CN117050914B - 一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在改善glp-1分泌量中的应用 - Google Patents

一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在改善glp-1分泌量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在改善GLP‑1分泌量中的应用，嗜黏蛋白阿克曼氏菌为嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT‑AKK015，于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28065。嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT‑AKK015能改善肠道内环境，修复受损的肠道粘膜细胞，提高肠道L细胞数量，改善GLP‑1分泌量，使GLP‑1分泌处于正常水平，使胰腺功能从根本上得到修复，同时还能提高人体基础代谢率，对于肥胖人群可以促进减肥，对于消瘦人群可以促进营养物质的吸收，双向调节人体糖脂代谢至正常水平。

Description

一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在改善GLP-1分泌量中的应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，尤其涉及一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌及其在改善GLP-1分泌量中的应用。
背景技术
糖脂代谢是机体能量转化的重要代谢通路，如果胰岛细胞、胃肠黏膜细胞及体内各个脏器受损，就容易导致机体糖脂代谢异常，容易诱发糖尿病、肥胖、厌食症、皮包骨、脂肪肝和动脉硬化等各种代谢类疾病。
市面上对于人体糖脂代谢干预的方式，主要是抑制食欲，加速燃脂，促进激素分泌等减肥方向，同时还需配合多运动。相关产品的方向较为单一且不可持续，对消瘦人群的糖脂代谢异常不能很好的改善，不能从根本上调节糖脂代谢至正常水平，不能从根本上解决由机体胰岛细胞受损、肠道微环境失衡导致的肥胖/消瘦等体征及其引发的代谢类疾病。因此，需要一款可以双向调节糖脂代谢，提高人体基础代谢速率，修复胰腺功能的产品。
GLP-1是一种由30个氨基酸组成的肠肽激素，主要由L细胞通过前胰高血糖素(Gcg)基因的翻译加工产生，血液中的GLP-1主要是由L细胞合成。GLP-1在分泌后被二肽基肽酶-IV(DPP-IV)快速降解，因此只有分泌总量的10-15％能进入体循环并发挥降血糖活性。GLP-1通过刺激葡萄糖依赖型的胰岛素合成与分泌，抑制胰高血糖素的分泌，由于它有血糖依赖性，仅在血糖浓度高于空腹水平时进行降血糖，不会因持续的降糖而导致低血糖症的发生，故可作为血糖稳态的有益因素。筛选一种能够从根源处改善GLP-1分泌量，保护人体胰腺健康的有益菌具有重要意义。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一株嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015。
本发明的目的之二在于提供嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌为嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.28065，名称为FMT-AKK015。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
本发明提供了一种改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的产品，所述产品的活性成分包括目的之一所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的活菌体、灭活菌体、溶胞产物、发酵物、提取物、培养液和上清液中的一种或任意组合。
作为本发明的一个优选方案，所述改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的产品包括药品。
作为本发明的一个优选方案，所述提高机体基础代谢率为提高受试者的机体基础代谢率，所述受试者包括哺乳动物，优选为人类，也可以为猫、狗、猪、鼠、牛、羊等动物。
本发明提供了一种改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的冻干粉，所述冻干粉中的菌株包括目的之一所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015。
作为本发明的一个优选方案，本发明所提供的冻干粉，除了包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015外，还可以包括其他菌株，通过不同种类的菌株联合使用，可以同时发挥多种功效。在制备冻干粉时，可以包括冻干保护剂，通过冻干保护剂对嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015进行保护，以提高其活性。
本发明提供了一种改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的发酵制品，由菌株对中药组合物发酵而成，所述菌株包括目的之一所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015；所述中药组合物包括山药20-80份，葛根10-50份，麦冬10-60份。
作为本发明的一个优选方案，所述改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的发酵制品，由菌株对中药组合物发酵而成，所述菌株包括目的之一所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015；所述中药组合物包括山药50份，葛根30份，麦冬20份。
本发明所提供的中药组合物中的各原料均属于药食同源成分。
其中，山药富含粘液蛋白、多糖及糖蛋白复合体，能够修复人体内各脏器的氧化损伤，改善血糖血脂代谢紊乱的情况，有利于减少皮下脂肪堆积，避免肥胖的发生和发展。
葛根富含葛根素，可以通过调节炎症因子的表达抑制炎症反应，降低氧化应激等作用来实现血糖改善，有利于降低糖尿病患者和动物的血糖、减轻体质量、改善糖耐量和胰岛素抵抗。
麦冬含有麦冬寡糖，能够降低糖尿病人群的空腹血糖值，改善口服葡萄糖耐量，促进胰岛β细胞、肝脏及脂肪INSR、IRS-1的表达上调，提高机体对胰岛素的敏感性，有利于防治Ⅱ型糖尿病。
本发明所提供的中药组合物，优选采用生鲜的山药、生鲜的葛根和生鲜的麦冬，这些生鲜的药食同源原料，可以更全面更充分地保留了天然蛋白质、糖类及功效因子，本发明的中药组合物作为中药配方，药效温和，可以改善GLP-1分泌量，有利于调节糖脂代谢至正常水平，提高人体基础代谢率。
作为本发明的一个优选方案，所述改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的发酵制品，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015对所述中药组合物进行发酵时，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的添加量为所述中药组合物的5～10％，优选地为5％。
本发明还提供了一种改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的肠道定位释放混悬剂，包括发酵制品，还包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015菌粉和辅料。其中，所述发酵制品由嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansiamuciniphila)FMT-AKK015对中药组合物发酵而成，所述中药组合物包括山药20-80份，葛根10-50份，麦冬10-60份。
作为本发明的一个优选方案，所述肠道定位释放混悬剂，包括按照重量份计的以下组分：所述改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的发酵制品4-8份，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015菌粉1-5份，微晶纤维素40-50份，羧甲基纤维素钠6-10份，木薯淀粉10-14份，玉米淀粉8-12份，低聚半乳糖10-15份，抗性糊精2-8份，椰子油粉8-12份。
作为本发明的一个优选方案，所述肠道定位释放混悬剂，包括按照重量份计的以下组分：所述改善GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的发酵制品6份，嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015菌粉3份，微晶纤维素45份，羧甲基纤维素钠8份，木薯淀粉12份，玉米淀粉10份，低聚半乳糖13份，抗性糊精5份，椰子油粉10份。
作为本发明的一个优选方案，在所述肠道定位释放混悬剂中，所述发酵制品与所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015菌粉的重量比为(2-3)：(1-4)，优选为2：(1-4)，更加优选地为2：1。
本发明还提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015在制备以下(Ⅰ)～(Ⅵ)项产品中至少一项中的应用，所述产品包括药品；
(Ⅰ)在制备改善GLP-1分泌量产品中的应用；
(Ⅱ)在制备提高机体基础代谢率产品中的应用；
(Ⅲ)在制备预防、减缓和/或修复肠道粘膜细胞受损产品中的应用；
(Ⅳ)在制备增加肠道L细胞数量产品中的应用；
(Ⅴ)在制备双向调节受试者糖脂代谢产品中的应用；
(Ⅵ)在制备改善受试者胰腺功能产品中的应用。
其中，所述双向调节受试者糖脂代谢，包括：预防、减缓和/或治疗消瘦人群糖脂代谢异常，以及，预防、减缓和/或治疗肥胖人群糖脂代谢异常。
本发明所提供的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015可以双向调节受试者糖脂代谢，可以让肥胖人群达到减肥的目的，也可以让消瘦人群达到促进营养物质吸收的目的。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所提供的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015有利于修复胰腺功能，提高人体基础代谢率，效果显著，健康安全。
(2)本发明所提供的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015，是一种可以定殖于肠道的有益微生物，能够改善肠道内环境，修复受损的肠道粘膜细胞，提高肠道L细胞的数量，改善GLP-1分泌量，使GLP-1分泌处于正常水平，使胰腺功能可以从根本上得到修复，同时还能提高人体基础代谢率，对于肥胖人群可以促进减肥，对于消瘦人群可以促进营养物质的吸收，双向调节人体糖脂代谢至正常水平。
(3)本发明所提供的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015，天然、安全、疗效可持续，可以被广泛应用。
(4)本发明提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的发酵物创新配方，除了选用新鲜的组合物(山药、葛根、麦冬)进行发酵，还特别选用嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015进行发酵，使得发酵物能够显著性地双向改善GLP-1分泌量，促进胰腺功能的修复，提高基础代谢率。
(5)本发明提供了嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的发酵物创新工艺，除了进行菌株接种及发酵，还涵盖微波破壁、超临界制粒技术，使得发酵物的功能性成分含量及生物利用度能够显著性提高，人体食用后，在胰腺养护方面效果更为显著。
(6)本发明还提供嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的菌粉及发酵物的创新应用，即，将菌粉及发酵物按照最佳比例进行配伍，再搭配其他辅料制成肠道定位释放的混悬剂，能极大地提高产品在改善GLP-1分泌量、提高基础代谢率的功效。
生物保藏信息：
所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌的保藏编号为CGMCC No.28065，分类命名为：嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila，名称为FMT-AKK015，已于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过商业渠道购买获得。
在本发明实施例中，涉及的益生菌菌株包括：
嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015，于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，单位简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.28065。
嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)CICC 24917，购买于中国工业微生物菌种保藏管理中心。
嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)SHBCC D24814，购买于上海保藏生物技术中心，菌种编号为SHBCC D24814。
副干酪乳酪杆菌(Lacticaseibacillusparacasei)LBC-81-10，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为1.2744。
动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)No.8，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为1.2809。
发酵粘液乳杆菌(Limosilactobacillusfermentum)PCM 491，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为1.2029。
嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)IFFI 6005，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为1.3342。
植物乳植杆菌(Lactiplantibacillusplantarum)YJG，购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株编号为1.9087。
本发明所提供的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015具有以下生物学特性：
(1)菌体特征：单个菌体呈球形或椭球形，无芽孢，无鞭毛，直径＜1μm；
(2)菌落特征：白色的不透明菌落，菌落表面有白色丝状菌膜；
(3)生长特性：厌氧生长，适宜生长温度为37℃，适宜生长pH值为7.0；实施例1能够促进L细胞分泌GLP-1的菌株筛选
1、菌株准备
准备以下实验菌株：副干酪乳酪杆菌LBC-81-10、动物双歧杆菌乳亚种No.8、嗜粘蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015、发酵粘液乳杆菌PCM 491、嗜酸乳杆菌IFFI 6005、植物乳植杆菌YJG，分别编号A-F。
2、试剂制备
(1)MRS液体培养基
称取10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母提取物、2g K2HPO4、5g无水乙酸钠、20g葡萄糖、2g柠檬酸三铵、1mL吐温-80、0.2g MgSO4、0.05g MnSO4于烧杯中，加入1L蒸馏水，加热溶解，调节pH到7.0，在121℃的条件下灭菌20min，冷却后即得MRS液体培养基。
(2)MRS固体培养基
称取10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母提取物、2g K2HPO4、5g无水乙酸钠、20g葡萄糖、2g柠檬酸三铵、1mL吐温-80、0.2g MgSO4、0.05g MnSO4、20g琼脂于烧杯中，加入1L蒸馏水，加热溶解，调节pH到7.0，在121℃的条件下灭菌20min，冷却后即得MRS固体培养基。
(3)菌悬液
将冻存的菌株接入MRS液体培养基中，37℃培养18h，在4℃5000r/min离心5min，弃上清液，得菌泥，将菌泥按3％接种量接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下活化18h。用接种环沾取少量菌液在MRS固体培养基上进行三区划线，37℃条件下培养48h，挑取单菌落至MRS液体培养基中培养18h，连续活化三代后，作为菌悬液。对菌悬液进行血球计数板计数，用灭菌MRS液体培养基调整菌悬液浓度分别为109CFU/mL。
(4)发酵上清液
取10mL无菌离心管，加入9mL的MRS液体培养基和1mL活化后的菌悬液，用枪头多次吹打溶液并上下翻转溶液，使溶液分散均匀，于37℃厌氧环境培养48h，然后在4℃条件下以5000r/min的速率离心5min，用移液枪吸取部分上清液，在无菌条件下用0.22μm的滤膜过滤，获得无菌体的发酵上清液，于-20℃的条件下贮存。
(5)KRB缓冲液
119mM NaCl，5mM KCl，2.6mM KH2PO4，2.6mM MgSO4，2mM CaCl2，24.6mM NaHCO3和10mM HEPES，pH 7.0。
3、细胞模型构建
(1)NCI-H716细胞的培养
选用人源性细胞NCI-H716作为构建L细胞模型进行培养，以RPMI 1640(10％FBS)为培养基，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中进行培养。在细胞培养过程中，每隔1天更换1次培养液；换液时，将细胞悬浮液离心(1000r/min，3min)，用新的培养基将细胞重新悬浮、培养，按1:2进行传代。
(2)L细胞模型的构建
对Matrigel基质胶进行稀释，稀释方式为每70μL基质胶加入3.5mL DMEM。将稀释后的基质胶加入24孔板，在细胞培养箱中孵育24h，使其充分凝固，吸除多余的胶后用DMEM(10％FBS)培养基冲洗，晾干，置于4℃贮存。取生长状态良好的NCI-H716细胞，加入RPMI1640(10％FBS)培养基重悬细胞，利用血球计数板对细胞进行计数并调整细胞悬液浓度至1×106个/mL。分别取1mL细胞悬液加入用基质胶预处理的24孔板中，置于37℃、5％CO2培养箱培养48h。
4、实验方法
将发酵上清液从-20℃冰箱取出，室温解冻后，以1:1的比例分别配置不同菌株的发酵上清液与KRB缓冲液的混合溶液，在超净台紫光灯下灭菌1h。移取1mL KRB缓冲液与发酵液的混合溶液于含有L细胞模型的24孔板，同时加入抑制GLP-1分解的苯甲基磺酰氟(PMSF)至终浓度为50μg/mL，于37℃、5％CO2温育5h。培养结束后，分别收集上清液，于2000r/min下离心10min，收集上清液并加入5μLPMSF，混合均匀后，于-20℃的条件下贮存。使用ELISA试剂盒测定上清液中GLP-1的含量，结果如表1所示。
5、结果与分析
表1不同菌种对L细胞分泌GLP-1的影响
由表1可得，菌株A、菌株B、菌株C、菌株E和菌株F均对L细胞分泌GLP-1有一定程度的促进作用，其中嗜粘蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的发酵液促进L细胞分泌GLP-1的效果最为显著，其上清液中GLP-1含量为60.0pg/mL，说明嗜粘蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015定殖于肠道后，其代谢产物能促进L细胞分泌GLP-1。
实施例2能够修复胰腺功能，提高人体基础代谢率的菌株筛选
一、高血糖小鼠模型实验
1、实验菌株准备
嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015、嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC 24917、嗜黏蛋白阿克曼氏菌SHBCC D24814
2、试剂制备
(1)菌悬液
将冻存的菌株接入MRS液体培养基中，37℃培养18h，在4℃5000r/min离心5min，弃上清液，得菌泥，将菌泥按3％接种量接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下活化18h。用接种环沾取少量菌液在MRS固体培养基上进行三区划线，37℃条件下培养48h，挑取单菌落至MRS液体培养基中培养18h，连续活化三代后，作为菌悬液。对菌悬液进行血球计数板计数，用灭菌MRS液体培养基调整菌悬液浓度分别为109CFU/mL。
(2)柠檬酸缓冲液
称取柠檬酸2.1g，加入双蒸水100mL，即得A液。称取柠檬酸钠2.94g，加入双蒸水100mL，即得B液。将A液、B液按照1：1的比例混合，调节pH值为4.2，即得柠檬酸缓冲液。
(3)链脲佐菌素(STZ)溶液
用柠檬酸缓冲液以1％的浓度溶解链脲佐菌素(STZ)，即得链脲佐菌素(STZ)溶液。
3、高血糖小鼠模型
选用50只雄性C57BL/6J小鼠，鼠龄为2个月左右，随机分为5组：空白组、高血糖模型组、实验A组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC 24917)、实验B组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015)和实验C组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌SHBCC D24814)。鼠房温度为25±2℃，湿度为57±3％，12小时昼夜交替，基础饲料适应性喂养一周。
从第2周开始，高血糖模型组、实验A组-C组喂养高脂高糖饲料。3周后，高血糖模型组、实验A组-C组分别以100mg/kg的剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液，连续注射7天，构建糖尿病模型，测定小鼠随机血糖，血糖值高于11.1mmol/L的为糖尿病模型成功小鼠；同时，空白组注射同等剂量的柠檬酸缓冲液作为对照。
3、血液样本收集：实验结束时，五组小鼠均隔夜禁食12h后，将禁食过夜的小鼠用4％的水合氯醛腹腔注射麻醉后，打开腹腔，找到肝门静脉插管，并用细线结扎空肠部分，用浓度为10mg/kg体重的菌悬液直接给药在结扎的空肠上，空白组和模型组注射同等量的生理盐水，具体注射情况见表2。收集在肠道内给药0、15、30min时各组的肝门静脉血浆，血浆保存在抗凝管中，在-20℃的条件下保存，用GLP-1小鼠试剂盒测量GLP-1分泌情况，结果如表3所示。
表2注射情况分组表
组别 注射情况
空白组 生理盐水
高血糖模型组 生理盐水
A组 109CFU/mL嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC24917菌悬液
B组 109CFU/mL嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015菌悬液
C组 109CFU/mL嗜黏蛋白阿克曼氏菌SHBCCD24814菌悬液
5、基础代谢率(BMR)测定
以封闭式流体压力呼吸计测定动物的BMR。呼吸室容积为3.6L，以KOH吸收呼吸室内的CO2，以干燥硅胶吸收水分。BMR测定温度为28±1℃。
收集肝门静脉血浆后，将小鼠转移至呼吸室内适应1h，待动物稳定后，每隔5min记录1次，连续测定60min。选取2个连续稳定的最低值计算BMR(mLO2/h)，并校正到标准状态下(1个大气压，0℃)。根据在呼吸商约等于1的情况下，动物消耗1mLO2的能量支出等于20.9kJ，将BMR单位由mLO2/h换算为kJ/d。结果如表3所示
6、结果与分析
表3不同菌株对高血糖模型小鼠的影响
由表3可得，不同株的嗜粘蛋白阿克曼氏菌对高血糖模型小鼠肠道的GLP-1释放均有不同程度的促进作用，其中，效果最为显著的是B组，即嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015实验组。在30min时，实验B组能使小鼠血浆中GLP-1含量达到63.1pg/mL，有利于降低血糖，使血糖趋于正常水平，保护胰腺健康。在基础代谢方面，不同株的嗜粘蛋白阿克曼氏菌都能不同程度地提高高血糖模型小鼠的基础代谢率，其中，B组小鼠的BMR值最高，为86kJ/d，与空白组相比有显著性差异。
二、低血糖小鼠模型实验
1、实验菌株
嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015、嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC 24917、嗜黏蛋白阿克曼氏菌SHBCC D24814
2、菌悬液制备
将冻存的菌株接入MRS液体培养基中，37℃培养18h，在4℃5000r/min离心5min，弃上清液，得菌泥，将菌泥按3％接种量接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下活化18h。用接种环沾取少量菌液在MRS固体培养基上进行三区划线，37℃条件下培养48h，挑取单菌落至MRS液体培养基中培养18h，连续活化三代后，作为菌悬液。对菌悬液进行血球计数板计数，用灭菌MRS液体培养基调整菌悬液浓度分别为109CFU/mL。
3、低血糖小鼠模型
选用出生后31天的雄性ICR小鼠50只，随机分为5组：空白组、低血糖模型组、实验A组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC 24917)、实验B组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015)和实验C组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌SHBCC D24814)。鼠房温度为25±2℃，湿度为57±3％，12小时昼夜交替，基础饲料适应性喂养一周后。每天上午9:00，实验A组-C组以10mL/kg的剂量分别灌胃109CFU/mL的菌悬液，空白组和低血糖模型组灌胃相同剂量的生理盐水，连续30天。具体灌胃情况见表4。
第31天时，低血糖模型组、实验A组-C组小鼠注射10U/kg胰岛素建立低血糖模型，在注射胰岛素约20min后小鼠出现低血糖症状，即表现出呆滞、后肢无力、间歇性惊厥、翻正反射消失、角弓反张，甚至昏迷等低血糖症状，说明造模成功，空白组注射等剂量的生理盐水。观察各组小鼠的存活情况，注射3h后，低血糖小鼠使用0.1mL 50％葡萄糖灌胃挽救，空白组注射等剂量的50％葡萄糖，计算小鼠的存活率，并收集各组的肝门静脉血浆，血浆保存在抗凝管中，在-20℃的条件下保存，用GLP-1小鼠试剂盒测量GLP-1分泌情况，结果如表5所示。
表4灌胃情况分组表
组别 灌胃情况
空白组 生理盐水
低血糖模型组 生理盐水
A组 109CFU/mL嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC24917菌悬液
B组 109CFU/mL嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015菌悬液
C组 109CFU/mL嗜黏蛋白阿克曼氏菌SHBCCD24814菌悬液
4、基础代谢率(BMR)测定
以封闭式流体压力呼吸计测定动物的BMR。呼吸室容积为3.6L，以KOH吸收呼吸室内的CO2，以干燥硅胶吸收水分。BMR测定温度为28±1℃。
收集肝门静脉血浆后，将小鼠转移至呼吸室内适应1h，待动物稳定后，每隔5min记录1次，连续测定60min。选取2个连续稳定的最低值计算BMR(mLO2/h)，并校正到标准状态下(1个大气压，0℃)。根据在呼吸商约等于1的情况下，动物消耗1mLO2的能量支出等于20.9kJ，将BMR单位由mLO2/h换算为kJ/d。结果如表5所示。
5、结果与分析
表5不同菌株对低血糖模型小鼠的影响
注射胰岛素28min后低血糖模型组小鼠开始出现死亡，随着低血糖时间的延长，低血糖模型组小鼠的存活率显著下降。由表5可得，低血糖模型组小鼠的存活率仅为50％；菌组在注射胰岛素后，实验A组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌CICC 24917实验组)没有明显改善，实验B组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015实验组)和实验C组(嗜黏蛋白阿克曼氏菌SHBCCD24814实验组)低血糖症状明显减轻，甚至在规定时间给予葡萄糖灌胃前均无明显症状，其中实验B组表现最好，存活率为100％。实验B组的GLP-1数值与空白组接近，小鼠血浆中GLP-1的含量为22.1pg/mL，说明实验B组在低血糖使仍能保持GLP-1分泌量处于稳态。
在基础代谢方面，不同菌株对低血糖小鼠的基础代谢率的影响不同，与空白组相比，实验A组小鼠的基础代谢率没有明显改善，实验B组和实验C组小鼠的基础代谢率有明显提高，其中，实验B组小鼠的基础代谢率最高。
结合表3的实验结论，说明了补充嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015能够改善受试者的GLP-1分泌量，有利于修复胰腺功能，提高基础代谢率。本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015可以双向调节人体糖脂代谢至正常水平，既可以用于血糖水平偏高人群，也可以用于血糖水平偏低人群；既适用于肥胖人群，也适用于消瘦人群。
实施例3含有嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的发酵制品
一种含有嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的发酵制品，由嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的对中药组合物发酵而成，中药组合物包括山药50份，葛根30份，麦冬20份。发酵制品按照以下方法制备而成：
1、原料选择：选择新鲜的、表面完好无损伤、无病斑的山药、葛根、麦冬；
2、预处理：将山药、葛根、麦冬清洗干净，用不锈钢削皮器去皮后，称取山药50份、葛根30份、麦冬20份，再将山药和葛根切成4mm厚的薄片；
3、打浆：将处理好的山药片、葛根片及麦冬，用破壁机在速度12000r/min的条件下，处理1min，得到基料A；
4、灭菌：将基料A于150℃的条件下，加热灭菌2s，冷却后，得到基料B；
5、培养基制备：取蛋白胨5g/L、葡萄糖2g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、牛脑浸粉4g/L、牛心浸粉4g/L、酪蛋白胨16g/L、琼脂14.5g/L，调节pH为7.0，作为固体培养基。取蛋白胨10/L、葡萄糖2g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、牛脑浸粉12.5g/L、牛心浸粉5g/L，调节pH为7.0，作为液体培养基；
6、菌种活化：将嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的菌液平板(固体培养基)划线后，在37℃的条件下厌氧培养18h。挑取平板上的单菌落接种于液体培养基中，活化24h，得基料C；
7、发酵：将基料C按表6的比例接种基料B中，搅匀，在37℃的条件下厌氧培养24h，再转入4℃的环境中冷藏12h，得基料D；
8、离心：将基料D置于离心机中进行离心15min，离心条件为4000r/min，分离上清液及沉淀，上清液记为基料E，沉淀记为基料F；
9、微波破壁：向基料F中加入5倍4℃的水，再置于微波萃取机中，在微波功率为500W的条件下，处理1min，重复2次，得基料G；
10、水提：向基料G中加入15倍水，在45℃、300r/min的条件下，搅拌提取50min，然后经4000r/min离心15min，分离上清液及沉淀，收集上清液记为基料H，沉淀记为基料I；
11、醇沉：向基料H中加入3倍体积的乙醇(浓度为95％)，在300r/min的条件下，连续搅拌30min，静置18h后，置于离心机中离心15min，离心条件为4000r/min，收集沉淀，记为基料J；
12、醇提：向基料I中加入10倍体积的乙醇溶液(浓度为30％)，在100℃的条件下，保持90min，冷却至室温后，置于离心机中，在5000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入10倍体积的乙醇溶液(浓度为30％)，在100℃的条件下，保持90min，冷却至室温后，置于离心机中，在5000r/min的条件下离心15min，收集上清液记为基料M；将基料K和基料M合并，混匀后，得基料N；
13、浓缩：将基料N置于旋转蒸馏仪中，在-0.09MPa、60℃、18r/min的条件下，运行10h，得基料O；
14、冻干：将基料E、基料J、基料O搅拌混匀后，在-20℃的条件下预冻15h，之后在冷阱温度为-50℃、真空度为18Pa的条件下，冻干10h，得基料P；
15、超临界制粒：称取10份聚乙烯吡咯烷酮，加入基料P溶解混匀后，注入微粒生成釜中，同时将CO2注入微粒生成釜进行制粒，得发酵制品。其中，生成釜的参数设置为：有机溶液流量为9.2×10-2mL/s、微粒生成釜温度40℃、压力9.0MPa、CO2的流速为0.3m/s。
表6嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的接种添加量/％
a组 b组 c组 d组 e组 f组
0 1 3 5 7 9
采用“GB 5009.5-2016食品中蛋白质的测定”对发酵物的蛋白质进行含量检测，结果如表7。
采用“中国药典2020年版的葛根素含量测定”对发酵物的葛根素进行含量检测，结果如表7。
采用“硫酸-蒽酮法”对发酵物的总寡糖进行含量测定，结果如表7。
表7不同的发酵比例对发酵物指标的影响
由表7可得，实验a组嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的添加量为0，得到发酵制品其蛋白质、葛根素和总寡糖的含量在所有实验组别中均是最低的。而添加了嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015对中药组合物进行发酵，能够提高中药组合物中蛋白质、葛根素、总寡糖等功能性成分的含量，有利于改善GLP-1分泌量，预防血糖紊乱的发生和发展，同时可以保护胰岛β细胞，提高人体基础代谢率。结合3项指标的实验结果，实验d组发酵制品的蛋白质、葛根素、总寡糖的含量与实验e-f组无显著性差异，说明实验d组的发酵制品的各成分含量已达饱和状态，因此选择实验d组的嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的添加量作为最佳发酵比例，即5％。
此外，在发酵制品制备过程中，步骤9采用微波破壁技术，利用微波很强的穿透性和破碎细胞的能力，能够使细胞内的液态水气化时产生压力将细胞膜、细胞壁冲破，细胞收缩，导致孔洞和裂纹的形成，可促使提取溶剂进入细胞内溶解并释放出细胞内物质，有利于蛋白质、糖类、葛根素等有效成分充分地析出，极大地提高了提取效率。
且在步骤15中采用超临界制粒技术，利用同轴喷嘴喷出流体的速度差，将其中的有机溶液雾化为细小液滴，同时利用超临界流体(CO2)的抗溶剂作用，使溶解在有机溶剂中的溶质快速析出，从而形成微细颗粒。微粒生成釜温度为40℃，使得蛋白质、糖类、葛根素等功能性成分能够更好地保持活性，同时也能更好地结合成一个整体。此外，所得微细颗粒状的发酵制品，能够更好地被人体吸收利用，极大地提高了发酵物的生物利用度，人体食用此发酵制品后，能显著改善GLP-1分泌量、提高人体基础代谢率，保护胰腺健康。
实施例4含有嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的肠道定位释放混悬剂一、肠道定位释放混悬剂的制备
一种肠道定位释放混悬剂，制备原料包括以下组分：发酵制品、嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015菌粉、微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、木薯淀粉、玉米淀粉、低聚半乳糖、抗性糊精和椰子油粉，具体配方见下表8。
其中，发酵制品由嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015的对中药组合物发酵而成，中药组合物包括山药50份，葛根30份，麦冬20份。
表8肠道定位释放混悬剂配方表(重量份)
本发明实施例所提供的肠道定位释放混悬剂的制备方法包括以下步骤：
1、原料选择：选择新鲜的、表面完好无损伤、无病斑的山药、葛根、麦冬；
2、预处理：将山药、葛根、麦冬清洗干净，用不锈钢削皮器去皮后，称取山药50份、葛根30份、麦冬20份，再将山药和葛根切成4mm厚的薄片；
3、打浆：将处理好的山药片、葛根片及麦冬，用破壁机在速度12000r/min的条件下，处理1min，得到基料A；
4、灭菌：将基料A于150℃的条件下，加热灭菌2s，冷却后，得到基料B；
5、培养基制备：取蛋白胨5g/L、葡萄糖2g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、牛脑浸粉4g/L、牛心浸粉4g/L、酪蛋白胨16g/L、琼脂14.5g/L，调节pH为7.0，作为固体培养基。取蛋白胨10/L、葡萄糖2g/L、氯化钠5g/L、磷酸氢二钠2.5g/L、牛脑浸粉12.5g/L、牛心浸粉5g/L，调节pH为7.0，作为液体培养基；
6、菌种活化：将嗜黏蛋白阿克曼氏菌(Akkermansia muciniphila)FMT-AKK015的菌液平板(固体培养基)划线后，在37℃的条件下厌氧培养18h。挑取平板上的单菌落接种于液体培养基中，活化24h，得基料C；
7、发酵：将重量比为5％的基料C接种基料B中，搅匀，在37℃的条件下厌氧培养24h，再转入4℃的环境中冷藏12h，得基料D；
8、离心：将基料D置于离心机中进行离心15min，离心条件为4000r/min，分离上清液及沉淀，上清液记为基料E，沉淀记为基料F；
9、微波破壁：向基料F中加入5倍4℃的水，再置于微波萃取机中，在微波功率为500W的条件下，处理1min，重复2次，得基料G；
10、水提：向基料G中加入15倍水，在45℃、300r/min的条件下，搅拌提取50min，然后经4000r/min离心15min，分离上清液及沉淀，收集上清液记为基料H，沉淀记为基料I；
11、醇沉：向基料H中加入3倍体积的乙醇(浓度为95％)，在300r/min的条件下，连续搅拌30min，静置18h后，置于离心机中离心15min，离心条件为4000r/min，收集沉淀，记为基料J；
12、醇提：向基料I中加入10倍体积的乙醇溶液(浓度为30％)，在100℃的条件下，保持90min，冷却至室温后，置于离心机中，在5000r/min的条件下离心15min，分离上清液及沉淀，上清液记为基料K，沉淀记为基料L；向基料L中加入10倍体积的乙醇溶液(浓度为30％)，在100℃的条件下，保持90min，冷却至室温后，置于离心机中，在5000r/min的条件下离心15min，收集上清液记为基料M；将基料K和基料M合并，混匀后，得基料N；
13、浓缩：将基料N置于旋转蒸馏仪中，在-0.09MPa、60℃、18r/min的条件下，运行10h，得基料O；
14、冻干：将基料E、基料J、基料O搅拌混匀后，在-20℃的条件下预冻15h，之后在冷阱温度为-50℃、真空度为18Pa的条件下，冻干10h，得基料P；
15、超临界制粒：称取10份聚乙烯吡咯烷酮，加入基料P溶解混匀后，注入微粒生成釜中，同时将CO2注入微粒生成釜进行制粒，得发酵制品。其中，生成釜的参数设置为：有机溶液流量为9.2×10-2mL/s、微粒生成釜温度40℃、压力9.0MPa、CO2的流速为0.3m/s。
16、混合：将配方量的发酵制品，45份微晶纤维素，8份羧甲基纤维素钠，12份木薯淀粉，10份玉米淀粉，13份低聚半乳糖，5份抗性糊精，10份椰子油粉倒入三维混合机中，在600r/min的条件下运行5min，混合均匀，冷却后，再加入配方量的嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015菌粉，在600r/min的条件下运行2min，混合均匀，得到肠道定位释放混悬剂。
二、人群测试
1、受试人群：50名志愿者，年龄22～35岁，其中25名为肥胖人群，BMI值≥28kg/m2；25名为消瘦人群，BMI值＜18.5kg/m2。分组情况见表9，每个小组5人。
表9受试人群分组
2、试验方法：
(1)食用混悬剂前测试：受试者过夜空腹9h，第1天早上8:00时，将75g无水葡萄糖稀释成25％浓度液体，并在10min内食用完毕。均于空腹、食用葡萄糖后30、60、120和180min静脉取血测定GLP-1，用体脂秤测量人体基础代谢率，结果如表10所示。
(2)食用混悬剂后测试：受试者按照分组连续20天食用混悬剂g-k，剂量为2g/次、2次/天，食用方式为饭后1h用37℃、150mL温水调匀食用。第21天早上8:00时，将75g无水葡萄糖稀释成25％浓度液体，并在10min内食用完毕。均于空腹、食用葡萄糖后30、60、120和180min静脉取血测定GLP-1，用体脂秤测量人体基础代谢率，结果如表10所示。
(3)GLP-1的含量测定：应用含EDTA的预冷试管并置于冰浴中，采用酶联免疫吸附法测定，采血后立即离心，血浆保存于-20℃，直至分析。
3、结果与分析
表10不同实施例的混悬剂对人体GLP-1、基础代谢率的影响
由表10可得，肥胖人群和消瘦人群坚持食用混悬剂g-k 20天后，均能有效改善GLP-1分泌量，并提高身体的基础代谢率，有利于修复胰腺功能，使糖代谢趋于正常水平。其中，混悬剂j的效果最为显著，将发酵物与嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015菌菌粉按照一定比例制成混悬剂，能极大地提高产品在改善GLP-1分泌量、提高基础代谢率的功效。此外，单独使用嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015菌粉(混悬剂h)，也能很好得修复胰腺功能，改善GLP-1分泌量，提高基础代谢率。本发明的嗜黏蛋白阿克曼氏菌FMT-AKK015定殖于肠道后，能够持续分泌有机酸、糖类、蛋白质、氨基酸等功能性成分，修复受损肠粘膜细胞，提高L细胞的数量，改善GLP-1的分泌量，使GLP-1分泌处于正常水平，同时还可以提高人体基础代谢率，可以促进肥胖人群减肥，也可以促进消瘦人群对营养物质的吸收，修复受损细胞，有利于预防糖尿病的发生和发展。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种嗜黏蛋白阿克曼氏菌，其特征在于，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌为嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015于2023年07月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 28065。
2.一种提高GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的产品，其特征在于，所述产品的活性成分包括权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015的活菌体和/或嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015的发酵物；所述产品包括药品。
3.如权利要求2所述的产品，其特征在于，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015的发酵物包括嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015的发酵上清液。
4.一种提高GLP-1分泌量和/或提高机体基础代谢率的冻干粉，其特征在于，所述冻干粉中的菌株包括权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015。
5.一种发酵制品，其特征在于，由菌株对中药组合物发酵而成，所述菌株包括权利要求1所述的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015；所述中药组合物包括山药20-80份，葛根10-50份，麦冬10-60份；所述发酵制品能够提高中药组合物中蛋白质、葛根素和总寡糖的含量。
6.如权利要求5所述的发酵制品，其特征在于，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015对所述中药组合物进行发酵时，所述嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015的添加量为所述中药组合物的5~10%。
7.嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）FMT-AKK015在制备以下（Ⅰ）~（Ⅱ）项产品中至少一项中的应用，所述产品包括药品；
（Ⅰ）在制备提高GLP-1分泌量产品中的应用；
（Ⅱ）在制备提高机体基础代谢率产品中的应用。
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