CN107873696A - 一种熊科动物红细胞保存液及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种熊科动物红细胞保存液，包括：NaCl、NaH₂PO₄、ATP、葡萄糖、甘露醇、谷胱甘肽。本发明针对大熊猫血液生理特点，配制四种红细胞保存液，对不同时间点保存液上清游离血红蛋白检测发现：第10天，B3保存液与其他组有差异显著；第20天，B2、B3与其他两组有差异显著；第30天，B2、B3与其他两组有显著性差异。以上结果表明，B3保存液是最佳保存体系。采用ATP检测及2,3‑DPG检测验证B3的保存效果，结果显示B3组ATP及2,3‑DPG含量与B1组有显著性差异，表明B3保存液对大熊猫红细胞保养效果更好。本发明的保存液可有效保存熊科动物红细胞达30天，可用于熊科动物临床红细胞输注。

Description

一种熊科动物红细胞保存液及其应用

技术领域

本发明涉及血液保存技术领域，具体公开了一种熊科动物红细胞保存液及其应用。

背景技术

熊猫输血是大熊猫兽医临床中急需的重要技术手段，由于缺乏相应研究，导致大熊猫血液成分及其替代血源亚洲黑熊的血液成分无法较长期在体外保存，阻碍了大熊猫红细胞输注在大熊猫疾病治疗和野外救治中的应用。如何在比较长时间段保存大熊猫红细胞，使得分散在全球的大熊猫都可以在需要的情况下，使用安全高质量的红细胞输注治疗，是一个急需解决的问题。

人类红细胞寿命大约为120天，受损或衰老的红细胞的膜脆性增加，致使抗原暴露，暴露的抗原与自身IgG结合，最终被巨噬细胞吞噬；另外，红细胞老化致使表面CD47含量下降，也会导致红细胞被吞噬；由于老化红细胞易被吞噬清除，故而对于如何更好的保存红细胞以满足输血治疗的目的，是输血医学中一直不断探索的问题。

红细胞输注的目的是输送具有正常生物功能的红细胞进入受血者体内，减轻或治疗受血者因缺乏红细胞或缺乏具有正常生物功能的红细胞造成的症状。日常输血中最常用的红细胞体外保存方法是4℃保存，不同的配方及添加剂决定了红细胞保存时间的长短。由于红细胞在保存期间持续代谢，所以红细胞4℃体外保存只能起到短时体外保存的作用。临床上对体外保存后的红细胞输注效果的评判标准是输注后24h输注的红细胞成活率应高于70％(Pittiglio DH，1983)，而实验中评价红细胞保存效果最常用的是游离血红蛋白/溶血率、ATP和2,3-DPG三类指标(Pittiglio DH，1983；Hess JR，2002)。

游离血红蛋白/溶血率作为通过肉眼可以观察到的最直观的指标，是一个红细胞保存体系好坏的直接评价。体外保存红细胞发生溶血后，输血过程中大量游离血红蛋白进入机体，会诱发黄疸，还导致脑部缺氧，过多的血红蛋白代谢还会导致肾脏疾病(HeatonWA，1992；CF，1999)。ATP是红细胞保持正常生理功能的基础。1983年Pittiglio发现，红细胞内ATP含量与输注后24h红细胞成活率有直接关系(Pittiglio DH，1983)。随着红细胞保存时间的延长，红细胞内的2,3-DPG含量下降，致使红细胞携氧能力下降，故2,3-DPG是红细胞保存又一衡量指标(Hess JR，2002)。

中国专利201410501658.0公开了一种红细胞保存液，包括蒸馏水、氯化钠、枸橼酸钠、氯化氨、磷酸氢二钠、葡萄糖、甘露醇、腺嘌呤、氯霉素、叠氮钠、氨基酸，其重量比为：蒸馏水：枸橼酸钠：氯化氨：磷酸氢二钠：葡萄糖：甘露醇：腺嘌呤：氯霉素：叠氮钠：氨基酸：氯化钠＝100：2-3∶0.5-1：0.1-0.2：4-5：1-2∶0.1-0.2：0.15-0.2∶0.001-0.0025：1-2：2-3，该保存液来可延长红细胞保存期。中国专利201510396952.4公开了一种红细胞保存液，所述红细胞保存液的组成和含量如下：腺嘌呤0.3-0.5g/L，葡萄糖25-35g/L，柠檬酸钠6-10g/L，肌苷0.2-0.4g/L，氯霉素0.2-0.3g/L，硫酸新霉素0.08-0.12g/L，氯化钠2.5-3.5g/L，磷酸二氢钠0.04-0.06g/L，该保存液能够使红细胞的保存期限达到十四周，在保存期的内红细胞悬液有较高的抗原效价。现有技术红细胞保存液研究在人上进行的较多，而对于熊科动物红细胞保存液研究较少。在人红细胞保存研究中使用过的保存液有ACD保存液、CPD-A保存液等，发明人在前期预实验中发现，使用人类红细胞保存液对大熊猫保存效果不佳，人类红细胞保存液并不适合大熊猫红细胞保存。其原因经推测可能是，由于大熊猫红细胞脆性及血浆中Na⁺离子含量与人类不同，大熊猫红细胞对人类红细胞保存液耐受性较差。因此针对熊科动物血液生理特点，有必要研发一种熊科动物红细胞保存液，而关于本发明的熊科动物红细胞保存液，目前还未见报道。

发明内容

本发明的第一个目的是针对现有技术中的不足，提供一种熊科动物红细胞保存液。

本发明的第二个目的是针对现有技术中的不足，提供一种熊科动物红细胞体外保存的方法。

为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：

一种熊科动物红细胞保存液，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

作为本发明的一个优选实施方案，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

作为本发明的一个优选实施方案，所述熊科动物红细胞来源为健康大熊猫抗凝血，所述大熊猫红细胞体外有效保存时间不少于30天。

为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：

一种熊科动物红细胞体外保存的方法，所述方法包括采用如上所述的保存液对熊科动物红细胞进行体外保存的步骤。

作为本发明的一个优选实施方案，所述熊科动物红细胞来源为健康大熊猫抗凝血，所述大熊猫红细胞体外有效保存时间不少于30天。

本发明优点在于：

由于大熊猫红细胞脆性及血浆中Na+离子含量与人类不同，导致其对人类红细胞保存液耐受性较差。本发明针对大熊猫血液生理特点，选择钠盐作为主要晶体渗透压的来源，并使用葡萄糖作为主要能量来源，配制四种红细胞保存液(B1-B4保存液)。通过不同时间点对保存液上清游离血红蛋白检测发现：第10天时，B3保存液与其他组有差异显著(P<0.01)；第20天时，B2(P<0.05)、B3(P<0.01)与其他两组有差异显著；第30天时，B2(P<0.05)、B3(P<0.01)与其他两组有显著性差异。以上实验结果表明，B3保存液是最佳保存体系。采用ATP检测及2,3-DPG检测评价B3保存液的保存效果，结果显示B3组ATP及2,3-DPG含量与B1组有显著性差异，表明B3保存液对大熊猫红细胞保养效果更好。本发明的红细胞保存液可有效保存熊科动物红细胞达30天，可用于熊科动物临床红细胞输注。

附图说明

附图1为大熊猫红细胞脆性区间图。图中人类参考值(图中红色柱形部分)：开始溶血(0.42％-0.46％)氯化钠溶液；完全溶血:(0.32％-0.34％)氯化钠溶液(n＝6)。

附图2为大熊猫新鲜及衰老红细胞显微镜观察。大熊猫新鲜红细胞及4℃放置20天后的红细胞扫描电镜及100×光学显微镜照片。A、B为新鲜红细胞；C、D为放置20天细胞。

附图3为B3大熊猫红细胞保存液保存红细胞效果100×光学显微镜观察。A、B、C、D分别为第0、10、20、30天。

附图4为大熊猫红细胞保存液保存红细胞第30天外观。A、B、C、D分别为B1、B2、B3、B4保存液保存大熊猫红细胞。

附图5为人、大熊猫红细胞在人类红细胞体外保存液10天保存效果。取样方法为：保养混匀后，静置，并吸取上清，并对上清离心。A、B为人红细胞在ACD、CPD-A中保存效果；C、D为大熊猫在ACD、CPD-A中保存效果。

附图6为大熊猫红细胞保存体系游离血红蛋白测定(n＝6；*：P<0.05；**：P<0.01)。

附图7为大熊猫红细胞保存液B3保养效果评价。A：ATP含量测定10天、20天、30天；B：2，3-DPG含量测定10天、20天、30天(n＝6；*：P<0.05；**：P<0.01)。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1保存液配制及大熊猫细胞状态评定实验

血浆渗透压是红细胞生存的内环境。正常情况下，红细胞与血浆处于基本渗透压平衡状态。当血浆渗透压发生变化时，会造成血细胞生存环境恶化、功能受限甚至死亡。为了合理配置熊科动物红细胞保存液，我们首先针对大熊猫血浆渗透压进行了测定。

由于本实验针对的是健康大熊猫红细胞生理脆性的研究，且大熊猫血液样本有限，参考人类犬类在无意义区间选择了较大的渗透脆性梯度，在人类及犬类有意义的脆性区间，我们将梯度缩小一半，故选择了0.10％、0.20％、0.30％、0.40％、0.45％、0.50％、0.55％、0.60％、0.65％、0.70％、0.80％、0.90％的盐水梯度。需要说明的是，由于大熊猫血样稀少，单只大熊猫的红细胞无法满足脆性实验。为了实验结果的可靠性，我们采用6只雄性大熊猫、6只雌性大熊猫及6只亚成体大熊猫的红细胞分三组混合后进行实验。具体操作如下：

1)大熊猫红细胞使用冷PBS清洗三次，每次清洗后3500rpm，离心3min弃去上清，备用，

2)按照每种盐水梯度每管500μL，分装至1.5mL EP管中，将洗好的大熊猫红细胞压积按照每管20μL加入已加好盐水梯度溶液的EP管中，每样品做3个复管，

4)4℃放置2h，期间每30min对EP管轻柔颠倒混匀，保证所有的细胞与梯度盐水的接触，

5)5000rpm，4℃，离心5min，取上清200μL到透明板中，

6)使用化学发光仪吸光度(absorbance)，540nm吸收波长下进行检测。

大熊猫红细胞脆性区间

在使用盐水浓度梯度对大熊猫红细胞脆性区间进行实验后，根据离心后上清中游离血红蛋白的吸光度衡量溶血程度制图，由图1可以清楚发现，大熊猫完全溶血的区间大约在3.5％-4％盐水区间，开始溶血范围在4％-5％盐水区间，通过与人类比较可以发现，其红细胞对低渗溶液的耐受能力较差。

大熊猫血浆生理pH值和渗透压测定

使用血气仪对大熊猫血液进行pH值测定、使用露点渗透压对大熊猫血浆渗透压进行测定后发现，大熊猫血浆渗透压及pH值相对比较恒定，变化不大。

表1大熊猫血浆生理pH值、渗透压

注：pH值(n＝16)；血浆渗透压(n＝10)

大熊猫新鲜红细胞与4℃存放30天红细胞形态学观察

为了从形态学上衡量大熊猫红细胞保养效果，我们首先通过新鲜大熊猫红细胞与放置20天大熊猫全血中的红细胞进行了显微镜观察，如图2所示，新鲜红细胞表面光滑，而放置20天后大熊猫红细胞明显有出脊。

实施例2大熊猫红细胞保存实验

大熊猫红细胞保存液配制：

2×母液配方

本实验中对大熊猫红细胞脆性的研究发现，大熊猫红细胞较人类红细胞对渗透压更为敏感，故本实验中通过人类血浆渗透压与大熊猫渗透压比较后，通过浓度稀释比控制，配置渗透压不同的红细胞保存溶液，将渗透压分别调整为235(1:0.85/H2O：母液)、245(1:0.92)、255(1:1)、265(1:1.1)四种。标为B1、B2、B3、B4四种保存液。

大熊红细胞体外保养液体外保养大熊猫红细胞30天外观、细胞形态学观察

从对比新鲜和衰老大熊猫红细胞我们可以发现使用100×光学显微镜即可判断大熊猫红细胞状态，故在我们对大熊猫红细胞体外保存液体外保存0天、10天、20天、30天进行形态学观察，观察发现细胞外部形态保持良好，细胞呈现扁平双凹圆盘状，说明保存液对大熊猫红细胞体外保存效果良好。图3以B3体外保存液为例。

大熊猫红细胞体外保存液B1、B2、B3、B4四组溶液30天外观观察(图4)，可以发现B1、B4上清略发红，这是由于细胞破裂后游离血红蛋白释放导致的，B2略淡，B3最淡，说明B2、B3组大熊猫红细胞溶血程度较小。从外观上观察，大熊红细胞体外保存液B3对大熊猫红细胞体外保存效果最好。(由于大熊猫红细胞有限，B4按比例混合好后，按照1.5mL/管进行分装，其余按照3mL/管进行分装)。

而在预实验中使用人类红细胞保存液对大熊猫保存效果不佳(图5)，与上述保存液存在明显差异。

实施例3大熊猫红细胞保存溶液保存30天游离血红蛋白检测

由于外观我们已经发现大熊猫红细胞保存液B3对大熊猫红细胞保存效果最好，为了验证这一结论，我们对保养上清中的游离血红蛋白含量进行了分析，结果如图6所示，发现在10天、20天、30天时，B3保养液保养组与其他组有极显著差异(P<0.01)。进一步说明了大熊猫红细胞保存液B3，是这四组中的最佳方案。

实施例4B3大熊猫红细胞液保养评价(ATP、2,3-DPG测定)

ATP与2,3-DPG含量是评价红细胞保氧的重要指标，为了验证大熊猫红细胞保存液B3对大熊猫红细胞保存效果，我们对ATP及2,3-DPG含量进行了检测，结果如图7所示，通过与保养效果较差的B1组的比较，我们发现在10天、20天时B1组与B3组ATP含量差异极显著，30天时差异显著。10天、30天时2,3-DPG含量差异显著(P<0.05)，20天时差异极显著(P<0.01)。

效果评价

实验中，我们使用人类红细胞保存液对大熊猫红细胞保存后发现，保存效果不佳(图5)，说明人类红细胞保存液并不适合大熊猫红细胞保存。其原因经推测可能是，由于大熊猫红细胞脆性及血浆中Na⁺离子含量与人类不同，大熊猫红细胞对人类红细胞保存液耐受性较差。根据大熊猫血浆离子浓度及渗透压范围并参考了文献中人类、犬类的保存液配方，配制了大熊猫红细胞保存液(1213液)。通过不同时间点对保存液上清游离血红蛋白检测发现：第10天时，B3保存液与其他有差异显著(P<0.01)；第20天时，B2(P<0.05)、B3(P<0.01)与其他两组有差异显著；第30天时，B2(P<0.05)、B3(P<0.01)与其他两组有显著性差异(图6)。以上实验结果显示，B3保存液是这几组中的最佳保存体系，故我们将B3选为大熊猫1213保养液。为了评价B3大熊猫红细胞保存液(1213液)保存效果，进行ATP检测及2,3-DPG检测，与溶血程度比较严重的B1相比，10天、30天差异显著(P<0.05)20天差异极显著(P<0.01)，也说明了大熊猫红细胞体外保养液B3对红细胞保养效果良好(图7)。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种熊科动物红细胞保存液，其特征在于，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

2.根据权利要求1所述熊科动物红细胞保存液，其特征在于，所述红细胞保存液的组成和含量如下：

3.一种熊科动物红细胞体外保存的方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1或2所述的保存液对熊科动物红细胞进行体外保存的步骤。

4.根据权利要求1-2所述熊科动物红细胞保存液、权利要求3所述的方法，其特征在于，所述熊科动物红细胞来源为健康大熊猫抗凝血，所述大熊猫红细胞体外有效保存时间不少于30天。