CN114796289A - 一种抗腹泻中药微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗腹泻中药微生态制剂，由植物乳杆菌发酵马齿苋得到；制备方法：(1)向马齿苋中加水，榨汁，得到马齿笕汁，备用；(2)将植物乳杆菌接种至液体培养基中，恒温静置培养，得到植物乳杆菌菌液；(3)将马齿苋汁进行高压蒸汽灭菌处理，冷却后加入植物乳杆菌菌液，恒温静置培养；(4)离心，过滤，浓缩，得到抗腹泻中药微生态液剂；或，预冷后进行冷冻干燥，得到抗腹泻中药微生态粉剂。本发明抗腹泻中药微生态制剂具有抗腹泻、调节肠道菌群、促进动物生长等功能，还具有绿色、无污染、无残留、不产生耐药性等特点；同时，本发明制备方法可生产出液剂和粉剂两种类型，可通过直接灌喂、混合饲料、制成胶囊等方式给药，使用方便。

Description

一种抗腹泻中药微生态制剂及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及中药微生态制剂技术领域，更具体的说是涉及一种抗腹泻中药微生态制剂及其制备方法和应用。
背景技术
自上世纪60年代以来，全球的畜禽产量大幅增加，一方面是由于人口增长对畜禽产品需求的增加，另一方面也与养殖生产效率的提高密不可分。其中，抗生素的使用对养殖效率的提高有着很大的帮助。
腹泻是畜禽最为常见的消化系统疾病，也是大量畜禽疾病共有的一类常见症状，对畜禽养殖业影响巨大，不仅造成严重的死淘损失，而且直接影响整个养殖周期的出栏体重、出栏时间和料重比等，从而造成巨大的经济损失。与此同时，预防畜禽腹泻病、追求畜禽养殖更高的生产性能，是化药抗生素在畜牧养殖领域应用的主体，也是化药抗生素盲目使用、滥用的重灾区。随着畜牧生产中抗生素的大量使用，导致的环境污染和药物残留等诸多问题也引起了人们的关注。
关于抗生素替代品的研发方向很多，有中药及其提取物、酶制剂、抗菌肽和微生态制剂等。其中，中药微生态制剂是利用益生菌在生长代谢产物酶类和有机酸类等活性物质，作用于中药以改变其有效成分，同时中药含有的糖类和蛋白质等又能为益生菌的生长繁殖提供能量来源，促进益生菌的生长，具有无污染、无残留、不产生耐药性等特点，对畜牧业的绿色发展具有重要的意义。
因此，如何开发一种安全有效的抗腹泻中药微生态制剂是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种抗腹泻中药微生态制剂及其制备方法和应用，以解决现有技术中的不足。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种抗腹泻中药微生态制剂，由植物乳杆菌发酵马齿苋得到。
一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)向马齿苋中加水，榨汁，得到马齿笕汁，备用；
(2)将植物乳杆菌接种至液体培养基中，然后恒温静置培养，得到植物乳杆菌菌液；
(3)将马齿苋汁进行高压蒸汽灭菌处理，冷却后加入植物乳杆菌菌液，然后恒温静置培养，得到发酵液；
(4)将发酵液进行离心，过滤，浓缩，得到抗腹泻中药微生态液剂；或，将发酵液预冷后进行冷冻干燥，得到抗腹泻中药微生态粉剂。
进一步，上述步骤(1)中，水与马齿苋的质量比为1:(1-3)。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，本发明马齿笕汁为草绿色，有清香味。
进一步，上述步骤(2)中，接种前将植物乳杆菌涂布至MRS固体培养基计数一次，记录植物乳杆菌的含量为9.95×108cfu/mL；液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，吐温801mL，磷酸氢二钾2g，酵母提取物4g，七水合硫酸镁0.2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1000mL；植物乳杆菌的接种体积为液体培养基体积的0.5％-2％；恒温静置培养的温度为28-42℃，时间为24h以上。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过恒温静置培养，能够促进植物乳杆菌的繁殖，从而获得足够量的植物乳杆菌用于下一步马齿苋汁的发酵。
进一步，上述步骤(3)中，灭菌处理的温度为121℃，时间为15-20min；植物乳杆菌菌液的加入体积为马齿苋汁体积的0.5％-2％；恒温静置培养的的时间为28-42℃，时间为15天。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过恒温静置培养，能够促进植物乳杆菌对马齿苋中有效成分的提取和转化。
进一步，上述步骤(4)中，浓缩的仪器为旋转蒸发仪，温度为35-42℃，浓缩至发酵马齿笕的含量为10g/mL；预冷的温度为-80℃。
采用上述进一步技术方案的有益效果在于，通过浓缩或预冷后冷冻干燥，能够获得浓度足够高的马齿苋发酵产物，从而方便实际应用。
本发明还请求保护一种上述抗腹泻中药微生态制剂或如上述制备方法制得的抗腹泻中药微生态制剂在制备药物或饲料中的应用。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
1、本发明抗腹泻中药微生态制剂具有抗腹泻、调节肠道菌群、促进动物生长等功能，还具有绿色、无污染、无残留、不产生耐药性等特点；同时，本发明制备方法可生产出液剂和粉剂两种类型，可通过直接灌喂、混合饲料、制成胶囊等方式给药，使用方便。
2、本发明抗腹泻微生态制剂在动物试验结果中显示出了较好的抗腹泻功效，即对大肠杆菌攻毒的小鼠具有显著的抗腹泻作用，本发明抗腹泻微生态制剂可显著降低小鼠的腹泻率、腹泻指数、稀便数和稀便率等，对肠道组织起到了很好的保护作用。
附图说明
图1为各组小鼠的粪便情况；
图2为各组小鼠的腹泻率；
图3为各组小鼠的生存率；
图4为各组小鼠的肠道组织结构；
图5为各组小鼠的小肠粘膜层厚度；
图6为各组小鼠的肠绒毛长度。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
抗腹泻中药微生态制剂，由植物乳杆菌发酵马齿苋得到；
上述抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)向马齿苋中加蒸馏水，榨汁，得到马齿笕汁，备用；
其中，蒸馏水与马齿苋的质量比为1:2；
(2)将植物乳杆菌涂布至MRS固体培养基计数一次，记录植物乳杆菌的含量为9.95×108cfu/mL；再将植物乳杆菌以1％的体积比接种至液体培养基中，然后置于35℃的恒温箱中静置培养24h，得到植物乳杆菌菌液；
其中，液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，吐温-801mL，磷酸氢二钾2g，酵母提取物4g，七水合硫酸镁0.2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1000mL；
(3)将马齿苋汁等体积分装至发酵瓶中，然后在121℃下高压蒸汽灭菌处理15min，冷却后加入1％体积比的植物乳杆菌菌液，然后置于35℃的恒温箱中静置培养15天，得到发酵液；
(4)将发酵液进行离心，过滤，装入旋转蒸发仪中在38℃下浓缩至发酵马齿笕的含量为10g/mL，即得抗腹泻中药微生态液剂。
实施例2
抗腹泻中药微生态制剂，由植物乳杆菌发酵马齿苋得到；
上述抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)向马齿苋中加蒸馏水，榨汁，得到马齿笕汁，备用；
其中，蒸馏水与马齿苋的质量比为1:1；
(2)将植物乳杆菌涂布至MRS固体培养基计数一次，记录植物乳杆菌的含量为9.95×108cfu/mL；再将植物乳杆菌以0.5％的体积比接种至液体培养基中，然后置于28℃的恒温箱中静置培养24h，得到植物乳杆菌菌液；
其中，液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，吐温-801mL，磷酸氢二钾2g，酵母提取物4g，七水合硫酸镁0.2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1000mL；
(3)将马齿苋汁等体积分装至发酵瓶中，然后在121℃下高压蒸汽灭菌处理15min，冷却后加入0.5％体积比的植物乳杆菌菌液，然后置于28℃的恒温箱中静置培养15天，得到发酵液；
(4)将发酵液进行离心，过滤，装入旋转蒸发仪中在35℃下浓缩至发酵马齿笕的含量为10g/mL，即得抗腹泻中药微生态液剂。
实施例3
抗腹泻中药微生态制剂，由植物乳杆菌发酵马齿苋得到；
上述抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)向马齿苋中加蒸馏水，榨汁，得到马齿笕汁，备用；
其中，蒸馏水与马齿苋的质量比为1:3；
(2)将植物乳杆菌涂布至MRS固体培养基计数一次，记录植物乳杆菌的含量为9.95×108cfu/mL；再将植物乳杆菌以2％的体积比接种至液体培养基中，然后置于42℃的恒温箱中静置培养24h，得到植物乳杆菌菌液；
其中，液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，吐温-801mL，磷酸氢二钾2g，酵母提取物4g，七水合硫酸镁0.2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1000mL；
(3)将马齿苋汁等体积分装至发酵瓶中，然后在121℃下高压蒸汽灭菌处理20min，冷却后加入2％体积比的植物乳杆菌菌液，然后置于42℃的恒温箱中静置培养15天，得到发酵液；
(4)将发酵液进行离心，过滤，装入旋转蒸发仪中在42℃下浓缩至发酵马齿笕的含量为10g/mL，即得抗腹泻中药微生态液剂。
实施例4
抗腹泻中药微生态制剂，由植物乳杆菌发酵马齿苋得到；
上述抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)向马齿苋中加蒸馏水，榨汁，得到马齿笕汁，备用；
其中，蒸馏水与马齿苋的质量比为1:3；
(2)将植物乳杆菌涂布至MRS固体培养基计数一次，记录植物乳杆菌的含量为9.95×108cfu/mL；再将植物乳杆菌以2％的体积比接种至液体培养基中，然后置于42℃的恒温箱中静置培养24h，得到植物乳杆菌菌液；
其中，液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，吐温-801mL，磷酸氢二钾2g，酵母提取物4g，七水合硫酸镁0.2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1000mL。；
(3)将马齿苋汁等体积分装至发酵瓶中，然后在121℃下高压蒸汽灭菌处理20min，冷却后加入2％体积比的植物乳杆菌菌液，然后置于42℃的恒温箱中静置培养15天，得到发酵液；
(5)将发酵液在-80℃预冷后，采用冷冻干燥技术进行冻干，即得抗腹泻中药微生态粉剂。
实施例5活性评价
将实验室保存的大肠杆菌菌液按1％的体积比接种至装有LB液体培养基的三角瓶中，置于恒温摇培养，取适量菌液离心，弃上清，加适量的生理盐水重悬，离心，此过程重复3次，取2-3mL菌液在600nm处测得吸光值，代入提前测绘好的标准曲线，计算得出大肠杆菌浓度，调整最终浓度为4.0×108CFU/mL。
准备60只SPF级ICR小鼠，随机分为6组，分别为空白组(Control)、模型组(Model)、阳性对照组(Positive)和发酵马齿苋组(POE，低剂量、中剂量、高剂量)。其中，空白组和模型组灌喂PBS缓冲液，阳性对照组灌喂肠炎宁，发酵马齿苋组灌胃不同用量(5g/kg、10g/kg、20g/kg)实施例1制得的抗腹泻中药微生态液剂，连续灌胃7天。最后一天灌胃结束后，除空白组小鼠外，其他各组小鼠均腹腔注射浓度为4.0×108CFU/mL的大肠杆菌。
1、小鼠的粪便情况
小鼠腹腔注射大肠杆菌后，观察各组小鼠的粪便情况。结果如图1所示。
图1为各组小鼠的粪便情况。由图1可知，发酵马齿苋中剂量组抗腹泻效果最佳。
2、小鼠腹泻率考察
小鼠腹腔注射大肠杆菌后，观察各组小鼠的腹泻情况，并统计各组小鼠的腹泻率。其中，腹泻率＝排稀便小鼠只数/小鼠总只数×100％。结果如图2所示。
图2为各组小鼠的腹泻率。由图2可知，空白组小鼠腹泻率为0，造模后模型组小鼠腹泻率为100％，说明腹泻模型造模成功；发酵马齿苋低、中、高剂量组小鼠腹泻率分别为60％、20％、20％，说明发酵马齿苋可有效降低小鼠腹泻率。
3、小鼠生存率考察
小鼠腹腔注射大肠杆菌后，观察各组小鼠的腹泻情况，并统计各组小鼠的生存率。其中，生存率＝死亡小鼠数/小鼠总数×100％。结果如图3所示。
图3为各组小鼠的生存率。由图3可知，造模后5h后模型组小鼠全部死亡；发酵马齿苋马齿苋低、中、高剂量干预组小鼠在造模后24h的生存率均显著高于模型组，说明发酵马齿苋可有效降低细菌性腹泻小鼠死亡率。
4、小鼠肠道组织结构观察
小鼠腹腔注射大肠杆菌后，观察腹泻情况，持续4h，取各组小鼠肠道组织组织，采用H.E染色法观察各组小鼠肠道组织结构，并测量各组小鼠小肠粘膜层厚度(Mucus layerthickness)和肠绒毛长度(Crypt length)。结果分别如图4-6所示。
图4为各组小鼠的肠道组织结构，图5为各组小鼠的小肠粘膜层厚度，图6为各组小鼠的肠绒毛长度。由图4-6可知，根据H.E染色结果，与阳性对照组相比，模型组小鼠小肠粘膜层厚度显著降低，肠绒毛长度显著缩短；与模型组相比，发酵马齿苋组干预小鼠小肠粘膜层厚度较模型组显著变厚，小肠绒毛长度显著变长。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种抗腹泻中药微生态制剂，其特征在于，由植物乳杆菌发酵马齿苋得到。
2.一种如权利要求1所述抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1)向马齿苋中加水，榨汁，得到马齿笕汁，备用；
(2)将植物乳杆菌接种至液体培养基中，然后恒温静置培养，得到植物乳杆菌菌液；
(3)将马齿苋汁进行高压蒸汽灭菌处理，冷却后加入植物乳杆菌菌液，然后恒温静置培养，得到发酵液；
(4)将发酵液进行离心，过滤，浓缩，得到抗腹泻中药微生态液剂；或，将发酵液预冷后进行冷冻干燥，得到抗腹泻中药微生态粉剂。
3.根据权利要求2所述的一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述水与马齿苋的质量比为1:(1-3)。
4.根据权利要求2所述的一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，接种前将植物乳杆菌涂布至MRS固体培养基计数一次，记录植物乳杆菌的含量为9.95×108cfu/mL。
5.根据权利要求2所述的一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述液体培养基的配方为：蛋白胨10g，牛肉浸膏5g，吐温-801mL，磷酸氢二钾2g，酵母提取物4g，七水合硫酸镁0.2g，柠檬酸二铵2g，葡萄糖20g，硫酸锰0.05g，乙酸钠5g，蒸馏水1000mL；所述植物乳杆菌的接种体积为液体培养基体积的0.5％-2％；所述恒温静置培养的温度为28-42℃，时间为24h以上。
6.根据权利要求2所述的一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述灭菌处理的温度为121℃，时间为15-20min。
7.根据权利要求2所述的一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述植物乳杆菌菌液的加入体积为马齿苋汁体积的0.5％-2％。
8.根据权利要求2所述的一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述恒温静置培养的的时间为28-42℃，时间为15天。
9.根据权利要求2所述的一种抗腹泻中药微生态制剂的制备方法，其特征在于，步骤(4)中，所述浓缩的仪器为旋转蒸发仪，温度为35-42℃，浓缩至发酵马齿笕的含量为10g/mL；所述预冷的温度为-80℃。
10.一种如权利要求1所述抗腹泻中药微生态制剂或如权利要求2-9任一项所述制备方法制得的抗腹泻中药微生态制剂在制备药物或饲料中的应用。
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