JP2003531124A - 胃腸臓器に幹細胞および/またはその子孫を移植することによる障害の治療 - Google Patents

胃腸臓器に幹細胞および/またはその子孫を移植することによる障害の治療

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Abstract

(57)【要約】 被験体の胃腸臓器に、幹細胞および/またはその子孫を移植することを含む、障害、典型的には胃腸障害を治療する方法。また、被験体の膵臓に、幹細胞および/またはその子孫を移植することを含む、増大したレベルのインシュリンを産生する方法。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】 本出願は、2000年4月13日に提出された米国仮特許出願第60/196
,806号、および2000年9月12日に提出された米国仮特許出願第60/
232,301号の有益性を主張し、それらはその全体を参照により本明細書に
援用される。
【0002】 [背景] 中枢神経系(CNS)または腸神経系(ENS)中の特定型のニューロンの変
性は、結果として幾つかの主要な障害をもたらす。パーキンソン病(PD)では
、ドーパミン作用性ニューロンが、脳の黒質にて損失され、骨格筋運動の協調の
障害を引き起こす。便秘を伴うPD患者の結腸では、ドーパミン作用性ニューロ
ンの損失が見られることが実証されている。アカラシア(achalasia)、ヒルシュ
スプルング病(Hirschsprung's disease)、および先天性幽門狭窄症では、酸化窒
素産生ニューロン(酸化窒素作用性(nitrinergic))の損失が十分に実証されて
いる。この酸化窒素作用性の損失は、胃腸(GI)平滑筋が弛緩することができ
ないことにつながり、結果として重篤な運動性障害をもたらす。
【0003】 面白い新たな治療上のストラテジー(strategy)は、冒された領域に、ニューロ
ンを移植する(implantation)ことにより、これらの損失を元に戻すことである。
例えば、PD患者の脳に胚ニューロンを移植することにより、運動性機能の改善
をもたらす結果となる。しかしながら、線条体ニューロンと、これらの移植され
た細胞との構造上および機能上の接触は、移植されたニューロンを同定すること
が困難であるため、また結合性に関する機能的アッセイが利用可能でないために
、明確に実証することはできなかった。胚組織の使用は、厳しく制限されている
。ヒト胚組織の供給は、制限されており、移植されたニューロンの宿主/移植片
拒絶に関する可能性が存在する。
【0004】 PD、アルツハイマー病、多発性硬化症、およびハンティングトン病のような
、CNSの神経変性障害は、臨床的実践にて一般的な問題である。アカラシア、
ヒルシュスプリング病、および先天性幽門閉塞症のような既知の腸神経変性障害
のほかに、幾つかの他の一般的な他の胃腸障害(例えば、逆流疾患、過敏性腸症
候群、および腸偽閉塞症)は、障害を起こした腸ニューロンに関連するとしてま
すます明確に理解されてきている。
【0005】 腸神経系(ENS)は、末梢神経系の一部であり、神経細胞体、それらの線維
、およびGI管の壁の内部に位置する支持細胞から構成される。これらの細胞体
は、2つの主要な神経節を有する叢:輪走筋層および縦走筋層間の末梢腸管筋神
経叢(アウエルバッハ神経叢(Auerbach's plexus))、ならびに粘膜筋板および
輪走筋間の粘膜下結合組織中の粘膜下神経叢(マイスナー神経叢(Meissner's pl
exus))に並べられる。たいてい、腸間筋ニューロンは、興奮性(アセチルコリ
ンおよびSP)および抑制性(酸化窒素、VIP、CGRP、およびATP)神
経伝達物質を、腸平滑筋に提供する。腸筋の緊張は、これらの神経伝達物質の対
抗作用の影響の総和に依存する。
【0006】 神経変性胃腸障害のための現在の治療オプションは非常に限られている。した
がって、ニューロン、筋組織、または他の組織に関連した胃腸障害、ならびに胃
腸臓器に関連した他の障害のための新規治療プロトコルが必要である。
【0007】 [概要] 本発明は、被験体(好ましくは哺乳類、より好ましくはヒト)の胃腸臓器への
移植のための、幹細胞および/またはその子孫を用いた、障害の治療方法に関す
る。かかる治療が有用であろう障害の範囲としては、先天性または後天性であり
得る、胃腸管の変性状態、免疫学的/炎症状態、腫瘍性状態、および特発性状態
が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、障害として、例えばニュ
ーロンならびに筋組織を含む様々な胃腸障害のいずれかが挙げられるが、他の組
織も同様に含まれ得る。胃腸臓器の機能または機能不全に関連した他の障害もま
た、本発明の方法を用いて治療することができる。
【0008】 胃腸臓器には、中空臓器および実質性臓器が含まれる。中空胃腸臓器には、口
、食道、胃、および腸のような消化管を構成するものが含まれる。実質性臓器に
は、肝臓、胆嚢、および膵臓のような、胃腸消化管に排出するものが含まれる。
【0009】 本明細書で使用する場合、胃腸障害の治療には、治療上および予防上(すなわ
ち防止)の処置の両方が含まれる。かかる治療の成功は、臨床的結果および/ま
たは形態学的分析により決定する、臓器もしくは患者の機能状態の評価により決
定することができる。
【0010】 具体的には、本発明は、様々な細胞構成成分(例えば、ニューロン、筋肉、ま
たは他の細胞型)を再形成する目的で、および/または治療目的のための生物学
的材料(例えば、神経伝達物質、サイトカイン、抗サイトカイン、成長因子、免
疫調節剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、鎮痛薬等)源を提供する目的で、胃腸臓器(例
えば、胃腸消化管、または消化管に排出する実質性臓器)に、幹細胞(好ましく
は、多能性または全能性の幹細胞)を移植する方法(implantation)(例えば、移
植(transplantation))を提供する。これらの幹細胞の供給源は、胚または成人
の神経および非神経組織(例えば、骨髄または脂肪組織)であり得る。
【0011】 例えば胃腸管の壁への、または膵臓もしくは肝臓のような実質性胃腸臓器への
局所注入を経て、全身(例えば、血流または腹膜腔を介して)または門脈循環系
へ投与することにより、あるいは任意の他の実践的手段により、移植を実施する
ことができる。
【0012】 本発明はまた、患者において増大したレベルのインシュリンを産生する方法を
提供する。これは、膵臓に、幹細胞および/またはその子孫を移植することに関
し、膵臓は、胃腸消化管に排出する実質性臓器であるため、本明細書で使用する
場合、胃腸臓器とみなされる。
【0013】 [好ましい実施形態の詳細な説明] 本発明は、胃腸臓器への移植のための、幹細胞および/またはその子孫を用い
た胃腸障害の治療方法に関する。具体的には、本発明は、様々な細胞構成成分(
例えば、ニューロン、筋肉、または他の細胞型)を再形成する目的で、および/
または治療目的のための生物学的材料源を提供する目的で、胃腸臓器(好ましく
は、胃腸消化管)に、幹細胞(例えば、多能性、全能性、多分化能性の幹細胞)
またはその子孫を移植する方法(implantation)(例えば、移植(transplantation
))を提供する。
【0014】 かかる治療法が使用されるであろう障害の範囲としては、先天性または後天性
であり得る、胃腸管の変性状態、免疫学的/炎症状態、腫瘍性状態、および特発
性状態が挙げられる。例としては、アカラシア、胃不全麻痺、腸偽閉塞症、およ
びヒルシュスプルング病が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、
胃腸障害は、例えばニューロンならびに筋肉組織、または胃腸管の他の細胞型に
関する様々な障害のいずれかであり得る。さらに、本発明はまた、伝統的に胃腸
障害とはみなされないが、その臓器が腸消化管に排出するという点で消化臓器と
みなされる臓器(例えば、肝臓、胆嚢、および膵臓)に関連した障害のための治
療法を提供するために使用される。かかる障害としては糖尿病が挙げられ、イン
シュリン産生の増大を生じさせるために、患者の膵臓への幹細胞を移植すること
によって、この糖尿病を治療することができる。
【0015】 幹細胞源は、胚または成人の神経および非神経組織であり得る。一般に、「神
経幹細胞(neural stem cell)」という用語は、(i)神経組織を生成することが
できるか、または神経系から得られる細胞、(ii)自己再生に関していくらか
能力を有する細胞、および(iii)非対称性細胞分裂により自分自身以外の細
胞を生じることができる細胞を記載するのに漠然と使用される。幹細胞の重要な
特徴は、自己再生を示すその能力、またはよりいっそう多くそれ自身を生成する
その能力である。幹細胞の最も簡潔な定義は、自己維持に関する能力を有する細
胞である。幹細胞のより厳格な(しかし、依然として単純化している)定義は、
Potten and Loeffler (Development, 110, 1001, (1990))により提供され、彼等
は、幹細胞を「a)増殖、b)自己維持、c)多数の分化した機能的子孫の産生
、d)損傷後の組織の再生、およびe)これらのオプションの使用における柔軟
性のあることが可能な未分化細胞」と定義している。幹細胞の役割は、自然の細
胞死、損傷または疾患により損失した細胞を回復させることである。特定型の組
織における幹細胞の存在は通常、高い代謝回転の細胞を有する組織と相関してい
る。しかしながら、幹細胞が高い代謝回転の細胞を有さない組織(例えば、肝臓
)にも存在すると考えられるので、この相関は必ずしも保持され得るとは限らな
い。
【0016】 細胞が無制限に分裂し、末期にはニューロンおよび神経膠へと分化する娘細胞
を産生する能力は、幹細胞の特性である。したがって、本明細書で使用する場合
、幹細胞は、自己維持が可能であり、それぞれの細胞分裂により、1つの娘細胞
もまた幹細胞となるであろうことを意味する。幹細胞の非幹細胞子孫を前駆細胞
と称する。単一多能性神経幹細胞から生成される前駆細胞は、ニューロン、星状
神経膠細胞(I型およびII型)、および寡突起神経細胞に分化することが可能
である。幾つかの前駆細胞は、1つよりも多い細胞型に分化することが可能な子
孫を産生することができる。例えば、O−2A細胞は、寡突起神経膠細胞および
II型星状神経膠細胞を生じる神経膠前駆細胞であり、したがって、「両能性(b
ipotential)」前駆細胞と称することができる。前駆細胞の際立った特徴は、幹
細胞とは異なり、それは増殖能力が限られており、したがって自己維持を示さな
いことである。
【0017】 神経組織および他の組織由来の幹細胞は、多くの場合、元となるそれらの組織
より規定される。あるいは、それらは、それらの潜在能力により定義することが
できる(Gage, Science, 287, 1433-1438 (2000))。細胞の潜在能力の理解は、正
常なヒト発育の状況で最良に記載される。Stem Cells: A Primer, National Ins
titutes of Health, May 2000(nih.gov/news/stemcell/primer.htmにてインタ
ーネット上で見出し得る)に記載されるように、精子が卵子と受精し、全生物体
を形成する可能性を有する単一細胞を創出すると、ヒトの発育が始まる。この受
精卵は全能性であり、その可能性が全体的であることを意味する。受精の最初の
数時間のうちに、この細胞は、同一の「全能性」細胞に分裂する。これは、これ
らの細胞のいずれか1つは、女性の子宮に位置する場合に、胚へと発育する可能
性を有することを意味する。実際に、2つの全能性細胞が分離して、2つの別個
の遺伝的に一致したヒトへと発育すると、一卵性双生児が発育する。受精の約4
日後、数周期の細胞分裂後に、これらの全能性細胞は分化し始め、胚盤胞と呼ば
れる細胞の中空球を形成する。胚盤胞は、細胞の外層を有し、中空球の内部には
、内部細胞塊と呼ばれる細胞のクラスターが存在する。
【0018】 細胞の外層は、子宮中での胚発育に必要な胎盤および他の支持組織を形成し続
けるであろう。内部細胞塊の細胞は、実質的にヒトの身体のほとんどの組織を形
成し続けるであろう。内部細胞塊の細胞は、ヒトの身体に見られるほとんどあら
ゆる型の細胞を形成することができるが、それらは、ヒトの子宮中での発育に必
要な胎盤および支持組織を生じることはできないので、生物を形成することはで
きない。これらの内部細胞塊の細胞は、「多分化能性(pluripotent)」である。
このことは、それらが育児の発育に必要な多くの型の細胞を生じさせることがで
きるが、すべての型の細胞を生じるさせことができるわけではないことを意味す
る。それらの可能性は、全体的ではないため、それらは全能性でなく、またそれ
らは胚ではない。したがって、内部細胞塊の細胞が女性の子宮に位置する場合、
それは、胚へと発育しないであろう(Stem Cells: A Primer, National Institut
es of Health, May 2000 は、nih.gov/news/stemcell/primer.htmにてインター
ネット上で見出し得る)。
【0019】 多分化能性幹細胞は、特定機能を有する細胞を生じるよう委ねられている幹細
胞へとさらなる分化を受ける。この例としては、赤血球、白血球および血小板を
生じる血液幹細胞、および様々な型の皮膚細胞を生じる皮膚幹細胞が挙げられる
。これらのより分化された幹細胞は、「多能性(multipotent)」と呼ばれる(Stem
Cells: A Primer, National Institutes of Health, May 2000 は、nih.gov/ne
ws/stemcell/primer.htmにてインターネット上で見出し得る)。
【0020】 たいていの幹細胞は、多能性幹細胞の範疇に入る。多能性幹細胞は、胚性組織
、出生後組織、年少者の組織、または成人組織から得ることができる。組織は、
各種の昆虫類、魚類、爬虫類、鳥類、両生類、哺乳類等から得ることができる。
好ましい供給源は哺乳類であり、好ましくはげっ歯類および霊長類であり、最も
好ましくはマウスおよびヒトである。異種ドナー動物の場合には、動物を安楽死
させて、所定の組織(例えば、神経組織)および特定領域を、無菌的手法を用い
て取り出してもよい。特に所定の領域としては、例えば、神経幹細胞を得ること
ができる任意の領域(例えば、神経系、骨髄等の任意の部分)が挙げられる。
【0021】 非神経幹細胞は、身体ならびに胚性幹細胞中のどこからでも得ることができる
。幹細胞は、神経幹細胞および非神経幹細胞を生成する能力を有するより原始的
な細胞(すなわち、他の組織の幹細胞)から得ることができる。
【0022】 幹細胞は、組織の結合性細胞外マトリックスからの個々の細胞の解離によりド
ナー組織から得ることができる。特定領域由来の組織が、無菌的手法を用いて取
り出され、トリプシン、コラゲナーゼ等のような酵素による処理を含む当該技術
分野で既知の任意の方法を用いて、あるいは先がとがっていない道具を用いるよ
うな物理的解離方法を用いて、細胞を解離する。
【0023】 幹細胞を、懸濁液中、または固定培養基上で培養することができる。しかしな
がら、培養基は、幹細胞の子孫の分化を誘発する傾向にある。したがって、多数
の未分化幹細胞の子孫を所望する場合には、懸濁液培養が好ましい。細胞成長を
支持することが可能な適切な培地としては、HEM、DMEM、RPMI、F−
12等が挙げられ、それらは、グルタミンおよび他のアミノ酸、ビタミン、ミネ
ラルならびにトランスフェリンのような有用なタンパク質等のような細胞代謝に
要されるサプリメントを含有することができる。培地はまた、酵母、細菌および
真菌による汚染を防止するための抗生物質(例えば、ペニシリン、ストレプトマ
イシン、ゲンタマイシン等)を含有してもよい。培養条件は、生理的条件に近い
状態にすべきである(好ましくは、pH約6〜約8、および温度約30℃〜約4
0℃)。培地は、EGF、アンフィレギュリン(amphiregulin)、酸性線維芽細胞
成長因子(aFGFまたはFGF−1)、塩基性線維芽細胞成長因子(bFGF
またはFGF−2)、トランスフォーミング成長因子α(TGF−α)、および
それらの組合せのような、少なくとも1つの増殖誘発性成長因子で補充すること
ができる。増殖誘発性成長因子に加えて、NGF、血小板由来成長因子(PDG
F)、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン(TRH)等を含む、細胞の増殖および
分化に影響を及ぼす他の成長因子を培地に添加してもよい。
【0024】 さらに、幹細胞はまた、いったんインビトロ(in vitro)で増殖させると、既知
の技法を用いて、インビトロで遺伝的に改変することができる。インビトロでの
遺伝的改変は、遺伝物質による感染のより高度の制御が必要である場合、インビ
ボ(in vivo)での遺伝的改変技術よりも、インビトロ遺伝的改変が、ある状況に
おいては望ましい場合がある。幹細胞の子孫は、当該技術で既知の任意の方法に
より、必要とされるまで低温保存することができる。細胞は、特定の低温保存剤
を含有する等張溶液、好ましくは細胞培地中に懸濁させることができる。かかる
低温保存剤としては、ジメチルスルホキシド(DMSO)、グリセロール等が挙
げられる。
【0025】 細胞の様々な遺伝的改変は、本発明の範囲内である。例えば、成長因子および
神経伝達物質のような他の型の神経学的作用物質を発現するように、細胞を遺伝
的に改変することができる。遺伝的改変が、生物学的に活性な物質の産生のため
のものである場合、その物質は一般的に、所定の胃腸障害の治療に有用なもので
あろう。例えば、細胞が酸化窒素を産生するように(アカラシアのために)、細
胞を遺伝的に改変することが望ましい場合がある。細胞はまた、成長因子受容体
、神経伝達物質またはそれらの受容体、神経伝達物質合成遺伝子、神経ペプチド
等を発現するように、インビボで改変することができる。
【0026】 幹細胞および/またはその子孫は、様々な方法で宿主に投与することができる
。例えば胃腸管の壁への局所注入を経て、全身または門脈循環系へ投与すること
により、あるいは任意の他の実践的手段により、移植(implantation)(例えば、
移植(transplantation))を実施することができる。胃腸障害のような障害の治
療における幹細胞の使用は、動物モデルを使用することにより実証することがで
きる。
【0027】 本発明は、宿主に対して異種のドナー組織から調製される幹細胞および/また
は幹細胞子孫の使用を可能にする。しかしながら一般に、異種移植がうまくいく
ために、移植される組織に対する免疫応答を低減するか、または排除する幾つか
の方法を用いることが好ましい。したがって、被移植者は、多くの場合、シクロ
スポリンのような免疫抑制薬の使用により、あるいは局所塗布される免疫抑制薬
を用いた局所免疫抑制ストラテジーにより、免疫抑制されるであろう。
【0028】 免疫抑制技法の代替法として、胚性幹細胞における相同組換えを用いた遺伝子
置換またはノックアウト(Smithiesら, Nature, 317, 230-234 (1985)により教
示される)方法、および細胞系における遺伝子置換またはノックアウト(H. Zhen
gら, PNAS, 88, 8067-8071 (1991))にまで及ぶ方法は、主要組織適合性複合体(
MHC)遺伝子の切断のために、幹細胞に適用され得る。MHC発現を欠如した
幹細胞は、被移植者を免疫抑制する必要なく、同種異系の組織適合性の障壁、お
よびおそらく異種の組織適合性の障壁でさえ乗り越えて、濃縮された神経細胞集
団の移植を可能にするであろう。
【0029】 任意の冒された領域全体にわたって、特に部位特異的な様式(すなわち、局所
的に)あるいは全身的に、細胞を送達することができる。細胞は、周囲領域の完
全性を維持する任意の方法を用いて、好ましくは局所注入により、特定領域に投
与され得る。細胞はまた、全身または門脈循環系に投与され得る。
【0030】 幹細胞またはその子孫に加えて、本発明の方法に有用な薬学的組成物は、幹細
胞の成長および分化を促進する成長因子、免疫抑制薬、抗炎症剤等を含むことが
できる。さらに、所望の場合には、幹細胞またはその子孫は、当業者に既知であ
るように、カプセル化することができる。
【0031】 生存宿主における移植片の生存は、臨床的、放射線医学的、組織学的、生理学
的等の方法を含む様々な方法を用いて検査することができる。コンピュータ断層
撮影法(CATスキャンすなわちCTスキャン)、核磁気共鳴または磁気共鳴画
像法(NMRまたはMRI)、または陽電子放射型断層撮影法(PET)スキャ
ンを含む非侵襲性スキャンを使用することができる。組織を取り出して、冒され
た領域を巨視的に検査することにより、あるいはより好ましくは顕微鏡を用いて
、移植片生存の検死解剖がなされ得る。光または電子顕微鏡条件下にて目に見え
る任意の着色剤により、より具体的にはニューロンおよび神経膠に特異的な着色
剤により細胞を染色することができる。特に有用なのは、マウスのニューロンを
同定するM6抗体のような、神経細胞表面マーカーを同定するモノクローナル抗
体である。最も好ましいのは、任意の神経伝達物質、特にGABA、TH、Ch
ATおよびサブスタンスPに関連するもの、ならびに神経伝達物質、特にGAD
の合成に関与する酵素に関連するものを同定する抗体である。移植細胞はまた、
ローダミン標識もしくはフルオレセイン標識したマイクロスフェアのようなトレ
ーサ色素、ファストブルー、ビスベンズアミドまたはlacZ遺伝子(β−ガラ
クトシダーゼを産生する)のようなレトロウイルスにより導入される組織化学的
マーカーの先立っての組込みにより同定することができる。
【0032】 [実施例] 以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態を説明するために提供され
る。しかしながら、数多い他の変更は、本発明の範囲内である。
【0033】 ラット前脳神経幹細胞の生成およびインビトロ培養 胚17日目に段階的な妊娠状態の雌ホルツマンラット(Holtzman rat)から、神
経幹細胞を得た。胚ラットの脳を取り出し、脳室下域組織(SVZ)を各脳半球
から切り出した。次に、ディスパーゼ/DNアーゼ処理および穏やかな粉砕を用
いて、単一細胞懸濁液をこの組織から作製した。破片を混合し、ペレットにし、
Neurobasal培地に再懸濁した。2〜4時間後、細胞を遠心沈殿させて
、培地をミリリットル当たり20ナノグラム(ng/ml)のbFGFおよび2
0ng/mlのEGFを加えたNB27(B27および抗生物質を含有するNe
urobasal培地)と取り替えた。培地の50%を毎日取り替えた。
【0034】 免疫共沈降およびウェスタンブロッティング トリス緩衝生理食塩水(TBS)(50mM トリス塩酸[pH 7.5]、
150mM NaCl)中に5%(ドデシル硫酸ナトリウム)SDS、1ミリモ
ル濃度(mM)のベンズアミジン、0.5mMのフェニルメチル−スルホニルフ
ルオリド、1mMのエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含有する溶液中に細
胞を溶解することにより、神経幹細胞から総タンパク質抽出物が得られた。13
,000×gで10分間(min)の遠心分離により、不溶性材料を除去した。
免疫共沈降のために、全細胞可溶化液からのタンパク質500マイクログラム(
μg)を、抗Ret抗体(sc-167-G, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, C
A)2マイクロリットル(μl)、およびプロテインA−アガロース(Boehringer
Mannheim, Indianapolis, IN)20μlのいずれかとともに、4℃にて一晩イン
キュベートした。沈殿凝集物をLaemmliの試料緩衝溶液に再懸濁して、7
.5%SDS−PAGEゲル上で実行し、PVDF膜(Amersham, Amersham Plac
e, UK)に転写した。TBS中の5%脱脂粉乳、0.05%ツイーン20中の1/
1000での希釈での抗RETチロシンキナーゼ受容体(Ret)抗体のいずれ
かとともに、室温にて2時間、それらをインキュベートした。ホースラディッシ
ュペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体とともにインキュベーションした後
、酵素により触媒される発光(ECL)キット(Amersham)により、免疫反応性を
検出した。陰性対照のために、免疫沈降における一次抗体を省略する以外は、上
述するのと同じ方法にて、試料を処理した。
【0035】 免疫細胞化学 免疫細胞化学に関して、ポリオルニチン被覆チャンバスライド(Nunc, Napervi
lle, IL)上へ、またはヒト腸平滑筋の単層(ATCCから購入)上に神経幹細胞を播
種した。−20℃にて10分間、100%メタノールにより細胞を固定した。以
下の抗体:抗−βIII−チュブリン(0.5μg/ml、Promega Corp., Mad
ison, WI)および抗nNOS(1:200希釈、Santa Crux Biotechnology, Sna
ta Cruz, CA)を使用した。一次抗体とのインキュベーション前に、5%正常ヤギ
血清を用いて、室温にて1時間、細胞をブロックした。リン酸緩衝溶液(PBS
)中で細胞を洗浄し、1.5%ヤギ血清を含有するPBS中で希釈した一次抗体
とともに、4℃にて一晩インキュベートした。次に、適切なAlexa結合二次
抗体(Alexa−488、Alexa−594、1:500希釈、Molecular P
robes, Eugenem OR)とともに、室温にて1時間、細胞をインキュベートした。一
次抗体を省略して、適した対照を作製した。
【0036】 酸化窒素検出 神経幹細胞を、ポリオルニチン被覆カバーガラス上へ蒔いた。NO感受性蛍光
指示体であるDAF−2DA(10μM、Alexis Biochemicals, San Diego, CA
)を含有する標準的なKrebs溶液中で、細胞を37℃にて1時間インキュベ
ートした。負荷後、細胞をKrebs液中で洗浄し、L−アルギニンまたはL−
NAMEを含有するKrebs液に入れた。倒立Nikon Diaphot顕
微鏡に結合したアルゴンイオンレーザー(488nm)を利用した共焦点レーザ
走査型顕微鏡システムを用いて細胞を観察した。
【0037】 移植用細胞の標識方法および調製 インビボでの細胞検出を可能にするために、製造業者の説明書に従って、CM
−DiI(Molecular Probes, Eugene, OR)により、神経幹細胞を標識した。PB
S中で洗浄した後、400,000細胞/μlの濃度で細胞をPBS中に再懸濁
し、氷上に保持した。移植のために、体重が約20gmの雄C57BL/6J野
生型マウス(Jackson Laboratories)を使用した。強烈な麻酔下で手術を行った。
マウスには、10μlのハミルトン注射器に取り付けた22G針を用いて幽門へ
両側に細胞懸濁液2μlを与えた。
【0038】 組織加工 移植の2、4および8週間後に、マウスに麻酔をして、経心臓的に(transcard
ially)灌流して、0.1M PBS中の氷冷4%パラホルムアルデヒド(PFA
)で固定した。幽門を取り出して、室温にて1時間、PFA中で後固定し、PB
S中の30%ショ糖中で、4℃にて一晩凍結保護した。次に組織を最適切開化合
物(OCT)中に包埋し、15〜30μmの凍結切片をクリオスタット上で切り
出し、さらなる加工のために収集した。二重免疫蛍光のために、切片を50%グ
リセロール/50%PBSで透過化処理して、抗体の透過を可能にした。倒立N
ikon Diaphot顕微鏡に結合したOZモデル共焦点顕微鏡(Noran Int
ruments)を用いて、共焦点顕微鏡法により、これらのマーカーとの蛍光親油性色
素DiIの共存を導いた。
【0039】 結果および議論 ラット前脳から単離した神経幹細胞(NSC)は、インビトロにて腸平滑筋と
の構造上の接触を形成することができることが実験により実証された(図1)。
【0040】 培養したNSCはまた、神経酸化窒素(nNOS)を発現し、インビトロで酸
化窒素(NO)を産生し(図2)、NSCの使用は、かかる酵素が機能的に欠如
している実験条件において、nNOSを再導入するための妥当なツールであるこ
とを示す。
【0041】 データは、NSCを野生型マウスの胃腸壁に首尾よく移植することができ(図
3)、それらは移植の2週間後に酸化窒素作用性ニューロン(nNOSを発現す
る)に分化する(図4)ことを示している。NSCは、依然として生育可能であ
り、移植の8週間後に、nNOSは免疫反応性である(データは示さない)。
【0042】 ENSは、他の末梢神経系と同様に、完全に神経堤から得られる。堤由来の前
駆体は多分化能性であり、腸の任意の領域を首尾よく神経支配するが、それは、
これらの細胞の局部的分化および分化を決定する際に重要なようである腸壁内の
微小環境である。これらの細胞により発現されるRETチロシンキナーゼ受容体
と、腸由来神経栄養成長因子であるGDNF(神経膠細胞系由来成長因子)およ
びneurturin(NTN)(図5)との相互作用がこのプロセスでは重要
である。この相互作用はまた、RETに密接に関連した細胞外GPI結合受容体
の一群:GDNFファミリー受容体(GFR)α1およびα2を含む(図6)。
GDNFは、約E12までのこれらの前駆物質のための分裂促進剤として作用し
、結果として腸全体に移植するのに十分な数の増殖をもたらす(図7)。後に、
それは分化因子として作用し、神経膠を犠牲にしてニューロンの発達を促進する
【0043】 NTNはまた、重要な腸ニューロトロフィン(neurotrophin)であり、インビト
ロでの神経膠前駆物質の増殖および生存を促進するが、NTNの突然変異により
示されるようにRET、あるいはその好ましい受容体であるGFRα2ほど重要
でない。NTN/GFRα2系は、成熟腸神経系の維持にとって重要である一方
で、GDNF/GFRα1系は、その発達にとって重要であると仮定する。
【0044】 本発明者等の研究室での上記研究により、ラット前脳から単離した神経幹細胞
(NSC)は、腸ニューロトロフィンGDNFおよびNTNのための受容体系を
発現することが実証された。
【0045】 上述の詳細な説明および実施例は、単なる理解の明瞭性のためだけに提供して
きた。不必要な限定は、そこから解釈されるべきではない。本発明は、図示およ
び記載してきた綿密な詳述に限定されない。というのは、当業者に明らかな変更
に関しては、特許請求の範囲により規定される本発明の範囲内に含まれるであろ
うからである。本明細書中の列挙したすべての特許、特許文書、および刊行物の
完全な開示は、それぞれが別個に参照により援用されたかのように、参照により
援用される。
【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、ヒト腸平滑筋細胞との共培養における神経幹細胞(神経マーカーであ
るβ−チュブリンに関して染色)である(写真)。
【図2】 図2(A)は、ラット神経幹細胞の総タンパク質抽出物のウェスタンブロット
分析であり、図2(B)は、ラット神経幹細胞におけるnNOS免疫反応性を示
したものである(写真)。
【図3】 図3(A)は、L−アルギニン(1mM)またはL−NAME(100μM)
の存在下での、培養神経幹細胞におけるイオノマイシン(1.4μM)による刺
激後のNO産生の疑似カラーイメージ(pseudocolor image)である(写真)。N
SCにNO感受性蛍光指示体DAF−2を負荷し、倒立Nikon Diaph
ot顕微鏡に結合したアルゴンイオンレーザー(488nm)を利用した共焦点
レーザー走査型顕微鏡システムを用いて細胞を観察した。図3(B)は、L−ア
ルギニン(1mM)またはL−NAME(100μM)の存在下にて測定した1
1個の培養神経幹細胞におけるNO産生を反映する相対蛍光強度変化を示すもの
である。誤差バーは、標準偏差を示す。*はp<0.05であり、**は、p<0
.01である(対のスチュ−デントのt検定(paired Student's t-test))。
【図4】 図4(A)は、野生型C57BL/6Jマウスの幽門での移植8週間後のDi
I標識NSCである(写真)。図4(B)は、β−チュブリンおよびnNOSの
共存を示す移植DiI標識NSCの二重免疫蛍光染色(矢印)である(写真)。
LM=縦走筋。CM=輪走筋である。
【図5】 図5(A)は、ラット神経幹細胞の総タンパク質抽出物のウェスタンブロット
分析である(写真)。図5(B)は、ラット神経幹細胞におけるRet免疫反応
性を示す(写真)。細胞核をDAPI(4,6−ジアミノ−2−フェニルインド
ール二塩酸塩)を用いて青色で対比染色する(明るい領域により表される)。縮
尺バーは、10μmである。
【図6】 図6は、(A)ラット神経幹細胞の総タンパク質抽出物(NSC)+陽性対照
のウェスタンブロット分析である(写真)。図6(B)は、ラット神経幹細胞に
おけるGFRα1免疫反応性を示す(写真)。図6(C)は、ラット神経幹細胞
におけるGFRα2免疫反応性を示す(写真)。細胞核は、DAPIを用いて青
色で対比染色する(明るい領域により表される)。スケールバー(scale bar)は
、10μmである。
【図7】 図7(A)および(B)は、対照としてのNeurobasal培地(A)、
または100ng/mlのGDNF(B)のいずれかに10日間曝露されたラッ
ト神経幹細胞におけるRet免疫反応性を示す(写真)。細胞核は、DAPIを
用いて青色で対比染色する(明るい領域により表される)。Bにおける偏球形成
に留意されたい。スケールバーは、50μmである。図7(C)は、同一濃度で
のGDNFの影響下でのRET+細胞集団の有意な増殖を示すグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY, DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I T,LU,MC,NL,PT,SE,TR),OA(BF ,BJ,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW, ML,MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,G M,KE,LS,MW,MZ,SD,SL,SZ,TZ ,UG,ZW),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ, MD,RU,TJ,TM),AE,AG,AL,AM, AT,AU,AZ,BA,BB,BG,BR,BY,B Z,CA,CH,CN,CO,CR,CU,CZ,DE ,DK,DM,DZ,EE,ES,FI,GB,GD, GE,GH,GM,HR,HU,ID,IL,IN,I S,JP,KE,KG,KP,KR,KZ,LC,LK ,LR,LS,LT,LU,LV,MA,MD,MG, MK,MN,MW,MX,MZ,NO,NZ,PL,P T,RO,RU,SD,SE,SG,SI,SK,SL ,TJ,TM,TR,TT,TZ,UA,UG,US, UZ,VN,YU,ZA,ZW Fターム(参考) 4C087 BB45 BB47 CA04 MA66 MA67 NA14 ZA66

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 障害を治療する方法であって、障害に冒された被験体の胃腸
    臓器に、幹細胞、その子孫、またはそれらの組合せを移植することを含む方法。
  2. 【請求項2】 前記移植された細胞は、ニューロン、筋肉、または他の組織
    を再形成する、請求項1に記載の方法。
  3. 【請求項3】 前記細胞は、治療上の処置のための生物学的材料源を提供す
    る、請求項1に記載の方法。
  4. 【請求項4】 前記幹細胞は、多能性幹細胞、多分化能性幹細胞、全能性幹
    細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項1に記載の方法
  5. 【請求項5】 前記細胞は、神経幹細胞である、請求項1に記載の方法。
  6. 【請求項6】 前記細胞は、胚性神経組織、成人神経組織、またはそれらの
    組合せから得られる、請求項5に記載の方法。
  7. 【請求項7】 前記胃腸臓器は、実質性臓器を含む、請求項1に記載の方法
  8. 【請求項8】 前記実質性胃腸臓器は、肝臓、胆嚢、または膵臓である、請
    求項7に記載の方法。
  9. 【請求項9】 前記胃腸臓器は、中空臓器を含む、請求項1に記載の方法。
  10. 【請求項10】 前記中空胃腸臓器は、口、食道、胃、または腸である、請
    求項9に記載の方法。
  11. 【請求項11】 被験体の胃腸臓器に細胞を移植することは、前記細胞を局
    所投与することを含む、請求項1に記載の方法。
  12. 【請求項12】 局所的に細胞を投与することは、胃腸管の壁に前記細胞を
    注入することを含む、請求項11に記載の方法。
  13. 【請求項13】 胃腸管に細胞を移植することは、前記細胞を全身投与する
    ことを含む、請求項1に記載の方法。
  14. 【請求項14】 前記障害は、胃腸管の変性状態、免疫学的/炎症状態、腫
    瘍性状態、または特発性状態を含む、請求項1に記載の方法。
  15. 【請求項15】 障害に冒された被験体の胃腸臓器に、幹細胞、その子孫、
    またはそれらの組合せを移植することを含む、前記障害を治療する方法であって
    、前記胃腸臓器は、実質性臓器または中空臓器を含む、前記方法。
  16. 【請求項16】 胃腸管の変性状態、免疫学的/炎症状態、腫瘍性状態、ま
    たは特発性状態を含む障害に冒された被験体の胃腸臓器に、幹細胞、その子孫、
    それらの組合せを移植することを含む、前記障害を治療する方法であって、前記
    移植された細胞は、ニューロン、筋肉、または他の組織を再形成する、前記方法
  17. 【請求項17】 被験体中に増大したレベルのインシュリンを産生する方法
    であって、前記被験体の膵臓に、幹細胞および/またはその子孫を移植すること
    を含む、前記方法。
  18. 【請求項18】 前記幹細胞は、多能性細胞、多分化能性細胞、全能性細胞
    、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項17に記載の方法。
  19. 【請求項19】 前記細胞は、神経幹細胞である、請求項17に記載の方法
  20. 【請求項20】 前記細胞は、胚性神経組織、成人神経組織、またはそれら
    の組合せから得られる、請求項17に記載の方法。
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