CN115381859A - 嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物中的应用、组合物及其应用 - Google Patents

嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物中的应用、组合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物或者在制备改善血糖水平的保健品组合物中的应用，该嗜粘蛋白阿克曼菌为嗜粘蛋白阿克曼菌AM06、嗜粘蛋白阿克曼菌AM02或者两者的组合；其中，嗜粘蛋白阿克曼菌AM06保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22793；嗜粘蛋白阿克曼菌AM02保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22794。该应用中，可降低血糖，减少胰岛素抵抗，减少胰岛炎，从而有效防治糖尿病的发生发展及其恶化，提高患者的生活质量。还涉及含有该嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物及其应用。

Description

嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物中的应 用、组合物及其应用
技术领域
本发明涉及糖尿病防治技术领域和保健品技术领域，特别涉及嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物或者在制备改善血糖水平的保健品组合物中的应用，还涉及含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物及其在制备或作为防治糖尿病的药品或者在制备或作为改善血糖水平的保健食品中的应用，还涉及含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物。
背景技术
糖尿病是由于胰岛B细胞分泌功能发生障碍，导致人体内脂肪、蛋白质以及碳水化合物代谢紊乱，进一步对人体器官造成慢性损伤以及功能性障碍的代谢性疾病，糖尿病的发病与环境、遗传、自身免疫等因素有关。随着社会的发展、物质生活水平的提高以及生活方式的改变，加上老年人数量剧增、老龄化结构的加重，中国的糖尿病患病率逐年升高，已经成为肿瘤和心脑血管疾病之外对人们健康产生严重威胁的慢性非传染疾病之一。
根据病因学可以将糖尿病分为四大类，包括1型糖尿病(T1DM)、2型糖尿病(T2DM)、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病(GDM)。其中，T1DM、T2DM和妊娠期糖尿病是临床常见类型。T1DM病因和发病机制尚未完全明了，其显著的病理学和病理生理学特征是胰岛β细胞数量显著减少乃至消失所导致的胰岛素分泌显著下降或缺失。T2DM的病因和发病机制目前亦不明确，其显著的病理生理学特征为胰岛素调控葡萄糖代谢能力的下降(胰岛素抵抗)伴胰岛β细胞功能缺陷所导致的胰岛素分泌减少(相对减少)。特殊类型糖尿病是病因学相对明确的糖尿病。对于1型糖尿病患者，由于胰岛素分泌绝对不足，需要终生胰岛素替代治疗以维持生命。对于2型糖尿病，二甲双胍为T2DM患者控制高血糖的一线用药和药物联合中的基本用药。此外，目前可用于糖尿病临床治疗的药物还包括磺脲类药物、格列奈类药物、α-糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类(TZD)、二肽基肽酶Ⅳ抑制剂(DPP-4i)、α-糖苷酶抑制剂和钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)、胰高糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)和胰岛素等。然而，上述多种糖尿病治疗药物仍无法满足临床需求，仍有必要进一步开发有关糖尿病防治的新药物。
发明内容
基于此，本申请的发明目的包括提供嗜粘蛋白阿克曼菌以及含有所述嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物在制备防治糖尿病的药物组合物或者在制备改善血糖水平的保健品组合物中的应用，所述嗜粘蛋白阿克曼菌为嗜粘蛋白阿克曼菌AM06、嗜粘蛋白阿克曼菌AM02或者两者的组合；其中，
所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM06于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22793；
所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM02于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22794。
在本发明的第一方面，提供嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物或者在制备改善血糖水平的保健品组合物中的应用，所述嗜粘蛋白阿克曼菌为嗜粘蛋白阿克曼菌AM06、嗜粘蛋白阿克曼菌AM02或者两者的组合；其中，
所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM06于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22793；
所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM02于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22794。
在一些实施方式中，所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM02各自独立地为活菌、灭活菌或者活菌和灭活菌的组合。
在一些实施方式中，所述糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病中至少一种。
在一些实施方式中，所述改善血糖水平的方式包括诱导分泌GLP-1和减少胰岛素抵抗中的至少一种。
在一些实施方式中，所述药物组合物包括所述嗜粘蛋白阿克曼菌和药学上可接受的载体；及/或，
所述保健品组合物包括所述嗜粘蛋白阿克曼菌和可食用原辅料。
在一些实施方式中，所述药物组合物为药品，其剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂或管饲制剂；和/或，
所述保健品组合物为保健食品，其剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊和溶液剂、混悬剂或乳剂。
在本发明的第二方面，提供含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物在制备或作为防治糖尿病的药品或者在制备或作为改善血糖水平的保健食品中的应用，其中，所述嗜粘蛋白阿克曼菌如本发明的第一方面所定义。
在一些实施方式中，所述含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物还包括第二活性成分，所述第二活性成分至少包括α-糖苷酶抑制剂；及/或，
所述含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物为复合益生菌，所述复合益生菌还包括不同于所述嗜粘蛋白阿克曼菌的益生菌。
在一些实施方式中，所述α-糖苷酶抑制剂选自阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇中的一种或多种。
在本发明的第三方面，提供含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物，其中，所述嗜粘蛋白阿克曼菌如本发明的第一方面所定义；进一步地，所述含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物还包括第二活性成分，更进一步地，所述第二活性成分至少包括α-糖苷酶抑制剂；
更进一步地，所述α-糖苷酶抑制剂选自阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇中的一种或多种。
本申请的发明人经分离得到了菌株AM06(保藏号CGMCC No.22793)和AM02(保藏号CGMCC No.22794)，根据16S rRNA分析、形态分析、代谢物成分分析、功效分析(如人工胃液和人工肠液的耐受性，抑制炎症因子破坏肠细胞的紧密连接蛋白的能力，抑制LPS诱导肝切片肝炎的作用)等综合分析，两者均属于嗜粘蛋白阿克曼菌，而且鉴定为不同于ATCC BAA-835(标准菌株)等嗜粘蛋白阿克曼菌的新菌种。
发明人发现，上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02可用于防治糖尿病(包括但不限于2型糖尿病和1型糖尿病)，或者用于改善血糖水平。因此，上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02可用于制备药物组合物或者制备保健品组合物，进一步可制备药品或保健食品。上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02，可降低血糖，减少胰岛素抵抗，减少胰岛炎，从而有效预防和/或治疗糖尿病的发生发展及其恶化，提高患者的生活质量。经实验分析，申请人认为，上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02可通过增强肠道屏障，诱导肠道L细胞分泌GLP-1，从而降低血糖，减少胰岛素抵抗，减少胰岛炎。
进一步地，发明人还发现，上述新分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02还可联合其他糖尿病治疗药物(如α-糖苷酶抑制剂，进一步如阿卡波糖)用于防治糖尿病，或者用于改善血糖水平。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案、更完整地理解本申请及其有益效果，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对本领域技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一实施例中培养得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM02的菌落特征图；
图2为本发明一实施例中得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06的菌落特征图；
图3为本发明一实施例中培养得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM02进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
图4为本发明一实施例中培养得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06进行革兰氏染色后的显微镜观察图；
图5为本发明一实施例中几种嗜粘蛋白阿克曼菌培养上清代谢物PCA分析图；
图6为本发明一实施例中几种嗜粘蛋白阿克曼菌对TNF-α和IFN-γ诱导Caco2细胞紧密连接蛋白ZO-1表达降低的影响的荧光显微镜拍摄图。
本发明中分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06，其分类命名为Akkermansiamuciniphila，已于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22793；该菌株于2021年06月28日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年06月28日检测为存活菌株。
本发明中分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM02，其分类命名为Akkermansiamuciniphila，已于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22794；该菌株于2021年06月28日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年06月28日检测为存活菌株。
具体实施方式
下面结合附图、实施方式和实施例，对本发明作进一步详细的说明。应理解，这些实施方式和实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，提供这些实施方式和实施例的目的是使对本发明公开内容理解更加透彻全面。还应理解，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式和实施例，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本发明的保护范围。此外，在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为充分地理解，应理解，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述实施方式和实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语
除非另外说明或存在矛盾之处，本文中使用的术语或短语具有以下含义：
本文所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项(也即均用“逻辑或”连接的技术方案)，也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合(也即均用“逻辑与”连接的技术方案)。
本发明中涉及“多个”、“多种”、“多次”等，如无特别限定，指在数量上大于2或等于2。例如，“一种或多种”表示一种或大于等于两种。
本文中所使用的“其组合”、“其任意组合”、“其任意组合方式”等中包括所列项目中任两个或任两个以上项目的所有合适的组合方式。
本文中，“合适的组合方式”、“合适的方式”、“任意合适的方式”等中所述“合适”，以能够实施本发明的技术方案、解决本发明的技术问题、实现本发明预期的技术效果为准。
本文中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。如果一个技术方案中出现多处“优选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“优选”各自独立。
本发明中，“进一步”、“更进一步”、“特别”等用于描述目的，表示内容上的差异，但并不应理解为对本发明保护范围的限制。
本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。
本发明中，“第一方面”、“第二方面”、“第三方面”、“第四方面”等中，术语“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于描述目的，不能理解为指示或暗示相对重要性或数量，也不能理解为隐含指明所指示的技术特征的重要性或数量。而且“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅起到非穷举式的列举描述目的，应当理解并不构成对数量的封闭式限定。
本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
本发明中，涉及到数值区间(也即数值范围)，如无特别说明，该数值区间内可选的数值的分布视为连续，且包括该数值区间的两个数值端点(即最小值及最大值)，以及这两个数值端点之间的每一个数值。如无特别说明，当数值区间仅仅指向该数值区间内的整数时，包括该数值范围的两个端点整数，以及两个端点之间的每一个整数，相当于直接列举了每一个整数。当提供多个数值范围描述特征或特性时，可以合并这些数值范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之数值范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。该数值区间中的“数值”可以为任意的定量值，比如数字、百分比、比例等。“数值区间”允许广义地包括百分比区间，比例区间，比值区间等定量区间。
本发明中的温度参数，如无特别限定，既允许为恒温处理，也允许在一定温度区间内存在变动。应当理解的是，所述的恒温处理允许温度在仪器控制的精度范围内进行波动。允许在如±5℃、±4℃、±3℃、±2℃、±1℃的范围内波动。
本发明中，术语“室温”一般指4℃～35℃，较佳地指20℃±5℃。在本发明的一些实施例中，室温是指20℃～30℃。
在本发明中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，3～5h表示左端点“3”和右端点“5”的单位都是h(小时)。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。除非和本申请的发明目的和/或技术方案相冲突，否则，本发明涉及的引用文献以全部内容、全部目的被引用。本发明中涉及引用文献时，相关技术特征、术语、名词、短语等在引用文献中的定义也一并被引用。本发明中涉及引用文献时，被引用的相关技术特征的举例、优选方式也可作为参考纳入本申请中，但以能够实施本发明为限。应当理解，当引用内容与本申请中的描述相冲突时，以本申请为准或者适应性地根据本申请的描述进行修正。
在本发明中，“嗜粘蛋白阿克曼菌”可以是活菌体，也可以经过灭活、基因重组、改造或修饰、减毒、化学处理、物理处理的全部或部分保留原生物活性的嗜黏蛋白阿克曼菌，还可以是菌体的裂解物、培养物(例如上清液)或者从上培养物中提取到的成分。
目前的糖尿病治疗药物可通过如下方式进行糖尿病的治疗，但仍存在进一步开发用于糖尿病防治的新药物的迫切需求。
胰岛素：胰岛素治疗是控制高血糖的重要手段。T1DM患者需依赖胰岛素维持生命，也必须使用胰岛素控制高血糖，并降低糖尿病并发症的发生风险。T2DM虽不需要胰岛素来维持生命，但当口服降糖药效果不佳或存在口服药使用禁忌时，仍需使用胰岛素，以控制高血糖，并减少糖尿病并发症的发生风险。在某些时候，尤其是病程较长时，胰岛素治疗可能是最主要的、甚至是必需的控制血糖措施。目前胰岛素临床上最常见的不良反应就是引起低血糖反应，胰岛素用量过大或血糖控制后未及时减少胰岛素用量，注射胰岛素后未按时进餐或进食量不足，运动量过大或者运动前未加餐，注射混合胰岛素中长效胰岛素比例过大等等，都可能诱发低血糖。
二甲双胍：双胍类药物的主要药理作用是通过减少肝脏葡萄糖的输出和改善外周胰岛素抵抗而降低血糖。许多国家和国际组织制定的糖尿病诊治指南中均推荐二甲双胍作为T2DM患者控制高血糖的一线用药和药物联合中的基本用药。单独使用二甲双胍不增加低血糖风险，但二甲双胍与胰岛素或胰岛素促泌剂联合使用时可增加发生低血糖的风险。二甲双胍的主要不良反应为胃肠道反应。长期服用二甲双胍可引起维生素B12水平下降。
磺脲类药物：该类药物属于胰岛素促泌剂，主要药理作用是通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素，增加体内的胰岛素水平而降低血糖。磺脲类药物如果使用不当可导致低血糖，特别是在老年患者和肝、肾功能不全者；磺脲类药物还可导致体重增加。有肾功能轻度不全的患者如使用磺脲类药物宜选择格列喹酮。
格列奈类药物：该类药物为非磺脲类胰岛素促泌剂，主要通过刺激胰岛素的早时相分泌而降低餐后血糖，也有一定的降空腹血糖作用，可使糖化血红蛋白HbA1c降低0.5％～1.5％。格列奈类药物的常见不良反应是低血糖和体重增加，但低血糖的风险和程度较磺脲类药物轻。格列奈类药物可以在肾功能不全的患者中使用。
噻唑烷二酮类(TZD)：主要通过增加靶细胞对胰岛素作用的敏感性而降低血糖。TZD单独使用时不增加低血糖风险，但与胰岛素或胰岛素促泌剂联合使用时可增加低血糖风险。体重增加和水肿是TZD的常见不良反应，这些不良反应在与胰岛素联合使用时表现更加明显。TZD的使用与骨折和心力衰竭风险增加相关。
α-糖苷酶抑制剂：可与双胍类、磺脲类、TZD或胰岛素联合使用。α-糖苷酶抑制剂的常见不良反应为胃肠道反应(如腹胀、排气等)。从小剂量开始，逐渐加量是减少不良反应的有效方法。单独服用本类药物通常不会发生低血糖。
二肽基肽酶Ⅳ抑制剂(DPP-4i)：通过抑制二肽基肽酶Ⅳ(DPP-4)而减少GLP-1(胰高血糖素样肽-1)在体内的失活，使内源性GLP-1水平升高。GLP-1以葡萄糖浓度依赖的方式增加胰岛素分泌，抑制胰高糖素分泌。
钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)：可抑制肾脏对葡萄糖的重吸收，降低肾糖阈，从而促进尿糖的排出。目前在我国上市的SGLT2i有达格列净、恩格列净、卡格列净和艾托格列净。SGLT2i的常见不良反应为泌尿系统和生殖系统感染及与血容量不足相关的不良反应，罕见不良反应包括糖尿病酮症酸中毒(DKA)。
胰高糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)：通过激活GLP-1受体以葡萄糖浓度依赖的方式刺激胰岛素分泌和抑制胰高糖素分泌，同时增加肌肉和脂肪组织葡萄糖摄取，抑制肝脏葡萄糖的生成而发挥降糖作用，并可抑制胃排空，抑制食欲。GLP-1RA的主要不良反应为轻～中度的胃肠道反应，包括腹泻、恶心、腹胀、呕吐等。这些不良反应多见于治疗初期，随着使用时间延长，不良反应逐渐减轻。
基于此，临床上仍亟需开发出更多不良反应更少，更能防治慢性并发症，改善胰岛素抵抗和延缓胰岛细胞功能衰竭的药物。
本发明的第一方面
在本发明的第一方面，提供嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物或者在制备改善血糖水平的保健品组合物中的应用，所述嗜粘蛋白阿克曼菌为嗜粘蛋白阿克曼菌AM06、嗜粘蛋白阿克曼菌AM02或者两者的组合。
本申请的发明人经分离得到了菌株AM06(保藏号CGMCC No.22793)和AM02(保藏号CGMCC No.22794)，根据16S rRNA分析、形态分析、代谢物成分分析、功效分析(如人工胃液和人工肠液的耐受性，抑制炎症因子破坏肠细胞的紧密连接蛋白的能力，抑制LPS诱导肝切片肝炎的作用)等综合分析，两者均属于嗜粘蛋白阿克曼菌，而且鉴定为不同于ATCC BAA-835(标准菌株)等嗜粘蛋白阿克曼菌的新菌种。
在本发明中，“嗜粘蛋白阿克曼菌”与本领域的通常定义一致，包括但不限于嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和AM02。
嗜黏蛋白阿克曼菌(Akkermansia muciniphila，A.muciniphila〉隶属疣微菌门(Verucomicrobia)，阿克曼菌科(Akkermansiaceae)，阿克曼菌属(Akkermansia)。嗜黏蛋白阿克曼菌是一种黏蛋白降解菌，为厌氧、无动力、无芽孢的卵圆形革兰氏阴性菌，适合在20～40℃和pH5.5～8.0条件下生长(最适温度37℃，最适pH6.5)，普遍存在于人体肠道内，虽然属于厌氧菌，但也能够耐受一定程度的氧。嗜粘蛋白阿克曼菌可通过降解和利用粘蛋白作为能源，在粘液层和结肠中定植，进一步地，还可通过黏蛋白降解产生短链脂肪酸(SCFA)，这些短链脂肪酸(包括乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)的生产对人类健康具有重要作用。
在本发明中，“本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌”特指嗜粘蛋白阿克曼菌AM06、嗜粘蛋白阿克曼菌AM02或者两者的组合，可以记为“AM06和/或AM02”。
嗜粘蛋白阿克曼菌AM06于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22793，可通过实施例1的方法分离得到，还可通过包括但不限于实施例2至实施例4中的一种或多种方法进行菌种鉴定。
在一些实施例中，嗜粘蛋白阿克曼菌AM06的菌落培养特征包括：圆形凸起、边缘整齐、不透明、白色、大小不均一的菌落，进一步地，菌落大小约为0.08～2.2mm。
在一些实施例中，嗜黏蛋白阿克曼菌AM06分离自母乳。
嗜粘蛋白阿克曼菌AM02于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22794，可通过实施例1的方法分离得到，还可通过包括但不限于实施例2至实施例4中的一种或多种方法进行菌种鉴定。
在一些实施例中，CGMCC No.22794的嗜粘蛋白阿克曼菌AM02的菌落培养特征包括：圆形凸起、边缘整齐、不透明、白色、大小不均一的菌落，进一步地，菌落大小约为0.08～2.2mm。
在一些实施例中，申请人还进行了人工胃液、人工肠液的耐受性考察。其中，人工胃液耐受性考察中，对0.9wt％的NaCl溶液组、pH3人工胃液组和pH2人工胃液组不同组别37±2℃，厌氧孵育0h、1.5h和3h后的活菌数进行统计分析，结果表明，嗜粘蛋白阿克曼菌株的人工胃液耐受性依次为AM02＞AM06＞标准株ATCC BAA-835。其中，人工肠液耐受性考察实验中，对37±2℃厌氧孵育0h、4h、8h后的活菌数进行统计分析，人工肠液耐受性优于AM06>AM02>ATCC BAA-835。
在一些体外实验中，嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和AM02，对人工胃液和人工肠液的耐受性，抑制炎症因子破坏肠细胞的紧密连接蛋白的能力，抑制LPS诱导肝切片肝炎的作用均优于标准株BAA-835。
嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和AM02各自独立地可以是活菌体，也可以是经过灭活处理的嗜黏蛋白阿克曼菌(即灭活菌，可以为全部或部分地灭活)，还可以是菌体的裂解物、培养物(例如上清液)或者从上培养物中提取到的成分。
在一些实施方式中，嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和嗜粘蛋白阿克曼菌AM02各自独立地为活菌、灭活菌或者活菌和灭活菌的组合。灭活菌可以为形态结构完整的灭活菌、形态结构不完整的灭活菌或者其组合。
在一些实施方式中，嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和嗜粘蛋白阿克曼菌AM02各自独立地为活菌、形态结构完整的灭活菌、形态结构不完整的灭活菌中的一种或多种。
在一些实施方式中，本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌选自嗜黏蛋白阿克曼菌活菌体。
在一些实施方式中，本发明所述嗜黏蛋白阿克曼菌选自嗜黏蛋白阿克曼菌灭活菌。
在本发明中，“形态结构完整”可以包括但不限于经过灭活处理而被全部活部分地灭活的嗜黏蛋白阿克曼菌。
在本发明中，“形态结构不完整”的情况可以包括但不限于菌体的裂解物、培养物(例如上清液)或者从上培养物中提取到的成分等。
发明人经大量实验发现，上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02可用于防治糖尿病(包括但不限于2型糖尿病和1型糖尿病)或者用于改善血糖水平。因此，上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02可用于制备药物组合物或者制备保健品组合物，进一步可制备药品或保健食品。上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02，可降低血糖，减少胰岛素抵抗，减少胰岛炎，从而有效预防和/或治疗糖尿病的发生发展及其恶化，提高患者的生活质量。经实验分析，申请人认为，上述分离得到的嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02可通过增强肠道屏障，诱导肠道L细胞分泌GLP-1，从而降低血糖，减少胰岛素抵抗，减少胰岛炎。
用于制备药物组合物
在本发明中，“防治”包括预防、治疗、辅助治疗等方面。如本文所用，“防治”是指减轻、延缓进展、衰减、预防，或维持现有疾病或病症。“防治”还包括将疾病或病症的一个或多个症状治愈、预防其发展或减轻到某种程度。在本发明中，“防治”与“预防和/或治疗”具有相同含义，可以互换使用。
在本发明中，“组合物”可以为多种物质的组合，进一步地，可以为组合使用，也可以为组合而成的混合物。
在本发明中，“药物”包括在体内或体外提供药理作用的任何药剂、化合物、组合物或混合物，且往往提供的是有益效果。“药物”在体内产生药理作用的范围没有特别限制，可以为全身效果，也可以只在局部产生效果。所述“药物”的活性没有特别限制，可以为能与其它物质发生相互作用的活性物质，也可以为不发生相互作用的惰性物质。
在本发明中，“药物组合物”指具有防治疾病或病症作用、可作为药品使用或者可用于制备药品的组合物。
在本发明中，“药品”指可直接施用的药物制剂，其通常具有规定的用法和用量。
在一些实施方式中，所述糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病中至少一种。
在一些实施方式中，所述糖尿病包括糖尿病1型糖尿病和2型糖尿病中至少一种。
在一些实施方式中，所述糖尿病至少包括1型糖尿病。
在一些实施例中，所述糖尿病为1型糖尿病。
在一些实施例中，用于防治1型糖尿病时，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)能够有效防治小鼠1型糖尿病(如自发的1型糖尿病)，减少和延缓糖尿病的发病并减少胰岛炎，且疗效AM06＞AM02＞BAA-835。
在一些实施例中，所述糖尿病至少包括2型糖尿病。
在一些实施例中，所述糖尿病为2型糖尿病。
在一些实施例中，嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和/或AM02能够有效防治动物(如小鼠)的2型糖尿病，减少体重，降低空腹血糖和胰岛素水平，减少胰岛素抵抗并减少肝脏脂肪累积，且疗效AM06＞AM02＞BAA-835。
在一些实施方式中，药物组合物包括本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)以及药学上可接受的载体。
在本发明中，“药学上可接受的”指在合理医学判断范围内适于施用患者且与合理益处/风险比相称的那些配体、材料、组合物和/或剂型。
在本发明中，“药学上可接受的载体”指药学上可接受的材料、组合物或媒剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或囊封材料。如本文所用，短语“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的缓冲剂、注射用无菌水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂及抗真菌剂、等渗剂及吸收延迟剂及诸如此类。在与配制物中其他成分兼容且对患者无害的意义上，每种载体必须为“药学上可接受的”。合适的实例包括但不限于：(1)糖，例如乳糖、葡萄糖及蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉、马铃薯淀粉及经取代或未经取代的β-环糊精；(3)纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素及乙酸纤维素；(4)粉状黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可脂及栓剂蜡；(9)油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油及大豆油；(10)二醇，例如丙二醇；(11)多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇及聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯及月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁及氢氧化铝；(15)海藻酸；(16)无热原水；(17)等渗盐水；(18)林格氏溶液；(19)乙醇；(20)磷酸盐缓冲液；及(21)药物配制物中所采用的其他无毒兼容物质。
本发明中，“载体”包括但不限于甘露醇、山梨醇、焦亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、盐酸半胱氨酸、巯基乙酸、蛋氨酸、维生素C、乙二胺四乙酸二钠(EDTA二钠)、EDTA钙钠，一价碱金属的碳酸盐、醋酸盐、磷酸盐或其水溶液、盐酸、醋酸、硫酸、磷酸、氨基酸、氯化钠、氯化钾、乳酸钠、木糖醇、麦芽糖、葡萄糖、果糖、低聚果糖、右旋糖苷、甘氨酸、淀粉、蔗糖、糊精(如麦芽糊精)、乳糖、甘露糖醇、硅衍生物、纤维素及其衍生物、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、甘油、吐温80、琼脂、碳酸钙、碳酸氢钙、表面活性剂、聚乙二醇、环糊精、磷脂类材料、高岭土、滑石粉、硬脂酸钙、硬脂酸镁。
在一些实施方式中，药物组合物还可以包括其他药物活性成分。其他药物活性成分可以为具有糖尿病防治效果的药物成分，也可以为具有其他疾病防治效果的药物成分。
在一些实施方式中，其他药物活性成分可以从已有的糖尿病防治药物中进行合适的选择：磺脲类药物、格列奈类药物、α-糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类(TZD)、二肽基肽酶Ⅳ抑制剂(DPP-4i)、α-糖苷酶抑制剂和钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)、胰高糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)和胰岛素等。
在一些实施方式中，其他药物活性成分至少包括α-糖苷酶抑制剂。α-糖苷酶抑制剂可以选自阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇中的一种或多种。在一些实施例中，药物组合物包含本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)和阿卡波糖。
用于制备保健品组合物
在本发明中，“保健品”与“保健食品”具有相同含义，可互换使用。在本发明中，“保健品”指具有保健功能的食品，其能够调节动物体(人或其它动物)生理机能，且往往提供的是有益效果。“保健品”在体内产生有益作用的范围没有特别限制，可以为全身效果，也可以只在局部产生效果。
在本发明中，“保健品组合物”指具有保健功能的食品组合物。保健品组合物可以作为保健品直接被食用，也可以作为膳食添加剂而被食用。其中，如本文所用，“治疗”是指减轻、延缓进展、衰减，或维持现有疾病或病症，治疗还包括将疾病或病症的一个或多个症状治愈、预防其发展或减轻到某种程度。
在本发明中，“食品”指可直接食用的制品。“食品组合物”指由可食用物质组成的组合物。应当理解，本发明中的食品组合物除可以包含前述的嗜粘蛋白阿克曼菌外，还允许包含任意合适的其他可食用物质。在一些实施例中，其他可食用物质可选自食品管理规范中允许添加的物质，进一步地，不包含食品管理规范中禁止添加的物质。如无特别限定，食品管理规范指生产时的现行规范。
在本发明中，“改善血糖水平”是指有益性降低血糖水平，“有益性”指为健康带来有益性效果。
在一些实施方式中，改善血糖水平的方式没有特别限定。比如，在一些实施例中，改善血糖水平的方式包括诱导分泌GLP-1和减少胰岛素抵抗中的至少一种。在另一些实施例中，改善血糖水平的方式选自诱导分泌GLP-1和减少胰岛素抵抗中的一种或多种。
在一些实施方式中，保健品组合物包括本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌和可食用原辅料。
在本发明中，“可食用原辅料”指可食用原料、可食用辅料或者两者的组合。其中，“可食用原料”指能够单独改善血糖水平的可食用物质，但不是AM06和AM02；“可食用辅料”指不具有单独改善血糖水平功能的可食用物质。应当理解，“可食用原辅料”可以选自保健品管理规范中允许添加的物质，进一步地，不包含保健品管理规范中禁止添加的物质。如无特别限定，保健品管理规范指生产时的现行规范。
在一些实施方式中，食品组合物包括本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)以及可食用辅料。在本发明中，食品添加剂也属于可食用辅料。可食用辅料的举例如食糖，果糖，蜂蜜，葡萄糖，淀粉，维生素，有益微量元素和中量元素(如钙粉)，大豆粉，绿豆粉，麦芽糊精，奶粉，蔬菜汁，水果汁，香料、香精等。本发明的可食用辅料可以单一或复合地使用。
在一些实施方式中，保健品组合物由本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)和可食用辅料组成。
在一些实施方式中，保健品组合物还可以含有其它保健成分，其它保健成分是不同于AM06和AM02的保健成分，其保健功能可以为改善血糖水平，也可以为其他的保健功能。
在一些实施方式中，保健品组合物还含有其他益生菌。其他益生菌可以选自本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)的改造菌以及其他种属的益生菌。其他种属的益生菌的可以包括脆弱拟杆菌、克里斯特森氏菌、布拉氏酵母菌、鼠李唐乳杆菌、双歧乳杆菌、希氏肠球菌中的一种或多种。
在一些实施方式中，保健品组合物还含有其他种属的益生菌。
制剂类型
在一些实施方式中，药物组合物为药品。
在本发明中，“药品”指可直接施用的药物制剂，其通常具有规定的用法和用量，与前述定义一致。
在一些实施方式中，药物制剂可以为液体制剂或固体制剂。液体制剂指含有液相的制剂，非限制性举例如溶液剂、混悬剂、乳剂等。固体制剂的非限制性举例如片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂等。
在一些实施方式中，根据施用方式的不同，药物制剂可以为口服剂、注射剂、滴剂、贴剂、管饲制剂等。
在一些实施方式中，药品的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂或管饲制剂。
应当理解，药品中含有治疗有效量的本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)。
在本发明中，“治疗有效量”是指针对疾病、病症和/或症状，将引起个体的生物学或医学响应的药物活性成分的量，例如为个体带来药理上积极效果的本发明嗜粘蛋白阿克曼菌的量，所述药理上积极效果包括但不限于降低或抑制酶或蛋白质活性或改善症状、缓解病症、减缓或延迟疾病进程或预防疾病等。
在一些实施方式中，保健品组合物为保健食品。
在一些实施方式中，保健食品的剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、溶液剂、混悬剂或乳剂。进一步地，非限制性的举例如蜜丸、水蜜丸、水丸、糖浆、糖浆剂等。
应当理解，保健食品中含有保健有效量的本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)。此处的“保健有效量”指能够改善血糖水平的量，在正常的保健食品的食用剂量时能够发挥改善血糖水平的作用。
本发明中，“受试者”指服用药物组合物的患者或食用保健品组合物的食用者。
本发明中，“受试者”是动物，优选为哺乳动物，更优选地为人，受试者包括但不限于保健品的食用者和具有疾病、病症和/或症状的患者。本发明中的受试者优选为哺乳动物。术语“哺乳动物”主要是指温血脊椎类哺乳动物，包括但不限于：猫、狗、兔、熊、狐狸、狼、猴子、鹿、鼠(如大鼠、小鼠)、猪、牛、羊、马、人等，优选灵长类动物，更优选为人。
在一些实施方式中，受试者为哺乳动物。
在一些实施方式中，药物组合物和保健品组合物各自独立地适用于人或其他哺乳动物。本发明中，“其他哺乳动物”不为人，“其他哺乳动物”的非限制性举例如猫、狗、兔、熊、狐狸、狼、猴子、鹿、鼠(如大鼠、小鼠)、猪、牛、羊、马等，进一步如小鼠或大鼠；“其他哺乳动物”的非限制性举例还如灵长类动物。
在一些实施方式中，受试者为人、小鼠或大鼠。
在一些实施方式中，受试者为人或者小鼠。
本发明中，“患者”是指一种动物，优选为哺乳动物，如人，又如小鼠，还如大鼠。
受试者的不同可能会导致前述药物组合物或保健品组合物中的其他成分的选择范围不同。
本发明的第二方面
在本发明的第二方面，提供含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物在制备或作为防治糖尿病的药品或者在制备或作为改善血糖水平的保健食品中的应用。这里的“含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物”指含有“本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)”的组合物。“本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌”的定义可参考本发明第一方面。
进一步地，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌为嗜粘蛋白阿克曼菌AM06(保藏编号为CGMCC No.22793)、嗜粘蛋白阿克曼菌AM02(保藏编号为CGMCC No.22794)或者两者的组合。
在一些实施方式中，含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物为药物组合物或保健品组合物。
在本发明的第二方面，“组合物”、“防治”、“糖尿病”、“药品”、“保健食品”、“改善血糖水平”、“药物组合物”、“保健品组合物”的定义可参考本发明第一方面。“药品”、“保健食品”的定义还可参考本发明第四方面。
含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物用于制备药品时，是一种药物组合物，其中的药物活性成分包括嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和嗜粘蛋白阿克曼菌AM02中至少一种。
本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌可以是活菌体，也可以是经过灭活处理的嗜黏蛋白阿克曼菌(即灭活菌，可以为全部或部分地灭活)，还可以是菌体的裂解物、培养物(例如上清液)或者从上培养物中提取到的成分。
在一些实施方式中，含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物还包括第二活性成分。
在本发明中，“第二活性成分”指除本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)之外，其他具有改善血糖水平作用的活性成分。
在一些实施方式中，第二活性成分可以为本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)的改造菌。改造方式包括但不限于基因编辑、化学处理、物理处理等方式。经改造后的嗜粘蛋白阿克曼菌形成不同于AM06和AM02的新菌种。该改造菌可以仍具有防治糖尿病或改善血糖水平的功能，还可以被赋予其他的药理和/或生理上的新功能。
在一些实施方式中，含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物还包括第二药物活性成分。
在本发明中，“第二药物活性成分”指除本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)之外，其他具有糖尿病防治作用的药物活性成分。“第二药物活性成分”在”第二活性成分”范围内。
在一些实施方式中，第二药物活性成分的非限制性举包括：胰岛素、二甲双胍、磺脲类药物、格列奈类药物、α-糖苷酶抑制剂、噻唑烷二酮类药物(TZD)、二肽基肽酶Ⅳ抑制剂(DPP-4i)、α-糖苷酶抑制剂、钠-葡萄糖共转运蛋白2抑制剂(SGLT2i)、胰高糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)等中的一种或多种。
在一些实施方式中，第二药物活性成分至少包括α-糖苷酶抑制剂。
在一些实施方式中，α-糖苷酶抑制剂可选自阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇中的一种或多种。
在一些实施方式中，第二药物活性成分为阿卡波糖。
在一些实施方式中，含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物为复合益生菌，此时，该组合物除含有本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)外，还含有不同于本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的其他益生菌。
在本发明中，“复合益生菌”含有至少两种益生菌。应当理解，“含有嗜粘蛋白阿克曼菌的复合益生菌”包括本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌，还包括不同于本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的其他益生菌。
在一些实施例中，其他益生菌(不同于本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌)可以包括本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的改造菌以及其他种属的益生菌。其他种属的益生菌为不同于嗜粘蛋白阿克曼菌的益生菌，可以包括但不限于脆弱拟杆菌、克里斯特森氏菌、布拉氏酵母菌、鼠李唐乳杆菌、双歧乳杆菌、希氏肠球菌等。
在一些实施例中，复合益生菌包括多种嗜粘蛋白阿克曼菌。
在一些实施例中，复合益生菌由嗜粘蛋白阿克曼AM06和AM02中至少一种，以及AM06的改造菌和AM02的改造菌中至少一种组成。
在一些实施例中，复合益生菌包括本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌，还包括其他种属的益生菌。其他种属的益生菌定的义如上。进一步还包括本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的改造菌。
在本发明中，“含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物”中的各成分可以以任意合适的时机出现。比如，可以直接配制成混合物打开即用，也可以单独包装而在使用时再配制成混合物，还可以分别给予受试者而在体内的局部位置同时出现并发挥组合作用。“含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物”还含有其他药物活性成分时，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(AM06和/或AM02)与其他药物活性成分的组合同样可以以任意合适的时机出现；其中“其他药物活性成分”的定义可参考本发明的第一方面。以任意合适的时机出现的“含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物”均在本发明的保护范围之内。
本发明的第三方面
在本发明的第三方面，提供含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物；
其中，“含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物”的定义可参考本发明的第二方面。
在一些实施方式中，本方面的含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物还包括第二活性成分。“第二活性成分”的定义可参考本发明的第二方面。
在一些实施方式中，第二活性成分至少包括α-糖苷酶抑制剂。
在一些实施方式中，α-糖苷酶抑制剂可以选自阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇中的一种或多种。
本发明的第四方面
在本发明的第四方面，提供一种糖尿病的防治方法，包括给予受试者治疗有效量的本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌(也即向受试者施用治疗有效量的本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌)。
在一些实施方式中，提供一种糖尿病的防治方法，包括给予受试者治疗有效量的含有本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的药物组合物。
在一些实施方式中，提供一种糖尿病的防治方法，包括给予受试者治疗有效量的含有本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的药品。
在本发明的第四方面，还提供一种改善血糖水平的方法，包括给予受试者保健有效量的本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌，或者给予受试者保健有效量的含有本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的保健品组合物，或者给予受试者治疗保健有效量的含有本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的保健食品。
在本发明的第四方面，“嗜粘蛋白阿克曼菌”、“本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌”、“组合物”、“药物组合物”、“药品”、“防治”、“糖尿病”、“治疗有效量”、“改善血糖水平”、“保健有效量”、“保健品组合物”、“保健食品”的定义可参考本发明第一方面或第二方面。
在本发明的第四方面，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌可以与其他药物活性成分联用，用于防治糖尿病或者改善血糖水平。“其他药物活性成分”的定义可参考本发明的第一方面。比如，其他药物活性成分可以为具有糖尿病防治效果的药物成分，也可以为具有其他疾病防治效果的药物成分。在本发明的一些实施例中，其他药物活性成分为本发明的第二方面所定义的第二活性成分。
在一些实施例中，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌与α-糖苷酶抑制剂联用。
在一些实施例中，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌与阿卡波糖联用。可以各自以合适的单位施用，比如，阿卡波糖可以根据每单位体重的化合物量提供，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌可以以每人或每只的菌量提供。比如在实施例8中，以“30mg/kg的阿卡波糖+109CFU/只的AM06”的方式联用。
在本发明中，本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌，含有本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的药物组合物，含有本发明所述嗜粘蛋白阿克曼菌的药品，均属于本发明所定义的“药物”范畴。
在一些实施方式中，药物的施用方式包括但不限于：口服、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)注射、和局部给药、吸入。
用于口服给药的固体剂型可以包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性成分可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，具体例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。如悬浮液可包含悬浮剂，具体例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，以及用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水或非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
用于局部给药的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。由活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合而成。
本方面的上述药物制剂中的“活性成分”指药物组合物中能够发挥“药物”作用的成分。
可以理解的是，本发明实施例的药物可以添加不同的药学上可接受的载体从而制备成合适的临床剂型，这些临床剂型包括但不限于上文所述剂型。
以下提供一些具体实施例。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以按照制造厂商所建议的条件，或者参考本领域已知的实验方法。
下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。
以下各例中，10倍梯度稀释，表示每个梯度进行10倍稀释的稀释方式。单位“天”可表示为“d”。
实施例1.嗜粘蛋白阿克曼菌的分离及鉴定
1.1.AM02菌株的分离及鉴定
用无菌取样勺，取黄豆粒大小粪便(样本来源于成年健康男性)于10mL离心管中，取样完成后将样本立即转移至37℃厌氧工作站中(85％N2、10％H2、5％CO2，体积百分比)，按10倍梯度稀释将样本稀释至10-9，取各稀释度溶液各1mL接种至9mL以黏蛋白为唯一碳源的基础培养基中，厌氧培养7天。取10-4稀释度接种的培养液1mL，按1：10的梯度稀释方式将培养液稀释至10-6，分别取各稀释度100μL分别于黏蛋白琼脂培养基上涂布，厌氧培养7天，挑取单菌落接种至2mL的BHI肉汤(含N-乙酰-D-氨基葡萄糖培养基)。对培养后的菌液进行16srRNA测序，将16S rRNA序列于NCBI数据库上进行序列比对。分离得到的菌株鉴定为嗜粘蛋白阿克曼氏菌，16S rRNA测序结果如下所示：
gtgacgggcggggtgcatagacatgcagtcgaacgagagaattgctagcttgctaataattctctagtggcgcacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccccgagagcgggatagccctgggaaactgggattaataccgcatagtatcgaaagattaaagcagcaatgcgcttggggatgggctcgcggcctattagttagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgatgacgggtagccggtctgagaggatgtccggccacactggaactgagacacggtccagacacctacgggtggcagcagtcgagaatcattcacaatgggggaaaccctgatggtgcgacgccgcgtgggggaatgaaggtcttcggattgtaaacccctgtcatgtgggagcaaattaaaaagatagtaccacaagaggaagagacggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagaggtctcaagcgttgttcggaatcactgggcgtaaagcgtgcgtaggctgtttcgtaagtcgtgtgtgaaaggcgcgggctcaacccgcggacggcacatgatactgcgagactagagtaatggagggggaaccggaattctcggtgtagcagtgaaatgcgtagatatcgagaggaacactcgtggcgaaggcgggttcctggacattaactgacgctgaggcacgaaggccaggggagcgaaagggattagatacccctgtagtcctggcagtaaacggtgcacgcttggtgtgcggggaatcgaccccctgcgtgccggagctaacgcgttaagcgtgccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaagaaattgacggggacccgcacaagcggtggagtatgtggcttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgtaatgaacaacatgtgaaagcatgcgactcttcggaggcgttacaacaggtgctgcatggccgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgtttggttaagtccagcaacgagcgcaacccctgttgccagttaccagcacgtgaaggtggggactctggcgagactgcccagatcaactgggaggaaggtggggacgacgtcaggtcagtatggcccttatgcccagggctgcacacgtactacaatgcccagtacagagggggccgaagccgcgaggcggaggaaatcctgaaaactgggcccagttcggactgtaggctgcaacccgcctacacgaagccggaatcgctagtaatggcgcatcagctacggcgccgtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacatcatggaagccggtcgcacccgaagtatctgaagccaaccgcaaggaggcaggtcctaaggtagactactgtctat。
该序列在NCBI上与ATCC BAA-835的16S rRNA序列比对结果显示Per.Ident值为99.43％。
1.2.AM06菌株的分离及鉴定
将新鲜采集的母乳样本(来源于成年健康女性)立即注射于5mL厌氧西林瓶中保存，然后将样本转移至37℃厌氧工作站中(85％N2、10％H2、5％CO2，体积百分比)，按10倍梯度稀释将样本稀释至10-6，取各稀释度溶液各1mL接种至9mL以黏蛋白为唯一碳源的基础培养基中，厌氧培养约1个月。取10-1～10-4稀释度接种的培养液1mL，按1：10的稀释方式将培养液稀释至10-6，分别取各稀释度100μL分别于黏蛋白琼脂培养基上涂布，厌氧培养7天，挑取单菌落接种至2mL的BHI肉汤(含N-乙酰-D-氨基葡萄糖培养基)。对培养后的菌液进行16SrRNA测序鉴定，将16S rRNA序列于NCBI数据库上进行序列比对，结果鉴定为嗜粘蛋白阿克曼氏菌，16S rRNA的测序结果如下所示：
cggattacggcgtgctaagactgcagtcgacgagagattgctagcttgctaataattctctagtggcgcacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccccgagagcgggatagccctgggaaactgggattaataccgcatagtatcgaaagattaaagcagcaatgcgcttggggatgggctcgcggcctattagttagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgatgacgggtagccggtctgagaggatgtccggccacactggaactgagacacggtccagacacctacgggtggcagcagtcgagaatcattcacaatgggggaaaccctgatggtgcgacgccgcgtgggggaatgaaggtcttcggattgtaaacccctgtcatgtgggagcaaattaaaaagatagtaccacaagaggaagagacggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagaggtctcaagcgttgttcggaatcactgggcgtaaagcgtgcgtaggctgtttcgtaagtcgtgtgtgaaaggcgcgggctcaacccgcggacggcacatgatactgcgagactagagtaatggagggggaaccggaattctcggtgtagcagtgaaatgcgtagatatcgagaggaacactcgtggcgaaggcgggttcctggacattaactgacgctgaggcacgaaggccaggggagcgaaagggattagatacccctgtagtcctggcagtaaacggtgcacgcttggtgtgcggggaatcgaccccctgcgtgccggagctaacgcgttaagcgtgccgcctggggagtacggtcgcaagattaaaactcaaagaaattgacggggacccgcacaagcggtggagtatgtggcttaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggcttgacatgtaatgaacaacatgtgaaagcatgcgactcttcggaggcgttacacaggtgctgcatggccgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgtttggttaagtccagcaacgagcgcaacccctgttgccagttaccagcacgtgaaggtggggactctggcgagactgcccagatcaactgggaggaaggtggggacgacgtcaggtcagtatggcccttatgcccagggctgcacacgtactacaatgcccagtacagagggggccgaagccgcgaggcggaggaaatcctaaaaactgggcccagttcggactgtaggctgcaacccgcctacacgaagccggaatcgctagtaatggcgcatcagctacggcgccgtgaatacgttcccgggtcttgtacacaccgcccgtcacatcatggaagccggtcgcacccgaagtcattactgaagccaaccgcaaggaggcaggtcctaaagtgagactataacaa。
该序列在NCBI上与ATCC BAA-835的16S rRNA序列比对结果显示Per.Ident值为99.22％。
1.3.菌株保藏信息
嗜粘蛋白阿克曼菌AM02，其分类命名为Akkermansia muciniphila，已于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22794；该菌株于2021年06月28日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年06月28日检测为存活菌株。
嗜粘蛋白阿克曼菌AM06，其分类命名为Akkermansia muciniphila，已于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.22793；该菌株于2021年06月28日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2021年06月28日检测为存活菌株。
实施例2.嗜粘蛋白阿克曼菌的培养和灭活菌制备
2.1.将嗜粘蛋白阿克曼菌种划线接种于BHA平板，厌氧培养3天。观察菌落形态特征、染色特性、大小、球杆状和分布情况等。
菌落特征：嗜粘蛋白阿克曼菌AM02和AM06在上述培养基上培养3天后，均呈现圆形凸起、边缘整齐、不透明、白色、大小不均一的菌落，菌落大小约为0.08～2.2mm，可参见图1(嗜粘蛋白阿克曼菌AM02)和图2(嗜粘蛋白阿克曼菌AM06)。
显微镜下形态：对嗜粘蛋白阿克曼菌AM02和AM06进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，椭圆形、单个或成链状排列，可参见图3(嗜粘蛋白阿克曼菌AM02)和图4(嗜粘蛋白阿克曼菌AM06)。
标准菌株ATCC BAA-835的菌落特征为：圆形凸起、边缘整齐、不透明、白色、大小不均一的菌落。显微镜下形态为革兰阴性细菌，椭圆形、单个或成链状排列。
2.2.选取单个菌落接种于BHI肉汤中培养48小时(温度为37℃)，所得菌液离心沉淀，转速16000×g，离心30min，去上清，收集沉淀物，即得嗜粘蛋白阿克曼菌菌泥。分别培养得到AM02、AM06、ATCC BAA-835嗜粘蛋白阿克曼菌。
2.3.灭活菌的制备：取适量菌泥，按菌泥:生理盐水(m:v)＝1:10的比例添加生理盐水，使用搅拌器在1000rpm条件下搅拌5～20min，使菌体均匀分散。取100mL分散后菌液置于无菌三口圆底烧瓶内(尽量保证菌液不黏附于烧瓶内壁)。将三口圆底烧瓶置于磁力搅拌器加热盘上，放入无菌搅拌子，并插入温度电极，设置转速300～500rpm，温度70℃，加热30min，得到嗜粘蛋白阿克曼菌的灭活菌。
实施例3.嗜粘蛋白阿克曼菌培养上清非靶向代谢学差异分析
3.1.样本制备
取实施例2中培养结束后的各个嗜粘蛋白阿克曼菌(AM02、AM06、ATCC BAA-835)的培养上清，各取1mL菌液12000rpm离心5min后，上清过0.22μm滤膜后，取滤液作为待测样本，进行非靶向代谢组学分析。每个菌株各制备5份平行的待测样本。
3.2.实验结果
PCA是一种数据降维方法，即把多个变量降维到一组新的综合变量，再从中选取尽可能多地反映原有变量信息的前几个主成分，从而达到降维的目的。PCA图反应样本的真实分布情况，主要用于观察样本组间分离趋势，以及是否有异常点出现，同时从原始数据上反映组间和组内的变异度。
实验结果可参见图5。图5中包含了质控样本(QC样本)和所有样本的PCA分析。其中各个QC样本在两个主成分分析图中均聚集在一起，说明检测期间仪器稳定，采集数据的重复性好。同时结果还显示，AM06培养上清中的代谢物与BAA-835的培养上清代谢物较接近，AM02与BAA-835的培养上清代谢物差异较大。
各菌株之间差异代谢物的数量比较结果可参见表1。可见AM02与标准株BAA-835相比，正离子(pos)模式检测的差异代谢物和负离子(neg)模式检测的差异代谢物分别为205和135个，AM06与标准株BAA-835相比，正离子(pos)模式检测的差异代谢物和负离子(neg)模式检测的差异代谢物分别为111和62个。
表1.差异代谢物统计表
Figure BDA0003684157570000181
实施例4.嗜粘蛋白阿克曼菌的功效验证
4.1.嗜粘蛋白阿克曼菌对于人工胃液的耐受性
4.1.1.实验方法及分组
表2.实验分组
Figure BDA0003684157570000182
表3.实验方法
Figure BDA0003684157570000183
“+”表示需要检测。
4.1.1.1.取嗜粘蛋白阿克曼菌菌种1支，去除标签，75％(v/v)酒精对甘油冻存管外表面进行擦拭消毒，涡旋振荡混匀，开启。吸取100～500μL菌液接种至10mL/管的BHI肉汤中，摇匀，共制备3管，同时不接菌作阴性对照，置于37℃厌氧培养2～4天，得一级种子液。
一级种子液进行革兰氏染色镜检，应为G-杆菌，无芽孢，无杂菌。
4.1.1.2.取上述一级种子液10mL，12000×g、4℃离心10min，弃上清，加入1mL0.9wt％的NaCl溶液重悬，分别制得菌液，备用。
4.1.1.3.按表2和表3将AM06、AM02及标准菌株的菌液分别加入至0.9wt％NaCl、pH3.0以及pH2.0的人工胃液中，混匀，分装成5mL/管，置于厌氧手套箱37℃孵育0h、1.5h以及3h后取出检测各样品的菌浓度。每个实验组做3个平行。
4.1.1.4.活菌数测定：
取实验样品，按10倍系列梯度稀释为不同的稀释度，取100μL稀释液接种至BHA平板上，涂布均匀，每个稀释度共做2个平皿，一般做2～3个稀释度，同时取稀释液100μL于BHA平板上，作为阴性对照，所有涂布平皿正置，于厌氧条件下培养约3～5天，观察平皿上菌落生长情况，并计数。
根据2个平皿菌落数之和按下列公式计算活菌数：
活菌数(CFU/mL)＝2个平皿菌落数之和/2×10×最终稀释度
存活率计算：
Figure BDA0003684157570000191
4.1.2.实验结果
实验结果可参见表4。不同嗜粘蛋白阿克曼菌株的人工胃液耐受性自高到低依次为AM02＞AM06＞标准株BAA-835。
表4.嗜粘蛋白阿克曼菌人工胃液耐受性存活率结果统计表
Figure BDA0003684157570000192
4.2.嗜粘蛋白阿克曼菌对于人工肠液的耐受性
4.2.1.实验方法及分组
表5.实验分组
Figure BDA0003684157570000193
4.2.1.1.一级种子液制备
取嗜粘蛋白阿克曼菌菌种1支去除标签，75％(v/v)酒精对甘油冻存管外表面进行擦拭消毒，涡旋振荡混匀，开启。吸取100μL菌液接种至10mL/管的BHI肉汤中，摇匀，共制备3管，同时不接菌作阴性对照，置于37℃厌氧培养2～4天，得一级种子液。
一级种子液进行革兰氏染色镜检，应为G-杆菌，无芽孢，无杂菌。
4.2.1.2.菌泥制备
分别上述一级种子液分装成1.5mL/管，12000×g、离心10min，弃上清，制得菌泥，AM06、AM02及标准菌株各制备3管菌泥。
4.2.1.3.菌株人工肠液耐受性评价
如表5和表6所示，向制得的菌泥中每管分别加入1.5mL人工肠液，混匀，然后每管溶液按照0.5mL/支进行分装，分装3管，分别于37℃厌氧孵育0、4h和8h，取样检测活菌数。每组各做3个平行。
表6.实验方法
Figure BDA0003684157570000201
“+”表示需要检测。
4.2.1.4.活菌数测定
分别取孵育后的样品，10倍梯度系列稀释后，取100μL稀释液接种至BHA平板上，涂布均匀，每个稀释度共做2个平皿，一般做2～3个稀释度，同时取100μL稀释液于BHA平板上，作为阴性对照，所有涂布平皿正置，于厌氧条件下培养约3～5天，观察平皿上菌落生长情况，并计数。
活菌数(CFU/mL)＝2个平皿菌落数之和/2×10×最终稀释度
存活率计算：
存活率＝各时间点活菌数/对应0h活菌数×100％
4.2.2.实验结果
结果可参见表7，ATCC BAA-835、AM02、AM06菌株人工肠液耐受性良好，耐受性自高到低依次为AM02＞AM06＞标准株BAA-835。
表7.存活率统计表
Figure BDA0003684157570000202
4.3.嗜粘蛋白阿克曼菌对TNF-α和IFN-γ诱导Caco2细胞紧密连接蛋白ZO-1表达的影响
TNF-α：肿瘤坏死因子-α；IFN-γ：干扰素-γ。
4.3.1.实验方法和分组
将Caco2细胞接种至96孔板培养至汇合度为80％～90％，使用100ng/mL TNF-α+100ng/mL IFN-γ诱导Caco2细胞24h后，再分别加入AM02、AM06、BAA-835继续与细胞孵育24h，实验分组可参见表8，每组做5个复孔。使用免疫荧光法观察BAA-835、AM06和AM02对TNF-α和IFN-γ诱导Caco2细胞紧密连接蛋白ZO-1表达的影响。
表8.实验分组
Figure BDA0003684157570000211
4.3.2.实验结果
对拍摄的图片进行荧光强度统计，结果可参见图6和表9。与空白对照组相比，经过TNF-α和IFN-γ诱导48h后炎症模型组细胞间隙的荧光强度显著减弱，说明ZO-1蛋白表达减少，细胞间的紧密连接被破坏。与炎症模型组相比，给予AM02、AM06、BAA-835干预后细胞的处理组荧光强度显著增加(p<0.05)，且AM02和AM06抑制炎症因子诱导Caco2细胞ZO-1蛋白减少的能力显著优于BAA-825(p<0.05)。
表9.荧光强度统计
编号 组别 荧光强度
A 空白对照组 36.2647±5.8977**
B 炎症模型组 25.6588±4.5303
C AM02组 41.7059±6.5664**aa
D AM06组 40.2949±4.5437**aa
E BAA-835组 33.6688±4.13336**
注：**表示与模型组比较，差异极显著p<0.01；aa表示与BAA-835组相比，差异极显著p<0.01。
实施例5.嗜粘蛋白阿克曼菌诱导NCI-H716细胞分泌GLP-1
5.1.实验方法和分组
取生长对数期的NCI-H716细胞，离心弃上清，加入0.02g/L BSA溶液混选细胞，按3×106个/孔的接种量接种至6孔板，培养2h后，按表10实验分组向细胞中加入适量的0.02g/L牛血清白蛋白(BSA)溶液、AM02、AM06、BAA-835继续与细胞孵育36h，收集上清，使用ELISA法检测上清中的GLP-1的含量。
表10.实验分组
编号 组别 受试物
A 空白对照组 /
B AM02组 1×10<sup>8</sup>CFU/mL AM02
C AM06组 1×10<sup>8</sup>CFU/mL AM06
D BAA-835组 1×10<sup>8</sup>CFU/mL BAA-835
5.2.实验结果
实验结果可参见表11。加入AM02、AM06、BAA-835后均可显著诱导NCI-H716细胞分泌大量的GLP-1(p<0.01)，且与BAA-835相比，AM02和AM06诱导的GLP-1的含量显著增高(p<0.05)。
表11.GLP-1含量(pg/mL)
编号 组别 GLP-1含量(pg/mL)
A 空白对照组 134.5±28.34
B AM02组 536.56±17.35**a
C AM06组 573.45±23.21**a
D BAA-835组 475.46±34.14**
注：**表示与模型组比较，差异极显著p<0.01；a表示与BAA-835组相比，差异显著p<0.05。
实施例6嗜粘蛋白阿克曼菌防治自发性2型糖尿病小鼠模型的药效实验
6.1.实验设计及方法
实验动物：SPF级db/db小鼠，雄性，4～5周龄，100只；SPF级C57BL/KsJ小鼠，雄性，4～5周龄，10只。实验期间饲养场地：SPF级小鼠房。
实验分组：空白组为C57BL/KsJ小鼠，10只动物。其余实验组为db/db小鼠，分为：模型组、阳性药组(索马鲁肽，0.36mg/kg，皮下注射)、AM06低剂量组(106CFU/mL)、AM06中剂量组(108CFU/mL)、AM06高剂量组(1010CFU/mL)、AM02中剂量组(108CFU/mL)、ATCC BAA-835中剂量组(108CFU/mL)，以及AM06、AM02和BAA-835的灭活菌组(各组给药剂量均为108个/mL)，每组10只动物。一周适应期后，并各组开始给予相应药物。实验的第1天至第42天，各组小鼠给予正常饮食，各组每天给药1次。第43天对各组小鼠进行取材。
实验设计检测：
实验第43天，小鼠禁食12小时后用CO2对动物实施安乐死。心脏穿刺采集血样用于检测检测血糖和胰岛素含量。记录终末体重和肝脏重量。取小鼠肝脏组织，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋，5μm切片，HE染色，光镜下观察肝脏病理学改变并对脂肪变性作评分。脂肪变性评分标准：0分表示肝细胞内脂滴散在，稀少，基本正常；1分表示含脂滴的肝细胞不超过1/4；2分表示含脂滴的肝细胞不超过1/2；3分表示含脂滴的肝细胞不超过3/4；4分表示肝组织几乎被脂滴代替。
6.2.实验结果
各检测指标结果可参见表12和表13。
表12.各项检测指标统计(mean±SD，n＝10)
Figure BDA0003684157570000231
表13.
Figure BDA0003684157570000232
表12和表13中，
注1：*表示与模型组比较，差异显著p<0.05，**表示与模型组比较，差异极显著p<0.01；
注2：a表示与BAA-835中剂量组比较，差异显著p<0.05，aa表示与BAA-835中剂量组比较，差异极显著p<0.01；
注3：b表示与BAA-835中剂量组比较，差异显著p<0.05，bb表示与BAA-835中剂量组比较，差异极显著p<0.01。
6.2.1.小鼠体重
如表12所示，与空白组相比，模型组小鼠的体重显著增加(p<0.01)。与模型组相比，AM06中高剂量组，AM02中剂量组，AM06灭活菌组和AM02灭活菌组均可显著减少体重(p<0.05)，其余各个给药组有减少小鼠体重的趋势，但无显著性差异。且AM06中剂量组的体重显著低于BAA-835中剂量组(p<0.05)，AM02中剂量组的体重有低于BAA-835中剂量组的趋势。AM02和AM06灭活菌组的体重要显著低于BAA-835灭活菌组。说明AM02和AM06的活菌和灭活菌在减少糖尿病鼠体重增长的疗效要优于BAA-835活菌和灭活菌。
6.2.2.小鼠的血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数
如表12和表13所示，与空白组相比，模型组小鼠的血糖水平、胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均显著增加(p<0.01)，说明模型组小鼠出现高血糖和高胰岛素血症，即胰岛素抵抗。与模型组相比，各个给药组可不同程度地降低动物血糖和胰岛素水平，并显著降低了胰岛素抵抗指数(p<0.01)。且在同等剂量水平下，AM06和AM02的活菌或灭活菌的胰岛素抵抗指数要显著优于BAA-835的活菌或灭活菌。说明AM02和AM06的活菌和灭活菌在降糖和减少胰岛素抵抗的疗效要优于BAA-835活菌和灭活菌。
6.2.3.小鼠肝脏病理评分
对各组小鼠进行肝脏病理HE染色，根据切片的脂肪变性程度进行评分积分，结果可参见表13。与空白对照组相比，模型组的肝脏脂肪变性评分显著增加(p<0.01)，说明动物出现脂肪肝。与模型组相比，各个给药组均可不同程度地降低肝脏脂肪变性积分，且AM06和AM02的中低剂量组可显著降低肝脏脂肪变性评分(p<0.05)。在同等剂量水平下，AM02和AM06的活菌或灭活菌的肝脏脂肪变性评分有低于BAA-835活菌或灭活菌的趋势，说明AM02和AM06的活菌和灭活菌在减少肝脏脂肪累积的疗效要略优于BAA-835活菌和灭活菌。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼菌AM02和AM06能够有效防治小鼠自发的2型糖尿病，减少体重，降低空腹血糖和胰岛素水平，减少胰岛素抵抗并减少肝脏脂肪累积，且各菌株的疗效AM06＞AM02＞BAA-835。
实施例7.嗜粘蛋白阿克曼菌防治小鼠1型糖尿病的药效实验
7.1.实验动物：SPF级NOD小鼠，雌性，4～5周龄，80只；SPF级BALB/c小鼠，雌性，4～5周龄，10只。实验期间饲养场地：SPF级小鼠房。
实验分组：空白组为BALB/c小鼠，10只动物。其余实验组为NOD小鼠，分为：模型组、阳性药组(甘精胰岛素，50IU/kg，皮下注射)、AM06组(108CFU/mL)、AM02组(108CFU/mL)、ATCCBAA-835组(108CFU/mL)，AM06灭活菌组(108个/mL)、AM02灭活菌组(108个/mL)、ATCC BAA-835灭活菌组(108个/mL)，每组10只动物。一周适应期后，并各组开始给予相应药物，各组每天给药1次，给予24周。第43天对各组小鼠进行取材。
实验设计
每周取尾静脉血1滴，用快速血糖仪测定随机血糖，在连续两个读数中，等于或大于12.0mmol/L则认为是糖尿病。
实验结束后，取小鼠胰腺组织，多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察对胰岛炎作评分。胰岛淋巴细胞浸润的严重程度按下列标准记分：0分：胰岛周围无淋巴细胞浸润；1分：胰岛周围局部淋巴细胞浸润；2分：胰岛内有部分淋巴细胞浸润，范围<1/3；3分：胰岛内有较多淋巴细胞浸润，范围l/3～l/2；4分：胰岛内有大量淋巴细胞浸润，范围>1/2，但未达100％；5分：全胰岛炎。
7.2.实验结果
检测结果可参见表14。
表14.各组动物实验的检测结果
Figure BDA0003684157570000251
注1：*表示与模型组比较，差异显著p<0.05,**表示与模型组比较，差异极显著p<0.01；
注2：a表示与BAA-835中剂量组比较，差异显著p<0.05,aa表示与BAA-835中剂量组比较，差异极显著p<0.01；
注3：b表示与BAA-835中剂量组比较，差异显著p<0.05,bb表示与BAA-835中剂量组比较，差异极显著p<0.01。
7.2.1.糖尿病发病率
如表14所示，与空白组相比，随着小鼠的周龄增加，模型组小鼠的糖尿病发病率逐步增加，且至实验结束发病率可达90％。与模型组相比，各个给药组不同程度地减少和延缓了糖尿病的发生。且AM02和AM06的活菌和灭活菌在减少糖尿病发病的效果要略优于BAA-835活菌和灭活菌。
7.2.2.胰岛炎性积分
如表14所示，与空白组相比，模型组小鼠胰岛炎性积分显著增加(p<0.01)，说明模型组小鼠出现胰岛炎。与模型组相比，各个给药组可不同程度地降低动物胰岛炎性积分，阳性药组，AM06组和AM02组显著降低胰岛炎性积分(p<0.05)。其中AM06组和AM02组的胰岛炎性积分要显著低于BAA-835组，AM06和AM02灭活菌组的胰岛炎性积分有低于BAA-835灭活菌组的趋势。说明AM02和AM06的活菌和灭活菌在减少胰岛炎性积分的效果要优于BAA-835活菌和灭活菌。
综上所述，嗜粘蛋白阿克曼菌AM02和AM06能够有效防治小鼠自发的1型糖尿病，减少和延缓糖尿病的发病并减少胰岛炎，且各菌株的疗效AM06＞AM02＞BAA-835。
实施例8.嗜粘蛋白阿克曼菌与阿卡波糖联用降低小鼠餐后血糖
8.1.实验方法
实验动物：SPF级C57/BL小鼠，雄性，4～5周龄，70只；实验期间饲养场地：SPF级小鼠房。
实验分组和造模：取10只动物作为空白组，实验期间喂食普通饲料且不注射STZ(链佐霉素)。其余动物高脂饲料喂养4周后，腹腔注射STZ 150mg/kg，然后挑选随机血糖大于16.7mmol/L的动物随机分为模型组、阿卡波糖组(30mg/kg)、AM06组(109CFU/只)、阿卡波糖+AM06组(30mg/kg的阿卡波糖+109CFU/只的AM06)，每组10只动物。分组后，除空白组外的动物继续喂养高脂饲料，各组开始给予相应药物，每天给药1次，持续3周。
血糖检测：实验终点时，所有动物禁食16h，检测动物的空腹血糖。然后按2g/kg的剂量灌胃给予动物淀粉溶液，检测动物餐后1h和2h的血糖值。
8.2.实验结果
实验结果可参见表15。与空白组相比，模型组的空腹血糖、餐后1h和2h的血糖值均显著升高(p<0.01)。与模型组相比，阿卡波糖组、AM06组、阿卡波糖+AM06组的空腹血糖、餐后1h和2h的血糖值均有不同程度的降低(p<0.05或p<0.01)，且阿卡波糖+AM06组与阿卡波糖组比较更能降低空腹血糖和餐后血糖(p<0.05)。
表15.各组动物的血糖检测结果
Figure BDA0003684157570000261
注1：*表示与模型组比较，差异显著p<0.05，**表示与模型组比较，差异极显著p<0.01；
注2：a表示与阿卡波糖组比较，差异显著p<0.05，aa表示与阿卡波糖组比较，差异极显著p<0.01。
以上各实施方式和实施例的各技术特征可以进行任意合适方式的组合，为使描述简洁，未对上述实施方式和实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为在本说明书记载的范围中。
以上各实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对本发明保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，得到的等价形式同样落于本发明的保护范围。还应当理解，本领域技术人员在本发明提供的技术方案的基础上，通过合乎逻辑的分析、推理或者有限的试验得到的技术方案，均在本发明所附权利要求的保护范围内。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求的内容为准，说明书及附图可以用于解释权利要求的内容。

Claims (10)

1.嗜粘蛋白阿克曼菌在制备防治糖尿病的药物组合物或者在制备改善血糖水平的保健品组合物中的应用，其特征在于，所述嗜粘蛋白阿克曼菌为嗜粘蛋白阿克曼菌AM06、嗜粘蛋白阿克曼菌AM02或者两者的组合；其中，
所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM06于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22793；
所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM02于2021年06月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.22794。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM06和所述嗜粘蛋白阿克曼菌AM02各自独立地为活菌、灭活菌或者活菌和灭活菌的组合。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述糖尿病包括1型糖尿病、2型糖尿病、特殊类型糖尿病和妊娠期糖尿病中至少一种。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述改善血糖水平的方式包括诱导分泌GLP-1和减少胰岛素抵抗中至少一种。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物组合物包括所述嗜粘蛋白阿克曼菌和药学上可接受的载体；及/或，
所述保健品组合物包括所述嗜粘蛋白阿克曼菌和可食用原辅料。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物组合物为药品，其剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、溶液剂、混悬剂、乳剂、霜剂、喷雾剂、滴剂、贴剂或管饲制剂；和/或，
所述保健品组合物为保健食品，其剂型为丸剂、片剂、颗粒剂、胶囊、溶液剂、混悬剂或乳剂。
7.含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物在制备或作为防治糖尿病的药品或者在制备或作为改善血糖水平的保健食品中的应用，其特征在于，所述嗜粘蛋白阿克曼菌如权利要求1或2中所定义。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物还包括第二活性成分，所述第二活性成分至少包括α-糖苷酶抑制剂；及/或，
所述含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物为复合益生菌，所述复合益生菌还包括不同于所述嗜粘蛋白阿克曼菌的益生菌。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述α-糖苷酶抑制剂选自阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇中的一种或多种。
10.含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物，其特征在于，所述嗜粘蛋白阿克曼菌如权利要求1或2中所定义；
优选地，所述含有嗜粘蛋白阿克曼菌的组合物还包括第二活性成分，所述第二活性成分至少包括α-糖苷酶抑制剂；
优选地，所述α-糖苷酶抑制剂选自阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇中的一种或多种。
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