CN114796626B - 一种预血管化支架及其制备方法与应用 - Google Patents

一种预血管化支架及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种预血管化支架及其制备方法与应用。该方法包括以下步骤：(1)将温敏性水凝胶材料、甲基丙烯酸酰化的肝素溶解，再加入引发剂，得水凝胶前体溶液；(2)将中空管浸泡在所得水凝胶前体溶液中，使冰水在中空管的管内流通，水凝胶前体溶液在温度的作用下在中空管外周形成水凝胶涂层；(3)将所得中空管置于光照下照射，再浸泡到血管内皮生长因子溶液中，得预血管化支架。本发明的方法简单高效，无需使用复杂模具，所得支架移植到皮下间隙能促进血管生成，预血管完成后取出中空管并原位注射胰岛细胞，能使胰岛通过预血管化生成的血管网络进行营养物质和氧气的交换，快速进行血运重建，增强胰岛血糖调节功能，达到治疗糖尿病的目的。

Description

一种预血管化支架及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于支架技术领域，具体涉及一种预血管化支架及其制备方法与应用。
背景技术
1型糖尿病是一种自身免疫性疾病，其中免疫系统攻击胰岛中产生胰岛素的β细胞，导致体内血糖上升。现阶段的1型糖尿病患者只有在不间断地提供胰岛素注射、血糖检测设备、科学教育的情况下，才能过上健康充实的生活，严峻的糖尿病形势迫使人们发展高效高质量的治疗手段来提高生命质量。随着组织工程领域的深入研究，胰岛移植作为一种细胞替代疗法，是治疗1型糖尿病恢复病人血糖水平最有潜力的途径之一。
胰岛移植是指使用具有正常胰岛素分泌功能的胰岛细胞替代体内的病变、损伤细胞，从而实现血糖调节功能修复的治疗方法。胰岛细胞移植到特定位置后要求能快速建立血运重建，减少移植后细胞的缺氧损耗和增强血糖调节能力，通常将胰岛细胞移植在富含血管或富含氧气的环境中，如肝脏(通过门静脉)、腹膜腔或网膜袋等。相对而言，皮下空间对比其他移植部位，通常被认为是一个更具有可移植性的部位，因为它可以支持临床上相关一定体积的移植物，且手术侵入性小，易于移植物的植入，取出和监测，但其存在着血管密度有限，氧气、营养物质等浓度较低，交换效率低，影响移植细胞正常功能的发挥甚至是存活，使移植无法到达理想的预期效果。因此，为了提高移植效率，常对皮下空间进行血管化设计，包括使用生物工程设备和生物材料、药物和营养因子输送系统和策略来诱导早期血管生成和血管再生，让胰岛移植可以直接在皮下空间或间接在一个封装装置内进行。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种预血管化支架及其制备方法与应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现。
一种预血管化支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将温敏性水凝胶材料、甲基丙烯酸酰化的肝素溶于水中，然后加入引发剂，得到水凝胶前体溶液；
(2)将中空管浸泡在步骤(1)所得水凝胶前体溶液中，使冰水在所述中空管的管内流通，所述水凝胶前体溶液在温度的作用下在所述中空管外周形成水凝胶涂层；
(3)将步骤(2)所得中空管置于光照下照射，再浸泡到血管内皮生长因子(VEGF)溶液中，得到预血管化支架。
优选的，步骤(1)所述温敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酰化明胶、甲基丙烯酸缩水甘油酯化明胶和琼脂中的至少一种。
优选的，步骤(1)所述温敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酰化明胶。
优选的，步骤(1)所述温敏性水凝胶材料在水凝胶前体溶液中的浓度为5～15wt％。
优选的，步骤(1)所述甲基丙烯酸酰化的肝素在水凝胶前体溶液中的浓度为0.25～1wt％。
优选的，步骤(1)所述引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮(I2959)和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐(LAP)中的一种或多种；所述引发剂在水凝胶前体溶液中的浓度为0.05～1wt％。
优选的，步骤(1)中，温敏性水凝胶材料、甲基丙烯酸酰化的肝素、引发剂通过水浴搅拌得到水凝胶前体溶液，温度为37-60℃。
优选的，步骤(2)所述中空管选用硅橡胶管和聚四氟乙烯管中的至少一种；所述中空管的内径为1～2mm，外径为3～5mm，管长为1～3cm。
优选的，步骤(3)所述照射的时间为30s～5min；所述血管内皮生长因子溶液的浓度为500ng～1ug/mL；所述浸泡的时间为4～15h。
优选的，本发明中空管的两端与两个注射器连通，其中一个注射器吸满冰水，另一注射器空载，冷水通过中空管在注射器之间流通，中空管外的水凝胶前体溶液受到温度变化的影响实现凝胶化在中空管表面进行涂附，得到水凝胶涂层，然后在光照下照射，再浸泡到血管内皮生长因子溶液中，所得预血管化支架在移植到皮下空间后，拔出中空管，将细胞液原为注射在中空管保留的管腔中，实现细胞在皮下空间支架中的移植。
由以上任一项所述的制备方法制得的一种预血管化支架。
以上所述的一种预血管化支架在制备调控血糖的药物或医疗器械中的应用。
本发明将现有具备腔室结构的支架分成两个部分，分别包括维持细胞移植腔室的生物惰性中空管，负载生物活性物质的生物相容性良好的涂层材料，实现了支架的可拆离结合。
与现有技术相比，本发明具有如下优点及有益效果：
本发明的支架成型工艺较为简单、温和，操作过程中无需用到复杂的模具，在共价交联的作用下能结合负载多种生物活性物质，快速实现功能化涂层的构建，同时，通过生物活性物质的有效释放，能明显促进皮下空间的血管生成，改善胰岛皮下移植的治疗效果。
附图说明
图1为水凝胶涂层支架的制备过程示意图。
图2为水凝胶涂层支架的实物图。
图3为支架皮下移植15天的光学和HE染色图。
图4为皮下移植胰岛移植的非空腹血糖水平图。
图5为皮下移植胰岛移植3个月后的HE染色图。
具体实施方式
以下结合具体实施例及附图对本发明的技术方案做进一步详细的描述，但本发明的保护范围及实施方式不限于此。
本发明实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行。所用未注明生产厂商者的原料、试剂等，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
按10wt％的浓度将甲基丙烯酸酰化明胶，1wt％甲基丙烯酸酰化的肝素溶于去离子水中，在40℃下水浴搅拌充分溶解，加入0.15wt％的引发剂LAP，继续搅拌溶解得到水凝胶前体溶液，将内径1.5mm，外径4mm的硅胶管裁成2cm长度，在室温条件下，把提前预冻的0℃冰水转移到注射器里，通过弯头转接针头连接5mL注射器和硅胶管，将硅胶管浸泡到水凝胶前体溶液中，推动注射器，使冰水在管内流通，管外明胶受到温度的影响，逐渐冷凝，涂附在管的外周，随之光照作用下照射5min使水凝胶交联，并浸泡到500ng/mL的VEGF溶液中，4℃过夜放置后得到负载生物活性物质的预血管化支架。将所得预血管化支架用于SD大鼠皮下移植，并观察其移植后的预血管化现象。
本实施例所得到的负载生物活性物质的预血管化支架的制备过程如图1所示；所得支架实物如图2所示，展示了支架侧面和截面的光学图像，并说明了支架的可拆离结合性；所得支架皮下移植15天后的预血管化效果光学图片和HE染色结果如图3所示，通过对比图3中(a)的中空管和图3中(b)的预血管化支架移植到皮下空间后周围血管密度的差异，可以看出通过冷凝作用构建的负载生物活性物质的预血管化支架能有效促进皮下空间的血管生成，有利于胰岛移植在糖尿病小鼠中进行血糖调节的应用。
实施例2
按10wt％的浓度将甲基丙烯酸酰化明胶，1wt％甲基丙烯酸酰化的肝素溶于去离子水中，在40℃下水浴搅拌充分溶解，加入0.15wt％的引发剂LAP，继续搅拌溶解得到水凝胶前体溶液，将内径1.5mm，外径4mm的硅胶管裁成2cm长度，在室温条件下，把提前预冻的0℃冰水转移到注射器里，通过弯头转接针头连接5mL注射器和硅胶管，将硅胶管浸泡到前体明胶溶液中，推动注射器，使冰水在管内流通，管外明胶受到温度的影响，逐渐冷凝，涂附在管的外周，随之光照作用下照射5min使水凝胶交联，并浸泡到500ng/mL的VEGF溶液中，4℃过夜放置后得到负载生物活性物质的预血管化支架。
将本实施例所得预血管化支架用于C57BL/6J小鼠皮下移植，在移植15天后，小鼠按15mg/kg的浓度腹腔注射STZ糖尿病造模成功后，于预血管化支架位置，将中空管取出后原位注射胰岛细胞并记录糖尿病小鼠的3个月血糖变化。
本实施例在小鼠皮下移植的预血管化支架对胰岛细胞治疗糖尿病的效果，所得非空腹血糖水平记录如图4所示，与无预血管化支架的胰岛组相比，在预血管化支架中原位注射的胰岛(支架+胰岛组)，可以在移植后通过预血管化网络对受者体内血糖快速做出响应并保持良好的细胞活性及胰岛素分泌功能，能在至少3个月内实现血糖矫正。对移植时间到达3个月的移植物进行回收并进行HE染色，由图5可以看出，皮下预血管化支架能为移植胰岛保留空腔，其移植空腔周围有明显血管(红色箭头)生成，移植空腔内部没有明显的炎症反应并且胰岛(绿色箭头)也保持着良好的细胞形态。
对比例1
按10wt％的浓度将明胶溶于去离子水中，在40℃下水浴搅拌充分溶解，将内径1.5mm，外径4mm的聚四氟乙烯管裁成2cm长度，在室温条件下，把提前预冻的0℃冰水转移到注射器里，通过弯头转接针头连接5mL注射器和硅胶管，将硅胶管浸泡到明胶溶液中，推动注射器，使冰水在管内流通，管外明胶受到温度的影响，逐渐冷凝，涂附在管的外周，得到明胶涂层支架。结果发现，基于明胶的温敏性，明胶涂层支架随着环境温度上升，明胶涂层的状态从凝胶态转变为溶胶态，无法稳定涂布在中空管周围。
对比例2
按10wt％的浓度将甲基丙烯酸(MAA)，1wt％甲基丙烯酸酰化的肝素溶于去离子水中，在40℃下水浴搅拌充分溶解，加入0.15wt％的引发剂LAP，继续搅拌溶解得到前体溶液，将内径1.5mm，外径4mm的硅胶管裁成2cm长度，在室温条件下，把提前预冻的0℃冰水转移到注射器里，通过弯头转接针头连接5mL注射器和硅胶管，将硅胶管浸泡到前体溶液中，推动注射器，使冰水在管内流通。结果发现，惰性硅胶管对于没有温敏性的水凝胶难以实现稳定涂层，其疏水表面在缺少表面活性剂的情况下，与水介质不发生反应与浸润。
对比例3
按10wt％的浓度将甲基丙烯酸酰化明胶，1wt％甲基丙烯酸酰化的肝素溶于去离子水中，在40℃下水浴搅拌充分溶解，加入0.15wt％的引发剂LAP，继续搅拌溶解得到水凝胶前体溶液，将内径1.5mm，外径4mm的硅胶管裁成2cm长度，在室温条件下，直接将硅胶管浸泡到水凝胶前体溶液中，极少量溶液浸涂在管的外周，随之光照作用下照射5min使浸涂的水凝胶交联，并浸泡到500ng/mL的VEGF溶液中，4℃过夜放置后得到负载生物活性物质的水凝胶。将所得水凝胶用于大鼠皮下移植，并观察其移植后预血管化现象。
本对比例的皮下移植15天后的预血管化效果光学和HE染色如图3中的(c)所示，相比于实施例1的图3中的(b)，本实施例的水凝胶在中空管周围无法形成稳定涂层，在后续处理中易发生脱落，以及对生物活性物质的装载不充分，导致其促血管生成效果差，血管生成密度较低，说明实施例1的预血管化支架具有更好的预血管化效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质于原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种预血管化支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将温敏性水凝胶材料、甲基丙烯酸酰化的肝素溶于水中，然后加入引发剂，得到水凝胶前体溶液；
（2）将中空管浸泡在步骤（1）所得水凝胶前体溶液中，使冰水在所述中空管的管内流通，所述水凝胶前体溶液在温度的作用下在所述中空管外周形成水凝胶涂层；
（3）将步骤（2）所得中空管置于光照下照射，再浸泡到血管内皮生长因子溶液中，得到预血管化支架
步骤（1）所述温敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酰化明胶、甲基丙烯酸缩水甘油酯化明胶和琼脂中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述温敏性水凝胶材料为甲基丙烯酸酰化明胶。
3.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述温敏性水凝胶材料在水凝胶前体溶液中的浓度为5~15wt%。
4.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述甲基丙烯酸酰化的肝素在水凝胶前体溶液中的浓度为0.25~1wt%。
5.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）所述引发剂为2-羟基-4'-(2-羟乙氧基)-2-甲基苯丙酮和苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂盐中的一种或多种；所述引发剂在水凝胶前体溶液中的浓度为0.05~1wt%。
6.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）所述中空管选用硅橡胶管和聚四氟乙烯管中的至少一种；所述中空管的内径为1~2mm，外径为3~5mm，管长为1~3cm。
7.根据权利要求1-2任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）所述照射的时间为30s~5min；所述血管内皮生长因子溶液的浓度为500ng~1ug/mL；所述浸泡的时间为4~15h。
8.由权利要求1-7任一项所述的制备方法制得的一种预血管化支架。
9.权利要求8所述的一种预血管化支架在制备调控血糖的药物或医疗器械中的应用。
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