CN104138391A - 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用 - Google Patents

间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN104138391A
CN104138391A CN201310170161.0A CN201310170161A CN104138391A CN 104138391 A CN104138391 A CN 104138391A CN 201310170161 A CN201310170161 A CN 201310170161A CN 104138391 A CN104138391 A CN 104138391A
Authority
CN
China
Prior art keywords
stem cell
stress
mescenchymal stem
lymphocyte
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201310170161.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104138391B (zh
Inventor
时玉舫
曹刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Institute of Nutrition and Health of CAS
Original Assignee
Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS filed Critical Shanghai Institutes for Biological Sciences SIBS of CAS
Priority to CN201310170161.0A priority Critical patent/CN104138391B/zh
Priority to US14/889,981 priority patent/US10071119B2/en
Priority to EP14795387.1A priority patent/EP2997971B1/en
Priority to PCT/CN2014/076511 priority patent/WO2014180269A2/zh
Publication of CN104138391A publication Critical patent/CN104138391A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104138391B publication Critical patent/CN104138391B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2026—IL-4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5023—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects on expression patterns
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G01N2333/5406—IL-4
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70503—Immunoglobulin superfamily, e.g. VCAMs, PECAM, LFA-3
    • G01N2333/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • G01N2333/70596—Molecules with a "CD"-designation not provided for elsewhere in G01N2333/705

Abstract

本发明公开了间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用。具体地，本发明提供了间充质干细胞用于制备预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少的药物组合物；和/或用于制备预防或治疗应激反应引起的免疫力下降的药物组合物；和/或用于制备促进白介素-4(IL-4)表达量和/或活性增加或增强的药物组合物。本发明发现间充质干细胞能够通过调控IL-4，从而保护激素紊乱诱导的淋巴细胞减少，从而具备激活免疫反应的功能。

Description

间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明公开了间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降中的应用。
背景技术
过去几十年以来的流行病学证据以及人们传统的生活经验都显示精神压力(Stress)会严重损害个人健康。一方面，压力会直接促进疾病的发生和进展。比如有研究显示压力过程中分泌的糖皮质激素会下调小鼠的抑癌基因p53蛋白质水平，从而促进肿瘤的发生。另外一方面，越来越多的研究关注压力对于疾病发生和发展的间接促进作用，特别是下调免疫系统的功能。
免疫系统功能的下降在众多疾病发生和发展的过程中起着至关重要的作用。下调的免疫系统功能使人更易于感染病毒，延迟伤口愈合时间，增加患癌症几率等等。
虽然，人们对于压力怎样促进疾病发生和发展的理解有了很大的进步。但是，一直缺乏有效对抗压力的有效措施。临床上非常需要能有效对抗压力的有效措施，从而解除压力对于疾病发生和发展的不良影响。
因此，本领域迫切需要开发一种能够有效对抗压力不利影响，同时增强人体免疫系统功能的药物。
发明内容
本发明提供了一种将间充质干细胞应用于对抗过度应激反应引起的免疫系统疾病的方法。
本发明的第一方面，提供了一种间充质干细胞的用途，用于制备预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或应激反应导致的免疫力下降的药物组合物。
在另一优选例中，所述应激反应导致的淋巴细胞减少包括糖皮质激素上升引起的淋巴细胞减少。
在另一优选例中，所述的淋巴细胞包括T淋巴细胞或B淋巴细胞。
在另一优选例中，所述的淋巴细胞减少包括凋亡引起的淋巴细胞减少。
在另一优选例中，所述的免疫力下降包括淋巴细胞减少、白介素-4(IL-4)的表达量和/或活性下降。
在另一优选例中，所述的间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞。
在另一优选例中，所述的间充质干细胞来源于哺乳动物，更佳地来源于人、小鼠、或大鼠。
在另一优选例中，所述的药物组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的药物组合物为液体，并含有0.05-5×106细胞/ml，更佳地，为0.5-2×106细胞/ml。
在另一优选例，所述间充质干细胞的施用剂量为0.01-100×106个间充质干细胞/kg。
在另一优选例中，所述的药物组合物还含有额外的活性成分IL-4。
本发明的第二方面，提供了一种间充质干细胞的用途，用于制备促进白介素-4表达量和/或活性增加或增强的药物组合物。
本发明的第三方面，提供了一种筛选用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物的方法，所述的方法包括步骤：
(a)在测试组中，向经应激反应处理的细胞培养体系中添加测试化合物，并观察淋巴细胞的减少情况；在对照组中，在相同细胞培养体系中不添加测试化合物，并观察淋巴细胞的减少情况；
其中，若测试组中的淋巴细胞减少显著少于对照组，则选出测试化合物作为用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物。
在另一优选例中，所述的经应激反应处理的细胞培养体系中的细胞包括(a)从经应激反应处理的动物中所分离细胞；和/或(b)体外用糖皮质激素处理后的细胞。
在另一优选例中，所述的减少包括：因凋亡造成的淋巴细胞减少。
在另一优选例中，所述的“显著少于”指测试组淋巴细胞凋亡数(或减少数)小于对照组淋巴细胞凋亡数(或减少数)的50%。
在另一优选例中，所述的方法还包括步骤：
(b)测定测试组和对照组细胞体系中IL-4的表达量和/或活性
其中，若测试组中的IL-4表达量和/或活性显著高于对照组，则选择该测试化合物作为用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指测试组中的IL-4的表达量和/或活性至少大于对照组中的50%。
本发明的第四方面，提供了一种预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或应激反应导致免疫力下降的方法，给需要的对象施用安全有效量的间充质干细胞。
在另一优选例中，所述的对象包括哺乳动物(如人)。
在另一优选例中，所述安全有效量的间充质干细胞的施用剂量为0.01-10×106个间充质干细胞/kg。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了间充质干细胞阻止束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少
BALB/c雄鼠（6-8周）在接受束缚应激处理之前，通过尾静脉接受1×106间充质干细胞或者接受PBS。两轮束缚应激处理结束后，对小鼠脾细胞和胸腺细胞总数进行计数（图1A，B）。流式分析T淋巴细胞和B淋巴细胞的相对比例，结合脾细胞的绝对总数量，得出相应的T淋巴细胞和B淋巴细胞的绝对数量（图1C，D）。体内脾细胞的凋亡通过TUNEL方法检测。
图2：糖皮质激素介导了束缚应激引起的淋巴细胞数量减少
BALB/c雄鼠（6-8周）在接受束缚应激处理之前，通过尾静脉分别接受1×106间充质干细胞，PBS或者糖皮质激素拮抗剂RU486（25mg/kg）。两轮束缚应激处理结束后，统计淋巴细胞的数量（图2A）。对BALB/c雄鼠（6-8周）腹腔注射地塞米松（5mg/kg），同时给小鼠分别尾静脉注射1×106间充质干细胞或者PBS。2天之后，对小鼠脾细胞进行计数。
图3：间充质干细胞不影响束缚应激诱导的糖皮质激素的产生
2轮束缚应激之后，收集小鼠的血清，并通过酶联免疫结合法测定血清中糖皮质激素的含量。
图4：间充质干细胞对抗地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡
2×105脾细胞与不同数量的间充质干细胞以1:1/40，1:1/20，1:1/10的比例共培养。不同浓度的地塞米松加入到共培养体系。30小时后收集脾细胞并进行PI染色，运用流式对PI染色的脾细胞进行DNA含量分析（图4A）。为了得到脾细胞存活率，用100%减去图A中亚二倍体的百分比例。对纯化的T淋巴细胞和B淋巴细胞进行类似于图A中脾细胞的分析(图4C和4D)。
图5：白介素-4具有非常强的抵抗地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡功能
脾细胞培养在含有不同浓度地塞米松的培养基中，并分别加入白介素-4，白介素-6，白介素-7或白介素-15（各10ng/ml）。24小时后收集细胞进行PI染色，并通过流式分析DNA含量。
图6：间充质干细胞对束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少的保护作用依赖于白介素-4
BALB/c雄鼠（6-8周）在束缚应激开始之前，尾静脉接受PBS，间充质干细胞，或间充质干细胞加白介素-4的中和抗体。确定T细胞和B细胞的数量（方法和图1中描述的方法相同）。STAT6缺失的小鼠和T-bet缺失的小鼠接受两轮束缚应激，然后统计淋巴细胞的数目。
图7：间充质干细胞对束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少的治疗作用
BALB/c雄鼠（6-8周）在束缚应激开始之后，尾静脉接受PBS，间充质干细胞。两轮应激后检测小鼠脾脏淋巴细胞的数目。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，首次意外地发现了间充质干细胞对于应激反应导致的淋巴细胞减少或免疫力下降有预防或治疗的作用。不同于以往的间充质干细胞在抑制炎症反应的中的作用，本发明人发现了间充质干细胞居然能够通过调控IL-4，从而保护糖皮质激素升高诱导的淋巴细胞减少，从而具备激活免疫反应的功能。在此基础上，完成了本发明。
术语
如本文所用，术语“应激反应”、“应激”、“压力”可替换使用，均指应激反应(Stress)，指机体突然受到强烈有害刺激（如创伤、手术、失血、感染、中毒、缺氧、饥饿等）时，通过下丘脑引起血中促肾上腺皮质激素浓度迅速升高，糖皮质激素大量分泌的生理现象。应激反应可以诱发广泛的神经内分泌反应，当应激反应持续存在或应激过度时，可能导致多种生理或心理的疾病发生。
间充质干细胞
间充质干细胞是一种多能成体干细胞，可以很容易地从多种组织中分离获取，比如骨髓，脂肪组织，脐带等。相比其他种类的干细胞比如胚胎干细胞，间充质干细胞在许多方面具有优势。比如，间充质干细胞不像胚胎干细胞那样会涉及到临床使用上的伦理问题；间充质干细胞也不会在体内成瘤；此外，间充质干细胞具有很低的免疫原性，使得不易于被接受者排斥。间充质干细胞的这些优点使得它成为临床上细胞治疗一种较为理想的候选细胞。
间充质干细胞和免疫系统有着非常密切的联系。过去几年里，间充质干细胞被用来治疗多种免疫功能过度亢进的疾病，包括多发性硬化，移植物抗宿主免疫性疾病，I型糖尿病，风湿性关节炎，系统性红斑狼疮等，并取得了很好的疗效。
有研究显示，间充质干细胞在接触炎症因子——干扰素γ加上肿瘤坏死因子α，白介素1α或白介素1β的情况下，通过分泌一氧化氮和趋化因子从而获得免疫抑制功能。一氧化氮和趋化因子的共同作用能显著地抑制免疫反应。
然而，本发明人在通过实验发现，在应激反应导致的免疫力低下的发病机制中，间充质干细胞具备激活免疫细胞——淋巴细胞，从而增强免疫力的功能。
可用于本发明的间充质干细胞种类没有特别限制，可以包括来源于骨髓、脂肪、脐带、胎盘、羊水等的间充质干细胞。
可用于本发明的间充质干细胞为液体，并含有0.05-5×106细胞/ml，更佳地，为1-2×106细胞/ml。施用时，所述的间充质干细胞的数量约为0.01-10×106/kg。
白介素-4(IL-4)
IL-4具有多种生物学功能，包括诱导B细胞、T细胞活化以及B细胞向浆细胞分化，在体液免疫和获得性免疫发挥重要作用。IL-4可以保护或阻止淋巴细胞凋亡，此外，IL-4还可以促进巨噬细胞的抗原提呈能力和杀伤肿瘤细胞的功能。
可用于本发明的IL-4的浓度没有特别限制，可以为任何施用于细胞或动物的合理浓度，通常，在细胞实验中，所述的IL-4的浓度为1ng/ml-50ng/ml，和/或动物实验中：所述的IL-4的浓度为0.5mg/kg-10mg/kg。
在本发明中，IL-4还可以作为用于预防或治疗应激导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的的药物组合物中的额外成分，用于预防或治疗应激性糖皮质激素升高导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降。
药物组合物
本发明提供了一种将间充质干细胞用于制备预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的药物组合物。其中，所述的药物组合物包括安全有效量的间充质干细胞以及其药学上可接受的载体。
当在治疗上进行施用(给药)时，可增强IL-4的表达和/或活性，进而抑制在应激反应中，由于体内糖皮质激素水平升高而造成的淋巴细胞减少和/或免疫力下降。通常，可将这些间充质干细胞配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。
本发明中的药物组合物，它含有安全有效量的间充质干细胞、药学上可接受的载体或赋形剂和任选的IL-4。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。
筛选方法
本发明还提供了一种筛选用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物的方法。其中，一种方法包括先筛选出可能影响应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的化合物，再测试所筛选的化合物对淋巴细胞凋亡的影响以及对IL-4表达和/或活性的影响。
具体的步骤为：
(a)在测试组中，向经应激反应处理的细胞培养体系中添加测试化合物，并观察淋巴细胞的减少情况；在对照组中，在相同细胞培养体系中不添加测试化合物，并观察淋巴细胞的减少情况；
其中，若测试组中的淋巴细胞减少显著少于对照组，则选出测试化合物作为用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物。
在本发明中，所述的经应激反应处理的细胞培养体系中的细胞包括(a)从经应激反应处理的动物中所分离细胞；和/或(b)体外用糖皮质激素处理后的细胞；所述的减少包括：因凋亡造成的淋巴细胞减少。
在另一优选例中，所述的“显著少于”指测试组淋巴细胞凋亡数(或减少数)小于对照组淋巴细胞凋亡数(或减少数)的50%。
此外，所述的方法还包括步骤：
(b)测定测试组和对照组细胞体系中IL-4的表达量和/或活性
其中，若测试组中的IL-4表达量和/或活性显著高于对照组，则选择该测试化合物作为用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物。
在另一优选例中，所述的“显著高于”指测试组中的IL-4的表达量和/或活性至少大于对照组中的50%。
材料和通用方法
1.小鼠
雄性BALB/c小鼠(8-10周)购自上海斯莱克公司，STAT6基因缺陷(CD4TH2细胞发育缺陷)和T-bet基因缺陷小鼠(CD4TH1细胞发育缺陷)购自美国Jackson实验室。所有小鼠饲养在上海交通大学医学院动物房。
2.试剂
重组白介素-4，白介素-6，白介素-7，白介素-15均购自美国ebioscience公司。白介素-4抗体来自美国Harlan公司。地塞米松和RU486购自美国西格玛公司。
3.细胞
间充质干细胞从6-10周的BALB/c小鼠骨髓中分离获取。间充质干细胞培养在添加了10%胎牛血清,2毫摩尔每升谷氨酰胺，100单位每毫升盘尼西林和100微克每毫升链霉素的DMEM低糖培养基中。
4.动物实验模型：束缚性应激
雄性BALB/c小鼠(8-10周)置于50毫升离心管中，离心管含有多个孔，确保通气。小鼠置于管中12小时，然后解除束缚让小鼠休息12小时。休息期间提供小鼠食物和饮水。对照小鼠不进行束缚应激处理，但只在实验组小鼠休息期间提供食物和饮水。束缚应激持续2天之后，将小鼠断颈处死，取小鼠脾脏并进行计数和分析。
5.地塞米松及糖皮质激素拮抗剂RU486注射
地塞米松（5毫克每千克）被注射到小鼠腹腔中，两天后取小鼠脾脏并进行计数分析。糖皮质激素拮抗剂RU486在小鼠接受应激开始之前立即被注射到小鼠腹腔，小鼠束缚应激处理结束后立即取小鼠脾脏并进行计数分析。
6.酶联免疫法检测血清中糖皮质激素的含量
试剂盒购自武汉EIAab Science公司(试剂货号:E0540M)，按照说明书中指定程序测定。
7.TUNEL染色
试剂盒购自罗氏（ROCHE）公司(试剂货号:11684817910)，按照说明书指定程序进行染色。
8.DNA含量分析
细胞收集后先用PBS将细胞重悬，300g离心后除去PBS，然后用PI染色水溶液（含0.1%丙酮酸纳，0.1%Triton-X-100和50毫克每升碘化丙啶）重悬。将重悬后的细胞置于4度冰箱中过夜，最后通过流式细胞仪检测DNA含量。
9.流式细胞术
FITC标记的CD3抗体以及APC标记的CD19抗体分别用来检测T淋巴细胞和B淋巴细胞。将细胞与FITC-CD3和APC-CD19抗体于4度暗处孵育30分钟，然后用含0.1%BSA的PBS洗两遍，最后用含0.1%BSA的PBS重悬，流式检测。
本发明的有益效果
1.间充质干细胞对应激引起的免疫力低下有一定的预防和治疗作用。
2.间充质干细胞通过影响应激后糖皮质激素升高导致的淋巴细胞减少，从而预防和治疗应激引起的免疫力下降。
3.IL-4介导了应激反应中糖皮质激素诱导的淋巴细胞减少，间充质干细胞通过影响IL-4，从而改善应激反应的病理情况。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例1：间充质干细胞预防束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少
方法：根据通用方法3-5,给6-8周的BALB/c雄性小鼠从尾静脉预先注射1×106间充质干细胞或注射PBS作为对照，然后立即让小鼠接受束缚应激。两轮束缚应激之后，对小鼠的总脾细胞进行计数。
通过流式确定小鼠脾细胞的T淋巴细胞和B淋巴细胞的相对比例，进一步计算得出脾细胞中T淋巴细胞和B淋巴细胞的绝对数量。
结果：如图1A、B、C所示，束缚应激能够显著地使小鼠的脾脏细胞数量减少，相应的T淋巴细胞数量和B淋巴细胞数量均能观察到显著减少。
预先注射间充质干细胞的小鼠的脾细胞数量未明显减少，相应的T淋巴细胞数量和B淋巴细胞数量都未观察到明显的数量减少。
结论：实验结果证明间充质干细胞能够预防束缚应激引起的淋巴细胞数量减少。进一步的TUNEL染色结果显示，束缚应激引起了脾脏细胞的凋亡，而预先注射间充质干细胞能够抵抗束缚应激引起的凋亡。该结果更进一步说明间充质干细胞对抗束缚应激引起的淋巴细胞数量减少至少一部分原因是减少了脾脏细胞凋亡。
实施例2：糖皮质激素参与介导束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少
方法：根据通用方法5给6-8周的BALB/c雄性小鼠腹腔注射糖皮质激素拮抗剂RU486（25mg/kg），或注射PBS作为对照。然后立即让小鼠接受束缚应激。两轮束缚应激之后，对小鼠的总脾细胞进行计数。
结果：如图2A所示，在使用糖皮质激素拮抗剂RU486后，束缚应激引起的淋巴细胞数量减少的情况显著改善。
结论：糖皮质激素对束缚应激的影响能被拮抗剂所拮抗，由此可见，糖皮质激素参与了介导束缚应激引起的淋巴细胞数量减少。
实施例3间充质干细胞对抗糖皮质激素直接诱导的淋巴细胞数量减少
方法：根据通用方法5给小鼠直接注射地塞米松（人工合成的糖皮质激素），与此同时给小鼠尾静脉注射间充质干细胞。36小时之后对小鼠脾细胞计数。
结果：如图2B所示，在使用了间充质干细胞之后，束缚应激引起的淋巴细胞数量减少的情况也能得到显著改善。
结论：间充质干细胞也能对抗糖皮质激素直接诱导的淋巴细胞数量减少。
实施例4：间充质干细胞不影响束缚应激引起的糖皮质激素产生
方法：根据通用方法4，对6-8周的BALB/c雄性小鼠接受两轮束缚应激之后，收集小鼠血清，并通过ELISA方法检测血清中糖皮质激素的含量。
结果：如图3所示，束缚应激能诱导小鼠产生高水平的糖皮质激素，然而注射间充质干细胞并不能显著影响糖皮质激素的水平。
结论：该结果显示了间充质干细胞不能直接影响应激导致的糖皮质激素的产生量。
实施例5：间充质干细胞体外保护地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡1
方法：采用2X105细胞/ml的脾细胞分别与5X103,1X104,2X104(单位：细胞/ml)的间充质干细胞按1:1/40,1:1/20,1:1/10的比例混合共培养。将浓度分别为0ng/ml、0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、500ng/ml、1000ng/ml的地塞米松加入共培养体系。
脾细胞和间充质干细胞共培养30小时，然后收集非贴壁的脾细胞，进行PI染色，最后通过流式细胞仪检测脾细胞的DNA含量。细胞DNA含量少于正常二倍体DNA含量的被认为是凋亡细胞。
结果：如图4A和4B所示，随着地塞米松浓度的增多，DNA含量少于正常二倍体的比例（即凋亡细胞比例）逐渐增大。与此同时，MSC在数量为脾细胞1/40的情况下，即显著减少了地塞米松诱导的脾细胞凋亡。当MSC数量增加到脾细胞数量1/20的情况下，MSC进一步减少了地塞米松诱导的细胞凋亡水平。当MSC数量进一步增加到1/10的情况下，MSC不再进一步减少地塞米松诱导的细胞凋亡水平。
结论：间充质干细胞在数量在一定范围内，能够有剂量依赖的保护地塞米松诱导的脾细胞凋亡。其中，当间充质干细胞在数量为脾细胞1/20情况下，保护地塞米松诱导的脾细胞凋亡的效果接近最大。
实施例6间充质干细胞体外保护地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡2
方法：同实施例5,将2X105细胞/ml纯化的T淋巴细胞和2X106细胞/ml的B淋巴细胞分别与1X104细胞/ml的MSC共培养，并加入浓度为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml)的地塞米松至共培养体系。30小时后对T淋巴细胞和B淋巴细胞的DNA含量进行检测，以测定T淋巴细胞和B淋巴细胞的凋亡情况。
结果：由图4C可见，对于T淋巴细胞，在地塞米松浓度为1ng/ml时，间充质干细胞有较明显的保护T淋巴细胞凋亡效果，而在地塞米松浓度为0.1ng/ml和10ng/ml时，间充质干细胞有一定的保护T淋巴细胞凋亡的效果。
由图4D可见，对于B淋巴细胞，在地塞米松浓度为0.1ng/ml和1ng/ml时，间充质干细胞有非常显著地保护凋亡效果，而当地塞米松浓度达到10ng/ml时，间充质干细胞几乎没有保护地塞米松诱导B淋巴细胞凋亡的效果。
结论：实验结果证明，体外间充质干细胞对于中等剂量地塞米松诱导的T淋巴细胞的凋亡有一定程度的保护作用，而对于较低剂量的地塞米松诱导的B淋巴细胞凋亡有显著地保护作用。
实施例7：白介素-4能有效地保护地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡
方法：用不同浓度的地塞米松（0、1、10、100ng/ml）处理脾细胞，同时在培养体系中加入不同的细胞因子——白介素-4，白介素6，白介素7或白介素15（浓度均为10ng/ml）。24小时后对脾细胞的DNA含量进行检测，以测定脾细胞的凋亡情况。
结果：如图5所示，图表中的数值代表亚二倍体的比例，也即代表凋亡水平。地塞米松剂量依赖地增加脾细胞亚二倍体含量，而加入白介素-4能最有效地抵抗地塞米松增加脾细胞亚二倍体含量，其他细胞因子白介素6，白介素7或白介素15都不能有效抵抗塞米松增加脾细胞亚二倍体含量。
结论：相比其他白介素而言，白介素-4能最有效地保护地塞米松诱导的淋巴细胞凋亡。
实施例8：间充质干细胞通过IL-4保护束缚应激引起的淋巴细胞数量减少
方法：给6-8周的BALB/c雄性小鼠从尾静脉预先注射间充质干细胞并腹腔注射白介素-4中和抗体，作为对照，对另外3组小鼠只注射间充质干细胞，或只注射PBS，或不处理。然后立即对小鼠进行两轮束缚应激处理。处理结束之后，对小鼠的总脾细胞进行计数。通过流式确定小鼠脾细胞的T淋巴细胞和B淋巴细胞的相对比例，进一步计算得出脾细胞中T淋巴细胞和B淋巴细胞的绝对数量。
结果：由图6A-C可见，间充质干细胞能有效保护束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少，而当白介素-4被抗体中和后，间充质干细胞并却不能保护束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少。
结论：实验结果显示注射白介素-4中和抗体能削弱间充质干细胞保护束缚应激引起的淋巴细胞数量的减少，因此，间充质干细胞的保护作用是依赖于白介素-4的。
实施例9白介素-4信号转导缺失模型中间充质干细胞对于淋巴细胞数量减少的影响
方法：实验组1为利用白介素-4信号传导缺陷的STAT6缺失小鼠，进行束缚应激实验，并给予间充质干细胞注射，分析小鼠脾脏细胞中单个核细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞的数量。实验组2方法同实验组1，动物模型为T-bet缺失小鼠。对照组为未进行应激处理的STAT6缺失小鼠或T-bet缺失小鼠
结果：图6D可见，束缚应激显著诱导STAT6缺失小鼠的淋巴细胞数量减少，但间充质干细胞不能有效保护束缚应激诱导的STAT6缺失小鼠的淋巴细胞数量减少，而间充质干细胞可以保护束缚应激诱导的T-bet缺失小鼠的淋巴细胞数量减少。
结论：实验结果显示间充质干细胞不能保护白介素-4信号传导缺陷的STAT6缺失小鼠抵抗束缚应激引起的淋巴细胞数量减少，进一步证明间充质干细胞的保护作用是依赖于白介素-4的。
实施例10：间充质干细胞治疗束缚应激诱导的淋巴细胞数量减少
方法：根据通用方法3-5、给6-8周的BALB/c雄性小鼠接受束缚应激两轮，在第一轮应激之后，从尾静脉注射1×106间充质干细胞或注射PBS作为对照，第二轮束缚应激之后，对小鼠的脾脏淋巴细胞进行计数。
结果：如图7所示，束缚应激能够显著地使小鼠的脾脏淋巴细胞数量减少。而间充质干细胞治疗组小鼠的脾脏淋巴细胞数量未明显减少。
结论：间充质干细胞可以有效地治疗束缚性应激引起的淋巴细胞减少。
讨论
多年以来，间充质干细胞被认为在免疫亢进为主要机制的免疫系统疾病中起到重要作用，而本发明人发现，在弱的免疫反应微环境中，间充质干细胞可以反而变得具有免疫促进作用。间充质干细胞维持免疫反应在一定水平的这种“缓冲”能力可以作为基础去研究间充质干细胞干预压力影响的免疫系统功能，从而达到解除压力对于疾病发生和发展的不利影响的目的。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或应激反应导致的免疫力下降的药物组合物。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的淋巴细胞包括T淋巴细胞或B淋巴细胞。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的免疫力下降包括淋巴细胞减少、白介素-4(IL-4)的表达量和/或活性下降。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的间充质干细胞包括脐带间充质干细胞、脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、羊水间充质干细胞。
5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物含有间充质干细胞和药学上可接受的载体。
6.如权利要求1或5所述的用途，其特征在于，所述的药物组合物还含有额外的活性成分IL-4。
7.一种间充质干细胞的用途，其特征在于，用于制备促进白介素-4表达量和/或活性增加或增强的药物组合物。
8.一种筛选用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)在测试组中，向经应激反应处理的细胞培养体系中添加测试化合物，并观察淋巴细胞的减少情况；在对照组中，在相同细胞培养体系中不添加测试化合物，并观察淋巴细胞的减少情况；
其中，若测试组中的淋巴细胞减少显著少于对照组，则选出测试化合物作为用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括步骤：
(b)测定测试组和对照组细胞体系中IL-4的表达量和/或活性
其中，若测试组中的IL-4表达量和/或活性显著高于对照组，则选择该测试化合物作为用于预防或治疗应激反应导致的淋巴细胞减少和/或免疫力下降的候选化合物。
CN201310170161.0A 2013-05-08 2013-05-08 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用 Active CN104138391B (zh)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310170161.0A CN104138391B (zh) 2013-05-08 2013-05-08 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用
US14/889,981 US10071119B2 (en) 2013-05-08 2014-04-29 Application of mesenchymal stem cells in prophylaxis or treatment of stress response-induced weakened immunity
EP14795387.1A EP2997971B1 (en) 2013-05-08 2014-04-29 Application of mesenchymal stem cells in prophylaxis or treatment of stress response-induced weakened immunity
PCT/CN2014/076511 WO2014180269A2 (zh) 2013-05-08 2014-04-29 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201310170161.0A CN104138391B (zh) 2013-05-08 2013-05-08 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104138391A true CN104138391A (zh) 2014-11-12
CN104138391B CN104138391B (zh) 2018-07-31

Family

ID=51847844

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201310170161.0A Active CN104138391B (zh) 2013-05-08 2013-05-08 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用

Country Status (4)

Country Link
US (1) US10071119B2 (zh)
EP (1) EP2997971B1 (zh)
CN (1) CN104138391B (zh)
WO (1) WO2014180269A2 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148276A (zh) * 2015-04-16 2016-11-23 中国科学院上海生命科学研究院 间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用
WO2017136539A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Hare Joshua M Mesenchymal stem cells as vaccine adjuvants and methods for using the same
CN111759864A (zh) * 2020-07-14 2020-10-13 中国人民解放军总医院 羊水干细胞在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114015648B (zh) * 2021-10-20 2024-02-20 成都拜美森生物科技有限公司 一种高性能的脂肪间充质干细胞溶液及其制备方法和用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101384702A (zh) * 2004-03-22 2009-03-11 奥西里斯治疗公司 间充质干细胞及其用途

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8685728B2 (en) * 2008-01-31 2014-04-01 Rutgers The State University Of New Jersey Kit containing stem cells and cytokines for use in attenuating immune responses
AU2012258424B2 (en) * 2008-11-14 2016-01-21 Medipost Co., Ltd. Composition comprising mesenchymal stem cells or culture solution of mesenchymal stem cells for the prevention or treatment of neural diseases
CN102719397B (zh) * 2012-07-16 2013-05-29 天津和泽干细胞科技有限公司 间充质干细胞及其在抗hiv-1中的应用

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101384702A (zh) * 2004-03-22 2009-03-11 奥西里斯治疗公司 间充质干细胞及其用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KANGXING ZHOU,ET AL: "Transplantation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cell", 《CELLULAR & MOLECULAR IMMUNOLOGY》 *
MEHDI NAJAR,ET AL: "Mesenchymal stromal cells promote or suppress the proliferation of T lymphocytes from cord blood and peripheral blood: the importance of low cell ratio and role of interleukin-6", 《CYTOTHERAPY》 *
范斌: "脐带间充质干细胞移植治疗肝硬化及免疫调控的初步研究", 《中国优秀硕士学位论文数据库》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106148276A (zh) * 2015-04-16 2016-11-23 中国科学院上海生命科学研究院 间充质干细胞在制备治疗神经退行性疾病的药物中的应用
WO2017136539A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Hare Joshua M Mesenchymal stem cells as vaccine adjuvants and methods for using the same
EP4316497A3 (en) * 2016-02-04 2024-05-01 Longeveron Inc. Mesenchymal stem cells as vaccine adjuvants and methods for using the same
US11975068B2 (en) 2016-02-04 2024-05-07 Longeveron, Inc. Mesenchymal stem cells as vaccine adjuvants and methods for using the same
CN111759864A (zh) * 2020-07-14 2020-10-13 中国人民解放军总医院 羊水干细胞在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用
CN111759864B (zh) * 2020-07-14 2022-09-13 中国人民解放军总医院 羊水干细胞在制备治疗狼疮肾炎的药物中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2997971A2 (en) 2016-03-23
EP2997971A4 (en) 2017-06-07
EP2997971B1 (en) 2020-10-14
CN104138391B (zh) 2018-07-31
WO2014180269A2 (zh) 2014-11-13
US10071119B2 (en) 2018-09-11
US20160120908A1 (en) 2016-05-05
WO2014180269A3 (zh) 2015-02-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230357416A1 (en) Methods for treating skin infection by administering an il-4r antagonist
Liang et al. Mesenchymal stem cell transplantation for diffuse alveolar hemorrhage in SLE
EP2931877B1 (en) Methods modulating immunoregulatory effect of stem cells
WO2016184427A1 (zh) 低氧处理的间充质干细胞及其应用
CN104138391A (zh) 间充质干细胞在预防或治疗应激反应导致的免疫力下降中的应用
JP6573293B2 (ja) 炎症性疾患の予防または治療用ペプチド及びこの用途
KR20100022022A (ko) 자가면역 질환 및 암을 치료하기 위한 의약 및 방법
CN104302314A (zh) 减毒博代氏杆菌菌株对抗变应性疾病的效果
CN105079792A (zh) Il-17在提高间充质干细胞免疫抑制功能中的应用
US20220333197A1 (en) Treatment of Atopic Dermatitis Using Mesenchymal Stem Cells and Immune Modulation
Farkhad et al. Are mesenchymal stem cells able to manage cytokine storm in COVID-19 patients? A review of recent studies
CN113559107B (zh) 孕激素在制备抑制细胞因子风暴的药物中的应用
Mangin et al. Intravenous administration of human adipose derived-mesenchymal stem cells is not efficient in diabetic or hypertensive mice subjected to focal cerebral ischemia
Yalvac et al. VIP-expressing dendritic cells protect against spontaneous autoimmune peripheral polyneuropathy
Heidari et al. Menstrual blood-derived mesenchymal stem cell therapy for severe COVID-19 patients
To et al. Mesenchymal stem cell transplantation in rheumatoid arthritis
KR101721054B1 (ko) 지방조직유래 줄기세포 배양액을 함유하는 염증질환 예방 또는 치료용 조성물
P Gileva et al. TNF binding protein of variola virus acts as a TNF antagonist at epicutaneous application
CN101683354B (zh) 一种肝损伤相关的药物靶点及其应用
Vieira et al. SAT0115 Tofacitinib Versus Biologic Treatments in Patients with Active Rheumatoid Arthritis Who have had an Inadequate Response to Tumour Necrosis Factor Inhibitors-A Network Meta-Analysis
Ohno et al. Assessing the pyrogenicity of whole influenza virus particle vaccine in cynomolgus macaques
Jahangirifard et al. The effect of bromelain (anaheal) on clinical and para-clinical parameters in hospitalized COVID-19 patients
김현욱 Anti-inflammatory effects of canine adipose-derived mesenchymal stem cells in a rat model of severe acute pancreatitis
JP6741194B2 (ja) 強皮症予防および／または治療剤
Martínez-Morán et al. Embolia cutis medicamentosa (Nicolau syndrome) after glatiramer acetate injection

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
CP01 Change in the name or title of a patent holder

Address after: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No.

Patentee after: Shanghai Institute of nutrition and health, Chinese Academy of Sciences

Address before: 200031 Yueyang Road, Shanghai, No. 319, No.

Patentee before: SHANGHAI INSTITUTES FOR BIOLOGICAL SCIENCES, CHINESE ACADEMY OF SCIENCES

CP01 Change in the name or title of a patent holder