JP2002502858A - ケラチノサイト増殖促進法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、アンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、および／またはＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片またはその類似体、ＡＩＩＡＴ_２２型受容体アゴニストの、単独で、または他の増殖因子およびサイトカインと組合せた存在下での成長による、上皮幹細胞およびケラチノサイトの増殖および分化の促進のための、方法、改良細胞培養培地およびキットを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （相互参照） 本出願は、１９９８年２月９日出願の、米国出願番号第６０／０７４，１０５
号の一部継続出願である。

【０００２】 （技術分野） 本発明は、上皮幹細胞およびケラチノサイトの増殖を加速させ、重層上皮損傷
に対するより迅速かつ効率的な細胞応答を促進させ、および損傷部位での瘢痕お
よび機能損失を減少させるための方法に関する。

【０００３】 （発明の背景） 表皮は、ケラチノサイトと呼ばれる、絶えず再生される重層上皮細胞からなる
（米国特許第５，６９３，３３２号、そのまま参考として本明細書に組込む）。
表皮の基底層（これは、基底板および皮膚結合組織と直接接触している）は、上
皮幹細胞を含み、これは、分裂してケラチノサイトを生じ、これは分化するにつ
れてケラチンを産生し、表皮の表面へと「押さ」れる。（同上）。ケラチノサイ
トが表皮の表面に近づくにつれ、細胞は死滅し、ケラチンは、実質的に水に不透
過性で細菌感染を防ぐように作用する、角質化した皮膚表面の原因となる。（同
上）。このプロセスは、高度に保存されており、生化学的および形態学的マーカ
ーのパネルを介して忠実に監視できる（Ｃｏｕｌｏｍｂｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ａ
ｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３６：２３１−２３８（１９
９７）；そのまま参考として本明細書に組込む）。

【０００４】 この表在性表皮層は、末期的に分化した、高度に平板化した扁平細胞（「スク
アムズ」ｓｑｕａｍｅｓ）の堆積からなる（Ｃｏｕｌｏｍｂｅ、１９９７）。身
体表面には一定の摩擦力が維持されているために、スクアムズは、絶えず、皮膚
表面から剥がれている。普通の条件下では、表皮は自己再生組織であり、その表
面での細胞損失速度は、その前駆体区画の細胞産生速度と平衡化している（上記
；Ｗａｔｔ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１：１１０７−
１１１５（１９８９）；Ｆｕｃｈｓ、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌ．１７
：１９７−２０８（１９９３）；全参考文献をそのまま本明細書に組込む）。

【０００５】 真皮は、表皮を支える十分に血管新生化した組織である。真皮は、繊維芽細胞
を含み、これは、皮膚の強度および柔軟性に寄与するコラーゲン、フィブロネク
チン、およびエラスチンなどの細胞外基質タンパク質を含む、様々な結合組織の
成分を産生する（米国特許第５，６９３，３３２号）。真皮に存在する血管は、
表皮の上皮細胞に栄養素を輸送し、細胞代謝の廃棄産物を運び去る。基底膜は、
一部、表皮の真皮への付着に役立つ。皮膚はまた、毛包および汗腺などの様々な
副次的器官も含む。

【０００６】 例えば、裂創、穿刺または火傷による皮膚の損傷により、皮膚にまたは皮膚を
通して広がり得る創傷がもたらされる。創傷が極めて小さく局在化している場合
、正常な治癒プロセスで創傷を閉鎖でき、正常な機能を組織に回復できる。（同
上）。しかし、損傷により、深い創傷または広い領域を冒す創傷がもたらされる
場合もある。かかる創傷の治癒には臨床的介入が必要である。例えば、身体のか
なりの部位を覆う火傷には、損傷組織の最小限の広範な洗浄および組織の汗腺を
防ぐための包帯の適用が必要であり、瘢痕形成を伴い得、おそらく損傷領域に不
体裁および機能損失を生じる。（同上）。加えて、患者からの傷害を受けていな
い皮膚または皮膚代用物を使用した皮膚移植術がしばしば必要である。

【０００７】 表皮への損傷は、創傷部位を迅速に閉じ、皮膚を回復させるように設計された
ホメオスタシス応答を引き起こす。（Ｃｏｕｌｏｍｂｅ、１９９７；Ｍａｒｔｉ
ｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７６：７５−８１、１９９７；そのまま参考として本明
細書に組込む）。損傷事象により上部真皮の毛細血管が破壊された場合にはいつ
でも血餅が迅速に形成され、一時的な物理的バリヤーおよび様々な型の炎症細胞
を該部位に引きつける走化性シグナル源を提供する（Ｃｏｕｌｏｍｂｅ、１９９
７）。この後、常在する皮膚細胞型が、近位無傷組織から創傷部位に移動し、創
傷辺縁でのその増殖が起こる。創傷閉鎖は、ケラチノサイトの創傷部位への移動
および創傷部位の下の組織の特殊繊維芽細胞の収縮の複合作用により達成され、
これは創傷の縁を共に近くに引っ張る。創傷床の非効率的再構築により瘢痕が残
り、重度の場合には、創傷部位における組織機能の損失につながり得る。かなり
の表面積の皮膚損傷を切り抜けて生き残る能力は、適切なバリヤー機能を付与す
る上皮裏打ちが創傷部位に創傷部位に回復される効率に直接依存している。（同
上）。

【０００８】 創傷部位を囲む健康組織からの常在細胞の補充、およびその移動、増殖および
分化の協調は、損傷に対する重層上皮の応答において鍵となる特徴を示す。（同
上）。これらの現象に関与するシグナルを定めるためにかなりの努力がなされた
。創傷皮膚部位に存在し、かつ活性であることが示された増殖因子およびサイト
カインの得られたリストは長い（同上）。しかし、修復応答の完了に関与する機
序は依然として不明である。上皮幹細胞（「ＥＳＣ」）およびケラチノサイトの
増殖を加速する方法は、重層上皮損傷に対するより迅速かつ効率的な細胞応答を
促進し、従って、損傷部位での瘢痕および機能損失を減少させるであろう。

【０００９】 （発明の要約） １つの実施形態において、本発明は、細胞を、アンギオテンシノーゲン、アン
ギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、アンギオテ
ンシンＩＩ（ＡＩＩ）類似体、ＡＩＩ断片またはその類似体またはＡＩＩ ＡＴ _２ ２型受容体アゴニストと、単独で、または他の増殖因子およびサイトカインと
組み合わせて、接触させることにより、ＥＳＣおよびケラチノサイトの増殖を促
進させるための方法を提供する。

【００１０】 本発明の別の実施形態において、改良細胞培養培地が、ＥＳＣおよびケラチノ
サイトの増殖のために提供され、ここでは改良点として、有効量のアンギオテン
シノーゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ類似体、Ａ
ＩＩ断片またはその類似体またはＡＩＩ ＡＴ_２２型受容体アゴニストを細胞培
養培地に添加することを含む。

【００１１】 さらなる実施形態において、本発明は、ＥＳＣおよびケラチノサイトの増殖の
ためのキットを提供するものであって、該キットは、有効量のアンギオテンシノ
ーゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ
断片またはその類似体またはＡＩＩ ＡＴ_２２型受容体アゴニスト、および細胞
培養培地補充として有効量の活性剤を使用するための説明書を含む。好ましい実
施形態において、該キットは、さらに、細胞培養培地を含む。別の好ましい実施
形態において、該キットは、さらに、細胞培養のための無菌容器を含む。

【００１２】 （好ましい実施例の詳細な説明） 全ての引用した特許、特許出願および参考文献は、そのまま参考として本明細
書に組込む。

【００１３】 本明細書で定義した「上皮幹細胞（ＥＳＣ）」なる語は、長期生存し、比較的
未分化であり、細胞分裂する可能性が高く、最終的には上皮のホメオスタシスに
関与する細胞を意味する。この型の細胞は、以下を含むがこれに限定されない；
米国特許第５，５５６，７８３号；米国特許第５，４２３，７７８号；Ｒｏｃｈ
ａｔら、Ｃｅｌｌ ７６：１０６３（１９９４）；Ｊｏｎｅｓら、Ｃｅｌｌ ７
３：７１３（１９９３）；Ｊｏｎｅｓら、Ｃｅｌｌ ８０：８３（１９９５）；
全参考文献をそのまま本明細書に組込む。本明細書で定義した「増殖」は、細胞
自己再生および分化を伴う細胞増殖の両方を包含する。

【００１４】 特記しない限り、本明細書で使用した「活性剤」なる語は、アンギオテンシノ
ーゲン、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）、ＡＩ類似体、ＡＩ断片およびその類似体
、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片またはその類似体およびＡＩＩ ＡＴ_２２型受容体
アゴニストを含む化合物群を意味する。

【００１５】 ＤｉＺｅｒｅｇａの米国特許第５，０１５，６２９号（その全開示を、参考と
して本明細書に組込む）は、創傷組織の治癒速度を増加させる方法を記載し、こ
れは、該組織への、該増加に十分な量のアンギオテンシンＩＩ（ＡＩＩ）の適用
を含む。創傷組織へのＡＩＩの適用により、創傷治癒速度は有意に増加し、より
迅速な再上皮化および組織修復がもたらされる。ＡＩＩなる語は、配列Ａｓｐ−
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号１］を有
する、ヒトおよび他の種に存在するオクタペプチドを意味する。アンギオテンシ
ンの生物学的形成は、血漿基質のアンギオテンシノーゲンに対するレニンの作用
により開始される（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ６０：７８６
−７９０（１９８７）；Ｃｌｏｕｓｔｏｎら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２：２４０−
２４８（１９８８）；Ｋａｇｅｙａｍａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２３：
３６０３−３６０９；Ｏｈｋｕｂｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．８０：２１９６−２２００（１９８３）；全参考文献をそのまま本明細書に組
込む）。かくして形成された物質は、アンギオテンシンＩ（ＡＩ）と呼ばれるデ
カペプチドであり、これは、ＡＩ、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−
Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ［配列番号３７］からＣ末端Ｈｉｓ−
Ｌｅｕ残基を除去する変換酵素アンギオテンシナーゼによりＡＩＩに変換される
。ＡＩＩは公知の昇圧剤であり、市販で入手できる。

【００１６】 研究により、ＡＩＩは、創傷修復に関与する培養細胞における有糸分裂誘発お
よび走化性を増加させ、また、その増殖因子および細胞外基質の放出も増加させ
る事が示されている（ｄｉＺｅｒｅｇａ、米国特許第５，０１５，６２９号；Ｄ
ｚａｕら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２１：Ｓ７（補刊ＩＩＩ）
１９８９；Ｂｅｒｋら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １３：３０５−１４（１９
８９）；Ｋａｗａｈａｒａら、ＢＢＲＣ １５０：５２−９（１９８８）；Ｎａ
ｆｔｉｌａｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８３：１４１９−２３（１９８
９）；Ｔａｕｂｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：５２６−５３０（
１９８９）；Ｎａｋａｈａｒａら、ＢＢＲＣ １８４：８１１−８（１９９２）
；ＳｔｏｕｆｆｅｒおよびＯｗｅｎｓ、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７０：８２０（１９
９２）；Ｗｏｌｆら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４０：９５−１０７（１９９
２）；ＢｅｌｌおよびＭａｄｒｉ、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３７：７−１２
（１９９０）。さらに、ＡＩＩは、ウサギ角膜眼およびヒヨコ絨毛尿膜モデルに
おいて血管形成性であることが示された（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚら、Ｊ．Ｌａｂ．
Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１０５：１４１（１９８５）；ＬｅＮｏｂｌｅら、Ｅｕｒ．
Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９５：３０５−６（１９９１）。さらに、ＡＩＩお
よびアンギオテンシンＩＩＩ類似体およびその断片は、組織修復に効果的である
ことが示されている（米国特許第５，６２９，２９２号；国際出願番号ＷＯ９５
／０８５６５号；国際出願番号ＷＯ９５／０８３３７号；国際出願番号ＷＯ９６
／３９１６４号、全参考文献をそのまま本明細書に組込む）。ＡＩＩはまた、熱
損傷領域の毛包において細胞増殖を増加させることが示されている（Ｒｏｄｇｅ
ｒｓら、Ｊ．Ｂｕｒｎ Ｃａｒｅ Ｒｅｈａｂｉｌ．１８：３８１−３８８（１
９９７）。

【００１７】 ある細胞型に対するＡＩＩの効果は、一部、細胞が発現するＡＩＩ受容体サブ
タイプに依存すると仮定されている（Ｓｈａｎｕｇａｍら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓ
ｉｏｌ．２６８：Ｆ９２２−Ｆ９３０（１９９５）；Ｈｅｌｉｎら、Ａｎｎａｌ
ｓ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２９：２３−２９（１９９７）；Ｂｅｄｅｃｓら
、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３２５：４４９−４５４（１９９７））。これらの研究
により、ＡＩＩ受容体サブタイプ発現は、発達中、少なくともある細胞型におい
て変化する動的なプロセスであることが示されている（同上）。ＡＩＩ活性は、
典型的には、ＡＴ１およびＡＴ２ＡＩＩ受容体のいずれかまたは両方により調節
されている。しかし、ＡＩＩは、近年、非ＡＴ１、非ＡＴ２受容体を介して、初
期ヒトケラチノサイトの増殖を刺激することが示されている（Ｓｔｅｃｋｅｌｉ
ｎｇｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２２９：
３２９−３３３（１９９６））。これらの結果は、ＡＩＩ活性の細胞型（すなわ
ち受容体発現に基づく）特異的性質を強調する。

【００１８】 他のデータにより、ＡＩＩ断片ＡＩＩ（１−７）は、ＡＩＩ活性を調節するＡ
Ｔ１およびＡＴ２受容体とは異なる受容体（群）を通して作用することが示唆さ
れる（Ｆｅｒｒａｒｉｏら、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．９：１７１６
−１７２２（１９９８）；Ｉｙｅｒら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ３１：６９
９−７０５（１９９８）；Ｆｒｅｅｍａｎら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２８
：１０４（１９９６）；Ａｍｂｕｈｌら、Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．Ｂｕｌｌ．３５
：２８９（１９９４））。従って、特定の細胞型に対するＡＩＩ（１−７）活性
は、同細胞型に対するＡＩＩの効果にのみ基づいて予想できない。

【００１９】 これらの全研究に基づき、アンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、およ
び／またはＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片またはその類
似体、および／またはＡＩＩＡＴ_２２型受容体アゴニストが、上皮幹細胞または
ケラチノサイトの増殖を加速するかは明らかでない。

【００２０】 ＡＴ２受容体に選択的なペプチドアゴニスト（ＡＩＩは、ＡＴ１よりもＡＴ２
に１００倍高い親和性を有する）は、ｐ−アミノフェニルアラニン６−ＡＩＩ［
“（ｐ−ＮＨ_２−Ｐｈｅ）６−ＡＩＩ］”］、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ
−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号３６］であり、ここで、Ｘａａは
、ｐ−ＮＨ_２−Ｐｈｅである（ＳｐｅｔｈおよびＫｉｍ、ＢＢＲＣ １６９：９
９７−１００６（１９９０））。このペプチドは、試験した実験モデルでＡＴ２
アンタゴニストと同等な結合特徴を与えた（Ｃａｔａｌｉｏｔｏら、Ｅｕｒ．Ｊ
．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２５６：９３−９７（１９９４）；Ｂｒｙｓｏｎら、Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２５：１１９−１２７（１９９２）。

【００２１】 ＡＩＩ受容体およびＡＩＩ受容体アンタゴニストの効果は、血管損傷および修
復の２つの実験モデルで調べられ、これにより、両方のＡＩＩ受容体サブタイプ
（ＡＴ１およびＡＴ２）が、創傷治癒に役割を果たしていることが示唆される（
Ｊａｎｉａｋら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ ２０：７３７−４５（１９９２）
；Ｐｒｅｓｃｏｔｔら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１３９：１２９１−１２９６
（１９９１）；Ｋａｕｆｆｍａｎら、Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．４９：２２３−２２８
（１９９１）；Ｖｉｓｗａｎａｔｈａｎら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １３：７８３−
７８６（１９９２）；Ｋｉｍｕｒａら、ＢＢＲＣ １８７：１０８３−１０９０
（１９９２）。

【００２２】 多くの研究は、ＡＩＩ（１−７）（ＡＩＩ残基１−７）またはＡＩＩの他の断
片に、その活性を評価するために、焦点を当てた。ＡＩＩ（１−７）は、ＡＩＩ
により顕現される効果の全範囲ではなく、いくらかを顕現する。Ｐｆｅｉｌｓｃ
ｉｆｔｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２２５：５７−６２（１９９
２）；Ｊａｉｓｗａｌら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ １９（補刊ＩＩ）：ＩＩ
−４９−ＩＩ−５５（１９９２）；ＥｄｗａｒｄｓおよびＳｔａｃｋ、Ｊ．Ｐｈ
ａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．２６６：５０６−５１０（１９９３）
；Ｊａｉｓｗａｌら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒ．Ｔｈｅｒ．２６５
：６６４−６７３（１９９１）；Ｊａｉｓｗａｌら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ
１７：１１１５−１１２０（１９９１）；Ｐｏｒｔｓｉら、Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａ
ｒｍａｃｏｌ．１１１：６５２−６５４（１９９４）。

【００２３】 この後定義するように、本発明の使用に好ましいクラスのＡＴ２アゴニストは
、ＡＩＩの６位に相当する位置にｐ−ＮＨ−Ｐｈｅを有する、ＡＩＩ、ＡＩＩ類
似体またはその活性断片を含む。ペプチド剤に加えて、必要なＡＴ２アゴニスト
活性を有する様々な非ペプチド剤（例えばペプチド擬似体）がさらに本発明の使
用に考えられる。

【００２４】 本発明の特に目的である活性ＡＩＩ類似体、ＡＩＩの断片およびその類似体は
、一般式Ｉ Ｒ^１−Ｒ^２−Ｒ^３−Ｒ^４−Ｒ^５−Ｒ^６−Ｒ^７−Ｒ^８ ［式中、 Ｒ^１およびＲ^２は、共に、式 Ｘ−Ｒ^Ａ−Ｒ^Ｂ− で示される基を形成し、 ここで、Ｘは、Ｈ、または１−３個のペプチド基であり、 Ｒ^Ａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロペンタンカルボ
ン酸）、Ａｌａ、Ｍｅ^２Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｂｅｔ、Ｇｌｕ（ＮＨ_２）、Ｇｌｙ、
Ａｓｐ（ＮＨ_２）およびＳｕｃから適切に選択され； Ｒ^Ｂは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−Ａｒ
ｇおよびＤ−Ｌｙｓから適切に選択され； Ｒ^３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａ
ｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群から選択されるが、Ｌｙｓもこの残基で
効果的であるあることが判明し； Ｒ^４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ_３）_２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒ、ａｚ
ａＴｙｒ、およびＡｌａからなる群から選択され； Ｒ^５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる
群から選択され； Ｒ^６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ_２−Ｐｈｅであり； Ｒ^７は、ＰｒｏまたはＡｌａであり；および Ｒ^８は、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され
、末端Ｔｙｒ基のようにＲ^４を含む配列を除外し、 およびここで配列はＡＩＩではない］ で示される配列のＲ^１−Ｒ^８基の少なくとも３つ連続したアミノ酸からなる配列
を含む。

【００２５】 このクラスの化合物の特に好ましい実施形態は、配列番号２、配列番号４、配
列番号１３、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号３１、配列
番号３４、および配列番号３８である。

【００２６】 本発明の実施に有用なＡＴ２アゴニストのカテゴリー内に該当する化合物は、
Ｒ^６がｐ−ＮＨ_２−Ｐｈｅであるという制限を課した上記で示したＡＩＩ類似体
を含む。

【００２７】 Ｒ^ＡおよびＲ^Ｂに特に好ましい組合せは、Ａｓｐ−Ａｒｇ、Ａｓｐ−Ｌｙｓ、
Ｇｌｕ−ＡｒｇおよびＧｌｕ−Ｌｙｓである。このクラスの特に好ましい実施形
態は以下を含む：ＡＩＩＩまたはＡＩＩ（２−８）、Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−
Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号２］；ＡＩＩ（３−８）、これはｄ
ｅｓ１−ＡＩＩＩまたはＡＩＶとしても知られる、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈ
ｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号３］；ＡＩＩ（１−７）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖ
ａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ［配列番号４］；ＡＩＩ（２−７）、Ａ
ｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ［配列番号５］；ＡＩＩ（３−
７）、Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ［配列番号６］；ＡＩＩ（５−
８）、Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号７］；ＡＩＩ（１−６）、Ａ
ｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ［配列番号８］；ＡＩＩ（１−
５）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ［配列番号９］；ＡＩＩ（１−
４）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ［配列番号１０］；およびＡＩＩ（１−
３）、Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ［配列番号１１］。他の好ましい実施形態は：Ａ
ｒｇ−ｎｏｒＬｅｕ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号１２
］およびＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−ｎｏｒＬｅｕ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配
列番号１３］を含む。本発明の範囲内に包含されるさらに別の好ましい実施形態
は、配列Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［
配列番号３１］を有するペプチドである。ＡＩＩ（６−８）、Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−
Ｐｈｅ［配列番号１４］およびＡＩＩ（４−８）、Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号１５］も試験し、効果のないことが判明した。

【００２８】 本発明の別のクラスの特に好ましい化合物は、以下の一般構造： Ｒ１−Ａｒｇ−Ｒ２−Ｔｙｒ−Ｒ３−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｒ４ ［式中、 Ｒ１は、ＨおよびＡｓｐからなる群から選択され； Ｒ２は、ＶａｌおよびＰｒｏからなる群から選択され； Ｒ３は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕおよびＶａｌからなる群から選
択され； Ｒ４は、Ｉｌｅ、ＰｈｅおよびＨからなる群から選択され；および およびここで活性剤はＡＩＩではない］ を有する化合物からなる。

【００２９】 本発明の特に目的である別のクラスの化合物は、一般式ＩＩ Ｒ^２−Ｒ^３−Ｒ^４−Ｒ^５−Ｒ^６−Ｒ^７−Ｒ^８ ［式中、 Ｒ^２は、Ｈ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−
ＡｒｇおよびＤ−Ｌｙｓからなる群から選択され； Ｒ^３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａ
ｉｂ、ＡｃｐｃおよびＴｙｒからなる群から選択され； Ｒ^４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ_３）_２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒ、ａｚ
ａＴｙｒ、およびＡｌａからなる群から選択され； Ｒ^５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる
群から選択され； Ｒ^６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ_２−Ｐｈｅであり； Ｒ^７は、ＰｒｏまたはＡｌａであり；および Ｒ^８は、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され
る］ で示される化合物である。

【００３０】 一般式ＩＩの化合物の特に好ましい群は、式 Ｒ^２−Ｒ^３−Ｔｙｒ−Ｒ^５−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号１６］ ［式中、 Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^５は、前記で定義した通りである］ を有する。特に好ましいのは、式Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐ
ｒｏ−Ｐｈｅ［配列番号２］のアンギオテンシンＩＩＩである。他の好ましい化
合物は、構造Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［配列
番号１７］およびＡｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ［
配列番号１８］を有するペプチドを含む。断片ＡＩＩ（４−８）は、反復試験で
効果がなく；これは、Ｎ末端上に露出したチロシンに起因すると信じられている
。

【００３１】 上記の式において、アミノ酸残基について標準的な３文字略称を使用する。反
対であるという表示のない場合、Ｌ形のアミノ酸を意図する。他の残基は以下の
ように略する：

【表１】 ＡＩＩおよびその類似体は、γまたはβターンのいずれかをとることが示唆さ
れている（Ｒｅｇｏｌｉら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ
２６：６９（１９７４）。一般に、Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^７位の中性側鎖は、受
容体への結合および／または固有活性に主に関与するＲ^４、Ｒ^６およびＲ^８位の
活性基の間における適切な距離の維持に関与し得る。Ｒ^３、Ｒ^５およびＲ^８位の
疎水性側鎖は、ペプチドの全体のコンフォメーションに重要な役割を果たし得、
および／または、仮定上の疎水性ポケットの形成に寄与し得る。

【００３２】 Ｒ^２位のアミノ酸上の適切な側鎖は、標的受容体に対する化合物の親和性に寄
与し得、および／または、ペプチドのコンフォメーションに重要な役割を果たし
得る。この理由から、ＡｒｇおよびＬｙｓは、Ｒ^２として特に好ましい。

【００３３】 本発明の目的において、Ｒ^３は、Ｒ^５（γターンモデルにおいて）またはＲ^６ （βターンモデルにおいて）との線形または非線形水素結合の形成に関与し得る
。Ｒ^３はまた、β逆平行構造（これも可能な構造として提唱されている）の最初
のターンに関与する。一般式Ｉの他の位置とは対照的に、βおよびγ分枝は、こ
の位置で等しく効果的であるようである。さらに、比較的安定なコンフォメーシ
ョンを維持するには１つの水素結合で十分であり得る。従って、Ｒ^３は、Ｖａｌ
、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｉｂ、Ａｃｐｃ
およびＴｙｒから適切に選択され得る。

【００３４】 Ｒ^４に関して、コンフォメーション分析により、この位置（並びにＲ^３および
Ｒ^５）の側鎖は、受容体の占有および刺激に不可欠であると信じられている疎水
性クラスターに寄与することが示唆された。従って、Ｒ^４は、好ましくは、Ｔｙ
ｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ_３）_２、ｈｏｍｏＳｅｒ、ＳｅｒおよびａｚａＴｙｒ
から選択される。この位置には、Ｔｙｒが特に好ましい。なぜなら、それは、フ
ェノール性ヒドロキシルからの水素を受容できる受容体部位と水素結合を形成し
得るからである（Ｒｅｇｏｌｉら（１９７４）、上記）。また、Ｒ^４はＡｌａで
あり得ることが判明した。

【００３５】 Ｒ^５位には、β脂肪族または非環式鎖を有するアミノ酸が特に望ましい。それ
故、ＧｌｙがＲ^５位に適切であるが、この位置のアミノ酸は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、
Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、ＧｌｙおよびＶａｌから選択することが好ましい。

【００３６】 本発明に記載の特に目的であるアンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ類似体、
ＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ類似体、断片および断片の類似体において、
Ｒ^６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ_２−Ｐｈｅである。ヒスチジンのイミダ
ゾール環の独特な特性（例えば、生理学的ｐＨでのイオン化、プロトンドナーま
たはアクセプターとして作用可能であること、芳香族的特徴）は、Ｒ^６としての
その特定の有用性に寄与すると信じられている。例えば、コンフォメーションモ
デルにより、Ｈｉｓは、Ｒ^７の配向に影響を与えることにより、水素結合形成（
βモデルにおいて）または逆平行構造の第二ターンに関与し得ることが示唆され
る。同様に、Ｒ^７は、Ｒ^８の最も望ましい配向を提供するためにＰｒｏであるべ
きと現在考えられている。Ｒ^８位において、疎水性環およびアニオン性カルボキ
シル末端は両方共、目的の類似体の受容体への結合に特に有用であるようであり
；それ故、Ｔｙｒおよび特にＰｈｅが、本発明の目的に好ましい。

【００３７】 特に目的である類似体は以下を含む：

【表２】 本発明のポリペプチドの合成は、Ｊ．Ｍ．ＳｔｅｗａｒｔおよびＪ．Ｄ．Ｙｏ
ｕｎｇ、固相ペプチド合成、第２版、Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ．Ｃｏ．
、ロックフォード、イリノイ（１９８４）、および固相合成については、Ｊ．Ｍ
ｅｉｅｎｈｏｆｅｒ１、ホルモン性タンパク質およびペプチド、第２巻、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（１９７３）、および溶液合成につい
ては、Ｅ．ＳｃｈｒｏｄｅｒおよびＫ．Ｌｕｂｋｅ、ペプチド、第１巻、Ａｃａ
ｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、（１９６５）などによる方法を含むが
、これに限定されない任意の慣用的な方法で合成され得る。前記の論文の開示を
、本明細書に参考として組込む。

【００３８】 一般に、これらの方法は、成長ペプチド鎖への保護アミノ酸の連続的添加を含
む（米国特許第５，６９３，６１６号、そのまま参考として本明細書に組込む）
。普通、最初のアミノ酸のアミノまたはカルボキシル基および任意の反応性側鎖
基を保護する。この保護されたアミノ酸を、次いで、不活性固体支持体に付着さ
せるか、または溶液中で使用し、配列における次のアミノ酸（これも適切に保護
する）を、アミド連鎖の形成を受け易い条件下で加える。全ての所望のアミノ酸
を適切な配列で連結させた後、保護基および任意の固体支持体を除去すると、粗
ポリペプチドが得られる。ポリペプチドを脱塩し、好ましくはクロマトグラフィ
ーにより精製すると、最終生成物が得られる。

【００３９】 好ましくは、ペプチドは、標準的な固相法に従って合成し、例えば、アプライ
ドバイオシステムズ４３０Ａ型ペプチドシンセサイザー（アプライドバイオシス
テムズ、フォスターシティー、カリフォルニア）で製造業者の指示に従って実施
し得る。固相法によるまたは液相中での、ペプチドまたはペプチド擬似体の他の
合成法は、当業者には公知である。

【００４０】 本発明の１つの実施形態において、アンギオテンシノーゲン、ＡＩ、ＡＩ類似
体、および／またはＡＩ断片およびその類似体、ＡＩＩ類似体、ＡＩＩ断片およ
びその類似体、および／またはＡＩＩ ＡＴ_２２型受容体アゴニスト（「活性剤
」）への曝露により、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｅｘ ｖｉｖｏでＥＳＣおよびケ
ラチノサイトの増殖を増加させるための方法が、単独で、または他の増殖因子お
よびサイトカインと組合せて開示される。かかる増殖因子およびサイトカインの
例は、リンホカイン、インターロイキン−１、２、３、４、５、６、７、８、９
、１０、１１、ケラチノサイト増殖因子、腫瘍壊死因子、上皮増殖因子（「ＥＧ
Ｆ」）、ＨＢ−ＥＧＦ、繊維芽細胞増殖因子１、２、および４、および形質転換
増殖因子αを含むがこれに限定されない。ＥＳＣおよびケラチノサイトの単離、
精製、ｅｘ ｖｉｖｏ増殖およびｉｎ ｖｉｖｏ動員の実験条件が報告されてい
る（米国特許第５，４２３，７７８号；米国特許第５，５６１，１０７号；米国
特許第５，６８６，３０７号；Ｒｈｅｉｎｗａｌｄら、細胞からの角質化するコ
ロニーの形成、Ｃｅｌｌ Ｇ．３３１−３４３、１９７５；全参考文献をそのま
ま本明細書に組込む）。

【００４１】 本発明の好ましい実施形態において、ＥＳＣおよびケラチノサイトは、前記し
たように、形成外科を受けている患者からの皮膚サンプルのトリプシン処理によ
り得られる（Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｔｏｘ
ｉｃｏｌｏｇｙ ８０：４９−５６（１９９７））。他の好ましい実施形態にお
いて、ＥＳＣは、米国特許第５，５５６，７８３号（そのまま参考として本明細
書に組込む）に記載のように、上部毛包から単離される。

【００４２】 単離ＥＳＣおよびケラチノサイトは、その後、本発明の活性剤の存在下で、適
切な増殖条件下で培養する。細胞増殖は培養中の様々の時間点で評価し、Ｎａｋ
ａｍｕｒａおよび共同研究者に方法によるＤＮＡ合成速度の測定（Ｎａｋａｍｕ
ｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（東京）９４：１０２９（１９８２）；Ｎａｋａ
ｍｕｒａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１２２：１
４５０（１９８４））、トリパンブルーダイ排除／血球計数器計測（Ｏｍｏｒｉ
ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ２６：７２０（１９９７））、またはフローサイト
メトリー（Ｄｒａｋｅｓ、１９９７）などによる方法を含むが、これに限定され
ない当分野で公知の方法を使用して評価する。

【００４３】 好ましい実施形態において、ＥＳＣおよびケラチノサイトを、ケラチノサイト
基礎増殖培地（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ．、サンディエゴ、カリフォルニ
ア）を含むがこれに限定されない標準的な培養培地に懸濁し、好ましくは約０．
１ｎｇ／ｍｌないし約１０ｍｇ／ｍｌの活性剤の存在下で、インキュベートする
。該細胞を、８ないし２１日間展開させ、細胞増殖をＤＮＡ合成速度の測定によ
り監視する（Ｎａｋａｍｕｒａら、１９８２；Ｎａｋａｍｕｒａら、１９８４）
。ＥＳＣおよびケラチノサイト増殖は、Ｙａｎｇら、Ｊ．ｏｆ Ｉｎｖｅｓｔｉ
ｇ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０７：３６７−３７２（１９９６）に記載のように^３ ［Ｈ］チミジン取込みにより測定する。別に、ＥＳＣおよびケラチノサイト細胞
増殖は、増殖細胞核抗原などの、非増殖細胞よりも増殖細胞に高い濃度で存在す
ることが知られているタンパク質に指向する抗体を使用して免疫組織化学により
周期的に評価する（ＰＣＮＡまたはサイクリン；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｉｅｓ）（Ｒｏｄｇｅｒｓら、１９９７）。

【００４４】 ケラチノサイトのスクアムズへの分化は、グルタミン転移酵素Ｉ型（ＴＧ−Ｉ
）（Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、１９９７）およびケラチン（Ｍａｒｔｉｎら、１９９
７）を含むがこれに限定されない典型的な分化したケラチノサイトマーカーの発
現を測定することにより検出する。これらのマーカーを検出する方法は、ノザン
ブロット分析法またはマーカー特異的ＤＮＡプライマーを用いた逆転写酵素−複
製連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｓｏｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２３５：１０−１４（１９９７）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ
ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１８５８１−９２（１９９５））、およ
び抗体検出（Ｔｈｅ Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｓｉｔｅ、サンディエゴ、カリフォルニ
ア）を含むがこれに限定されない。

【００４５】 さらなる好ましい実施形態において、活性剤の存在下で培養したＥＳＣおよび
ケラチノサイトは、Ｍｏｒｇａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３７：１４７６−１４
７９（１９８７）、およびＴｅｎｍｅｒら、ＦＡＳＥＢ Ｊ．４：３２４５−３
２５０（１９９０）に記載のように、ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＳＣおよびケラチノサ
イト特異的遺伝子療法に使用される。ｅｘ ｖｉｖｏ ＥＳＣまたはケラチノサ
イト特異的遺伝子療法の前に、細胞を濯ぎ、培養液を除去し、適切な培地に再度
懸濁し、その後ペレット化し、数回濯ぐ。最終の濯ぎの後、細胞を０．７×１０ ^６ ないし５０×１０^６細胞／ｍｌで、適切な培地に再度懸濁し、下記のように被
検者に再度注入する。

【００４６】 本発明の別の実施形態において、活性剤は、ｉｎ ｖｉｖｏ ＥＳＣおよびケ
ラチノサイト増殖を増加させるために使用され、これは、生検サンプルの採取お
よび上記の方法の使用により測定できる。好ましい実施形態において、生検サン
プルは、処理の約１日ないし約２週間後に採取する。

【００４７】 ＥＳＣおよびケラチノサイトの増殖増加に使用するために、活性剤は、経口、
非経口、吸入スプレー、経直腸、経皮、または局所を含む適切な経路により、慣
用的な医薬的に許容される担体、アジュバントおよび媒体を含む投薬単位製剤で
投与し得る。本明細書で使用した非経口なる語は、皮下、静脈内、筋肉内、胸骨
内、腱内、脊髄内、頭蓋内、胸腔内、注入技術または腹膜内を含む。

【００４８】 活性剤は、固体形（顆粒、粉末または坐剤を含む）または液体形（例えば、溶
液、懸濁液、またはエマルション）に製造され得、滅菌などの慣用的な医薬的操
作にかけ得、および／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤等の慣用
的なアジュバントを含み得る。

【００４９】 活性剤は、単一の活性な医薬として投与することができるが、それらは、１つ
以上の他の化合物と組合せて使用することもできる。組合せとして投与する場合
、活性剤および他の化合物は、同時または異なる時間に投与する別々の組成物と
して製剤化できるか、または活性剤および他の化合物は単一の組成物として投与
できる。

【００５０】 投与用に、活性剤は、通常、指示された投与経路に適切な１つ以上のアジュバ
ントと組合わせる。該化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アル
カン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、滑石、ステアリン酸マグネシウム
、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アラ
ビアゴム、ゼラチン、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、および／
またはポリビニルアルコールと混合し得、および慣用的な投与用に錠剤化または
カプセル化し得る。別に、本発明の化合物は、食塩水、水、ポリエチレングリコ
ール、プロプレングリコール、カルボキシメチルセルロースコロイド状溶液、エ
タノール、コーン油、落下生油、綿実油、ゴマ油、トラガカントゴム、および／
または様々な緩衝液に溶解し得る。他のアジュバントおよび投与形態も、医薬分
野で公知である。担体または希釈剤は、モノステアリン酸グリセリルまたはジス
テアリン酸グリセリルなどの時間遅延物質を、単独で、またはワックスまたは当
分野で公知の他の物質と共に含み得る。

【００５１】 活性剤を用いてＥＳＣおよびケラチノサイトのｉｎ ｖｉｖｏでの増殖を増加
させる用量療法は、損傷の型、年齢、体重、性、個体の医学的状態、状態の重度
、投与経路、および使用する特定の化合物を含む、様々な因子に基づく。従って
、用量療法は、様々に変化し得るが、標準的な方法を使用して医者により日常的
に決定できる。約０．１ｎｇ／ｋｇないし１０ｍｇ／ｋｇの活性剤／体重の次元
の用量レベルが、本明細書で開示した使用の全方法に有用である。

【００５２】 本発明の好ましい実施形態において、活性剤は経皮または局所投与する。活性
剤の活性成分の適切な経皮または局所用量は、好ましくは、１日２回約０．１ｎ
ｇ／ｋｇないし約１０ｍｇ／ｋｇの投与である。経皮適用では、活性成分は、０
．００１％−１０％ｗ／ｗ、例えば、１重量％−２重量％の製剤を含み得るが、
１０％ｗ／ｗという多くを含んでもよい。しかし、好ましくは５％ｗ／ｗ以下、
より好ましくは０．１％−１％の製剤を含み得る。

【００５３】 局所投与に適切な製剤は、皮膚の透過に適切な液体または半液体製剤（例えば
、塗布薬、ローション、軟膏、クリーム、またはペースト）および眼、耳、また
は鼻への投与に適切な滴剤を含む。

【００５４】 経皮パッチを含むがこれに限定されない経皮手段は、活性剤を治療部位に輸送
するために利用し得る。経皮製剤は、活性剤を、セルロース培地、例えば、メチ
ルセルロースまたはヒドロキシエチルセルロースを含むがこれに限定されないチ
キソトロピー性またはゼラチン状担体に取り込み、得られた製剤を、その後、着
用者の皮膚との皮膚接触を固定するに適した経皮装置に詰めることにより調製し
得る。

【００５５】 本発明の別の実施形態において、改良細胞培養培地が、ＥＳＣおよびケラチノ
サイトの増殖のために提供され、ここで、改良は、有効量の上記の活性剤を細胞
培養培地に添加することを含む。ＥＳＣおよびケラチノサイトの増殖を支持でき
る任意の細胞培養培地を、本発明に使用できる。かかる細胞培養培地は、ケラチ
ノサイト基礎増殖培地、基礎培地イーグル、ダルベッコ改変イーグル培地、イス
コーブ（Ｉｓｃｏｖｅ）改変ダルベッコ培地、マックコイ（ＭｃＣｏｙ）培地、
最少必須培地、Ｆ−１０栄養混合物、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）減少血清培
地、およびＲＰＭＩ培地、またはその組合せを含むがこれに限定されない。

【００５６】 改良細胞培養培地は、濃縮（すなわち１０×）または非濃縮形で供給され得、
液体、粉末、または凍結乾燥物として供給され得る。細胞培養物は、化学的に定
められ得るか、または血清サプリメントを含み得る。培養培地および血清サプリ
メントは、ギブコＢＲＬ（ガイサーズバーグ、メリーランド）およびシグマ（セ
ントルイス、ミズーリ）などの多くの源から市販で入手可能である。

【００５７】 さらなる実施形態において、本発明は、ＥＳＣおよびケラチノサイトの増殖の
ためのキットを提供するものであって、キットは、有効量の本発明の活性剤、お
よび細胞培養培地補充として有効量の活性剤を使用するための説明書を含む。

【００５８】 好ましい実施形態において、該キットは、さらに、細胞培養増殖培地を含む。
ＥＳＣおよびケラチノサイトの増殖を支持できる任意の細胞培養培地を、本発明
で使用できる。かかる細胞培養培地の例は、上記している。

【００５９】 改良細胞培養培地は、濃縮（すなわち１０×）または非濃縮形で供給され得、
液体、粉末、または凍結乾燥物として供給され得る。細胞培養液は、化学的に定
められ得るか、または血清サプリメントを含み得る。

【００６０】 さらなる好ましい実施形態において、該キットは、さらに、無菌容器を含む。
該無菌容器は、細胞培養フラスコ、ローラーボトル、または遠心チューブなどの
封着容器、または細胞培養プレートまたはマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ
；Ｎａｐｅｒｖｉｌｌｅ、イリノイ）などの封着のない容器を含むことができる
。

【００６１】 好ましい実施形態において、該キットは、さらに、再構成された細胞増殖培地
に包含させるための抗生物質補充を含む。適切な抗生物質補充の例は、アクチノ
マイシンＤ、フンジゾン（登録商標）、カナマイシン、ネオマイシン、ナイスタ
チン、ペニシリン、ストレプトマイシン、またはその組合せ（ギブコ）を含むが
これに限定されない。

【００６２】 本発明は、ＥＳＣおよびケラチノサイトの増殖を増強する方法を提供すること
により、天然皮膚または生皮膚等価物を使用した、創傷治癒および皮膚移植中の
ＥＳＣおよびケラチノサイト増殖の加速に臨床上有用である。本発明の方法はま
た、トランスフェクション用のかかる細胞を大量に、より効率的に提供すること
により、およびまた、トランスフェクトされたＥＳＣおよびケラチノサイトを迅
速に増殖させる、より効率的な手段を提供することにより、遺伝子療法の媒体と
してのＥＳＣおよびケラチノサイトの潜在的な有用性を増加させる。

【００６３】 本発明は、添付の実施例を参照してより良く理解され、これは、説明の目的の
みのためであり、本発明の範囲を制限するものと解釈するべきではない。

【００６４】 実施例１ 細胞数により測定した、ＡＩＩおよびＡＩＩ類似体および類似体断片
のｉｎ ｖｉｔｒｏでのケラチノサイト増殖に対する効果 正常なヒトケラチノサイトは、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（サンディエゴ、カリフォ
ルニア）から購入し、製造業者の指示に従って、ケラチノサイト増殖培地（ＫＧ
Ｍ；ヒト組換え上皮増殖因子、ヒト組換えインシュリン、ヒドロコルチゾン、エ
ピネフリン、プロスタグランジンＥ２および抗生物質を含む、ケラチノサイト基
礎培地）で集密となるまで培養した。集密に達すると、細胞を、培養フラスコか
らトリプシン処理し、２４穴プレートに、１００細胞／穴でＫＧＭに再度播いた
。細胞を２４時間接着させた後、細胞をＫＢＭに入れ、１０μｇ／ｍｌのＡＩＩ
（配列番号１）、ＡＩＩ（１−７）（配列番号４）、またはＡｌａ４ＡＩＩＩ（
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ）（配列番号１８）
を穴に加えた。表１に示されるように、ケラチノサイトを様々なペプチドに曝露
することにより、１穴あたりのケラチノサイト数はＫＢＭのみよりも増加した。

【００６５】

【表３】 実施例２ チミジン取込みにより測定した、ＡＩＩおよびＡＩＩ類似体および類
似体断片のｉｎ ｖｉｔｒｏでのケラチノサイト増殖に対する効果 正常なヒトケラチノサイトは、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（サンディエゴ、カリフォ
ルニア）から購入し、集密にまるまで３７℃で５％ＣＯ_２中、実施例１に記載の
ように、ケラチノサイト増殖培地（ＫＧＭ）で培養した。細胞を０．０２％トリ
プシン／０．０５％ＥＴＡを用いて集密で収集した。その後、細胞を、２４穴プ
レートに、５０，０００細胞／穴の密度で播いた。１２時間後、ＫＧＭを、基礎
培地（ＫＢＭ）と交換し、細胞を、２４時間培養して、静止状態とした。その後
、細胞を、１０μｇ／ｍｌの様々なペプチド（ＡＩＩ、ＡＩＩ（１−７）、また
はＡｌａ４−ＡＩＩＩ）と共に２４時間培養し、その後、１μＣｉ［^３Ｈ］チミ
ジンを各穴に加えた。その後、培養物を３７℃で５％ＣＯ_２中でさらに１２時間
続けた。その後、細胞を３回ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で洗浄して取り込まれていな
い放射活性を除去した。その後、細胞を５％ＴＣＡで１回洗浄し、１回１００％
エタノールで洗浄し、その後、１Ｍ ＮａＯＨに溶解し、２００μｌのアリコー
トの溶解液をシンチレーションカウンターで計測した。データは図１に提示し、
試験した全ペプチドが、培地対照と比較してチミジン取込みを増加させたことが
実証される。

【００６６】 実施例３ ＡＩＩ類似体および断片および類似体断片のｉｎ ｖｉｖｏでのケラ
チノサイト増殖に対する効果 約５００ｇの体重の雄ハートレイモルモットを、チャールズ・リバー・ラボラ
トリー（チャールズリバーズ、マサチューセッツ）から購入し、１４ｍｇ／ｋｇ
ロンパン（Ｒｏｍｐｕｎ）および１３０ｍｇ／ｋｇのケタミンの筋肉内注射によ
り麻酔した。その後、毛を、動物バサミで剃り背表面から除去し、その後、チオ
グリコレート除毛剤で処理した。毛を除去した後、領域を２回ベータダインで洗
浄し、その後、７０％エタノールで洗浄した。２つの火傷を、７５℃の水浴中で
熱した１８ｍｍの固体真鍮棒を用いて各モルモットに生じさせた。真鍮棒の一端
を、５０秒間モルモットの背中に置いた。この方法を、各動物および各火傷につ
いて異なる真鍮棒を用いて反復した。

【００６７】 各火傷は、１ｍｇ／ｍｌのＡＩＩ（１−７）（配列番号４）、Ａｌａ４−ＡＩ
ＩＩ（配列番号１８）、Ｐｒｏ３−ＡＩＩ（配列番号３１）、またはＩｌｅ８−
ＡＩＩ（Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ）
（配列番号３８）の存在下または非存在下で、０．０５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
．２）中１０％低粘度カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣナトリウム塩、シグ
マケミカル社、セントルイス、ミズーリ）で処理し、オートクレーブにより滅菌
した。各火傷は、その後、ヒルトップ・チャンバー（Ｈｉｌｌｔｏｐ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ、マジソン、ウィスコンシン）で整え、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ
）（ウェスタンメディカルサプライ、アルカディア、カリフォルニア）で覆った
。包帯を調べ、最初の５日間は毎日、損傷後７日目の検死までは隔日に交換した
。モルモットに、２０μｇ／ｋｇのブプロネックス（塩酸ブプレノフィン）を、
筋肉内に、損傷日および損傷後の最初の３日間の疼痛のために投与した。

【００６８】 熱損傷後７日目に、モルモットを安楽死させ、火傷領域を塊で切出し、組織を
、１０％緩衝化ホルムアルデヒド溶液中に一晩置いた。組織をパラフィンに包埋
させ、５μｍ切片を調製した。切片をサイクリン（ＭＩＢ−１）に対する一次抗
体を用いて免疫組織化学的分析のために処理し、次いで、ＤＡＫＯキットを用い
て一次抗体の認識を行った（以下の本文参照）。

【００６９】 パラフィン包埋切片を、６０℃で一晩オーブン中で焼いた。脱パラフィン化を
、「新鮮」なキシレン中で４回５分間インキュベートし、次いで、１００％エタ
ノールを用いて２回５分間インキュベートし、９５％エタノールで２回５分間イ
ンキュベートし、水で１回５分間インキュベートすることにより実施した。その
後、内因性ペルオキシダーゼ活性を、水中０．３％Ｈ_２Ｏ_２でクエンチした。抗
原検索は、Ｒｏｄｇｅｒｓら（１９９７）のプロトコルに小さな修飾を加えて実
施した。簡潔には、スライドを、０．１モル／Ｌトリス緩衝液（ｐＨ９．０）の
５％尿素中、プラスチックコプリン（Ｃｏｐｌｉｎ）瓶に入れた。その後、スラ
イドを、マイクロ波オーブンに入れ、３分間最大電力に設定した。蒸発が過度で
ある場合には抗原検索溶液に蒸留水を補充し、５分間５０％電力でマイクロ波に
かけた。その後、スライドを、１０分間冷却させ、５分間リン酸緩衝食塩水（Ｐ
ＢＳ）に入れた。

【００７０】 免疫組織化学染色を、いくらか修飾してアビジン−ビオチン−ペルオキシダー
ゼコンジュゲートを用いて実施した。スライドを、ＰＢＳ浴に５分間入れ、その
後、加湿インキュベーションチャンバーに置いた。非特異的抗体結合の遮断を、
ＰＢＳ中５％ウマ血清中で切片をインキュベートすることにより実施した。溶液
をデカントし、ＰＢＳ中１：１００の希釈で使用した一次次抗体ＭＩＢ−１の溶
液と交換し、６０分間室温でインキュベートした。スライドを、５分間ＰＢＳで
洗浄し、その後、ビオチニル化ウマ抗マウス抗体と共にインキュベートした。Ｐ
ＢＳ中で５分間洗浄した後、アビジン−ビオチン複合体を、室温でＰＢＳ中１：
１００の希釈でスライドに適用し、１時間インキュベートした。

【００７１】 最終のＰＢＳでの濯ぎ後、切片を、５分間、０．０３％過酸化水素を含む、Ｐ
ＢＳ中０．０６％３，３’−ジアミノベンジジン中でインキュベートした。対比
染色を、修飾ハリスヘマトキシリン−エオシン中で実施した後、切片を脱水し、
ペルマウント（Ｐｅｒｍｏｕｎｔ）を用いてカバーガラスをかけた。

【００７２】 オリンパスＶａｎｏｘ−Ｓ ＡＨ−２解剖顕微鏡および１００Ｘの拡大力を用
いて、生検標本の各切片を、（ａ）火傷縁上の領域または（ｂ）実際の火傷領域
のいずれかに分離した。火傷の領域を切出し、厚さが４−５ｍｍの３−５つの切
片に連続的に切断した。火傷の全領域および火傷の縁を包埋し、組織学的に調べ
た。ＭＩＢ−１抗体で染色した細胞は、明瞭な茶色であった。ＭＩＢ−１染色細
胞を計測するために、スライド上の各切片を、個々の１００Ｘ視野に分離した。
その後、各視野を、火傷の縁上の切片または火傷領域自体の一部のいずれかであ
るかを決定した。縁は、切片の縁に沿った茶色の上皮細胞を示す陽性染色により
示された。火傷部位に隣接した１００Ｘ視野に位置する表皮の基底層の茶色の細
胞（増殖ケラチノサイト）を一回一度に計測した。

【００７３】 火傷の深さは、深い部分的な厚さから全体的な厚さまで、（１）インドインク
の大動脈内注射により血管開存性の分析により、および（２）ヘマトキシリン−
エオシン−染色切片の顕微鏡分析による毛包における細胞の外観により決定した
。この分析により、ほとんどの既存の血管および細胞が、火傷部位で破壊されて
いるが、損傷は筋肉層には広がっていないことが判明した。

【００７４】 結果（図２）により、ＡＩＩ（１−７）（配列番号４）、Ａｌａ３−ＡＩＩＩ
（配列番号３９）、Ｐｒｏ３−ＡＩＩ（配列番号３１）、およびＩｌｅ８−ＡＩ
Ｉ（配列番号３８）の毎日投与は全て、個々の動物において、プラセボ対照と比
較してｉｎ ｖｉｖｏでサイクリン陽性細胞の数を増加させた。

【００７５】 本発明は、前記の特定の好ましい実施形態により限定されない。様々な変更を
、本発明の概念から逸脱することなく、開示された好ましい実施形態に施し得る
ことは、普通程度の技術的理解力を有する者には理解されるであろう。全てのか
かる変更は、本発明の範囲にある。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、ＡＩＩ断片および類似体のケラチノサイト増殖に対する効果を示すグ
ラフである。

【図２】 図２は、上皮火傷後７日目の、ＡＩＩ断片、類似体、および断片類似体のケラ
チノサイト増殖に対する効果を示すグラフである。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年８月１０日（２０００．８．１０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】発明の名称

【補正方法】変更

【補正内容】

【発明の名称】 ケラチノサイト増殖促進法

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ディゼレガ、 ギーア アメリカ合衆国 91106 カリフォルニア 州 パサデナ ヒルクレスト アヴェニュ ー 1270 Ｆターム(参考） 4B065 AA90X AC14 BD39 CA24 CA44 4H045 AA10 AA30 BA14 BA15 DA20 EA28 FA33

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を促進させる方法で
   あって、 一般式Ｉ Ｒ^１−Ｒ^２−Ｒ^３−Ｒ^４−Ｒ^５−Ｒ^６−Ｒ^７−Ｒ^８ ［式中、 Ｒ^１およびＲ^２は、共に、式 Ｘ−Ｒ^Ａ−Ｒ^Ｂ− で示される基を形成し、 ここで、Ｘは、Ｈ、または１−３個のペプチド基であり、 Ｒ^Ａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロペンタンカルボ
   ン酸）、Ａｌａ、Ｍｅ^２Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｂｅｔ、Ｇｌｕ（ＮＨ_２）、Ｇｌｙ、
   Ａｓｐ（ＮＨ_２）およびＳｕｃから適切に選択され； Ｒ^Ｂは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−Ａｒ
   ｇおよびＤ−Ｌｙｓから適切に選択され； Ｒ^３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａ
   ｉｂ、Ａｃｐｃ、ＬｙｓおよびＴｙｒからなる群から選択され； Ｒ^４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ_３）_２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒおよび
   ａｚａＴｙｒからなる群から選択され； Ｒ^５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる
   群から選択され； Ｒ^６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ_２−Ｐｈｅであり； Ｒ^７は、ＰｒｏまたはＡｌａであり；および Ｒ^８は、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され
   、末端Ｔｙｒ基のようにＲ^４を含む配列を除外し、 およびただし活性剤はＡＩＩではない］ で示される配列のＲ^１−Ｒ^８基の少なくとも３つ連続したアミノ酸からなる配列
   を含む、少なくとも１つの活性剤の、増殖を促進させるに有効な量と、上皮幹細
   胞またはケラチノサイトを接触させることを含む、上記方法。
2. 【請求項２】 活性剤は、アンギオテンシノーゲン、配列番号２、配列番号
   ３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号
   ９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６
   、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、
   配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配
   列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列
   番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番
   号３７、配列番号３８および配列番号３９からなる群から選択される、請求項１
   の方法。
3. 【請求項３】 活性剤は、配列番号４、配列番号３１、配列番号３８および
   配列番号３９からなる群から選択される、請求項１の方法。
4. 【請求項４】 活性剤の濃度は、約０．１ｎｇ／ｋｇないし約１０．０ｍｇ
   ／ｋｇである、請求項１の方法。
5. 【請求項５】 上皮幹細胞またはケラチノサイト細胞の増殖促進のための改
   良細胞培養培地であって、改良は、一般式Ｉ Ｒ^１−Ｒ^２−Ｒ^３−Ｒ^４−Ｒ^５−Ｒ^６−Ｒ^７−Ｒ^８ ［式中、 Ｒ^１およびＲ^２は、共に、式 Ｘ−Ｒ^Ａ−Ｒ^Ｂ− で示される基を形成し、 ここで、Ｘは、Ｈ、または１−３個のペプチド基であり、 Ｒ^Ａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロペンタンカルボ
   ン酸）、Ａｌａ、Ｍｅ^２Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｂｅｔ、Ｇｌｕ（ＮＨ_２）、Ｇｌｙ、
   Ａｓｐ（ＮＨ_２）およびＳｕｃから適切に選択され； Ｒ^Ｂは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−Ａｒ
   ｇおよびＤ−Ｌｙｓから適切に選択され； Ｒ^３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａ
   ｉｂ、Ａｃｐｃ、ＬｙｓおよびＴｙｒからなる群から選択され； Ｒ^４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ_３）_２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒおよび
   ａｚａＴｙｒからなる群から選択され； Ｒ^５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる
   群から選択され； Ｒ^６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ_２−Ｐｈｅであり； Ｒ^７は、ＰｒｏまたはＡｌａであり；および Ｒ^８は、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され
   、末端Ｔｙｒ基のようにＲ^４を含む配列を除外し、 およびただし活性剤はＡＩＩではない］ で示される配列のＲ^１−Ｒ^８基の少なくとも３つ連続したアミノ酸からなる配列
   を含む、少なくとも１つの活性剤の、上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を
   増加させるのに有効な量を、細胞培養培地に添加することを含む、上記改良細胞
   培養培地。
6. 【請求項６】 活性剤は、アンギオテンシノーゲン、配列番号２、配列番号
   ３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号
   ９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１６
   、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、
   配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配
   列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列
   番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番
   号３７、配列番号３８および配列番号３９からなる群から選択される、請求項５
   の改良細胞培養培地。
7. 【請求項７】 活性剤は、配列番号４、配列番号３１、配列番号３８および
   配列番号３９からなる群から選択される、請求項５の改良細胞培養培地。
8. 【請求項８】 活性剤の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌないし約１０．０ｍｇ
   ／ｍｌである、請求項５の改良細胞培養培地。
9. 【請求項９】 上皮幹細胞およびケラチノサイトの増殖を促進させるキット
   であって、 （ａ）一般式Ｉ Ｒ^１−Ｒ^２−Ｒ^３−Ｒ^４−Ｒ^５−Ｒ^６−Ｒ^７−Ｒ^８ ［式中、 Ｒ^１およびＲ^２は、共に、式 Ｘ−Ｒ^Ａ−Ｒ^Ｂ− で示される基を形成し、 ここで、Ｘは、Ｈ、または１−３個のペプチド基であり、 Ｒ^Ａは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｃｐｃ（１−アミノシクロペンタンカルボ
   ン酸）、Ａｌａ、Ｍｅ^２Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ｂｅｔ、Ｇｌｕ（ＮＨ_２）、Ｇｌｙ、
   Ａｓｐ（ＮＨ_２）およびＳｕｃから適切に選択され； Ｒ^Ｂは、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｌａ、Ｏｒｎ、Ｓｅｒ（Ａｃ）、Ｓａｒ、Ｄ−Ａｒ
   ｇおよびＤ−Ｌｙｓから適切に選択され； Ｒ^３は、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａ
   ｉｂ、Ａｃｐｃ、ＬｙｓおよびＴｙｒからなる群から選択され； Ｒ^４は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ（ＰＯ_３）_２、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、ｈｏｍｏＳｅｒおよび
   ａｚａＴｙｒからなる群から選択され； Ｒ^５は、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕ、ＶａｌおよびＧｌｙからなる
   群から選択され； Ｒ^６は、Ｈｉｓ、Ａｒｇまたは６−ＮＨ_２−Ｐｈｅであり； Ｒ^７は、ＰｒｏまたはＡｌａであり；および Ｒ^８は、Ｐｈｅ、Ｐｈｅ（Ｂｒ）、ＩｌｅおよびＴｙｒからなる群から選択され
   、末端Ｔｙｒ基のようにＲ^４を含む配列を除外し、 およびただし活性剤はＡＩＩではない］ で示される配列のＲ^１−Ｒ^８基の少なくとも３つ連続したアミノ酸からなる配列
   を含む、少なくとも１つの活性剤の、上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を
   促進させるに有効な量；および （ｂ）上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を促進させるに有効な量の活性剤
   を使用するための説明書を含む、上記キット。
10. 【請求項１０】 活性剤は、アンギオテンシノーゲン、配列番号２、配列番
    号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番
    号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１
    ６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１
    、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、
    配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配
    列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列
    番号３７、配列番号３８および配列番号３９からなる群から選択される、請求項
    ９のキット。
11. 【請求項１１】 活性剤は、配列番号４、配列番号３１、配列番号３８およ
    び配列番号３９からなる群から選択される、請求項９のキット。
12. 【請求項１２】 活性剤の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌないし約１０．０ｍ
    ｇ／ｍｌである、請求項９のキット。
13. 【請求項１３】 上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を促進させる方法
    であって、以下の一般式： Ｒ１−Ａｒｇ−Ｒ２−Ｔｙｒ−Ｒ３−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｒ４ ［式中、 Ｒ１は、ＨおよびＡｓｐからなる群から選択され； Ｒ２は、ＶａｌおよびＰｒｏからなる群から選択され； Ｒ３は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕおよびＶａｌからなる群から選
    択され； Ｒ４は、Ｉｌｅ、ＰｈｅおよびＨからなる群から選択され；および ここで活性剤はＡＩＩではない］ で示される配列を含む活性剤からなる配列を含む、少なくとも１つの活性剤の、
    増殖を促進させるに有効な量と、上皮幹細胞またはケラチノサイトを接触させる
    ことを含む上記方法。
14. 【請求項１４】 活性剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号１３、配列
    番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３４および配
    列番号３８からなる群から選択される、請求項１３の方法。
15. 【請求項１５】 活性剤の濃度は、約０．１ｎｇ／ｋｇないし約１０．０ｍ
    ｇ／ｋｇである、請求項１３の方法。
16. 【請求項１６】 上皮幹細胞またはケラチノサイト細胞の増殖促進のための
    改良細胞培養培地であって、以下の一般式： Ｒ１−Ａｒｇ−Ｒ２−Ｔｙｒ−Ｒ３−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｒ４ ［式中、 Ｒ１は、ＨおよびＡｓｐからなる群から選択され； Ｒ２は、ＶａｌおよびＰｒｏからなる群から選択され； Ｒ３は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕおよびＶａｌからなる群から選
    択され； Ｒ４は、Ｉｌｅ、ＰｈｅおよびＨからなる群から選択され；および ここで活性剤はＡＩＩではない］ で示される配列を含む活性剤からなる配列を含む、少なくとも１つの活性剤の、
    上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を増加させるに有効な量を、細胞培養培
    地に添加することを含む上記改良細胞培養培地。
17. 【請求項１７】 活性剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号１３、配列
    番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３４、および
    配列番号３８からなる群から選択される、請求項１６の改良細胞培養培地。
18. 【請求項１８】 活性剤の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌないし約１０．０ｍ
    ｇ／ｍｌである、請求項１６の改良細胞培養培地。
19. 【請求項１９】 上皮幹細胞およびケラチノサイトの増殖を促進させるキッ
    トであって、 （ａ）一般式Ｉ Ｒ１−Ａｒｇ−Ｒ２−Ｔｙｒ−Ｒ３−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｒ４ ［式中、 Ｒ１は、ＨおよびＡｓｐからなる群から選択され； Ｒ２は、ＶａｌおよびＰｒｏからなる群から選択され； Ｒ３は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ｎｏｒＬｅｕおよびＶａｌからなる群から選
    択され； Ｒ４は、Ｉｌｅ、ＰｈｅおよびＨからなる群から選択され；および ここで活性剤はＡＩＩではない］ で示される配列を含む活性剤からなる配列を含む、少なくとも１つの活性剤の、
    上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を促進させるに有効な量；および （ｂ）上皮幹細胞またはケラチノサイトの増殖を促進させるに有効な量の活性剤
    を使用するための説明書を含む、上記キット。
20. 【請求項２０】 活性剤は、配列番号２、配列番号４、配列番号１３、配列
    番号１８、配列番号１９、配列番号２６、配列番号３１、配列番号３４、および
    配列番号３８から選択される、請求項１９のキット。
21. 【請求項２１】 活性剤の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌないし約１０．０ｍ
    ｇ／ｍｌである、請求項１９のキット。