CN106479979A - 6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，该制备方法能够稳定地将大脑、小脑、中脑等功能区的神经干细胞从脑组织中分离、纯化并进行扩增，并且能够显著地提高各功能区神经干细胞的存活率，保持细胞的活率。

Description

6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，特别涉及一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法。
背景技术
干细胞是正常人体内存在的细胞群体，具有高度自我复制和高度分化潜能。近年来随着干细胞研究的深入，人们发现利用干细胞可再生各种组织和器官，例如肝脏、神经组织等。
脑神经干细胞具有干细胞的共性，即自我更新、多向分化和归巢的能力。在近期研究表面不同的脑功能区的神经干细胞，具有不同的分化倾向性，可以分化成为神经元细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、施万细胞以及嗅鞘细胞中的一种或几种；有研究认为，如果利用不同的脑功能区的神经干细胞的不同分化倾向性的特性以及其归巢的特性治疗相应部位的各种细胞引起的脑疾病，可以取得更为精准的治疗效果。那么，如果从同一脑组织中分离培养出不同的脑功能区脑神经干细胞，例如大脑皮层神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞等，是科研人员急需解决的技术问题；现有技术中只有针对大脑皮层、海马体等单一组织进行分离培养的介绍，例如CN102533639公开了一种人胚皮层神经干细胞的原代细胞的制备方法；CN103013918公开了一种人胚中脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法；CN103789268公开了一种分离培养海马神经细胞的方法及其专用培养基；CN102559584公开了一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法；但是并没有发现有对脑组织中6种不同功能区的脑神经细胞进行分离及培养的一个比较系统及稳定的方法。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，该制备方法能够稳定地将大脑、小脑、中脑等功能区的神经干细胞从脑组织中分离、纯化并进行扩增，并且能够显著地提高各功能区神经干细胞的存活率，保持细胞的活率。
本发明具体技术方案如下：
本发明一方面提供了一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，该方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜12-16周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别进行冲洗、消化、终止、分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，并分别进行悬浮培养；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别进行贴壁培养，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞。
进一步的改进，所述制备方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜12-16周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，均分别加入悬浮培养基和初级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养5-7天；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，均分别加入贴壁培养基和次级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养2-5天，收集贴壁细胞，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞。
其中，双抗为细胞培养添加物：青霉素及链霉素溶液，是一种含有青霉素(10000IU)和链霉素(10000μg/mL)在100倍的工作浓度的混合液。
进一步的改进，所述悬浮培养具体操作步骤如下：用悬浮培养基分别将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞稀释至浓度为5.2×104个大脑神经干细胞/mL、1.06×104个小脑神经干细胞/mL、2.12×104个中脑神经干细胞/mL、3.18×104个海马体神经干细胞/mL、1.06×104个嗅鞘神经干细胞/mL和3.18×104个基底节神经干细胞/mL分别接种于培养瓶中，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑神经干细胞悬浮培养7天，培养的第1天、第2天、第5天和第7天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天、第4天和第6天采用初级培养基进行培养；所述小脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天、第3天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用初级培养基进行培养；所述中脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第2天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天至第5天采用初级培养基进行培养；所述海马体神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天至第4天加入悬浮培养基进行培养，培养的第5天至第6天采用初级培养基进行培养；所述嗅鞘神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天至第4天采用初级培养基进行培养；所述基底节神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天、第4天和第6天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天、第3天和第5天采用初级培养基进行培养。
进一步的改进，所述贴壁培养具体操作步骤如下：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别向培养瓶中加入培养基，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑皮层悬浮细胞贴壁培养2天，每天均加入贴壁培养基和次级培养基进行培养；所述小脑悬浮细胞贴壁培养5天，培养的第1天、第3天和第4天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第5天采用次级培养基进行培养；所述中脑悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第1天至第2天采用次级培养基进行培养；所述海马体悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天至第3天采用次级培养基进行培养；所述嗅球悬浮细胞贴壁培养4天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用次级培养基进行培养；所述基底节悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天采用次级培养基进行培养。
本发明结合脑组织不同功能区神经干细胞的生长特性，通过大量试验总结出上述制备方法及条件，能有效维持6种不同功能区的脑神经干细胞的最佳状态，提高各神经干细胞的扩增能力。
进一步的改进，所述的终止液由质量分数为85-95％DMEM培养液、5-10％维生素C和1-2％辅酶Q-10组成。
进一步的改进，所以悬液培养基由DMEM培养液和悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为5-10μg/ml谷氨酰胺、2-3ng/ml促红细胞生成素、0.5-1μg/ml磷酸烯醇式丙酮酸、15-20ng/mlβ-胡萝卜素、13-18ng/ml多聚谷氨酸、7-10μg/ml壳聚糖和15-20ng/ml氯化钠；所述初级培养基由质量分数为85-95％DMEM培养液、1-5％生物素和2-7％表皮细胞生长因子组成。
进一步的改进，所述贴壁培养基由DMEM/F12培养液和贴壁溶质组成，所述贴壁溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为5-10ng/ml卵磷脂、1-3ng/ml氯化硒、1-2μg/ml多聚精氨酸、25-35ng/ml麦芽糖、15-20ng/ml牛血清白蛋白、5-7.5μg/ml多聚赖氨酸和50-60ng/ml胰岛素，所述次级培养基由质量分数为87-97％DMEM/F12培养液、2-3％维生素E、2-7％碱性成纤维细胞生长因子和1-3％赖氨酸组成。
本发明通过利用以上培养基，结合上述制备方法，能够有效地将脑组织中的6中不同功能区的神经干细胞分离出来，并且经过培养后提高细胞扩增速度的同时保持各神经干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。
进一步的改进，所述悬浮溶质还包括浓度为5-10ng/ml胆甾醇和1-2ng/ml蛋氨酸。通过加入这两种物质可提高悬浮培养基的稳定性。
进一步的改进，所述贴壁溶质还包括浓度为5-10ng/ml抗坏血酸和0.5-1ng/ml肝素钠。通过加入这两种物质可提高贴壁培养基的稳定性。
本发明另一方面提供了由上述的制备方法制得的大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞或海马体神经干细胞用于分化成神经元细胞、星形胶质细胞或少突胶质细胞的应用；制得的海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞或基底节神经干细胞用于分化成施万细胞的应用；制得的嗅鞘神经干细胞用于分化成嗅鞘细胞的应用。
本发明的有益效果是：本发明提供了的制备方法能够有效地将脑组织中的6种不同功能区的脑神经干细胞分离出来，再经过悬浮培养和贴壁培养后，能够有效维持地维持6种不同功能区脑神经干细胞的最佳状态，引导各神经干细胞的增殖，且有效地降低了培养和收获过程中6种不同功能区的脑神经干细胞的损伤率和死亡率，缩短生长周期；在能有效提高细胞扩增速度的同时保持6种不同功能区的脑神经干细胞的干性，不影响其分化性能，延长传代次数。
具体实施方式
实施例1
一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜12-16周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别进行冲洗、消化、终止、分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，并分别进行悬浮培养；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别进行贴壁培养，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞。
实施例2
一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜13周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；所述的终止液由质量分数为92％DMEM培养液、7％维生素C和1％辅酶Q-10组成；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，均分别加入悬浮培养基和初级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养5-7天；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，均分别加入贴壁培养基和次级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养2-5天，收集贴壁细胞，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞。
实施例3
一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜13周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；所述的终止液由质量分数为93％DMEM培养液、5％维生素C和2％辅酶Q-10组成；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，均分别加入悬浮培养基和初级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养5-7天；所以悬液培养基由DMEM培养液和悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为5μg/ml谷氨酰胺、2ng/ml促红细胞生成素、1μg/ml磷酸烯醇式丙酮酸、15ng/mlβ-胡萝卜素、18ng/ml多聚谷氨酸、7μg/ml壳聚糖和20ng/ml氯化钠；所述初级培养基由质量分数为90％DMEM培养液、4％生物素和6％表皮细胞生长因子组成；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，均分别加入贴壁培养基和次级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养2-5天，收集贴壁细胞，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；所述贴壁培养基由DMEM/F12培养液和贴壁溶质组成，所述贴壁溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为5ng/ml卵磷脂、3ng/ml氯化硒、1μg/ml多聚精氨酸、25ng/ml麦芽糖、20ng/ml牛血清白蛋白、7.5μg/ml多聚赖氨酸和60ng/ml胰岛素，所述次级培养基由质量分数为95％DMEM/F12培养液、2％维生素E、2％碱性成纤维细胞生长因子和1％赖氨酸组成。
实施例4
一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜13周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；所述的终止液由质量分数为90％DMEM培养液、8％维生素C和2％辅酶Q-10组成；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，均分别加入悬浮培养基和初级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养5-7天；所以悬液培养基由DMEM培养液和悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为10μg/ml谷氨酰胺、3ng/ml促红细胞生成素、0.5μg/ml磷酸烯醇式丙酮酸、20ng/mlβ-胡萝卜素、13ng/ml多聚谷氨酸、10μg/ml壳聚糖、15ng/ml氯化钠、5ng/ml胆甾醇和2ng/ml蛋氨酸；所述初级培养基由质量分数为88％DMEM培养液、5％生物素和7％表皮细胞生长因子组成；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于明胶包被的培养瓶中，均分别加入贴壁培养基和次级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养2-5天，收集贴壁细胞，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；所述贴壁培养基由DMEM/F12培养液和贴壁溶质组成，所述贴壁溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为10ng/ml卵磷脂、1ng/ml氯化硒、2μg/ml多聚精氨酸、35ng/ml麦芽糖、15ng/ml牛血清白蛋白、5μg/ml多聚赖氨酸、50ng/ml胰岛素、5ng/ml抗坏血酸和0.5ng/ml肝素钠，所述次级培养基由质量分数为90％DMEM/F12培养液、3％维生素E、5％碱性成纤维细胞生长因子和2％赖氨酸组成。
实施例5
一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜13周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；
b.悬浮培养：用悬浮培养基分别将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞稀释至浓度为5.2×104个大脑神经干细胞/mL、1.06×104个小脑神经干细胞/mL、2.12×104个中脑神经干细胞/mL、3.18×104个海马体神经干细胞/mL、1.06×104个嗅鞘神经干细胞/mL和3.18×104个基底节神经干细胞/mL分别接种于培养瓶中，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑神经干细胞悬浮培养7天，培养的第1天、第2天、第5天和第7天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天、第4天和第6天采用初级培养基进行培养；所述小脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天、第3天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用初级培养基进行培养；所述中脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第2天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天至第5天采用初级培养基进行培养；所述海马体神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天至第4天加入悬浮培养基进行培养，培养的第5天至第6天采用初级培养基进行培养；所述嗅鞘神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天至第4天采用初级培养基进行培养；所述基底节神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天、第4天和第6天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天、第3天和第5天采用初级培养基进行培养；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别向培养瓶中加入培养基，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑皮层悬浮细胞贴壁培养2天，每天均加入贴壁培养基和次级培养基进行培养；所述小脑悬浮细胞贴壁培养5天，培养的第1天、第3天和第4天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第5天采用次级培养基进行培养；所述中脑悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第1天至第2天采用次级培养基进行培养；所述海马体悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天至第3天采用次级培养基进行培养；所述嗅球悬浮细胞贴壁培养4天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用次级培养基进行培养；所述基底节悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天采用次级培养基进行培养。
实施例6
一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜13周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；所述的终止液由质量分数为90％DMEM培养液、8％维生素C和2％辅酶Q-10组成；
b.悬浮培养：用悬浮培养基分别将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞稀释至浓度为5.2×104个大脑神经干细胞/mL、1.06×104个小脑神经干细胞/mL、2.12×104个中脑神经干细胞/mL、3.18×104个海马体神经干细胞/mL、1.06×104个嗅鞘神经干细胞/mL和3.18×104个基底节神经干细胞/mL分别接种于培养瓶中，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑神经干细胞悬浮培养7天，培养的第1天、第2天、第5天和第7天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天、第4天和第6天采用初级培养基进行培养；所述小脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天、第3天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用初级培养基进行培养；所述中脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第2天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天至第5天采用初级培养基进行培养；所述海马体神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天至第4天加入悬浮培养基进行培养，培养的第5天至第6天采用初级培养基进行培养；所述嗅鞘神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天至第4天采用初级培养基进行培养；所述基底节神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天、第4天和第6天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天、第3天和第5天采用初级培养基进行培养；所以悬液培养基由DMEM培养液和悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为7μg/ml谷氨酰胺、2ng/ml促红细胞生成素、0.7μg/ml磷酸烯醇式丙酮酸、17ng/mlβ-胡萝卜素、15ng/ml多聚谷氨酸、8μg/ml壳聚糖和18ng/ml氯化钠；所述初级培养基由质量分数为92％DMEM培养液、5％生物素和3％表皮细胞生长因子组成；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别向培养瓶中加入培养基，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑皮层悬浮细胞贴壁培养2天，每天均加入贴壁培养基和次级培养基进行培养；所述小脑悬浮细胞贴壁培养5天，培养的第1天、第3天和第4天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第5天采用次级培养基进行培养；所述中脑悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第1天至第2天采用次级培养基进行培养；所述海马体悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天至第3天采用次级培养基进行培养；所述嗅球悬浮细胞贴壁培养4天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用次级培养基进行培养；所述基底节悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天采用次级培养基进行培养；所述贴壁溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为7ng/ml卵磷脂、2ng/ml氯化硒、1μg/ml多聚精氨酸、30ng/ml麦芽糖、17ng/ml牛血清白蛋白、6μg/ml多聚赖氨酸和55ng/ml胰岛素，所述次级培养基由质量分数为91％DMEM/F12培养液、2％维生素E、5％碱性成纤维细胞生长因子和2％赖氨酸组成。
实施例7
一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜13周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；所述的终止液由质量分数为93％DMEM培养液、6％维生素C和1％辅酶Q-10组成；
b.悬浮培养：用悬浮培养基分别将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞稀释至浓度为5.2×104个大脑神经干细胞/mL、1.06×104个小脑神经干细胞/mL、2.12×104个中脑神经干细胞/mL、3.18×104个海马体神经干细胞/mL、1.06×104个嗅鞘神经干细胞/mL和3.18×104个基底节神经干细胞/mL分别接种于培养瓶中，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑神经干细胞悬浮培养7天，培养的第1天、第2天、第5天和第7天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天、第4天和第6天采用初级培养基进行培养；所述小脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天、第3天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用初级培养基进行培养；所述中脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第2天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天至第5天采用初级培养基进行培养；所述海马体神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天至第4天加入悬浮培养基进行培养，培养的第5天至第6天采用初级培养基进行培养；所述嗅鞘神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天至第4天采用初级培养基进行培养；所述基底节神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天、第4天和第6天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天、第3天和第5天采用初级培养基进行培养；所以悬液培养基由DMEM培养液和悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为7μg/ml谷氨酰胺、2ng/ml促红细胞生成素、0.7μg/ml磷酸烯醇式丙酮酸、17ng/mlβ-胡萝卜素、15ng/ml多聚谷氨酸、8μg/ml壳聚糖、18ng/ml氯化钠、7ng/ml胆甾醇和2ng/ml蛋氨酸；所述初级培养基由质量分数为92％DMEM培养液、5％生物素和3％表皮细胞生长因子组成；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别向培养瓶中加入培养基，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑皮层悬浮细胞贴壁培养2天，每天均加入贴壁培养基和次级培养基进行培养；所述小脑悬浮细胞贴壁培养5天，培养的第1天、第3天和第4天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第5天采用次级培养基进行培养；所述中脑悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第1天至第2天采用次级培养基进行培养；所述海马体悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天至第3天采用次级培养基进行培养；所述嗅球悬浮细胞贴壁培养4天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用次级培养基进行培养；所述基底节悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天采用次级培养基进行培养；所述贴壁溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为7ng/ml卵磷脂、2ng/ml氯化硒、1μg/ml多聚精氨酸、30ng/ml麦芽糖、17ng/ml牛血清白蛋白、6μg/ml多聚赖氨酸、55ng/ml胰岛素、7.5ng/ml抗坏血酸和0.5ng/ml肝素钠，所述次级培养基由质量分数为91％DMEM/F12培养液、2％维生素E、5％碱性成纤维细胞生长因子和2％赖氨酸组成。
试验1：6种不同功能区脑神经干细胞体外扩增情况
1)分组
试验1组：本发明实施例3所述的制备方法；
试验2组：本发明实施例4所述的制备方法；
试验3组：本发明实施例6所述的制备方法；
对照1组：CN102533639公开的一种人胚皮层神经干细胞的原代细胞的制备方法；
对照2组：CN103013918公开的一种人胚中脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法；
对照3组：CN103789268公开的一种分离培养海马神经细胞的方法；
对照4组：CN102559584公开的一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法；
对照5组：CN102399747公开的一种神经干细胞的传代分离方法；
2)采用台盼蓝经典染色法对试验1组-3组和对照1组-5组的6种不同功能区的脑神经干细胞进行计数，分别统计分离细胞计数、培养后细胞总数；
3)将各功能区的脑神经干细胞进行冻存，复苏后通过流式细胞和细胞培养检测，并计算存活率；
4)，用巢蛋白抗体做免疫细胞荧光染色，对阳性细胞进行形态学鉴定，并统计出巢蛋白含量，各项结果见表1。
表1各功能区脑神经干细胞体外培养扩增试验结果
由表1可以看出，本发明所述的制备方法可以有效地进行体外培养各功能区的脑神经干细胞，扩增培养效率高，与对照组有非常显著的差异，另外经台盼蓝经典染色法可测的试验组每次传代后细胞活率都在90％以上，较对照组有差异；并且本发明制备的各功能区的脑神经干细胞高表达巢蛋白，并且培养后的各功能区的脑神经干细胞经过具有均质性。
试验2：6种不同功能区脑神经干细胞分化状态检测
1)分组
试验1组：本发明实施例3所述的制备方法；
试验2组：本发明实施例4所述的制备方法；
试验3组：本发明实施例6所述的制备方法；
对照1组：CN102533639公开的一种人胚皮层神经干细胞的原代细胞的制备方法；
对照2组：CN103013918公开的一种人胚中脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法；
对照3组：CN103789268公开的一种分离培养海马神经细胞的方法；
对照4组：CN102559584公开的一种分离培养人胚嗅鞘细胞以及纯化的方法；
对照5组：CN102399747公开的一种神经干细胞的传代分离方法；
2)试验方法
(1)各组分别采用相对应的培养方法，并分别收集培养后的6种不同功能区的脑神经干细胞，将6种不同功能的脑神经干细胞分别接种于6个多聚赖氨酸包被的120孔板中，分别加入DMEM/F12培养液，各培养7天；
(2)移去培养液，每孔加PHEM固定液(60mM PIPES，25mM HEPES，10mM EGTA，2mM MgSO4，pH 7.0)，反应10min，移去PHEM固定液，用PBS洗涤3次；
(3)每孔加入封闭血清，室温封闭1h；
(4)移去封闭血清，将6种不同功能区的脑神经干细胞接种的每个120孔板均分成5组，每组24孔；每个120孔板的第1组均加入一抗鼠抗04IgM抗体，室温反应30min；第2组均加入兔抗GFAP IgG抗体，室温反应45min；第3组均加入鼠抗β-微管蛋白IgG2b抗体，4℃反应12-16h；第4组均加入兔抗大鼠P-75抗体，4℃反应过夜，并用RT-PCR检测P0、Krox-20和Oct-6中mRNA的表达；第5组均加入兔抗鼠S-100抗体，4℃反应过夜，并用RT-PCR检测P0、Krox-20和Oct-6中mRNA的表达；每组反应后，分别用PBS洗涤五次；
(5)每孔没分别加入相应的荧光标记的二抗，室温反应1h，用PBS洗涤五次；
(6)在倒置显微镜下观察和计数，结果见表2。
表2试验组和对照组各功能区脑神经干细胞分化结果
其中“-”表示某一细胞内没有相应细胞标记物的表达，并且通过实验可知，能够表达S-100蛋白的神经干细胞还能够通过RT-PCR检测到P0、Krox-20和Oct-6中mRNA的表达；而表达P-75蛋白的神经干细胞不能为检测到P0、Krox-20和Oct-6中mRNA的表达，说明第5组中的神经干细胞能够分化成施万细胞，而第4组中的细胞能够分化成嗅鞘细胞。
经试验结果分析可知，试验1-3组分离培养的大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞和海马体神经干细胞有50％以上能够分化成神经元干细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞；试验1-3组分离培养的海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞有50％以上能够分化成施万细胞，而嗅鞘神经干细胞有50％以上能够分化成嗅鞘细胞；与对照组相比具有显著性差异。

Claims (10)

1.一种6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜12-16周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别进行冲洗、消化、终止、分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，并分别进行悬浮培养；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别进行贴壁培养，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞。
2.如权利要求1所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
a.分离：取新鲜12-16周离体的胎龄胚胎，无菌取出脑组织，将脑组织在解剖显微镜下分离出大脑皮层、小脑组织、中脑组织、海马体、嗅球和基底节6种不同脑功能区，分别将分离出的6种不同脑功能区的被膜或表面血管剥离，剪碎成0.5mm3/块，并用生理盐水和双抗混合液分别冲洗三遍，再分别用0.25％的胰蛋白酶消化液在37℃下消化20min，并分别用终止液终止消化，用吸管吹打散，120目滤网过滤，200转/min离心，分离、计数，分别制得大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞；
b.悬浮培养：将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞分别接种于培养瓶中，均分别加入悬浮培养基和初级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养5-7天；
c.贴壁培养：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，均分别加入贴壁培养基和次级培养基，在37℃，5％CO2条件下，各培养2-5天，收集贴壁细胞，分别制得传代大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞。
3.如权利要求2所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，步骤b中所述悬浮培养具体操作步骤如下：用悬浮培养基分别将大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞、海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞和基底节神经干细胞稀释至浓度为5.2×104个大脑神经干细胞/mL、1.06×104个小脑神经干细胞/mL、2.12×104个中脑神经干细胞/mL、3.18×104个海马体神经干细胞/mL、1.06×104个嗅鞘神经干细胞/mL和3.18×104个基底节神经干细胞/mL分别接种于培养瓶中，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑神经干细胞悬浮培养7天，培养的第1天、第2天、第5天和第7天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天、第4天和第6天采用初级培养基进行培养；所述小脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天、第3天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用初级培养基进行培养；所述中脑神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第2天加入悬浮培养基进行培养，培养的第3天至第5天采用初级培养基进行培养；所述海马体神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天至第4天加入悬浮培养基进行培养，培养的第5天至第6天采用初级培养基进行培养；所述嗅鞘神经干细胞悬浮培养5天，培养的第1天和第5天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天至第4天采用初级培养基进行培养；所述基底节神经干细胞悬浮培养6天，培养的第1天、第4天和第6天加入悬浮培养基进行培养，培养的第2天、第3天和第5天采用初级培养基进行培养。
4.如权利要求2所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，步骤c中所述贴壁培养具体操作步骤如下：分别将步骤b中每个培养瓶中的悬浮细胞接种于包被液包被的培养瓶中，并分别向培养瓶中加入培养基，在37℃，5％CO2条件下，分别进行培养；所述大脑皮层悬浮细胞贴壁培养2天，每天均加入贴壁培养基和次级培养基进行培养；所述小脑悬浮细胞贴壁培养5天，培养的第1天、第3天和第4天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第5天采用次级培养基进行培养；所述中脑悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第1天至第2天采用次级培养基进行培养；所述海马体悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天至第3天采用次级培养基进行培养；所述嗅球悬浮细胞贴壁培养4天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天和第4天采用次级培养基进行培养；所述基底节悬浮细胞贴壁培养3天，培养的第1天和第3天加入贴壁培养基进行培养，培养的第2天采用次级培养基进行培养。
5.如权利要求1所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，步骤a中所述的终止液由质量分数为85-95％DMEM培养液、5-10％维生素C和1-2％辅酶Q-10组成。
6.如权利要求2所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，所以悬液培养基由DMEM培养液和悬浮溶质组成，所述悬浮溶质及其在DMEM培养液中的浓度为5-10μg/ml谷氨酰胺、2-3ng/ml促红细胞生成素、0.5-1μg/ml磷酸烯醇式丙酮酸、15-20ng/mlβ-胡萝卜素、13-18ng/ml多聚谷氨酸、7-10μg/ml壳聚糖和15-20ng/ml氯化钠；所述初级培养基由质量分数为85-95％DMEM培养液、1-5％生物素和2-7％表皮细胞生长因子组成。
7.如权利要求1所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述贴壁培养基由DMEM/F12培养液和贴壁溶质组成，所述贴壁溶质及其在DMEM/F12培养液中的浓度为5-10ng/ml卵磷脂、1-3ng/ml氯化硒、1-2μg/ml多聚精氨酸、25-35ng/ml麦芽糖、15-20ng/ml牛血清白蛋白、5-7.5μg/ml多聚赖氨酸和50-60ng/ml胰岛素，所述次级培养基由质量分数为87-97％DMEM/F12培养液、2-3％维生素E、2-7％碱性成纤维细胞生长因子和1-3％赖氨酸组成。
8.如权利要求1所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述悬浮溶质还包括浓度为5-10ng/ml胆甾醇和1-2ng/ml蛋氨酸。
9.如权利要求1所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，其特征在于，所述贴壁溶质还包括浓度为5-10ng/ml抗坏血酸和0.5-1ng/ml肝素钠。
10.由权利要求1-9任一项所述的制备方法制得的大脑神经干细胞、小脑神经干细胞、中脑神经干细胞或海马体神经干细胞用于分化成神经元细胞、星形胶质细胞或少突胶质细胞的应用；制得的海马体神经干细胞、嗅鞘神经干细胞或基底节神经干细胞用于分化成施万细胞的应用；制得的嗅鞘神经干细胞用于分化成嗅鞘细胞的应用。
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