JPH0834744A - 新規な骨芽細胞増殖因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構 成】 本発明は、神経栄養因子３を有効成分
とする骨代謝性疾患の予防および治療剤に関する。 【効 果】 本剤は骨芽細胞の増殖およびカルシウ
ムの取り込みを促進するので、骨折などの骨の分化増殖
の促進を必要とする疾患の予防および治療に有効であ
る。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト神経栄養因子３か
らなる骨代謝疾患の予防および治療剤に関する。さらに
詳しくは、本発明は上記ヒト神経栄養因子３を新規な骨
芽細胞増殖因子として利用することにより骨形成に関わ
る疾患、特に骨折の予防および治療剤に関する。

【０００２】

【発明の背景】骨は局所で骨吸収と骨形成を繰り返し、
古い骨を新しい骨に置換することで内骨格としての支持
機能を維持し、また種々のメカニカルストレスやミネラ
ルバランスの変化に対し、迅速に反応する準備を整えて
いる。この骨再造形は破骨細胞等の骨吸収系細胞、骨芽
細胞等の骨形成系細胞が主体となり、両者のカップリン
グに基づいて遂行される。近年、骨芽細胞の機能は、単
に骨形成に止まらず、破骨細胞の分化・活性化に密接に
関連し、細胞連鎖的な骨改造現象におけるコントロール
センターとしてその役割を果している可能性が強いこと
が判明してきている（Ｉｎｏｕｅ，Ｔ．，Ｍｅｂｉｏ
（１９９０），Ｓｐｅｃｉａｌ Ｖｅｒｓｉｏｎ ｐ．
２〜７）。

【０００３】骨代謝疾患と総称される疾患の中には，骨
粗鬆症（Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）、ページェット病
（Ｐａｇｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、骨軟化症、過骨
形成症、大理石病等が含まれ、このうち、特に骨粗鬆症
は発生頻度が閉経後の女性および老齢人口の約半分を越
える程に高く、その診断と有効な治療法が強く望まれて
いる。

【０００４】骨代謝疾患とは、何らかの骨組織におけ
る、細胞レベルでの、骨に特異的な代謝の変調を伴うも
のであり、骨の代謝に特異的に関与する因子の発見、分
離そして同定は、この代謝の異常を明らかにするのに非
常に有効である。本発明者等は、これらの骨の代謝に特
異的な因子の発見のために鋭意研究し、ついに、本発明
を完成させるに至ったものである。より詳しくは、本発
明者等は、特に、骨形成において主要な働きをする骨芽
細胞の細胞株を用い、この細胞株により生成されるタン
パク質を同定したものである。

【０００５】

【従来の技術】本発明で提供されるヒト神経栄養因子−
３（ヒトニューロトロフィン３、以下ＮＴ−３と称す
る。）はＨｏｈｎ，Ａ．等およびＭａｉｓｏｎｐｉｅｒ
ｒｅ，Ｐ．Ｃ．等によって発見された（Ｈｏｈｎ，Ａ．
ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３４４，ｐ．３
３９−３４１，１９９０およびＭａｉｓｏｎｐｉｅｒｒ
ｅ，Ｐ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｖｏｌ．
２４７，ｐ．１４４６−１４５１，１９９０）タンパク
質であり、これは神経成長を促進する作用を有する。Ｎ
Ｔ−３は、Ｎ末端にＴｙｒをＣ末端にＴｈｒを有する１
１９個のアミノ酸のサブユニットのダイマーからなるタ
ンパク質であり、そのアミノ酸配列は先の文献に示され
ている。またＮＴ−３はペプロテック（株）（Ｒｏｃｋ
ｙ Ｈｉｌｌ，ＮＨ ０８５３３，ＵＳＡ）より市販さ
れている（カタログ番号４５０−０３）。先に挙げた文
献にはＮＴ−３をコードする遺伝子が記載されており、
この記載に基づいて、ＮＴ−３を製造することができ
る。ＮＴ−３が属する神経成長因子ファミリーは現在、
４種類が知られており、ＮＴ−３の他に、神経成長因子
（以下ＮＧＦと呼ぶ）、脳由来神経栄養因子（以下ＢＤ
ＮＦと呼ぶ）、および、ヒト神経栄養因子−４（ヒトニ
ューロトロフィン４）がある。これらの機能としては、
ＢＤＮＦは海馬の培養系において、アセチルコリンエス
テラーゼ陽性のニューロン数を増やすこと、およびＮＴ
−３はカルシウム結合蛋白（カルビニン）陽性のニュー
ロン数を増やすこと等が知られている（Ｉｐ，Ｎ．Ｙ．
ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ ｖｏｌ．１３，
ｐ．３３９４−３４０５，１９９３）。さらに、ＮＴ−
３は神経堤の前駆細胞の増殖を増加することが報告され
ている（Ｋａｌｃｈｅｉｍ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，ｖｏｌ．
８９，ｐ．１６６１−１６６５，１９９２）。

【０００６】一方、神経成長因子の受容体（レセプタ
ー）はｔｒｋファミリーであり、これまでｔｒｋＡ、ｔ
ｒｋＢ、ｔｒｋＣの３種類が知られている（Ｓｎｉｄｅ
ｒ，Ｗ．Ｄ．Ｃｅｌｌ．ｖｏｌ．７７，ｐ．６２７−６
３８，１９９４）。それぞれＮＧＦはｔｒｋＡに結合
し、ＢＤＮＦはｔｒｋＢに結合し、ＮＴ−３はｔｒｋＣ
に特異的に結合することが知られている。ｔｒｋは結腸
癌由来のプロトオンコジーンであり、Ｃ末端側半分のチ
ロシンキナーゼドメインを含む、チロシンキナーゼ型受
容体構造を有する。また、このチロシンキナーゼドメイ
ンのアミノ酸配列は他のレセプタータイプのチロシンキ
ナーゼと相同性が高い。このチロシンキナーゼの活性と
しては、例えば、ＮＧＦの受容体であるｔｒｋＡはＮＧ
Ｆに応答してチロシンリン酸化を受け、それ自身チロシ
ンキナーゼ活性を示す。このチロシンキナーゼによっ
て、ＭＡＰ２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｌｅ−ａｓｓｏｃｉａ
ｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ２，Ｂｏｕｌｔｏｎ，Ｔ．Ｇ．
ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ ｖｏｌ．６５，ｐ．６６３−６
７５，１９９１）やホスファリパーゼＣがチロシンリン
酸化を受け、その結果カルシウムイオンの流入がおき
る。このようなシグナル伝達系によって細胞の増殖シグ
ナルが伝わる（池内俊彦ら、実験医学ｖｏｌ．１０，
ｐ．１２６−１３１，１９９２）。このようにｔｒｋＣ
のようなチロシンキナーゼ型レセプターはリガンドが結
合することによりチロシンキナーゼが活性化されシグナ
ル伝達が開始される。リガンドとレセプターの結合によ
って活性化されるＣａ^２＋チャネルはレセプター作動性
Ｃａ^２＋チャネルと呼ばれており、リンパ球、平滑筋な
どの種々の細胞で調べられている（久野みゆき、実験医
学、ｖｏｌ．７，ｐ．７３−７８，１９８９）。

【０００７】従来、マウス骨芽細胞様細胞株ＭＣ３Ｔ３
−Ｅ１がＮＴ−３のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
を発現していること、また、そのｍＲＮＡの量はＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１細胞をＴＧＦ−βで処理することにより優位
に増強することが知られていた（中西徹ら，Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．Ｖｏ
ｌ．１９８，ｐ．８９１−８９７，１９９４）。ＭＣ３
Ｔ３−Ｅ１細胞は、小玉博明ら（Ｊｐｎ．Ｊ．Ｏｒａｌ
Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２３，ｐ．８９９−９０１，１９
８１）が確立した細胞株で、マウスの新生頭蓋冠から樹
立された石灰化能をもつ細胞株である。しかし、未だＮ
Ｔ−３が骨芽細胞増殖因子として働くことは知られてい
なかった。

【０００８】

【問題を解決するための手段】本発明者は、ＰＣＲ（ポ
リメラーゼチェインリアクション）法（ＰＣＲ Ｔｅｃ
ｈ−ｎｏｌｏｇｙ，Ｈｅｎｒｙ Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ，Ｓ
ｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ社，１９８９）によりＭＣ
３Ｔ３−Ｅ１細胞がｔｒｋＣを発現していることを新た
に発見した。これらの発見およびｔｒｋＣがＮＴ−３の
受容体であることに基づいて、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞は
ＮＴ−３を分泌し、ＮＴ−３はオートクリンで増殖する
と結論付けた。更に、本発明者は、ＮＴ−３をＭＣ３Ｔ
３−Ｅ１細胞の培養液中に加えると、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１
細胞を増殖させることおよびＮＴ−３をＭＣ３Ｔ３−Ｅ
１細胞の培養液中に加えると、ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞に
よるカルシウムの取り込みを増加させることを確認し、
ＮＴ−３が骨芽細胞増殖因子として働くと結論付けた。

【０００９】ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞増殖は、セル
プロリフェレーションアッセイキット（アマーシャム
社，ＲＰＮ２０とＲＰＮ２１０）で検出した。ＭＣ３Ｔ
３−Ｅ１細胞を細胞密度 ０５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌで細胞培養用ディッシュまたは９６ウエルプレートに
蒔き、４日間培養後、種々の濃度（０．２〜１００ｎｇ
／ｍｌ）のＮＴ−３（ペプロテック（株），Ｒｏｃｋｙ
Ｈｉｌｌ，ＮＨ ０８５５３，ＵＳＡ，カタログ番号
４５０−０３）を培養系に加えた。添加した翌日、アマ
ーシャム社のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。
その結果、ＮＴ−３がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖を促
すことが明らかになった。さらにカルシウム感受性蛍光
試薬を使った蛍光強度の測定（Ｇｒｙｎｋｉｅｗｉｃ
ｚ，Ｇ．ｅｔａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．
２６０，ｐ．３４４０−３４５０．１９８５）によっ
て、ＮＴ−３がＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞のカルシウムを取
り込みを促進することが検出された。即ち、これらの結
果からＮＴ−３がｔｒｋＣと結合し、オートクリンのメ
カニズムでＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を増殖させていること
が明らかになった。

【００１０】このように、ＮＴ−３が骨芽細胞増殖因子
として作用することを本発明者らは見出し、そして骨芽
細胞増殖因子が骨代謝に重要な因子であることから、本
発明はＮＴ−３からなる骨代謝疾患の予防治療剤、特に
骨折の子防治療剤を提供するものである。本発明の医薬
の投与方法としては、種々の方法を用いることができる
が、静脈内及び筋肉内投与が好ましい。静脈内投与の場
合は通常の静脈内注射の他、点滴静注により投与するこ
ともできる。本発明の医薬の剤型としては、種々の形態
のものを使用することができるが、液剤として使用こと
が好ましい。注射用製剤としては、例えば注射用粉末製
剤とすることができる。その場合は、適当な水溶性賦形
剤、例えばマンニトール、ショ糖、乳糖、マルトース、
ブドウ糖、フルクトース糖の１種又は２種以上を加えて
水で溶解し、バイアル又はアンプルに分注した後、凍結
乾燥し、密封して製剤とすることができる。本発明の医
薬の投与量としては、投与法、患者の年齢、体重、症状
等によって異なるが、通常は成人１日当たり本ペプチド
誘導体として１〜５００ｍｇの範囲が好ましい。以下に
実施例により、本発明を詳述する。なお、本発明はこれ
らの実施例により限定されるものではない。

【００１１】

【実施例】

実施例１ ｔｒｋＣの検出 ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を０．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍ
ｌの細胞密度でシャーレに蒔き、培養を開始した。培養
を初めて２、６、１０、１３、１５、２８日後の細胞を
回収し、その細胞から常法に従いＲＮＡを抽出した。抽
出したＲＮＡ ０．２μｇを用い、ｏｌｉｇｏ ｄ
（Ｔ）存在下リバーストランスクリプターゼ（パーキン
エルマー社の測定キット／宝酒造社）で処理し、一本鎖
ｃＤＮＡを合成した。一本鎖ｃＤＮＡは０．５μＭのｔ
ｒｋｆ（配列表配列番号１、アプライドバイオシステム
ズ社の機械を用いて合成以下同様）とｔｒｋｒ（配列表
配列番号２）のＰＣＲプライマーを用い、通常の条件で
アステックＰＣ８００（（株）アステック）を使用しＤ
ＮＡを増幅し、その増幅した溶液を５０倍に希釈し、更
にｔｒｋｆとｔｒｋｒ２（配列表配列番号３）で増幅し
た。このサンプルをアガロースゲル電気泳動にアプライ
し、３６２ｂｐのＤＮＡフラグメントがｔｒｋＣのバン
ドとして検出された（図１参照）。このバンドをゲルか
ら切り出し、フィルターキット（Ｔａｋａｒａ Ｓｕｐ
ｔｅｃ ０１および０２、宝酒造社）を用いてＤＮＡを
抽出した。次に、ファルマシアシュアークローンキット
を使用しＤＮＡ断片を平滑化、リン酸化を行い、脱リン
酸化したｐＵＣ１８ベクター（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ
ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｙ Ｐｒｅｓ
ｓ社，１９８９）へ挿入した。このプラスミドを大腸菌
ＪＭ１０９株へ形質導入し、コロニーを単離培養後ファ
ルマシアフレキシプレップキットを使用しプラスミドを
抽出した。このプラスミドを用いＤＮＡ塩基配列をジデ
オキシ法（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．７４，
ｐ．５４６３−５４８７，１９７７）により決定した。
今回決定されたマウスのｔｒｋＣの断片（配列表配列番
号４）と現在知られているラットおよびブタのｔｒｋＣ
の断片（Ｍｅｒｌｉｏ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｕ
ｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．５１，ｐ．５１３−５３
２，１９９２およびＬａｍｂａｌｌｅ，Ｆ．ｅｔ ａ
ｌ．，Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．６６，ｐ．９６７−９７９，
１９９１）との相異性を比較するとそれぞれ、異なる核
酸塩基は１９と２９、アミノ酸残基は１と０であった。

【００１２】実施例２ ＮＴ−３によるＭＣ３Ｔ３−Ｅ
１細胞の増殖活性 ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の細胞増殖は、セルプロリフェレ
ーションアッセイキット（アマーシャム社，ＲＰＮ２０
とＲＰＮ２１０）で検出した。ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を
細胞密度 ０．５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌで細胞培養
用ディッシュまたは９６ウエルプレートに蒔き、４日間
培養後、種々の濃度（０．２〜１００ｎｇ／ｍｌ）のＮ
Ｔ−３（ペプロテック（株），Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ，
ＮＨ ０８５５３，ＵＳＡ，カタログ番号 ４５０−０
３）を培養系に加えた。添加した翌日、アマーシャム社
のアッセイキットを用い細胞増殖を調べた。このキット
では、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）が細胞内の
ＤＮＡに取り込まれ、ＢｒｄＵをマウス抗−ＢｒｄＵ抗
体で結合し、２次抗体をパーオキシダーゼを結合した抗
マウス抗体を用い、パーオキシダーゼ活性で検出するも
のである。この結果を表１に示す。値は濃度０μｇ／ｍ
ｌを１．０と表わしたときの相対比活性である。

【００１３】

【表１】

【００１４】実施例３ カルシウム取り込みアッセイ 直径３５ｍｍディッシュにＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞を７．
５×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍｌで１．５ｍｌ蒔き、種々の
濃度のＮＴ−３を含む５％ウシ胎児血清／ａ−ＭＥＭ
（Ｇｉｂｃｏ社製）の培地で１日間培養した。培養後、
ＰＢＳで２回洗浄後ＨＥＰＥＳ緩衝液（１３２ｍＭ Ｎ
ａＣｌ，３５ｍＭ ＫＣｌ，０．５ｍＭＭｇＣｌ２，１
ｍＭ ＣａＣｌ２，９．５ｍＭ ＨＥＰＥＳ，５ｍＭ
Ｇｌｕｃｏｓｅ，Ｐｈ７．４）に溶かした５ｍＭ Ｆｕ
ｒａ−２ＡＭ（Ｄｏｊｉｎ社製）を室温で３０分処理し
た。細胞を洗浄後、３４０ｎｍ／３８０ｎｍの吸光度比
を測定し、０．０５ｎｇ／ｍｌのＮＴ−３での処理を１
とした時の相対比で表わした。この結果を表２に示す。

【００１５】

【表２】

【００１６】ＮＴ−３を培養系に加えることにより、カ
ルシウムの取り込みが起きることが判明した。これは、
受容体であるｔｒｋＣを介したシグナルがＣａ２＋チャ
ネルを活性化してカルシウムイオンの流入をもたらした
と考えられる。

【００１７】

【発明の効果】本発明によって提供されるＮＴ−３は、
ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞の増殖を促し、かつカルシウム取
り込みを増加するので、骨代謝性疾患の予防治療剤、特
に骨形成に関わる骨折の予防治療剤として有用である。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｔｒｋＣの電気泳動パターンの図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ヒト神経栄養因子３（ＮＴ−３）からなる
   骨代謝疾患の予防、治療剤
2. 【請求項２】ヒト神経栄養因子３（ＮＴ−３）からなる
   骨折の予防、治療剤