KR20140097878A

KR20140097878A - 식물 줄기세포 또는 식물 역분화 줄기 세포의 추출물을 이용한 맞춤형 만능줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포

Info

Publication number: KR20140097878A
Application number: KR1020130010559A
Authority: KR
Inventors: 권유욱; 박영배; 김효수; 백재승
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2013-01-30
Filing date: 2013-01-30
Publication date: 2014-08-07
Also published as: US9976118B2; KR101738715B1; US20150361391A1; CN105073978A; WO2014119893A1; CN105073978B

Abstract

본 발명은 식물 줄기세포 및 식물 역분화 줄기세포 (callus)의 추출물을 사용하여 성체의 분화된 세포를 재프로그램화 시킴으로써 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 및 상기 만능줄기세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 배아줄기세포와 같은 능력을 가진 만능줄기세포를 만드는데 난자를 사용하지 않기 때문에 윤리 문제를 해결할 수 있고, 무엇보다도 인체에 해가 없는 것이 검증된 식물 줄기세포 추출물을 사용하므로 안전성이 확보된 만능줄기세포를 제조할 수 있으며, 또한 각 개체에 맞추어진 면역적합성 세포 치료제를 개발하는데 이용될 수 있을 것이다. 이에 더하여, 질병을 가진 개체로부터 만능줄기세포를 유도함으로써 질환의 원인 규명 및 치료방법을 연구하는데 있어 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물 줄기세포 또는 식물 역분화 줄기 세포의 추출물을 이용한 맞춤형 만능줄기세포의 유도 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 {Method for derivation of pluripotent stem cells using plant stem cells or callus extracts, and pluripotent stem cells produced using the same}

본 발명은 식물 줄기세포 및/또는 식물 역분화 줄기 세포의 추출물을 사용하여 성체의 분화된 세포를 재프로그램화 및/또는 역분화를 일으킴으로써 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법, 상기 방법에 의해 제조된 만능줄기세포 및 상기 만능줄기세포를 포함하는 세포 치료제에 관한 것이다.

줄기세포(stem cell)는 생물 조직을 구성하는 다양한 세포들로 분화할 수 있는 세포로서 배아, 태아 및 성체의 각 조직에서 얻을 수 있는 분화(differentiation)되기 전 단계의 미분화 세포들을 총칭한다. 여러 가지 줄기세포 분류 중 만능줄기세포(pluripotent stem cell)라 함은 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer) 모두로 분화할 수 있는 다기능성을 지닌 줄기세포를 지칭한다.

줄기세포를 분류함에 있어, 해부학적인 존재부위에 따라, 세포의 기능에 따라, 세포표면에 표현된 항원의 종류에 따라, 전사인자에 따라, 세포가 생성하는 단백질에 따라, 그리고 그 줄기세포가 만들어 낼 수 있는 특정 세포종류에 따라 분류할 수 있다.

이러한 여러 가지 분류 중 가장 흔히 이용되고 비교적 명확한 분류는 줄기세포가 분리된 개체에 따른 것이다. 배아(embryo)에서 분리된 경우 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)와 성체에서 분리된 경우 성체줄기세포(adult stem cell)로 나눌 수 있다.

또 다른 흔한 분류는 하나의 줄기세포로부터 몇 종류의 분화된 세포를 만들어 낼 수 있는가에 따라 만능(pluripotency), 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotent) 줄기세포로 나눌 수 있으며, 일반적으로 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 만능줄기세포로, 성체줄기세포(adult stem cell)는 다분화능(multipotency) 및 단분화능(unipotent) 줄기세포로 구분할 수 있다.

수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyt)의 내부세포덩어리(세포내괴, inner cell mass)는 장차 태아를 형성할 부분으로서 이 내부세포덩어리로부터 형성된 배아줄기세포(embryonic stem cell, ES cell)는 한 개체를 구성하는 모든 조직의 세포로 분화될 수 있는 잠재력을 지닌 만능줄기세포(pluripotent stem cell)라 할 수 있다. 즉, 배아줄기세포는 무제한적으로 증식이 가능한 미분화 세포이고, 모든 세포로 분화할 수 있으며 성체줄기세포와 달리 배(germ) 세포도 만들 수 있어 다음 세대로 유전될 수 있다.

이와 같은 만능줄기세포인 배아줄기세포는 세포 제조과정에서 배아의 파괴라는 심각한 종교적 그리고 윤리적 문제점이 존재하며, 제한된 배아로부터 유래하기에 각 개체간의 면역 적합성 부재로 인하여 세포 치료제로 개발 시 이식거부반응을 피할 수 없다. 이러한 문제점을 극복하기 위한 대안으로 성체에서 유래한 세포를 이용하여 맞춤형 배아줄기세포 또는 배아줄기세포와 매우 유사한 세포를 인위적으로 제조하기 위한 여러 가지 방법들이 시도되어 왔다.

대표적인 방법으로 체세포 핵치환법(somatic cell nuclear transfer, SCNT), 세포 융합법(fusion with ES cell), 특정인자주입법(reprogramming by defined factor)이 있다. 체세포 핵치환법은 그 효율이 매우 낮고, 난자가 대량으로 필요하다는 점에서 큰 제한점이 있다. 세포융합법으로 유도된 세포는 2쌍의 유전자를 더 가지고 있어 세포의 안정성 측면에서 큰 문제점이 있다. 가장 최근에 발표된 기술인 특정인자주입법은 발암유전자를 포함하는 바이러스를 이용한 방법으로 암세포 형성이라는 심각한 문제점이 있다.

세포 치료제 개발을 위한 맞춤형 만능줄기세포를 확보하기 위하여 윤리적 문제가 없고 안전성이 확보된 제조방법의 개발이 요구되고 있다. 이러한 요구에 따라, 본 발명자 등은 동물 유래의 유도만능줄기세포 (iPS, induced pluripotent stem cells) 추출물로 역분화 줄기세포를 획득한 바 있으나, 여기에는 몇 가지 제약이 있다.

첫째, 이 방법을 수행하기 위해서는 대량 (20mg 이상)의 iPS 추출물이 필요하다. 따라서, 비용 및 노동력이 많이 요구되는 인간유래 역분화 줄기세포로부터 추출물을 분리하여 이를 이용한 역분화 유도는 아직 성공하지 못한 상태이다. 예를 들면, 20mg의 추출물을 얻기 위해 인간유래 역분화 줄기세포를 준비하려면 숙련된 기술자가 3개월 이상 이 일에 매진해야 하며, 그 비용은 상당하다.

둘째, 동물 줄기세포 또는 그에 상응하는 역분화 줄기세포의 경우 추출물을 분리하는 과정에서 완전히 파쇄되지 못하고 살아남아서 역분화를 유도할 체세포에 처리했을 때, 역분화가 유도된 세포와 추출물에 남아있는 역분화 줄기세포와의 구별이 용이하지 않아서 실험의 성공여부를 즉시 알 수 없고, 이들의 genomic DNA를 분석해야 비로소 알 수 있다. 결국 시간과 비용이 많이 낭비될 소지가 있다.

셋째, 아직 단백질로 인간유래 역분화 줄기세포가 만들어진 사례가 극히 드물기 때문에 바이러스로 만들어진 인간유래 역분화 줄기세포의 추출물을 이용해야 하는데, 이때, 바이러스에 의해 유도된 암 유발 물질 등이 섞여 있을 수 있으므로 향후 임상적용에 걸림돌이 될 수 있다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로서, 윤리적 문제가 없고 안전성이 확보된 맞춤형 만능줄기세포의 제조방법을 제시하고자 한다. 또한 종래 기술로는 실현하기 힘들었던 인간유래 역분화 줄기세포를 유도하는 방법을 제시하고자 한다.

본 발명자들은 성체에서 유래한 세포를 이용하여, 세포를 분리한 성체와 동일한 유전적 배경을 가지는 만능줄기세포를 유도할 수 있는 방법을 개발하게 되었으며, 따라서 여러 다양한 유전적 배경을 가진 성체유래 세포로부터 동일한 결과를 도출함으로써 본 발명의 방법이 맞춤형 만능줄기세포를 만들어 낼 수 있는 적합한 발명임을 제시하고자 한다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 식물유래 줄기세포 추출물을 이용하여 만능줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 식물 줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포에서 추출물을 제조하는 단계; 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 및 상기 성체유래 세포를 배양하여 배아줄기세포와 동일한 분화능을 가지는 만능줄기세포를 제작하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능줄기세포 제조 방법을 제공한다.

상기 추출물은 식물세포에서 얻어진 단백질, 지질, 당 및 산(acid)을 포함한다.

상기 추출물은 캘러스 파우더를 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 단계 a)의 추출물을 성체유래 세포에 주입하기 전 배양 배지와 함께 처리하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 상기 단계를 거쳐 생성된 물질을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서 상기 방법은 추출물을 성체유래 세포에 주입하기 전, 상기 성체유래 세포에 세포막 투과 증진 성분을 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 세포막 투과 증진 성분은 단백질 또는 화합물일 수 있고, streptolysin O 및 digitonin 을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에서 상기 방법은 상기 추출물이 주입된 성체유래 세포를 지지세포(feeder cell) 층으로 옮겨서 추가로 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 지지세포는 STO 세포를 포함한다.

또한, 본 발명은 식물 줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포에서 추출물을 제조하는 단계; 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 및 상기 성체유래 세포를 일반세포 배양액으로 배양한 후 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮긴 다음 배아줄기세포 배양액으로 배양하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능 줄기세포 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 배아줄기세포와 매우 흡사한 만능줄기세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 만능줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 세포 치료제의 약제학적 유효량을 개체 내 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 만능줄기세포를 세포 치료제의 유효성분으로 이용하는 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 만능줄기세포를 유효성분으로 포함하는 피부 미용 항진용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 조성물을 개체 내 투여하는 단계를 포함하는 피부 미용 항진 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 맞춤형 줄기세포 제작의 가장 좋은 방법으로, 식물줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기 세포(induced Pluripotent Plant Stem cells)의 추출물을 이용할 수 있으며, 또한 이 방법은 다양한 유전적 배경을 가진 인간을 포함하는 모든 종의 세포에 모두 적용될 수 있는 광범위한 제작방법이 될 것이다. 또한 본 발명의 방법은 식물유래 줄기세포 추출물을 사용함으로써, 윤리적 문제가 없고 안전성이 확보된 맞춤형 만능줄기세포의 제조를 가능하게 한다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 만능줄기세포를 유도하는 전체 실험과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 5일째 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림이다.
도 3은 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 8일째, feeder cell로 옮긴지 2일째 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림이다.
도 4A는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 32일째, feeder cell로 옮겨서 4번의 계대배양 후 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림이다. 도4B는 전형적인 배아줄기세포를 나타내는 그림이다.
도 5는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 32일째, feeder cell로 옮겨서 4번의 계대배양 후 관찰된 유도 만능줄기세포의 Alkaline phosphatase 염색 결과를 나타내는 그림이다.
도 6A는 식물 줄기세포 추출물을 처리한 지 50일째, feeder cell로 옮겨서 7번의 계대배양 후 관찰된 유도 만능줄기세포를 나타내는 그림과 그 세포의 Alkaline phosphatase 염색 결과를 나타내는 그림이다. 도6B는 야마나카의 4 factor 바이러스를 이용하여 유도된 인간 만능줄기세포와 Alkaline phosphatase 염색결과를 나타내는 그림이다.
도 7은 본 발명의 방법으로 유도된 만능줄기세포의 유전자 발현을 보여주는 그림이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

a) 식물 줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포에서 추출물을 제조하는 단계;

b) 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 및

c) 상기 성체유래 세포를 배양하여 배아줄기세포와 동일한 분화능을 가지는 만능줄기세포를 제작하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능줄기세포 제조 방법을 제공한다.

상기 추출물은 식물세포에서 얻어진 단백질, 지질, 당, 산(acid) 및 유기화합물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 추출물은 캘러스 파우더를 포함하고, 상기 캘러스 파우더는 물에 녹여 사용하는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용된 용어 '줄기세포'는 조직 및 기관의 특수화된 세포를 형성하도록 비제한적으로 재생할 수 있는 마스터 세포를 지칭한다. 줄기세포는 발달가능한 만능성 또는 다능성 세포이다. 줄기세포는 2개의 딸줄기세포, 또는 하나의 딸줄기세포와 하나의 유래('전이(transit)') 세포로 분열될 수 있으며, 이후에 조직의 성숙하고 완전한 형태의 세포로 증식된다.

본 발명에서 사용된 용어 '배아줄기세포'는 수정 후 발생 초기인 배반포기(blastocyt)의 내부세포덩어리(세포내괴, inner cell mass)에서 분리 후 배양한 세포로 만능성(pluripotency)을 지니는 세포를 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 '역분화 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기세포 (induced Pluripotent Stem cells, iPS) 추출물'은 시험관 내에서 여러 가지 방법으로 유도 및 배양한 역분화 줄기 세포 또는 유도된 만능 줄기세포 (induced Pluripotent Stem cells, iPS)를 물리-화학적 방법을 통하여 잘게 부순 후 원심분리 등의 방법으로 분리한 물질을 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 "식물 줄기세포"는 형성층 유래 식물줄기세포이다. 특히, 식물의 물관과 체관의 경계선상에 끼인 형성층에서 물리적으로 전혀 손상받지 않은 상태의 순수 식물줄기세포 (CMC Cambial Meristematic Cell)를 포함한다.

본 발명에서 사용된 용어 "캘러스"(Callus, 혹은 유합조직, 창상조직, 유상조직)는 분화되지 않은 부정형의 세포덩어리로 식물체에 상처가 났을 때 상처 주변에 생기는 분열조직이 형성한 종양조직이 대표적이다. 식물은 크게 세포분열을 하는 분열조직과 그렇지 않은 영구조직으로 구성되어 있는데 처음 분열조직의 세포를 영양 배지에 넣고 키우면 캘러스가 형성된다. 그 후 부정배가 형성되고 식물체로 분화된다. 이 캘러스는 흔히 "식물의 줄기세포"라고도 불린다. 본 발명에 사용되는 캘러스의 종류에는 제한이 없다.

본 발명에서 사용된 용어 '만능줄기세포'는 생체를 구성하는 3가지 배엽(germ layer), 즉 내배엽(endoderm), 중배엽(mesoderm), 외배엽(ectoderm) 모두로 분화할 수 있는 다기능성(만능성)을 지닌 줄기세포를 지칭한다. 전통적으로 배아줄기세포가 이 범주에 속하는 줄기세포라 할 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '맞춤형 만능줄기세포'는 만능줄기세포를 만들기 위해 사용한 공여세포와 유도된 만능줄기세포가 유전적으로 동일함을 지칭하며, 이는 맞춤형 만능줄기세포가 공여세포로부터 기원하여 유도된 세포임을 나타낸다.

본 발명에서 사용된 용어 '성체유래 세포'는 배아세포와 반대되는 용어로, 태어나서 생존하는 성체로부터 유래한 세포를 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 "분화(differentiation)"는 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 것을 말한다. 일반적으로 비교적 단순한 계(系)가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계(部分系)로 분리되는 현상이다. 예를 들면, 개체발생에서 처음에 동질적이었던 알 부분 사이에 머리나 몸통 등의 구별이 생기거나 세포에도 근세포라든가 신경세포 등의 구별이 생기는 것과 같이 처음에 거의 동질이었던 어떤 생물계의 부분 사이에 질적인 차이가 생기는 것, 또는 그 결과로서 질적으로 구별할 수 있는 부역 또는 부분계로 나누어져 있는 상태를 분화라고 한다.

본 발명의 방법은 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포를 배양하고 이로부터 추출물을 제조하는 단계를 포함하는데, 이는 당업계에 공지된 일반적인 방법에 따라 수행할 수 있다. 예를 들면, 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포를 배양하고 단백질 분해 효소 처리 후 부유액을 수합하거나 식물 줄기세포를 65℃에서 2 시간동안 반응시켜 필터링함으로써, 각각의 세포로부터 유래하는 단백질을 추출할 수 있다. 본 발명의 일 구현예에서, 캘러스 파우더를 사용할 수 있다.

상기 추출물 제조와 관련하여, 기존의 추출 방법을 응용하여 고농도의 추출물을 제조할 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다. 상기 추출물의 농도는 100ug/ml 내지 1mg/ml 가 바람직하며, 더욱 바람직하게는 500 ug/ml 이다. 추출물의 농도가 상기 범위를 벗어나면 맞춤형 만능줄기세포의 유도 효율이 저하되거나 추출물이 처리된 세포가 사멸할 우려가 있기 때문이다.

본 발명의 방법은 식물 줄기세포 또는 다양한 방법으로 유도된 모든 종류의 유도 만능 식물 줄기세포에서 분리한 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계를 포함한다.

상기 성체유래세포는 인간유래 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast) 를 포함한다.

주입을 위하여 세포막 투과 증진 성분 (예를 들면, streptolysin O 또는 digitonin)을 세포에 처리하여 가역적인 조그만한 구멍을 뚫어(투과화, permeabilization) 추출물이 세포내로 유입될 수 있도록 처치한다. 투과화 과정을 거친 후 추출물과 함께 배양(incubation)하는 과정을 통하여, 성체유래 세포 내로 식물 줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포에서 분리한 추출물을 주입한다.

본 발명은 추출물이 주입된 세포를 배양과정을 거쳐, 배아줄기세포와 매우 유사한 세포, 즉 배아줄기세포와 동일한 유전적 배경 및 분화능을 가지는 세포를 제작하는 단계를 포함한다.

상기의 추출물 주입 과정 후 일반 세포 배양액을 사용하여 추출물이 주입된 성체유래 세포를 배양한 후, 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 추가로 배양하는 과정을 수행할 수 있다.

더욱 구체적으로는 상기의 추출물 주입 과정 후 콜로니가 형성될 때까지 일반 세포 배양액(DMEM, 10% FBS, 50U/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신)을 사용하여 추출물이 주입된 성체유래 세포를 배양한 후, 콜로니가 생긴 이후에는 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮겨 배아줄기세포 배양액에서 7일마다 계대배양하며 배지는 매일 교환하며 배양하는 과정을 수행한다. 본 발명의 지지세포는 STO 세포를 포함한다.

상기 추출물에 의해 유도된 만능줄기 세포는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12에 20% KSR (Knockout serum replacement), 2 mM L-glutamine, 0.1mM 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 50U/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 및 10 ug/ml bFGF가 첨가된 배양액에서 배양할 수 있다. 상기 DMEM에 첨가되는 화합물의 농도는 본 발명의 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 변할 수 있다는 것은 당업자가 용이하게 인식할 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 식물 줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포에서 추출물을 제조하는 단계;

b) 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계;

c) 상기 성체유래 세포를 일반세포 배양액으로 배양한 후 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮긴 다음 배아줄기세포 배양액으로 배양하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능줄기세포를 유도하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 식물줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포를 이용하여 성체유래 세포로부터 배아줄기세포와 구분이 안될 만큼 유사한 세포를 만들 수 있다는 것에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 상기 본 발명의 방법을 통해 맞춤형 만능줄기세포가 유도됨을 확인하였다.

구체적으로, 세포의 모양에 있어서 본 발명에 의해 유도된 만능줄기세포는 그 모양이 배아줄기세포와 거의 동일함을 알 수 있다 (도 4 참조). 또한 배아줄기세포의 특징적인 유전자 (Nanog, Oct4)의 발현여부를 조사한 결과 본 발명에 의해 유도된 만능줄기세포에서 배아줄기세포와 동일하게 상기 유전자가 발현됨을 확인하였다(도 7 참조). 또한, 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 유도된 맞춤형 만능줄기세포를 제공한다.

본 발명자들은 상기 방법을 통해 10번의 계대배양을 성공하여 줄기세포의 특징인 self-renewal이 되는 것을 확인하였다 (도 6 참조).

또한 본 발명은 본 발명에 따라 제조된 맞춤형 만능줄기세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다. 구체적으로, 상기 세포 치료제는 간세포, 지방세포, 골세포, 연골세포, 근육세포, 신경세포, 심근세포, 혈관내피세포 등의 형성에 이용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어 '세포 치료제'는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포 치료제는 세포의 분화정도에 따라 크게 체세포 치료제, 줄기세포 치료제로 분류되며 본 발명은 특히 줄기세포 치료제에 관한 것이다.

이하, 하기 실시예를 들어 본 발명의 실시 형태를 구체적으로 설명하겠으나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것 일뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1. 식물세포 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계

본 발명자들은 식물유래 줄기세포 추출물로 캘러스 파우더를 사용하였다. 본 발명에 사용될 수 있는 캘러스 파우더에는 제한이 없다. 하기 실시예에서는 주식회사 아모레 퍼시픽으로부터 제공받은 세콰이어 캘러스 파우더 (sequoia callus power)를 사용하였다.

구체적으로, 인간유래 피부 섬유아세포 (human dermal fibroblast)를 트립신-EDTA를 이용하여 낱개의 세포로 한 후, cold PBS (phosphate buffered saline)으로 세정하였다. 세포 펠렛을 cold Ca2- 및 Mg2-free Hank's balanced salt solution (HBSS) 100㎕/100,000 세포가 되게 재현탁하고 1.5ml 튜브로 옮겼다. 120g, 5분간, 4℃로 swing-out rotor에서 원심분리한 후 상등액은 버리고 세포 펠렛을 다시 cold HBSS 97.7㎕로 재현탁하여 37℃ 수조(water bath)에서 2분간 반응시켰다. Streptolysin O(SLO, cold HBSS 중에 1:10 희석된 100 g/ml 스톡) 2.3㎕를 첨가하였다 (최종 SLO 농도: 230 ng/ml). 또는 이 과정에서 SLO 대신 Digitonin (20ug/ml)과 transport solution (110 mM potassium acetate, 5 mM sodium acetate, 2 mM magnesium acetate, 1mM EGTA, 2 mM DTT, protease-inhibitor cocktail, 20 mM HEPES pH7.3) 200ul를 첨가할 수 있다. 샘플을 37℃ 수조에서 50분간 반응시키는데, 10분에 한 번씩 위아래로 섞어주었다. 반응이 끝난 샘플을 얼음 위에 올려놓고 cold HBSS 200㎕를 첨가한 후, 120 g, 5분간, 4℃로 swing-out rotor에서 원심분리한다. 이러한 세포투과(permeabilization) 과정을 거친 후에, 세포 펠렛을 1㎕/1000 세포가 되도록 200㎕의 식물 줄기세포 추출물로 재현탁하였다. 식물 줄기세포 추출물로는 캘러스 파우더를 사용하였다 (500ug/ml). 그리고, ATP-재생 시스템 (10 mM 크레아틴 포스페이트, 및 25g/ml 크레아틴 키나아제), 각각 1mM 뉴클레오티드 트리포스페이트를 첨가하고 37℃ 수조에서 1시간 반응시키는데, 10분에 한번씩 위아래로 섞어주었다. 반응이 끝난 후, 원형질막을 재봉합하기 위하여 2 mM CaCl₂가 함유된 ES 세포 배지 1㎖을 첨가하여 37℃ 배양기에서 2시간 동안 반응시켰다. PBS 세정 후, 세포 펠렛을 배아줄기세포 배양 배지로 재현탁시킨후 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 seeding 하였다.

실시예 2. 추출물이 주입된 세포를 배양과정을 거쳐, 배아 줄기세포와 매우 유사한 세포를 제작하는 단계

DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)에 10% FBS, 50U/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신이 첨가된 일반세포 배양배지에서, 37℃를 유지하며 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 배양하였다. 0.1% 젤라틴이 코팅된 디쉬에 식물줄기세포 추출물(캘러스 파우더)이 주입된 성체유래 세포(인간유래 피부섬유아 세포)를 상기의 배지로 배양하여 첫 2일 후 배지를 교환해 주었다. 10일 동안 매일 배지를 교환해주며 배양한 후, mitomycin C(MMC)가 처리된 지지세포 (feeder cell, STO cell) 위에 1:2의 비율로 옮겼다. 이후 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)/F12에 20% KSR (Knockout serum replacement), 2 mM L-glutamine, 0.1mM 비필수 아미노산, 0.1mM β-머캅토에탄올, 50U/ml 페니실린, 50mg/ml 스트렙토마이신, 10 ug/ml bFGF가 첨가된 배양액에서 배지를 매일 교환해주며 7일에 한번 주기로 새로운 지지세포 위로 옮겼다. 평균적으로 약 21일 째 분석에 필요한 맞춤형 줄기세포를 배양할 수 있었다.

도 1은 본 발명의 방법에 따라 만능줄기세포를 유도하는 전체 실험과정을 나타내는 모식도이다. 도 2 내지 도 4는 각각 배양 5일째, 10일째, 및 32일째 만능줄기세포가 유도된 것을 보여주며, 도 5 및 도 6은 각각 배양 32일째 및 배양 50일째의 alkaline phosphatase 염색소견을 보여준다. Alkaline phosphatase 염색은 통상의 염색 키트를 이용하여 확인하였다.

도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 유도된 만능줄기세포가 배아줄기세포의 특징인 Alkaline phosphatase 염색 양성 소견(보라색)을 나타냄을 알 수 있다.

실시예 3. 맞춤형 만능줄기세포의 특성 분석 (유전자 발현분석)

배양된 세포를 회수한 후, TRIzol reagent (Invitrogen)를 사용하여 total RNA를 분리하였다. 역전사-중합효소연쇄반응(RT-PCR)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 Nanog, Oct-3/4 및 대조유전자인 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR을 진행하였다. PCR 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분석하여, 이들 유전자의 발현을 확인한 후 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 본 발명의 방법으로 유도된 만능줄기세포 (hiPS)는 배아줄기세포(hES) 의 특징적인 Nanog, Oct-3/4의 유전자 발현을 보임을 알 수 있다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

a) 식물 줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포에서 추출물을 제조하는 단계;
b) 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계; 및
c) 상기 성체유래 세포를 배양하여 배아줄기세포와 동일한 분화능을 가지는 만능줄기세포를 제작하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능줄기세포 제조 방법.
제 1항에 있어서,
상기 추출물은 식물세포에서 얻어진 단백질, 지질, 당 및 산(acid)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 단계 a)의 추출물은 성체유래 세포에 주입하기 전 배양 배지와 함께 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단계 a)의 추출물은 성체유래 세포에 주입하기 전 배양 배지와 함께 처리하는 단계를 거쳐 생성된 물질을 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 추출물의 농도가 100 ug/ml 내지 1 mg/ml 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 5항에 있어서,
상기 추출물의 농도가 500 ug/ml 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 추출물이 캘러스 파우더인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 7항에 있어서,
상기 캘러스 파우더는 물에 녹여 사용하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하기 전, 상기 성체유래 세포에 세포막 투과 증진 성분을 처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 9항에 있어서,
상기 세포막 투과 증진 성분은 단백질 또는 화합물인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 10항에 있어서,
상기 단백질은 streptolysin O 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 10항에 있어서,
상기 화합물은 digitonin 인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항에 있어서,
상기 추출물이 주입된 성체유래 세포를 지지세포(feeder cell) 층으로 옮겨서 추가로 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 13항에 있어서,
상기 지지세포가 STO 세포인 것을 특징으로 하는, 방법.
a) 식물 줄기세포 또는 유도 만능 식물 줄기세포에서 추출물을 제조하는 단계;
b) 상기 추출물을 성체유래 세포에 주입하는 단계;
c) 상기 성체유래 세포를 일반세포 배양액으로 배양한 후 지지세포(feeder cell) 층이 있는 배양 조건으로 옮긴 다음 배아줄기세포 배양액으로 배양하는 단계를 포함하는, 맞춤형 만능 줄기세포 제조 방법.
제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 맞춤형 만능 줄기세포를 유효성분으로 포함하는 피부 미용 항진용 조성물.
제 16항의 조성물을 개체 내 투여하는 단계를 포함하는 피부 미용 항진 방법.