100mmol/L。添加蛋白酶抑制剂可抑制垂体组织中蛋白酶的活性，保证提取物的生物活性。

进一步地，步骤3中灭菌方法为以下三种中任一种：

（1）先采用0.45um微滤膜过滤所述上清液后，再采用钴60辐照灭菌，辐照剂量10KGy~30KGy；辐照灭菌效率高，操作简单，成本低廉，适合大规模生产。

（2）先采用0.45um微滤膜过滤所述上清液，用培养液稀释上清液10-20倍后，再过0.22um滤器除菌；分步过滤可以节省前处理时间，适用短期内用量较大的用户操作。

（3）用组合滤器按照1.2um、0.45um、0.22um的使用顺序，过滤所述上清液。组合滤器可一次性完成过滤除菌操作，适用实验室小批量操作。

进一步地，步骤2中蛋白提取液为PBS、生理盐水或Hanks，它们的与生理条件下的体液成分、渗透压及pH较为接近，可以将组织及细胞中的有效因子通过相似相溶原理提取出来。若为PBS，则按照0.3~1g/ml的比例（每ml PBS中加入0.3~1g匀浆组织）加入垂体组织；若为生理盐水，添加量为0.5~2g/ml；若加入Hanks，添加量为0.3~1g/ml。

进一步地，步骤2中破碎方式为匀浆处理或破碎后超声处理；若为匀浆处理，每间隔1~2s匀浆破碎3s，匀浆转速为800~2000rpm；若为破碎后超声处理，超声5秒/次，每次间隔10~15s秒，超声频率300~500W。上述破碎方式能将垂体组织破碎至其颗粒直径不超过0.05cm，这样可以最大限度保证蛋白提取液浸润入组织块中，保证浸提效率。

进一步地，步骤2中搅拌为在低于500rpm转速下搅拌60min~150min。转速过高或者搅拌时间过长都会引起提取混合物温度升高，从而使其中的活性物质活性降低。

进一步地，步骤2中离心为两次离心，先在6000~8000rmp转速下离心10~15min，去除沉淀，收集上清液，再在10000~13000 rmp转速下离心10~15min。初次低速离心主要为了去除破碎后的大组织，避免后期处理量过大，二次高速离心可以将更小的组织碎片去除，有利于后期灭菌处理。

进一步地，步骤3中微滤膜为孔径为0.45um的滤膜。该孔径滤膜可有效去除肉眼看不见的小颗粒组织，有利于后期辐照或过滤除菌处理。

本发明的有益效果是，采用本发明方法提取的牛脑垂体提取物中蛋白含量平均可达到15mg/ml以上，既可以用于细胞培养，也可以用于组织工程培养。且本发明提取方法简单，提取效率高，适于规模化生产，为牛脑垂体提取物的量产提供有力的保障。

附图说明

图1是本发明实施例提供的分别添加本发明自提BPE和对照组BPE培养的人角质形成细胞显微照片；

图2是本发明实施例提供的分别添加本发明自提BPE和对照组BPE构建的含黑色素细胞的表皮模型的HE结果图。

图3是本发明实施例提供的不同灭菌方法对本发明自提BPE蛋白浓度的影响结果对比统计图。

图4是本发明实施例提供的不同灭菌方法对本发明自提BPE角质形成细胞培养效果的对比图。

图5是本发明实施例提供的添加和不添加PMSF蛋白酶抑制剂对本发明自提BPE提取效果的影响结果对比统计图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的详细说明，但本发明并不限于这些实施方式。

实施例1

BPE提取：采集新鲜牛脑垂体40个，置于RPMI-1640培养基中，低温运回操作间。用4℃预冷的PBS刷洗3~5次，清洗血污后，去除外部粘连组织及白色筋膜，裸露整个垂体，然后用剪刀剪碎后加入终浓度为10mmol/L的PMSF，超声破碎，超声波频率300W，5s/次，每两次之间间隔10s，直至组织呈糊状，组织中颗粒直径不超过0.05cm。将上述处理物转至干净烧杯中，按照1g/ml的比例添加4℃预冷的PBS，然后于4℃冰箱中以300rpm的转速搅拌150min，然后转移混合物至离心管中，8000rpm离心10min后收集上清进行二次离心，离心条件10000rpm，15min，收集上清。经过0.45um滤器过滤后，送辐照灭菌，灭菌剂量10KGy，灭菌完成得到本发明的牛脑垂体提取物BPE，冻存备用。

实施例2

BPE提取：采集新鲜牛脑垂体40个，置于RPMI-1640培养基中，低温运回操作间。用4℃预冷的PBS刷洗3~5次，清洗血污后，去除外部粘连组织及白色筋膜，裸露整个垂体，然后用剪刀剪碎后加入终浓度为50mmol/L的PMSF，超声破碎，超声波频率500W，5s/次，每两次之间间隔10s，直至组织呈糊状，组织中颗粒直径不超过0.05cm。将上述处理物转至干净烧杯中，按照2g/ml的比例添加4℃预冷的生理盐水，然后于4℃冰箱中以300rpm的转速搅拌100min，然后转移混合物至离心管中，6000rpm离心15min后收集上清进行二次离心，离心条件10000rpm，15min，收集上清。经过0.45um滤器过滤后，送辐照灭菌，灭菌剂量30KGy，灭菌完成得到本发明的牛脑垂体提取物BPE，冻存备用。

实施例3

BPE提取：采集新鲜牛脑垂体30个，置于DMEM培养基中，低温运回操作间。用4℃预冷的PBS刷洗3~5次，清洗血污后，去除外部粘连组织及白色筋膜，裸露整个垂体，向其中加入终浓度为100mmol/L的PMSF，然后用匀浆机2000rpm，每次启动3S，间隔1~2s进行点动破碎，直至组织呈糊状，组织中颗粒直径不超过0.05cm。将上述处理物转至干净烧杯中，按照0.3g/ml的比例添加4℃预冷的PBS，然后于4℃冰箱中以400rpm的转速搅拌90min，然后转移混合物至离心管中，6000rpm离心10min后收集上清进行二次离心，离心条件13000rpm，10min，收集上清。用组合滤器，依次经过1.2um、0.45um和0.22um滤器过滤除菌，得到本发明的牛脑垂体提取物BPE，冻存备用。

实施例4

BPE提取：采集新鲜牛脑垂体30个，置于DMEM培养基中，低温运回操作间。用4℃预冷的PBS刷洗3~5次，清洗血污后，去除外部粘连组织及白色筋膜，裸露整个垂体，向其中加入终浓度为100mmol/L的PMSF，然后用匀浆机1000rpm，每次启动3S，间隔1~2s进行点动破碎，直至组织呈糊状，组织中颗粒直径不超过0.05cm。将上述处理物转至干净烧杯中，按照0.3g/ml的比例添加4℃预冷的Hanks，然后于4℃冰箱中以400rpm的转速搅拌90min，然后转移混合物至离心管中，6000rpm离心15min后收集上清进行二次离心，离心条件13000rpm，10min，收集上清。用组合滤器，依次经过1.2um、0.45um和0.22um滤器过滤除菌，得到本发明的牛脑垂体提取物BPE，冻存备用。

实施例5

BPE提取：采集新鲜牛脑垂体30个，置于DMEM培养基中，低温运回操作间。用4℃预冷的PBS刷洗3~5次，清洗血污后，去除外部粘连组织及白色筋膜，裸露整个垂体，向其中加入终浓度为50mmol/L的PMSF，然后用匀浆机800rpm，每次启动3S，间隔1~2s进行点动破碎，直至组织呈糊状，组织中颗粒直径不超过0.05cm。将上述处理物转至干净烧杯中，按照0.5g/ml的比例添加4℃预冷的生理盐水，然后于4℃冰箱中以500rpm的转速搅拌120min，然后转移混合物至离心管中，8000rpm离心10min后收集上清进行二次离心，离心条件12000rpm，15min，收集上清。经过0.45um滤器过滤后，用DMEM培养液稀释上清液10倍后，再过0.22um滤器除菌，得到本发明的牛脑垂体提取物BPE，冻存备用。

实施例6

BPE提取：采集新鲜牛脑垂体30个，置于DMEM培养基中，低温运回操作间。用4℃预冷的PBS刷洗3~5次，清洗血污后，去除外部粘连组织及白色筋膜，裸露整个垂体，向其中加入终浓度为50mmol/L的PMSF，然后用匀浆机1800rpm，每次启动3S，间隔1~2s进行点动破碎，直至组织呈糊状，组织中颗粒直径不超过0.05cm。将上述处理物转至干净烧杯中，按照1g/ml的比例添加4℃预冷的Hanks，然后于4℃冰箱中以500rpm的转速搅拌60min，然后转移混合物至离心管中，8000rpm离心10min后收集上清进行二次离心，离心条件13000rpm，15min，收集上清。经过0.45um滤器过滤后，用DMEM培养液稀释上清液30倍后，再过0.22um滤器除菌，得到本发明的牛脑垂体提取物BPE，冻存备用。

（一）蛋白含量检测

通过本发明的方法提取的BPE蛋白含量平均可达到15mg/ml以上。

为了证实本发明的方法提取的BPE具有良好的生物活性，将本发明方法提取的牛脑垂体提取物分别用于细胞培养和组织工程皮肤构建，并与对照组进行比较。

对照组的牛脑垂体提取物提取方法为目前传统的BPE提取方法：机械破碎牛脑垂体，通过添加2ml/g的纯水进行浸提，浸提条件为4℃低速搅拌过夜，然后放置30min待组织沉淀后取上清4000rpm离心10min，收集上清再次进行超速离心30000rpm离心90min后，用0.22um的滤器过滤除菌后完成提取。

（二）细胞培养

在Gbico表皮细胞培养液EpiLife CF kit中分别添加对照组的BPE（蛋白浓度13.8mg/ml）和本发明自提的BPE（蛋白浓度14.3mg/ml），作用浓度25mg/L，用于培养表皮细胞（p4代）并传代1次，如图1所示，同为P4代人角质形成细胞，接种密度及培养条件相同，经过含有两种不同来源BPE的培养液培养，可以明显看出自提BPE组在同一时间下无论是细胞立体感，边缘折光性，克隆形成率，还是在铺板率（增殖能力）上均优于对照组BPE。

（三）组织工程皮肤构建

按照中国专利申请号201410045511.5中所述方法构建含黑色素皮肤模型，构建培养液中分别添加对照组的BPE（蛋白浓度14.2mg/ml）和本发明自提的BPE（蛋白浓度15.3mg/ml），作用浓度25mg/L，如图2组织学结构显示，本发明自提BPE可用于组织工程皮肤构建，且在构建结果与对照组BPE相比均可催生细胞增殖分化成表皮组织特有的四层结构，即基底层、棘层、颗粒层及角质层，结构完整清晰，两者无明显差异。

（四）不同灭菌方法对BPE提取效果的影响

经过该发明技术所获得的同批BPE，第一组采用辐照灭菌，辐照条件为钴60，辐照剂量15KGy；第二组采用分步过滤除菌处理，先用0.45um的滤膜进行过滤，然后在使用前用培养液稀释后用0.22um滤膜过滤除菌；第三组采用组合滤器法按顺序使用1.2um、0.45um和0.22um滤器过滤除菌；三种处理方法所得的BPE，分别检测蛋白浓度后，按照30mg/L的终浓度添加入角质细胞培养液中，培养同批P4代人角质形成细胞，比较三种处理方法所得BPE质量，结果表明三种处理方法所得BPE蛋白浓度第三组最佳（15.8mg/ml），第二组次之（16.1mg/ml），第一组蛋白浓度最小（16.2mg/ml）但与前两组比较差异不明显（见图3）。角质形成细胞培养效果上三组差异不显著,细胞立体感强，核膜核仁清晰，铺板率约65%左右（见图4），表明三组均能有效除菌，且不影响使用结果。

（五）PMSF蛋白酶抑制剂对BPE提取效果的影响

通过在提取时添加和不添加蛋白酶抑制剂PMSF比较BPE提取率，两组统一采用钴60辐照灭菌，辐照剂量10KGy，辐照完成后采用BCA蛋白浓度检测试剂盒检测获取的提取物蛋白浓度。结果表明同样的组织量及处理方法，添加PMSF组蛋白含量明显高于对照组，证明PMSF可有效抑制蛋白降解，保护活性因子成分。结果见图5。

尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims (7)

1.一种牛脑垂体提取物的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1，获取新鲜牛脑垂体，去除组织表面血污及杂物，并剔除外部粘连组织及白色包膜，裸露整个垂体组织；

步骤2，向垂体组织中加入蛋白酶抑制剂，并破碎为糊状，然后再加入蛋白提取液，在0~4℃低温条件下依次经过搅拌、离心，收集上清液；

步骤3，将所述上清液灭菌，即得所述牛脑垂体提取物。

2.根据权利要求1所述的牛脑垂体提取物的提取方法，其特征在于，步骤3所述灭菌方法为以下三种中任一种：

（1）先采用0.45um微滤膜过滤所述上清液后，再采用钴60辐照灭菌，辐照剂量10 KGy~30KGy；

（2）先采用0.45um微滤膜过滤所述上清液，用培养液稀释上清液10-20倍后，再过0.22um滤器除菌；

（3）用组合滤器按照1.2um、0.45um、0.22um的使用顺序，过滤所述上清液。

3.根据权利要求1或2所述的牛脑垂体提取物的提取方法，其特征在于，步骤2所述蛋白酶抑制剂为PMSF，加入垂体组织后的终浓度为10mmol/L~ 100mmol/L。

4.根据权利要求1或2所述的牛脑垂体提取物的提取方法，其特征在于，步骤2所述蛋白提取液为PBS、生理盐水或Hanks。

5.根据权利要求1或2所述的牛脑垂体提取物的提取方法，其特征在于，步骤2所述破碎方式为匀浆处理或破碎后超声处理；若为匀浆处理，每间隔1~2s匀浆破碎3s，匀浆转速为800~2000rpm；若为破碎后超声处理，超声5秒/次，每次间隔10~15s秒，超声频率300~500W。

6.根据权利要求1或2所述的牛脑垂体提取物的提取方法，其特征在于，步骤2所述搅拌为在低于500rpm转速下搅拌60min~150min。

7.根据权利要求1或2所述的牛脑垂体提取物的提取方法，其特征在于，步骤2所述离心为两次离心，先在6000~8000rmp转速下离心10~15min，去除沉淀，收集上清液，再在10000~13000 rmp转速下离心10~15min。