CN110205294A - 原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在铁代谢中的应用 - Google Patents

原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在铁代谢中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110205294A
CN110205294A CN201910345162.1A CN201910345162A CN110205294A CN 110205294 A CN110205294 A CN 110205294A CN 201910345162 A CN201910345162 A CN 201910345162A CN 110205294 A CN110205294 A CN 110205294A
Authority
CN
China
Prior art keywords
culture
astroglia
neuron
ohda
ventral midbrain
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910345162.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110205294B (zh
Inventor
谢俊霞
王俊
许曼曼
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Qingdao University
Original Assignee
Qingdao University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Qingdao University filed Critical Qingdao University
Priority to CN201910345162.1A priority Critical patent/CN110205294B/zh
Publication of CN110205294A publication Critical patent/CN110205294A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110205294B publication Critical patent/CN110205294B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/30—Nerves; Brain; Eyes; Corneal cells; Cerebrospinal fluid; Neuronal stem cells; Neuronal precursor cells; Glial cells; Oligodendrocytes; Schwann cells; Astroglia; Astrocytes; Choroid plexus; Spinal cord tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0618—Cells of the nervous system
    • C12N5/0622—Glial cells, e.g. astrocytes, oligodendrocytes; Schwann cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2502/00—Coculture with; Conditioned medium produced by
    • C12N2502/08—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system
    • C12N2502/081—Coculture with; Conditioned medium produced by cells of the nervous system neurons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在铁代谢、尤其是铁转运中的应用，属于细胞生物学领域，该技术方案通过设计试验方法检测该共培养体系，可在细胞层面明确神经元铁的来源、其与星形胶质细胞间的相互影响，以及铁转运的方向性问题。本发明建立的原代星形胶质细胞与原代中脑腹侧神经元共培养体系是一种新的研究帕金森病的细胞模型，可用于研究帕金森病等神经退行性疾病脑内高铁的相关研究中。

Description

原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在铁代 谢中的应用
技术领域
本发明属于细胞生物学领域，尤其涉及一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在铁代谢、尤其是铁转运中的应用。
背景技术
帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一种多发于中老年的第二大神经系统退行性疾病，其病理学特征为黑质多巴胺(dopamine,DA)能神经元缺失。近年来，脑内高铁导致黑质－纹状体系统DA能神经元功能的损伤已成为越来越受到神经科学家关注的热点问题。目前PD铁沉积的研究主要集中在DA能神经元，铁负载时，神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞有铁沉积，而星形胶质细胞却在同样的情况下没有铁沉积。那么，星形胶质细胞在脑铁代谢以及PD黑质铁聚积过程中是如何发挥作用的是进一步研究PD病人中脑内高铁以及铁沉积分布区域不同的关键。
目前，研究星形胶质细胞和DA能神经元铁转运的研究方法，主要是利用激光共聚焦显微镜，与钙黄绿素结合，实时观察铁转入细胞与转出细胞的速率。此种方法虽然可以高效实时观察其铁转运速率的变化，但无法研究星形胶质细胞对神经元铁转运的影响，无法确定神经元中过多的铁的来源，也无法确定不同细胞中的铁含量。星形胶质细胞与神经元间铁转运是如何相互影响的，铁沉积的铁的来源，各细胞中铁含量等仍是目前亟需探讨的关键问题。
在神经科学领域，目前应用星形胶质细胞和神经元共培养体系的研究主要集中在神经元突触的发育，细胞的迁徙、浸润，形态学及代谢产物的研究，且主要集中在海马和皮层星形胶质细胞和神经元的研究。并且，在中脑及帕金森病中的研究较少，且主要集中在了神经炎症对多巴胺能神经元的损伤、凋亡等的研究和星形胶质细胞的神经保护因子的保护作用，而在铁代谢中的研究较少。在体外研究中，并未见利用原代培养的星形胶质细胞和中脑腹侧(ventral mesencephalon,VM)神经元共培养系统用于铁转运的相互影响，及铁代谢的相关研究报道。
因此，构建中脑原代培养的星形胶质细胞和VM神经元共培养系统，建立一种新型的帕金森病的细胞模型，以在细胞层面明确神经元铁的来源、其与星形胶质细胞间的相互影响，以及铁转运的方向性对于本领域而言尤为重要。
发明内容
本发明提出一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在铁代谢、尤其是铁转运中的应用，通过设计试验方法检测该共培养体系，可在细胞层面明确神经元铁的来源、其与星形胶质细胞间的相互影响，以及铁转运的方向性问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢中的应用。
作为优选，包括以下步骤：
利用10μM 6-OHDA分别预孵育接种于Transwell上室的原代培养的星形胶质细胞和接种于Transwell下室的原代培养的中脑腹侧神经元24h；然后利用1mM外源性铁FAC继续孵育接种于Transwell上室的原代培养的星形胶质细胞30min；
将上室的原代培养的星形胶质细胞的培养基和下室的原代培养的中脑腹侧神经元的培养基同时更换为原代培养的中脑腹侧神经元的完全培养基，并将上室放入下室的孔板中共培养30min，检测原代培养的星形胶质细胞和中脑腹侧神经元中Fe2+的含量。
作为优选，将上室放入下室的孔板中对原代培养的星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元进行共培养前还包括共培养体系建立的步骤，具体包括以下步骤：
原代培养：从试验动物中提取分离原代星形胶质细胞，重悬沉淀，筛选后，用胰酶消化、并用星形胶质细胞完全培养液终止消化，然后加入星形胶质细胞完全培养液进行差速粘附处理，调整细胞浓度后接种于预先用多聚赖氨酸处理的Transwell上室中；从试验动物中提取分离原代中脑腹侧神经元，重悬沉淀，筛选后，加入中脑腹侧神经元接种培养液调整细胞浓度后，接种于预先用多聚赖氨酸处理的Transwell下室中；
共培养：在原代中脑腹侧神经元接种4-5天后，将胰酶消化并纯化的第3代星形胶质细胞制成细胞悬液，以0.7×106/ml将星形胶质细胞接种到Transwell上室中，待上室星形胶质细胞和下室中脑腹侧神经元长好，将上室和下两内的培养基同时更换为中脑腹侧神经元完全培养基，并将上室放入下室的孔板中，建立共培养体系。
作为优选，将上室和下两内的培养基同时更换为中脑腹侧神经元完全培养基，建立共培养体系时，向上室加入0.5ml中脑腹侧神经元完全培养基，向下室加入1.5ml中脑腹侧神经元完全培养基。
作为优选，中脑腹侧神经元完全培养液由DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml、2％B27、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成。
作为优选，星形胶质细胞完全培养液由DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成；中脑腹侧神经元接种培养液由DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成。
作为优选，所述Transwell为具有通透性的杯状装置，Transwell嵌套于常规细胞培养板中，Transwell的内部为上室，Transwell以外、常规细胞培养板以内为下室，Transwell的底部由具有通透性的膜构成。
作为优选，所述Transwell的底部由孔径为0.4μm的PET膜构成。
本发明还提供了一种原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在神经退行性疾病脑内铁代谢、尤其是铁转运中的应用。
作为优选，所述神经退行性疾病为帕金森病。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明利用原代星形胶质细胞与原代中脑腹侧神经元共培养体系，建立了一种中脑腹侧神经元和星形胶质细胞之间铁代谢、尤其是在铁转运方面的研究方法。该方法明确了该种共培养体系下的共培养时间，简化、明确了共培养体系中复杂的实验设计，可以有效降低实验消耗，提高研究效率，降低成本。
2、本发明结合了transwell细胞培养系统与铁含量测定，通过检测该共培养体系，可单独看到不同细胞内的铁含量，从而可以明确在细胞层面上神经元铁的来源、其与星形胶质细胞间的相互影响，以及铁转运的方向性问题。
3、本发明建立的共培养体系为一种新的研究帕金森病的细胞模型，可用于研究帕金森病等神经退行性疾病脑内高铁的相关研究中。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的Transwell工作示意图，其中，(a)为小室示意图；(b)星形胶质细胞单独培养示意图；(c)VM神经元单独培养示意图；(d)共培养示意图；
图2为本发明实施例所提供的FAC处理6-OHDA预孵育星形胶质细胞和6-OHDA预孵育VM神经元共培养示意图；
图3为本发明实施例所提供的星形胶质细胞与VM神经元共培养体系中，FAC处理星形胶质细胞时，VM神经元Fe2+含量升高示意图；
图4为本发明实施例所提供的星形胶质细胞与VM神经元共培养体系中，星形胶质细胞Fe2+含量不变示意图；
图5为本发明实施例所提供的6-OHDA处理星形胶质细胞和VM神经元共培养示意图；
图6为本发明实施例所提供的星形胶质细胞与VM神经元共培养体系中，神经元IRP1的蛋白表达示意图；
图7为本发明实施例所提供的星形胶质细胞与VM神经元共培养体系中，神经元DMT1和FPN1的蛋白表达示意图；
图8为本发明实施例所提供的星形胶质细胞与VM神经元共培养体系中，星形胶质细胞HIF-2α蛋白表达示意图；
图9为本发明实施例所提供的星形胶质细胞与VM神经元共培养体系中，星形胶质细胞DMT1和FPN1的蛋白表达示意图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1星形胶质细胞原代培养
1.1实验动物
实验动物选用新生24h Wistar乳鼠(由青岛市药检所动物中心提供)，用于星形胶质细胞原代培养。
1.2实验试剂
DMEM/F-12(1:1)：Gibco公司产品；胎牛血清(FBS Gold)：Gibco公司产品，EU级；多聚赖氨酸(poly-D-lysine-hydrobromide,poly-D-lysine)，硼酸，四硼酸钠：Sigma公司产品；青霉素-链霉素溶液(100X)，胰蛋白酶(Trypsin)：江苏海门碧云天生物技术研究所产品。
1.3实验仪器
超净工作台：苏州净化设备有限公司；CO2孵箱：美国Thermo Fisher Scientific产品；普通离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；温箱及烤箱：德国MEMMERF产品；-20℃和4℃冰箱：青岛海尔产品；-80℃超低温冰箱：美国Thermo Fisher Scientific产品；高压消毒锅：德国VARIOKLAV产品；十万分之一电子天平：日本岛津产品(AEL-40SM)；解剖显微镜，倒置相差显微镜：日本Olympus产品；空气浴恒温摇床：哈尔滨东明医疗仪器厂。
1.4液体配制
DMEM/F-12(1:1)基础培养液：DMEM/F12粉剂1包溶于1000ml双蒸水，加入2.438gNaHCO3，调节PH至7.2，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存。
星形胶质细胞完全培养液：DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml，20％胎牛血清，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
5×硼酸盐缓冲液：称取0.254g硼酸，0.476g四硼酸钠，溶于双蒸水，完全溶解后定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
多聚赖氨酸(Poly-D-lysine)：将Poly-D-lysine溶于除菌5×硼酸盐缓冲液中，储存液浓度为1mg/ml，-20℃分装保存。包被非玻璃制品时，以除菌1×硼酸盐缓冲液稀释至工作浓度(10μg/ml)。
1.5星形胶质细胞的培养与筛选
星形胶质细胞的培养和分离按文献操作，具体步骤如下：
培养板及培养瓶的处理：150cm2细胞培养瓶(Corning)在细胞接种前，将Poly-D-lysine(10μg/ml)加入培养瓶中，使其完全盖过瓶底，37℃，5％CO2孵箱中放置过夜，将剩余的多聚赖氨酸溶液吸掉，用高压灭菌双蒸水清洗三遍，超净工作台内紫外线照射0.5h，待用。
原代星形胶质细胞的获取，传代和接种培养：将出生24h之内的Wistar乳鼠浸泡于75％酒精中消毒。断颈取头，以眼科剪在乳鼠头部两侧沿耳上缘剪开，尽量减少破坏脑组织，以眼科镊剥取全脑，置于4℃预冷DMED/F12基础培养液的平皿中，之后全部操作在冰上完成，以减少细胞死亡。用角膜镊在解剖显微镜下去除小脑及嗅球部位，仔细剥离脑膜和血管后，置于新无菌DMED/F12基础培养液平皿中，以眼科剪将脑组织切碎，以灭菌Pasteur滴管及口径为1mm的移液器枪头、口径为0.5mm的移液器枪头贯续轻轻吹打至组织块完全消散。经200目细胞筛过滤除去未吹散组织块，将滤液移至离心管中，1000rpm，离心5min，弃上清液，用含20％胎牛血清及双抗的星形胶质细胞完全培养液中重悬沉淀物。按约5只脑/瓶(20ml)的密度将细胞悬液接种到Poly-D-lysine处理过的150cm2细胞培养瓶中，置37℃，5％CO2孵箱中，先将培养瓶上面朝下倒置，差速贴壁1h后转瓶正置。24h后半量换液一次,以后每三天换液一次。
细胞培养7-14天见底层细胞融合生长，长成致密单层细胞后即可用于星形胶质细胞的筛选。将细胞培养瓶置于空气浴恒温摇床，37℃，240rpm剧烈震摇16-18h，去上清液，以无血清DMEM/F12基础培养液漂洗底层细胞一次，加入0.25％胰酶消化细胞37℃1-5min后，用星形胶质细胞完全培养液终止消化，细胞悬液1000rpm离心5min弃上清含酶液，细胞重复洗涤一次后，加入星形胶质细胞完全培养液行差速粘附处理30min，重新混悬，调整细胞密度，以约5×104/cm2传代，传2代后，将细胞接种于Poly-D-lysine处理过的Transwell上室，稳定24-48h后可用于实验。
实施例2腹侧中脑(ventral mesencephalon,VM)神经元的原代培养
2.1实验动物
实验动物选用孕14天Wistar孕鼠(由青岛市药检所动物中心提供)，置于室温20℃，12：12小时昼夜循环光照条件下生活，自由取食、饮水。
2.2实验试剂
DMEM/F-12(1:1)：Gibco公司产品；B27：Gibco公司产品；胎牛血清(FBS Gold)：Gibco公司产品，EU级；多聚赖氨酸(poly-D-lysine-hydrobromide,poly-D-lysine)，硼酸，四硼酸钠：Sigma公司产品；青霉素-链霉素溶液(100X)，胰蛋白酶(Trypsin)：江苏海门碧云天生物技术研究所产品。
2.3实验仪器
超净工作台：苏州净化设备有限公司；CO2孵箱：美国Thermo Fisher Scientific产品；普通离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；温箱及烤箱：德国MEMMERF产品；-20℃和4℃冰箱：青岛海尔产品；-80℃超低温冰箱：美国Thermo Fisher Scientific产品；高压消毒锅：德国VARIOKLAV产品；十万分之一电子天平：日本岛津产品(AEL-40SM)；解剖显微镜，倒置相差显微镜：日本Olympus产品。
2.4液体配制
DMEM/F-12(1:1)基础培养液：DMEM/F12粉剂1包溶于1000ml双蒸水，加入2.438gNaHCO3，调节PH至7.2，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存。
VM神经元接种培养液：DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml，10％胎牛血清，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
VM神经元完全培养液：DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml，2％B27，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
5×硼酸盐缓冲液：称取0.254g硼酸，0.476g四硼酸钠，溶于双蒸水，完全溶解后定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。
多聚赖氨酸(Poly-D-lysine)：将Poly-D-lysine溶于除菌5×硼酸盐缓冲液中，储存液浓度为1mg/ml，-20℃分装保存。包被非玻璃制品时，以除菌1×硼酸盐缓冲液稀释至工作浓度(10μg/ml)。
2.5VM神经元的原代培养
于接种前1天，用10μg/ml或20μg/ml多聚赖氨酸处理Transwell下室，37℃培养箱中过夜。将液体吸出，用无菌三蒸水清洗三遍后，放置超净台中晾干。孕14天Wistar孕鼠用水合氯醛麻醉(400mg/kg，8％约lml/200mg)后，用75％酒精消毒腹部皮肤，沿腹中线剪开，充分暴露腹腔，将子宫(连成一串的胚囊)完整取出，.置于盛有预冷的D-hank’S液的玻璃皿中，剪破包膜将小胎鼠剥出，至新的D-hank’S液中，分离胚胎，在解剖显微镜下用纤维眼科弯镊去除端脑，取出中脑部分至新的D-hank’s液中，修剪剩下的脑组织块，去除脑膜，留出蝴蝶状的腹侧中脑，转移至新的D-hank’s液中，先用吸管将大块脑组织吹碎，然后用枪头轻轻吹打组织块至完全分离，形成单细胞悬液。将细胞悬液转移至大离心管中，放置离心机中1000rpm/min，离心5min。小心弃掉上清，加入适量接种液重悬，反复吹打至组织块完全消散。取10μl细胞悬液，稀释10倍后，用台盼蓝染色，在倒置显微镜下进行细胞计数，着色细胞为死细胞，加入适量接种液调整细胞浓度至1x106/ml接种到预先用Poly-D-lysine处理过的Transwell下室。置37℃，5％CO2培养箱中孵育18h后，更换为含有2％B27的培养液，之后每隔三天换液一次，5天后可用于实验。
实施例3星形胶质细胞和VM神经元共培养系统的建立及干预分组
3.1实验试剂
DMEM/F-12(1:1)：Gibco公司产品；B27：Gibco公司产品；胎牛血清(FBS Gold)：Gibco公司产品，EU级；青霉素-链霉素溶液(100X)，胰蛋白酶(Trypsin)：江苏海门碧云天生物技术研究所产品；6-hydroxydopamine,6-OHDA：sigma公司产品；抗坏血酸：sigma公司产品；FAC：sigma公司产品。
3.2实验仪器
超净工作台：苏州净化设备有限公司；CO2孵箱：美国Thermo Fisher Scientific产品；普通离心机：安徽中科中佳科学仪器有限公司；温箱及烤箱：德国MEMMERF产品；-20℃和4℃冰箱：青岛海尔产品；-80℃超低温冰箱：美国Thermo Fisher Scientific产品；高压消毒锅：德国VARIOKLAV产品；十万分之一电子天平：日本岛津产品(AEL-40SM)。
3.3液体配制
DMEM/F-12(1:1)基础培养液：DMEM/F12粉剂1包溶于1000ml双蒸水，加入2.438gNaHCO3，调节PH至7.2，0.2μm微孔滤膜过滤除菌，分装，4℃保存。
星形胶质细胞完全培养液：DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml，10％胎牛血清，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
VM神经元完全培养液：DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml，2％B27，100U/ml青霉素，0.1mg/ml链霉素，混匀后4℃保存。
3.4所用药物的配制
抗坏血酸溶液：溶于0.9％生理盐水中，储存液浓度为200μg/ml。
6-OHDA(6-羟基多巴胺)：取0.2056mg溶于抗坏血酸溶液中，储存液为1mM，使用时以无血清培养液稀释为工作液浓度。
外源性铁FAC(枸橼酸铁)：取2.65mg FAC溶于基础培养基，储存液为10mM，使用时以无血清培养液稀释为工作液浓度。
3.5常用液体的配制
6-OHDA：使用时用无血清无双抗DMEM/F12基础培养液稀释为10μM工作浓度。
外源性铁FAC：使用时用无血清无双抗DMEM/F12基础培养液稀释为1mM工作浓度。
3.6星形胶质细胞和VM神经元共培养系统的建立
在VM神经元接种第4或5天(视神经元生长状态决定)，将胰酶消化并纯化的第3代星形胶质细胞制成细胞悬液，以0.7×106/ml将星形胶质细胞接种到Transwell上室，第二天，观察上下两室细胞状态，1-3天左右(视细胞实际生长状态决定)，待上室星形胶质细胞和下室VM神经元长好，上下两室同时更换为VM神经元完全培养基。向上室加入0.5ml VMneuron完全培养基，下室加入1.5ml VM neuron完全培养基，将上室放入下室的孔板中，共培养体系即建立好，如图1所示。
3.7星形胶质细胞和VM神经元共培养系统干预处理
检测星形胶质细胞和VM神经元共培养体系中星形胶质细胞和神经元的胞内Fe2+。干预处理方法如图2所示：10μM 6-OHDA分别预孵育原代培养的星形胶质细胞和原代培养的VM神经元24h,1mM FAC孵育原代培养的星形胶质细胞30min，上下室同时更换为原代培养的VM神经元的培养基，将上室放置下室的孔板中共培养30min，检测原代培养的星形胶质细胞和VM神经元中Fe2+的含量。
这里需要说明的是，本实施例对干预时的关键参数进行了限定，具体的，采用6-OHDA分别处理星形胶质细胞和神经元6-OHDA，目的在于使两种细胞同时处于模拟体内黑质氧化应激状态。进一步，给予外源性铁FAC的时间为30min，且不能超过30min，否则铁会改变细胞形态和功能；而在研究铁含量时，共培养时间为30min，且不能超过30min，否则胞内铁的实时变化会有变化，这可能与自身生理的修复机制有关；另外，在研究铁蛋白表达变化时，需共同培养24h。
具体分组如下：
单共培养组(AS/N)：星形胶质细胞和VM神经元共培养30min；
星形胶质细胞和6-OHDA预孵育VM神经元共培养组(AS/N+6-OHDA)：10μM 6-OHDA预孵育VM神经元24h，与星形胶质细胞共培养30min；
6-OHDA预孵育星形胶质细胞和VM神经元共培养组(AS+6-OHDA/N)：10μM 6-OHDA预孵育星形胶质细胞24h，与VM神经元共培养30min；
6-OHDA预孵育星形胶质细胞和6-OHDA预孵育VM神经元共培养组(AS+6-OHDA/N+6-OHDA)：10μM 6-OHDA预孵育星形胶质细胞24h，10μM6-OHDA预孵育VM神经元24h，下上室共培养30min；
FAC处理星形胶质细胞和VM神经元共培养组(AS+FAC/N)：1Mm FAC处理星形胶质细胞30min，与VM神经元共培养30min；
FAC处理星形胶质细胞和6-OHDA预孵育VM神经元共培养组(AS+FAC/N+6-OHDA)：
10μM 6-OHDA预孵育VM神经元24h，1mM FAC星形胶质细胞30min，上下室共培养30min；
FAC处理6-OHDA预孵育星形胶质细胞和VM神经元共培养组(AS+6-OHDA+FAC/N)：10μM 6-OHDA预孵育星形胶质细胞24h，1mM FAC处理6-OHDA预孵育的星形胶质细胞30min，与VM神经元共培养30min。
FAC处理6-OHDA预孵育星形胶质细胞和6-OHDA预孵育VM神经元共培养组(AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA)：10μM 6-OHDA预孵育星形胶质细胞24h，10μM 6-OHDA预孵育VM神经元24h，1mM FAC处理6-OHDA预孵育的星形胶质细胞30min，上下室共培养30min。
实施例3检测星形胶质细胞和VM神经元内Fe2+的含量
3.1实验试剂
铁检测试剂盒：iron assay kit,MK250：sigma公司产品；0.25％胰蛋白酶：Hyclon公司产品。
3.2检测星形胶质细胞和VM神经元内Fe2+的含量
每空加100μl 0.25％胰蛋白酶分别消化星形胶质细胞和VM神经元，以五倍体积的iron assay buffer迅速混匀。用13,000×g，4℃离心10min，以去除不溶性物质。若为细胞培养基直接加入96孔板。铁含量的检测步骤采用Kazi等人报道的步骤，应用sigma公司的MAK025的iron assay kit，根据试剂盒说明书进行测量。
3.3统计学处理
实验结果以均数±标准(X±S.E.M.)表示，应用SPSS17.0统计软件。数据首先以正态分布检验，继以方差同质性检验。两组以上数据的比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)进行比较，继以Tukey进行两两均数间的比较。P<0.05表明结果有统计学意义。
3.4检测结果
干预处理后检测原代培养的VM神经元中Fe2+的含量。结果如图3所示：星形胶质细胞和神经元共培养体系中，与AS+FAC/N+6-OHDA组相比，给予星形胶质细胞6-OHDA处理(AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组)，神经元胞内Fe2+含量增加，差异有统计学意义(#P<0.05)。这说明，只有当星形胶质细胞被6-OHDA激活时，其向神经元转铁速率才会增加，神经元的铁含量升高。与AS+6-OHDA/N+6-OHDA组相比，给予星形胶质细胞铁(AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组)，神经元胞内Fe2+含量增加，差异有统计学意义(#P<0.05)。这说明，高铁环境是神经元铁含量增加的重要条件。与AS+6-OHDA+FAC/N组相比，给予神经元6-OHDA处理(AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组)，神经元胞内Fe2+含量显著增加，差异有统计学意义(##P<0.01)。这说明，神经元氧化应激条件下，神经元摄铁增加，铁转出减少，铁含量升高。神经元的氧化应激是其铁含量增加的重要条件。与AS/N组相比，分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理，并给予星形胶质细胞铁(AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组)，神经元胞内Fe2+含量增加，差异有统计学意义(*P<0.05)。结果表明，星形胶质细胞与神经元共培养体系，氧化应激激活星形胶质细胞，促进神经元Fe2+含量升高。。
干预处理后检测原代培养的星形胶质细胞中Fe2+的含量。结果如图4所示：与AS/N组相比，AS/N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe2+含量不变(P>0.05)。与AS/N组相比，AS+6-OHDA/N组的星形胶质细胞内Fe2+含量不变(P>0.05)。与AS/N组相比，AS+6-OHDA N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe2+含量不变(P>0.05)。与AS/N组相比，AS+FAC/N组的星形胶质细胞内Fe2+含量不变(P>0.05)。与AS/N组相比，AS+FAC/N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe2+含量不变(P>0.05)。与单共培养组相比，原代培养的VM神经元和FAC处理的6-OHDA预孵育原代培养的星形胶质细胞共培养组的星形胶质细胞内Fe2+含量不变(P>0.05)。与AS/N组相比，AS+6-OHDA+FAC/N+6-OHDA组的星形胶质细胞内Fe2+含量不变(P>0.05)。结果表明，星形胶质细胞与神经元共培养体系中，星形胶质细胞Fe2+含量不变。
以上结果表明，星形胶质细胞发挥了“铁泵”的作用，6-OHDA加快了星形胶质细胞铁转运，是神经元铁沉积的铁的来源。
实施例4免疫印迹检测VM神经元IRP1和星形胶质细胞HIF-2α激活情况以及VM神经元和星形胶质细胞DMT1和FPN1的蛋白表达
4.1实验试剂
6-OHDA、抗坏血酸：Sigma公司产品；丙稀酰胺，苯甲基磺酰胺(phenylmethylsulfonyl fulride，PMSF)：Genview公司产品；过硫酸铵(ammonium persulfate，APS)，Tween-20(吐温20)，十二烷基硫酸钠(sodiumdodecyl sulfate，SDS，电泳级)，NonidetP40，pepstatin，抑蛋白酶肽(aprotinin)，亮抑制肽(leupeptin)，脱氧胆酸钠(Nadeoxycholate)，rabbit anti-β-actin抗体，HRP标记的goat anti-rabbit IgG：Sigma公司产品；',N'-亚甲双丙烯酰胺：Bebco公司产品；氨基乙酸(甘氨酸，Glycine，电泳级)，三羟基甲基氨基甲烷(Tris)，Tris·Base，Tris·HCl，乙二胺四乙酸(EDTA)：Solarbio公司产品；PDVF膜，ECL化学发光试剂盒：Millipore公司产品；RIPA裂解液(中)，BCA蛋白定量试剂盒，彩色预染蛋白质分子量标准，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(tetramethyl ethylene diamine，TEMED)：江苏海门碧云天生物技术研究所产品；一抗：DMT1抗体为OriGene Technologies公司产品，FPN1抗体为sigma公司产品，HIF-2α的抗体为Novus Biologicals公司产品，IRP1抗体为Alpha Diagnostic公司产品，β-actin抗体购自北京博奥森公司；二抗：HRP标记的goatanti-rabbit IgG购自santa cruz公司。
4.2常用仪器
电泳槽Mini-VE、电转仪(湿转)Trans-Blot、电泳仪Power-Pac 200：BIO-RAD公司，美国；超纯水机：Milli pore公司产品，美国；分光光度计、台式低温高速离心机(5417R)：Eppendorf公司，德国；UVP凝胶成像系统，美国。
4.3所用药物的配制
抗坏血酸溶液：溶于0.9％生理盐水中，储存液浓度为200μg/ml。
6-OHDA：取0.2056mg溶于抗坏血酸溶液中，储存液为1mM，使用时以无血清培养液稀释为工作液浓度。
4.4所用抗体
一抗：rabbit anti-IRP1，rabbit anti-DMT1和rabbit anti-FPN1滴度为1:800，rabbit anti-HIF-2α滴度为1:1000。β-actin抗体滴度为1:10000；
二抗：HRP标记的goat anti-rabbit IgG，滴度为1:10000。
4.5常用液体的配制
PMSF：将1.74mg溶解于1ml异丙醇中，储存液的浓度为100mM，保存于-20℃。
细胞裂解液：50mM Tris pH7.5，1％Nonidet40，150mM NaCl,0.5％脱氧胆酸钠(避光)，1mM EDTA，10mM PMSF,PH值7.5，过滤后于4℃避光保存。临用时取987μl加入10μl100mM的PMSF，1μl pepstatin(1μg/ml)，1μl aprotinin(1μg/ml)，1μl leupeptin(1μg/ml)。
30％丙烯酰胺混合液(100ml)：29g丙烯酰胺和1g N,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的超纯水中，加热至37℃使之溶解，补水至终体积100ml，PH<7.0，过滤后4℃避光保存。
10％APS：0.1g APS加1ml超纯水，4℃保存，现用现配。
10％SDS：10g SDS溶于80ml超纯水，加热溶解后定容至100ml，室温保存。
1.5M Tris·Cl(PH8.8)：称取18.171g Tris溶于90ml超纯水，用浓HCl调节PH值至8.8，定容至100ml。
0.5M Tris·Cl(PH6.8)：称取6.057g Tris溶于90ml超纯水，用浓HCl调节PH值至6.8，定容至100ml。
10×电泳缓冲液：分别称取Tris 30g，甘氨酸144g，SDS 10g，超纯水定容至1000ml。
10×转膜缓冲液：Tris 30g，甘氨酸144g，超纯水定容至1000ml。
1×转膜缓冲液：分别称取10×转膜缓冲液100ml，甲醇200ml，超纯水700ml，调节PH值至8.3。
10×TBST溶液：分别称取Tris 24.2g，NaCl 80g，SDS 0.375g，1.0MHCl38ml，Tween-20 10ml，超纯水定容至1000ml。
封闭液：用1×TBST配制10％脱脂奶粉或5％BSA。
6-OHDA：使用时用无血清无双抗DMEM/F12或DMEM高糖基础培养液稀释为10μM工作浓度。
4.6星形胶质细胞接种与药物处理，星形胶质细胞和VM神经元共培养系统干预分 组
为了观察星形胶质细胞和VM神经元共培养体系中，星形胶质细胞HIF-2α，DMT1和FPN1和神经元IRP1，DMT1和FPN1蛋白表达的变化，进一步对星形胶质细胞和VM神经元共培养系统干预分组，方法为：10μM6-OHDA分别预孵育原代培养的星形胶质细胞和原代培养的VM神经元24h，上下室同时更换为原代培养的VM神经元的培养基，将上室放置下室的孔板中共培养24h，如图5所示。
具体分组如下：
单共培养组(AS/N)：星形胶质细胞和VM神经元共培养共培养24h；
星形胶质细胞和6-OHDA预孵育VM神经元共培养组(AS/N+6-OHDA)：10μM 6-OHDA预孵育VM神经元24h，与星形胶质细胞共培养24h；
6-OHDA预孵育星形胶质细胞和VM神经元共培养组(AS+6-OHDA/N)：10μM 6-OHDA预孵育星形胶质细胞24h，与VM神经元共培养24h；
6-OHDA预孵育星形胶质细胞和6-OHDA预孵育VM神经元共培养组(AS+6-OHDA/N+6-OHDA)：10μM 6-OHDA预孵育星形胶质细胞24h，10μM 6-OHDA预孵育VM神经元24h，下上室共培养24h；
4.7总蛋白的提取和定量
S1:共培养结束后，吸尽培养液，将上下室分离，用预冷的PBS洗三次，每孔加入100μl细胞裂解液：RIPA裂解液(强)，冰上裂解0.5h；
S2:裂解物收集后4℃，12000rpm离心20min，将上清液转移到新的Eppendorf管中；
S3:用BCA蛋白定量试剂盒检测提取蛋白浓度，将蛋白按每份30μg分装，并用0.01MPBS补至相同的体积，并加入5×loading buffer混匀，95℃以上水浴5min使蛋白变性，-80℃冰箱冻存。
4.8十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳及转膜
材料：
8％分离胶(10ml)：30％丙烯酰胺混合液2.16ml，30％Tris-HCl 2ml(PH 8.8)，10％SDS 80μl，10％APS 80μl，TEMED 4.8μl，ddH2O 3.68ml，混匀，向胶模内小心注入分离胶，留2cm左右的空间准备灌注积层胶，顶层覆盖无水乙醇隔离空气去除气泡。室温静置约0.5h至分离胶完全凝固。
5％浓缩胶(5ml)：30％丙烯酰胺混合液500μl，0.5M Tris(PH6.8)380μl，10％SDS30μl，10％APS 30μl，TEMED 3μl，ddH2O 2.1ml。现用现配，混匀后注入分离胶上层，勿产生气泡，并轻轻插入梳子。
方法：
P1:将蛋白上样后，浓缩胶恒压80V，样品前沿开始进入分离胶后，恒压120V继续电泳至彩色预染蛋白质分子量标准分离完全；
P2:将分离好的蛋白质从凝胶转移至PVDF膜，恒流300A，2h；
P3:转膜后，浸泡于10％脱脂牛奶-TBST封闭液在摇床上震摇2h，以封闭非特异性结合位点；
P4:用5％的脱脂奶稀释相应一抗：HIF-1α1:1000,HIF-2α1:1000,DMT1 1:800,FPN1 1:800,β-actin 1:10000，4℃摇床孵育过夜。1×TBST缓冲液漂洗10min×3次；
P5:加二抗(goat anti-rabbit IgG，1:10000)室温震摇1h，1×TBST缓冲液漂洗10min×3次；
P6:显色：将ECL化学发光试剂的A液和B液等体积混合，以0.125mL/cm2的量加于PVDF膜的蛋白面，室温孵育1min，去除A、B混合液；
P7:UVP凝胶成像系统观察，拍摄图片：条带的强弱用Vision WorksL S图像采集和分析软件进行密度分析，实验结果以目的蛋白与内参照蛋白β-actin条带平均OD值比值表示目的蛋白的表达水平。
4.9统计学处理
实验结果以均数±标准(X±S.E.M.)表示，应用SPSS17.0统计软件。数据首先以正态分布检验，继以方差同质性检验。两组以上数据的比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)进行比较，继以Tukey进行两两均数间的比较。P<0.05表明结果有统计学意义。
4.10蛋白表达水平结果
采用5.6项下1)共培养方法，检测如下内容：
(1)原代培养的VM神经元中IRP1的蛋白表达变化。结果如图6所示：星形胶质细胞和神经元共培养体系中，与AS/N组相比，给予神经元6-OHDA处理(AS/N+6-OHDA组)，神经元的IRP1上调，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N相比，给予星形胶质细胞6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N组)，神经元的IRP1上调，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N组相比，分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N+6-OHDA组)，神经元的IRP1显著上调，差异有统计学意义(**P<0.01)。结果表明，星形胶质细胞与神经元共培养体系，神经元中的IRP1被激活。
(2)检测原代培养的VM神经元中DMT1和FPN1的蛋白表达变化。结果如图7所示：星形胶质细胞和神经元共培养体系中，与AS/N组相比，给予神经元6-OHDA处理(AS/N+6-OHDA组)，神经元的DMT1蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(**P<0.01)。与AS/N组相比，给予星形胶质细胞6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N组)，神经元的DMT1蛋白表达显著升高，差异有统计学意义(**P<0.01)。与AS/N组相比，分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N+6-OHDA组)，神经元的DMT1蛋白表达升高，差异有统计学意义(*P<0.05)。星形胶质细胞和神经元共培养体系中，与AS/N组相比，给予神经元6-OHDA处理(AS/N+6-OHDA组)，神经元的FPN1显著下调，差异有统计学意义(**P<0.01)。与AS/N组相比，给予星形胶质细胞6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N组)，神经元的FPN1下调，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N组相比，分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N+6-OHDA组)，神经元的FPN1显著下调，差异有统计学意义(**P<0.01)。结果表明，星形胶质细胞与神经元共培养体系，神经元的DMT1表达上调，FPN1表达下调。
(3)检测原代培养的星形胶质细胞HIF-2α的蛋白表达变化。结果如图8所示：星形胶质细胞和神经元共培养体系中，与AS/N组相比，给予神经元6-OHDA处理(AS/N+6-OHDA组)，星形胶质细胞的HIF-2α上调，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N组相比，给予星形胶质细胞6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N)，星形胶质细胞的HIF-2α上调，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N组相比，分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N+6-OHDA组)，星形胶质细胞的HIF-2α上调，差异有统计学意义(*P<0.05)。结果表明，星形胶质细胞与神经元共培养体系，神经元产生的氧化应激可以激活星形胶质细胞HIF-2α。
(4)检测原代培养的星形胶质细胞中DMT1和FPN1的蛋白表达变化。结果如图9所示：星形胶质细胞和神经元共培养体系中，与AS/N组相比，给予神经元6-OHDA处理(AS/N+6-OHDA组)，星形胶质细胞的DMT1蛋白表达升高，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N组相比，给予星形胶质细胞6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N)，星形胶质细胞的DMT1蛋白表达升高，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N组相比，分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N+6-OHDA组)，星形胶质细胞的DMT1蛋白表达升高，差异有统计学意义(*P<0.05)。星形胶质细胞和神经元共培养体系中，与AS/N组相比，给予神经元6-OHDA处理(AS/N+6-OHDA组)，星形胶质细胞的FPN1升高，差异有统计学意义(*P<0.05)。与AS/N组相比，给予星形胶质细胞6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N组)，星形胶质细胞的FPN1显著升高，差异有统计学意义(**P<0.01)。与AS/N组相比，分别给予星形胶质细胞和神经元6-OHDA处理(AS+6-OHDA/N+6-OHDA组)，星形胶质细胞的FPN1显著升高，差异有统计学意义(**P<0.01)。结果表明，星形胶质细胞与神经元共培养体系，神经元氧化应激参与星形胶质细胞HIF-2α的激活对DMT1和FPN1蛋白表达的调控。
该结果提示，神经元经6-OHDA处理，6-OHDA被星形胶质细胞摄取。以上结果表明，DA能神经元加快星形胶质细胞铁的转运过程。
综上所述，星形胶质细胞是一种铁供给细胞，发挥“铁泵”的作用，星形胶质细胞铁转运的加快是神经元铁沉积铁的来源，神经元自身氧化应激加快了星形胶质细胞铁转运过程。在此过程中，PKC介导的HIF-2α激活起了重要作用。星形胶质细胞铁代谢的异常参与改变DA能神经元的铁代谢的机制，使其铁代谢功能紊乱，造成神经元铁沉积，引起DA能神经元变性死亡，导致PD。

Claims (10)

1.原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：
利用10μM6-OHDA分别预孵育接种于Transwell上室的原代培养的星形胶质细胞和接种于Transwell下室的原代培养的中脑腹侧神经元24h；然后利用1mM外源性铁FAC继续孵育接种于Transwell上室的原代培养的星形胶质细胞30min；
将上室的原代培养的星形胶质细胞的培养基和下室的原代培养的中脑腹侧神经元的培养基同时更换为原代培养的中脑腹侧神经元的完全培养基，并将上室放入下室的孔板中共培养30min，检测原代培养的星形胶质细胞和中脑腹侧神经元中Fe2+的含量。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，将上室放入下室的孔板中对原代培养的星形胶质细胞和原代培养的中脑腹侧神经元进行共培养前还包括共培养体系建立的步骤，具体包括以下步骤：
原代培养：从试验动物中提取分离原代星形胶质细胞，重悬沉淀，筛选后，用胰酶消化、并用星形胶质细胞完全培养液终止消化，然后加入星形胶质细胞完全培养液进行差速粘附处理，调整细胞浓度后接种于预先用多聚赖氨酸处理的Transwell上室中；从试验动物中提取分离原代中脑腹侧神经元，重悬沉淀，筛选后，加入中脑腹侧神经元接种培养液调整细胞浓度后，接种于预先用多聚赖氨酸处理的Transwell下室中；
共培养：在原代中脑腹侧神经元接种4-5天后，将胰酶消化并纯化的第3代星形胶质细胞制成细胞悬液，以0.7×106/ml将星形胶质细胞接种到Transwell上室中，待上室星形胶质细胞和下室中脑腹侧神经元长好，将上室和下两内的培养基同时更换为中脑腹侧神经元完全培养基，并将上室放入下室的孔板中，建立共培养体系。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，将上室和下两内的培养基同时更换为中脑腹侧神经元完全培养基，建立共培养体系时，向上室加入0.5ml中脑腹侧神经元完全培养基，向下室加入1.5ml中脑腹侧神经元完全培养基。
5.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，中脑腹侧神经元完全培养液由DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml、2％B27、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成。
6.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，星形胶质细胞完全培养液由DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成；中脑腹侧神经元接种培养液由DMEM/F-12(1:1)基本培养液200ml、10％胎牛血清、100U/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素构成。
7.根据权利要求2-4任一项所述的应用，其特征在于，所述Transwell为具有通透性的杯状装置，Transwell嵌套于常规细胞培养板中，Transwell的内部为上室，Transwell以外、常规细胞培养板以内为下室，Transwell的底部由具有通透性的膜构成。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述Transwell的底部由孔径为0.4μm的PET膜构成。
9.原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在神经退行性疾病脑内铁代谢、尤其是铁转运中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述神经退行性疾病为帕金森病。
CN201910345162.1A 2019-04-26 2019-04-26 原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用 Active CN110205294B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910345162.1A CN110205294B (zh) 2019-04-26 2019-04-26 原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910345162.1A CN110205294B (zh) 2019-04-26 2019-04-26 原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110205294A true CN110205294A (zh) 2019-09-06
CN110205294B CN110205294B (zh) 2021-05-28

Family

ID=67786533

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910345162.1A Active CN110205294B (zh) 2019-04-26 2019-04-26 原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在星形胶质细胞与神经元间铁代谢研究中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110205294B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110663646A (zh) * 2019-10-21 2020-01-10 四川农业大学 一种慢性食源性帕金森病小鼠模型及其建立方法和应用
CN110780077A (zh) * 2019-11-08 2020-02-11 青岛大学 缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病预防/治疗中的应用
CN116426478A (zh) * 2023-06-14 2023-07-14 中科聚研干细胞有限公司 一种脑源性神经前体细胞培养的方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014040076A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Xencor Methods of treating neurological diseases
CN104988121A (zh) * 2015-07-16 2015-10-21 西南大学 一种神经元、星形胶质细胞共培养体的建立方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2014040076A1 (en) * 2012-09-10 2014-03-13 Xencor Methods of treating neurological diseases
CN104988121A (zh) * 2015-07-16 2015-10-21 西南大学 一种神经元、星形胶质细胞共培养体的建立方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO-YUN ZHANG ET AL.: "Brain-derived neurotrophic factor and glial cell line-derived neurotrophic factor inhibit ferrous iron influx via divalent metal transporter 1 and iron regulatory protein 1 regulation in ventral mesencephalic neurons", 《BIOCHIMICA ET BIOPHYSICA ACTA》 *
HUAMIN XU ET AL.: "New Progress on the Role of Glia in Iron Metabolism and Iron-Induced Degeneration of Dopamine Neurons in Parkinson’s Disease", 《FRONTIERS IN MOLECULAR NEUROSCIENCE》 *
ULIANA DE SIMONE ET AL.: "Human Co-culture Model of Neurons and Astrocytes to Test Acute Cytotoxicity of Neurotoxic Compounds", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF TOXICOLOGY》 *
高俊华 等: "铁选择性损伤多巴胺能神经元的神经免疫炎症机制", 《中华神经科杂志》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110663646A (zh) * 2019-10-21 2020-01-10 四川农业大学 一种慢性食源性帕金森病小鼠模型及其建立方法和应用
CN110780077A (zh) * 2019-11-08 2020-02-11 青岛大学 缺氧诱导因子-2α作为作用靶点在帕金森病预防/治疗中的应用
CN116426478A (zh) * 2023-06-14 2023-07-14 中科聚研干细胞有限公司 一种脑源性神经前体细胞培养的方法
CN116426478B (zh) * 2023-06-14 2023-11-24 中科聚研干细胞有限公司 一种脑源性神经前体细胞培养的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN110205294B (zh) 2021-05-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110205294A (zh) 原代星形胶质细胞/原代中脑腹侧神经元共培养体系在铁代谢中的应用
Li et al. The effect of neurotrophin-3/chitosan carriers on the proliferation and differentiation of neural stem cells
Chirila et al. Bombyx mori silk fibroin membranes as potential substrata for epithelial constructs used in the management of ocular surface disorders
CN111544648B (zh) 一种蛋白修饰的plga微球及其构建的组织工程化神经
CN106609263A (zh) 高效诱导多能干细胞向视网膜色素上皮细胞分化的方法
CN108251372A (zh) 原代小胶质细胞/损伤神经元共培养体系及其构建方法和应用
CN107326009B (zh) 使血液单个核细胞逆向分化产生人血源性自体视网膜干细胞的方法、试剂盒及用途
Burmeister et al. Effect of various platelet preparations on retinal muller cells
CN105754943B (zh) 一种裸鼹鼠海马神经元培养方法
Ong et al. Differential protein expression in lens epithelial whole-mounts and lens epithelial cell cultures
CN105274055A (zh) 神经元原代培养的纯化方法
CN104353113A (zh) 一种用于修复脊髓损伤的类脊髓样组织的构建
CN106244551A (zh) 一种神经干细胞源性组织工程脊髓组织的构建
CN109913419A (zh) 一种糖尿病并发抑郁症的四重突触复合细胞模型、建立方法及应用
US20210260131A1 (en) Sponge patch complex of stem cell preparation for treating brain diseases, preparation method thereof, and application thereof
Rothermel et al. Artificial design of three-dimensional retina-like tissue from dissociated cells of the mammalian retina by rotation-mediated cell aggregation
CN113713175B (zh) 制备水凝胶支架的方法及由此得到的支架的用途
CN110302398A (zh) 一种含有Atoh7和/或Pou4f的组合物、其制备方法及医药用途
CN115651907A (zh) 一种混合胶质细胞共培养体系模型的构建方法与应用
US11788058B2 (en) Protein-modified PLGA microsphere and tissue-engineered nerve constructed therewith
CN111440768B (zh) 重组人Notch1蛋白在制备神经干细胞及皮层神经元中的应用
Rhodes Ultrastructure of Müller cells in the developing human retina
CN107365744B (zh) 3,4-二羟基苯甲酸甲酯在制备诱导神经干细胞/神经前体细胞定向分化药物中的应用
Xinyu et al. Nerve growth factor modulate proliferation of cultured rabbit corneal endothelial cells and epithelial cells
CN110507859A (zh) 含血管化区和轴突直行髓鞘化区的组织工程脊髓组织构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant