CN116426478A - 一种脑源性神经前体细胞培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及细胞生物技术领域，公开了一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具体包括以下步骤：步骤一、细胞获取；步骤二、环境构建；步骤三、协同培养；步骤四、传代培养；该脑源性神经前体细胞培养的方法，根据向不同脑功能区发育的脑组织提取出对应位置的细胞悬液后，构建出适应多个对应脑功能区位置提取细胞悬液同步培养的大型培养皿，以培养液为共同接触介质，有效模拟细胞的自然生长环境，保证最终得到神经前体细胞的优良性，更为贴合脑部环境的同时，判断结果更为精准。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生物技术领域，具体为一种脑源性神经前体细胞培养的方法。
背景技术
神经前体细胞是指界于神经干细胞和神经元细胞之间的一种神经细胞，它具有分化成神经元细胞的能力，并且具有神经干细胞多向分化的能力，神经前体细胞具有同神经干细胞类似的干性功能。
神经干细胞在动物中枢神经系统中广泛存在，但是含量极低。目前神经干细胞获取的主要来源是通过iPS诱导，反向诱导需要外源病毒基因的引入，这种外源病毒引入所带来的风险是难以避免的，因此，神经干细胞依然存在着获取来源受限，原代细胞来源相对较少的问题，神经前体细胞具有同神经干细胞类似的分化潜能，是神经干细胞最好的替代型细胞。
如专利号为CN103013918A所述的脑神经干细胞的原代细胞的分离传代培养方法和专利号为CN106479979A所述的6种不同脑功能区脑神经干细胞的制备方法，均通过提取脑神经干细胞实现相应功能，这虽然可以快速大量获得与神经干细胞功能类似的神经前体细胞的方法，但是其对于脑部不同功能区细胞都是采用单独培养的方式，这样不仅操作麻烦，而且无法得到自然生长环境下的优良神经前体细胞，在进行病菌与对应神经前提细胞的影响判断时，无法得到更为精准的判断。
发明内容
（一）解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种脑源性神经前体细胞培养的方法，解决了单独培养获取神经前体细胞的方式，不仅操作麻烦，而且无法得到自然生长环境下的优良神经前体细胞的问题。
（二）技术方案
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具体包括以下步骤：
一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具体包括以下步骤：
步骤一、细胞获取：选用向不同脑功能区发育的SD大鼠胚胎脑组织，利用吹打法将对应脑组织用吸管吹打成细胞悬液，用200目筛网过滤，经台盼蓝染色后进行观测至镜下可见单个细胞或者2-3个细胞微团，计数测定存活细胞比例，根据存活细胞比例调整细胞悬液的细胞浓度，再将细胞悬液按1×105个/ml接种至一定数量的培养瓶并增殖后，取5个40×视野计算镜下增殖后的平均细胞数目，并按镜下面积与培养瓶面积的比例结合总培养瓶数进行数目计算，得到总细胞数目；
步骤二、环境构建：构建大型培养皿（1），用隔板（3）分隔出一定数量的培养室（4），在培养室（4）中放置定位培养皿（6），大型培养皿（1）的中部设有加注筒（2），加注筒（2）的表面设有与培养室（4）连通的槽口（5）；
步骤三、协同培养：在定位培养皿（6）中放入垫板培养筒（7），向加注筒（2）中加入培养液，至培养液通过槽口（5）流入到定位培养皿（6），并进入到垫板培养筒（7）中，此时将所述步骤一中获得的向不同脑功能区发育的脑组织细胞悬液分别接种到步骤二中不同的垫板培养筒（7）中，将大型培养皿（1）放置于培养箱中培养；
步骤四、传代培养：在进行所述步骤三的培养过程中，1-2d后更换大型培养皿（1）并进行半量补液，3-4d后根据细胞生长情况半量换液，5-6d后在大型培养皿（1）中进行传代培养。
优选地，所述步骤一中的脑功能区包括大脑、小脑和脑干，其中大脑包括左脑和右脑，小脑包括延脑、桥脑和中脑。
优选地，所述步骤三中培养箱中的环境为3.5%二氧化碳、37℃。
优选地，所述步骤三中的培养液采用基础培养基由DMEM/F12加入表皮细胞生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF和肝素后制得。
优选地，所述培养液中表皮细胞生长因子EGF和碱性成纤维细胞生长因子bFGF终浓度在5-25ng/ml，肝素含量在0.001-0.0001%。
优选地，所述步骤二具体为：
构建一个大型培养皿（1），在大型培养皿（1）内腔中部固定安装一个加注筒（2），同时在加注筒（2）外周和大型培养皿（1）之间间隔均匀的固定安装至少六个隔板（3），利用隔板（3）将大型培养皿（1）内腔分隔出六个培养室（4），并且在加注筒（2）的表面开设出与培养室（4）连通的槽口（5），在培养室（4）中放置定位培养皿（6）。
通过采用上述技术方案，根据不同脑功能区提取出对应位置的细胞悬液后，构建出适应多个脑功能区提取细胞悬液同步培养的大型培养皿，以培养液为共同接触介质，有效模拟细胞的自然生长环境，保证最终得到神经前体细胞的优良性，通过加入肝素成分，大大降低了传统神经前体细胞在培养过程中容易聚集成球，导致细胞球中心细胞由于不能获取营养成分而死亡，最终影响细胞活率及质量的问题。
（三）有益效果
本发明提供了一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具备以下有益效果：
（1）本发明通过根据不同脑功能区提取出对应位置的细胞悬液后，构建出适应多个脑功能区提取细胞悬液同步培养的大型培养皿，以培养液为共同接触介质，有效模拟细胞的自然生长环境，保证最终得到神经前体细胞的优良性；
（2）本发明通过加入肝素成分，大大降低了传统神经前体细胞在培养过程中容易聚集成球，导致细胞球中心细胞由于不能获取营养成分而死亡，最终影响细胞活率及质量的问题。
附图说明
图1为本发明的流程示意图；
图2为本发明大型培养皿结构的俯视图；
图3为本发明大型培养皿结构的剖视图；
图4为本发明神经前体细胞在4倍显微镜下观察的示意图；
图5为本发明神经前体细胞在10倍显微镜下观察的示意图；
图6为本发明神经前体细胞在20倍显微镜下观察的示意图；
图7为本发明神经前体细胞在40倍显微镜下观察的示意图；
图8为本发明悬浮细胞团经免疫荧光染色后的示意图；
图9为本发明无FBS培养诱导分化阳性比例图；
图10为本发明5% FBS培养诱导分化阳性比例图；
图11为本发明诱导分化培养天数（x轴）、FBS浓度（y轴）与NF阳性比例（z轴）拟合示意图；
图12为本发明诱导分化培养天数（x轴）、FBS浓度（y轴）与GFAP阳性比例（z轴）拟合示意图；
图中，1、大型培养皿；2、加注筒；3、隔板；4、培养室；5、槽口；6、定位培养皿；7、垫板培养筒。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
请参阅图1-12，本发明实施例提供以下技术方案：
实施例一
一种脑源性神经前体细胞培养的方法，具体包括以下步骤：
步骤一、细胞获取：选用向不同脑功能区（左脑、右脑、延脑、桥脑、中脑和脑干）发育的SD大鼠胚胎脑组织，利用吹打法获取对应脑组织的细胞悬液，用200目筛网过滤，经台盼蓝染色后进行观测至镜下可见单个细胞或者2-3个细胞微团，计数测定存活细胞比例，根据存活细胞比例调整细胞悬液的细胞浓度，再将细胞悬液按1×105个/ml接种至一定数量的培养瓶并增殖后，取5个40×视野计算镜下增殖后的平均细胞数目，并按镜下面积与培养瓶面积的比例结合总培养瓶数进行数目计算，得到总细胞数目；
本步骤将选用向不同脑功能区发育的细胞进行培养，是因为不同脑区的神经前体细胞发育的趋势不同，同时基于控制变量，控制外界培养条件一致，表达出向不同脑功能区发育的细胞其本身具有的发育倾向，神经前体细胞可以发育为神经元细胞，如具有较长的细胞体和较长的轴突的锥形神经元细胞主要分布在大脑，负责认知功能，具有小圆形的细胞体和短的轴突的球形神经元细胞主要分布在小脑，负责协调肌肉运动等，影响神经前体细胞分化结果的主要有两个因素，一个因素是外界诱导分化，而另一主要因素为向不同脑功能区发育的对应位置细胞的选用，处于对应不同脑功能区位置的神经前体细胞具有不同的分化趋势，对于其分化成不同的神经元起到关键的作用；
步骤二、环境构建：构建一个大型培养皿1，在大型培养皿1内腔中部固定安装一个加注筒2，同时在加注筒2外周和大型培养皿1之间间隔均匀的固定安装至少六个隔板3，利用隔板3将大型培养皿1内腔分隔出六个培养室4，并且在加注筒2的表面开设出与培养室4连通的槽口5，在培养室4中放置定位培养皿6；
步骤三、协同培养：在定位培养皿6中放入垫板培养筒7，向步骤二中的加注筒2中加入以DMEM/F12为基础培养基，并且表皮细胞生长因子EGF和碱性成纤维细胞生长因子bFGF终浓度在5-25ng/ml、肝素含量在0.001-0.0001%的培养液，至培养液通过槽口5流入到定位培养皿6中，并进入到垫板培养筒7中，此时将步骤一中获得的向不同脑功能区发育的细胞悬液分别接种到步骤二中不同的垫板培养筒7中，将大型培养皿1放置于3.5%二氧化碳、37℃的培养箱中培养；
步骤四、传代培养：在进行步骤三的培养箱中培养过程中，1-2d后更换大型培养皿1并进行半量补液，3-4d后根据细胞生长情况半量换液，5-6d后在大型培养皿1中进行传代培养。
作为详细说明，使用吹打法制备细胞悬液的方式包括：将向不同脑功能区发育的脑组织转移到15ml离心管中，加3ml基础培养基DMEM/F12，用巴氏吸管反复轻轻吹打，直至组织和PBS液体混合成为悬浊液状态，得到悬浊液后，通过70um细胞筛过滤，获得细胞悬液定容到10ml，取样计数；
需要说明的是，步骤三中的接种细胞密度在0.8-2.0×106个/ml；
作为详细说明，如图4-7所示，从对应向左脑功能区发育位置的脑组织提取的细胞悬液，在接种培养后第6天在4、10、20、40倍显微镜下观察，为神经干细胞典型的悬浮生长状态，且形成较为规则的神经球，传代培养后获得的悬浮细胞团，经免疫荧光染色，如图8所示，扩增得到的细胞球呈nestin抗原阳性显色，而其进一步发育的神经元细胞和胶质细胞等细胞，nestin抗原阴性不显色，通过神经前体细胞的诱导分化试验检测，其与神经干细胞具有相近的生物学特性，具体诱导分化试验如下：
正常神经前体细胞nestin染色为阳性，采用多聚赖氨酸涂片后培养细胞分化成神经元细胞和星形胶质细胞，采用胎牛血清培养体系培养后神经元细胞，星形胶质细胞比例发生较大变化，分别采用神经元细胞和星形胶质细胞的标志物NF和GFAP进行检测，即NF阳性为神经元细胞，GFAP阳性为星形胶质细胞，结果如下表1所示：
表1：诱导分化试验分化比例表
具体诱导分化试验检测结果如图9-10所示，检测结果曲线拟合分析如图11-12所示；采用nestin进行免疫荧光染色原因为其主要表达于未分化和/或具有分裂能力的细胞中，神经前体细胞最先表达nestin，当神经细胞的迁移基本完成后，nestin的表达逐渐减少，一旦神经前体细胞朝向终末方向分化成神经元细胞和胶质细胞时，nestin停止表达，故nestin被认为是中枢神经系统发育过程中神经前体细胞的重要标志，神经干细胞的发育早于神经前体细胞，且神经干细胞具有发育成神经前体细胞的能力，神经前体细胞分化为神经元的能力高于神经干细胞，神经前体细胞的生物学特性与神经干细胞相似，神经前体细胞一定程度上保留了神经干细胞的多分化潜能。
Claims (6)
1.一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
步骤一、细胞获取：选用向不同脑功能区发育的SD大鼠胚胎脑组织，利用吹打法将对应脑组织用吸管吹打成细胞悬液，用200目筛网过滤，经台盼蓝染色后进行观测至镜下可见单个细胞或者2-3个细胞微团，计数测定存活细胞比例，根据存活细胞比例调整细胞悬液的细胞浓度，再将细胞悬液按1×105个/ml接种至一定数量的培养瓶并增殖后，取5个40×视野计算镜下增殖后的平均细胞数目，并按镜下面积与培养瓶面积的比例结合总培养瓶数进行数目计算，得到总细胞数目；
步骤二、环境构建：构建大型培养皿（1），用隔板（3）分隔出一定数量的培养室（4），在培养室（4）中放置定位培养皿（6），大型培养皿（1）的中部设有加注筒（2），加注筒（2）的表面设有与培养室（4）连通的槽口（5）；
步骤三、协同培养：在定位培养皿（6）中放入垫板培养筒（7），向加注筒（2）中加入培养液，至培养液通过槽口（5）流入到定位培养皿（6），并进入到垫板培养筒（7）中，此时将所述步骤一中获得的向不同脑功能区发育的脑组织细胞悬液分别接种到步骤二中不同的垫板培养筒（7）中，将大型培养皿（1）放置于培养箱中培养；
步骤四、传代培养：在进行所述步骤三的培养过程中，1-2d后更换大型培养皿（1）并进行半量补液，3-4d后根据细胞生长情况半量换液，5-6d后在大型培养皿（1）中进行传代培养。
2.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤一中的脑功能区包括大脑、小脑和脑干，其中大脑包括左脑和右脑，小脑包括延脑、桥脑和中脑。
3.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤三中培养箱中的环境为3.5%二氧化碳、37℃。
4.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤三中的培养液采用基础培养基由DMEM/F12加入表皮细胞生长因子EGF、碱性成纤维细胞生长因子bFGF和肝素后制得。
5.根据权利要求4所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述培养液中表皮细胞生长因子EGF和碱性成纤维细胞生长因子bFGF终浓度在5-25ng/ml，肝素含量在0.001-0.0001%。
6.根据权利要求1所述的一种脑源性神经前体细胞培养的方法，其特征在于：所述步骤二具体为：
构建一个大型培养皿（1），在大型培养皿（1）内腔中部固定安装一个加注筒（2），同时在加注筒（2）外周和大型培养皿（1）之间间隔均匀的固定安装至少六个隔板（3），利用隔板（3）将大型培养皿（1）内腔分隔出六个培养室（4），并且在加注筒（2）的表面开设出与培养室（4）连通的槽口（5），在培养室（4）中放置定位培养皿（6）。
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