CN103087985A - 诱导间充质干细胞定向分化为心肌细胞的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种将人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)扩增后体外定向诱导分化为心肌细胞的方法。本发明利用MSCs的生物学特性，采用密度梯度离心法分离富集人MSCs，利用干细胞的自我更新和增殖特性对干细胞进行扩增获得大量干细胞。分离出的干细胞在特定培养代数(第3-7代，第10代细胞)，以特定小分子嘧啶化合物，特定浓度(100μM)进行诱导。所述分离出的干细胞的体外诱导定向分化的方案的另一个特征是使用bFGF促进细胞增殖及心肌细胞表型表达。本发明可为心肌细胞损伤后提供补充来源，为干细胞移植替代临床治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基础，具有很好的临床应用前景。

Description

诱导间充质干细胞定向分化为心肌细胞的方法

技术领域

本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞的生物学特性，分离扩增成人骨髓间充质干细胞，加入特定浓度的小分子有机化合物MS-818，体外定向诱导分化为心肌细胞的方法。

背景技术

冠心病心肌梗死及心力衰竭是严重影响人民生活质量和寿命的主要疾病之一。研究资料显示，成熟的心肌细胞缺乏再生能力，心肌梗死(MI)发生后，梗死区心肌只能通过纤维组织增生，由无收缩功能的疤痕组织代替，导致心功能下降。临床上缺乏针对梗死心肌再生、重建的根本性治疗方法，而细胞替代治疗应运而生成为一个理想的治疗策略。骨髓间充质干细胞(Mesenchymai stem cells，MSCs)，是在骨髓中的一种类似成纤维细胞的一类细胞，具有多方向分化潜能，可以向骨组织、软骨组织、皮肤、造血干细胞支持介质、骨骼肌细胞及心肌细胞转化。自体骨髓间充质干细胞还具有取材方便、无免疫原性、具有多向分化潜能、合乎伦理学要求并且无致瘤性，具有其它干细胞不可比拟的优势，因此，探讨hMSCs体外大量扩增及向心肌细胞诱导分化条件将对损伤心肌的修复治疗具有深远意义。在研究MSCs向心肌细胞分化诱导中，目前主要使用化学诱导剂5-氮胞苷(5-azacytidine，5-AZA)。5-AZA是胞苷的类似物，它可以与DNA共价结合形成复合物从而导致DNA甲基在细胞分裂周期中进行性丢失，发挥去甲基化作用，启动MyoD等某些相关等位基因的表达。国外有学者将成年小鼠骨髓基质细胞经5-氮胞苷诱导后，能产生自主收缩的肌管结构的细胞团，显微镜下结构类似胚胎心肌细胞。但细胞经过5-AZA处理后可导致细胞部分脱壁，降解、或胞浆内形成脂肪空泡，说明5-AZA作为一种诱导剂对细胞也有一定毒性。

MS-818是一种嘧啶化合物，化学式为：C₁₁H₁₅N₅O·C₄H₄O₄，分子量为339，其结构式如下：

R：CH₃

在2002年日本学者Sugiyama等曾发现MS-818可使手术切割后的成年大鼠肌肉的再生加速，促进肌肉恢复(Noriyuki Sugiyama et al，Nerve 25(2)218-229，2002)。但目前MS-818诱导人间充质干细胞(hMSCs)向心肌细胞定向分化的研究尚未见报道。在本发明中我们将hMSCs体外分离、扩增后，加入MS-818，探索骨髓间质干细胞在体外转化为心肌细胞的过程及方法，为MSCs体外扩增后自体回输治疗心肌梗塞提供实验依据。

发明内容

本发明涉及一种利用骨髓间充质干细胞的生物学特性，分离扩增成人骨髓间充质干细胞，加入小分子嘧啶化合物诱导剂MS-818，体外定向诱导分化为心肌样细胞的方法。

本发明的目的是提供一种将人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)扩增后体外定向诱导分化为心肌细胞的方法。为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：利用MSCs的生物学特性，采用密度梯度离心法分离富集人MSCs，利用干细胞的自我更新和增殖特性对干细胞进行扩增获得大量干细胞。分离出的干细胞在特定培养代数(第3-7，10代细胞)，以特定小分子嘧啶化合物MS-818，特定浓度(100μM)进行诱导。分离出的干细胞的体外诱导定向分化方案的另一个特征是使用bFGF促进细胞增殖及心肌细胞表型表达。

本发明可为心肌细胞损伤后提供补充来源，为干细胞移植替代临床治疗心肌梗死及晚期心功能不全等奠定了基础，具有很好的临床应用前景。

附图说明

图1为MS-818诱导组和5-AZA诱导组培养间充质干细胞经a-actin单克隆抗体免疫染色照片(25x)。其中，A.MS-818诱导组；B.5-AZA诱导组。图1实验结果表明：MS-818和5-AZA诱导组均有a-actin抗原表达，证明诱导后有横纹肌细胞存在。

具体实施方式

实施例1、MS-818(2-呱啶-6-甲基-5-氧-5，6-二氢(7H)-吡咯[3，4-d]嘧啶马来酸)的制备

在2.25g(6mmol)乙烯-4-氯甲基-2-(4-苄基哌嗪)嘧啶-5-羧酸酯的乙醇溶液(10ml)中，在20℃滴加NH₄OH溶液(10ml，59mmol)，搅拌12小时。该混合物倒入NaHCO₃水溶液，用CHCl₃抽提。抽提物进行旋转蒸发，从甲苯中重结晶，产生浅褐色结晶(0.70g，产量：38％)。上述结晶(0.7g，2.3mmol)与在AcOH(13ml)中的10％Pd-C(0.07g)的悬浮液，在氢气中搅拌一小时。过滤得到结晶，对过滤物进行旋转蒸发。用NaHCO₃水溶液对残留物进行碱化，然后用甲苯抽提。抽提物用MgSO₄干燥，蒸发产生0.3g(产量：66％)浅褐色油。

实施例2、骨髓间充质干细胞的分离、纯化及原代、传代培养

无菌条件下抽取健康志愿者骼骨骨髓，加入DMEM/F12(1∶1)培养液中充分混合，离心弃上清及脂肪层，加入完全培养基充分混匀后，将骨髓液轻轻叠加到密度1.0739/ml的Percoll分离液上，900g离心30分钟(室温下)，取白细胞膜层以上的部分，加入含10％胎牛血清的DMEM/F12培养液(预先加入青-链霉素100u/ug.ml^-1)中充分混匀，离心洗涤备用，将分离的细胞按2 x 10⁵/m²的浓度接种于50ml塑料培养瓶中，置于37℃，5％CO₂和饱和湿度的孵箱中进行培养，48h后更换培养液，弃掉未贴壁细胞，以后每2-3天换液一次。细胞长到80％融合时用0.25％的胰蛋白酶消化传代，细巴斯德吸管吹打成单细胞悬液后以1 x 10⁵/ml种植于新培养液中，每2～3天换液一次。

实施例3、骨髓间充质干细胞定向诱导分化成心肌细胞

取分离培养3代后人MSCs，用0.25％胰蛋白酶消化，PBS清洗后，以2 x 10⁵/cm²的密度接种于24孔塑料培养板中，在完全培养基中加入30uM、50uM、100uM的MS-818，诱导分化24小时后，吸弃培养液，PBS清洗两次，继续用完全培养基培养，2～3天换液一次，细胞长到80％融合时用0.25％的胰蛋白酶消化传代。对诱导后14、21天的细胞爬片进行固定，免疫荧光染色观察desmin、心肌早期转录因子GATA4，心肌特异性cTnI及闰盘蛋白connexin43的表达。7.5 x 10⁵个MSCs，经扩增12代后可获得(5.8±0.48) x 10⁹个细胞，扩增约(7.7±0.39)x 10⁴倍；50、100uM的MS-818进行诱导后细胞体积增大，诱导后14天时20～30％细胞融合形成多核肌管样结构，30uM组MSCs未出现肌管结构，诱导后21天50、100uM组人MSCs中a-actin、desmin及心肌早期转录因子GATA4表达强阳性(图1)、心肌特异性cTnl、及闰盘蛋白connexin43的表达弱阳性，cThl阳性染色细胞率100uM诱导组高于50uM讥诱导组(P＜0.05)；30uM诱导组及阴性对照组心肌特异性蛋白的表达阴性。

分别取原代培养72h细胞、体外扩增第3、7、10代MSCs，以5.0 x 10⁴/cm³浓度接种于放置有消毒盖玻片的六孔板内，制备细胞爬片，每孔加2ml完全培养液(DMEM/F12+10％FBS)，达到60～70％融合时，bFGF(50ng/ml)预处理24h后，换MS-818(终浓度为100uM)诱导24h，PBS洗涤，更换为含有bFGF(1ng/ml)的完全培养基，之后每三天更换培养液，并每天在显微镜下观察细胞形态变化。诱导后20天的细胞爬片，进行肌钙蛋白I(troponinI)和结蛋白(desmin)的免疫组化鉴定。第3、7、10代人MSCs经MS-818与bFGF诱导可定向分化为心肌细胞，表达troponinI和desmin；RT-PCR显示：诱导后细胞心肌特异因子基因β-肌浆蛋白重链(β-MHC)为阳性表达，其中第7代MSCs的β-MHC的表达较第3、10代高。

Claims (5)

1.一种分离扩增培养成年人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)的方法，其特征在于利用干细胞生理特性，采用DMEM/F12+10％胎牛血清作为基本培养基，通过及时、反复传代对人MSCs进行纯化和扩增培养，从而获得大量高纯度MSCs。

2.根据权利要求1分离扩增得到的细胞，在体外进行定向诱导分化成心肌细胞的方案，其特征在于以特定的小分子有机化合物，特定浓度及特定培养代数在有血清条件下进行定向诱导。

3.根据权利要求2所述的小分子有机化合物是MS-818(2-呱啶-6-甲基-5-氧-5，6-二氢(7H)-吡咯[3，4-d]嘧啶马来酸)。

4.根据权利要求2所述的小分子有机化合物MS-818诱导心肌细胞产生的最佳浓度是100μM。

5.根据权利要求2所述的MSCs的培养代数为第3-7代细胞及第10代细胞，在有血清条件下进行心肌细胞定向诱导。

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