WO2023038404A1 - 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도 - Google Patents

비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도 Download PDF

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skin
extract
complex
culture medium
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임용환
백채윤
김미선
김민지
강승현
박명삼
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코스맥스 주식회사
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the ecosystem of the skin provides various types of habitats for microorganisms, and a wide range of microorganisms live there.
  • the human host forms a symbiotic relationship with them, and they are known to have many positive effects on the host.
  • the skin constitutes various types of habitats, such as indentations and specialized crevices, and helps a wide range of microorganisms to grow.
  • the skin forms a physical barrier and helps to defend against potential risk factors and toxic substances from the outside.
  • the skin becomes a point of contact with the external environment and is also a gathering place for various microorganisms (fungi, bacteria, viruses, and small larvae). According to the selection of physical and chemical functions, microorganisms adapt to specialized niches to prepare habitats.
  • the skin is cold, has an acidic nature, and remains dry. Structurally, the epidermis forms the skin barrier, blocks the penetration of microorganisms and toxins, and plays an important role in retaining moisture.
  • the uppermost layer of the epidermis is composed of the stratum corneum.
  • the epidermis has a form called 'brick and mortar structure', and the skin tissue undergoes a continuous self-healing process, and the scales that have passed through the differentiation process are constantly eliminated from the skin tissue.
  • Probiotics is a collective term for microorganisms that have a beneficial effect on the human body, and refers to microorganisms that benefit the body. Most probiotics known to date are known as lactic acid bacteria. Probiotics have been reported to produce effective effects through various beneficial actions on the human body, but studies on the interaction between skin flora and skin are insufficient.
  • One aspect is to provide a novel Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain.
  • Another aspect is to provide a lysate of the strain, a culture medium, or an extract of the culture medium.
  • Another aspect is to provide a complex fermented extract obtained by fermenting a complex extract of licorice, thistle and honeysuckle with the strain.
  • Another aspect is the Bifidobacterium animalis subspecies lactis ( Bifidobacterium animalis subsp. lactis ) strain, its lysate, culture, or extract of the culture; Or to provide a composition comprising a complex fermented extract obtained by fermenting a complex extract of licorice, milk thistle and honeysuckle with the strain.
  • lactis Bifidobacterium animalis subspecies lactis ( Bifidobacterium animalis subsp. lactis ) strain, its lysate, culture, or extract of the culture;
  • a composition comprising a complex fermented extract obtained by fermenting a complex extract of licorice, milk thistle and honeysuckle with the strain.
  • Another aspect provides a method for preventing, ameliorating, or treating a condition in a subject in need thereof comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition described above.
  • One aspect provides a Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain.
  • the strain may be isolated.
  • isolated means something that is artificially separated and available that does not exist in nature.
  • the strain may be isolated from dog skin.
  • the strain may be isolated from canine keratinocytes.
  • the strain may be a strain isolated by a method of inoculating canine keratinocytes in Tryptic Soy Agar (TSA) and culturing the cultured colony in pure isolation.
  • TSA Tryptic Soy Agar
  • the strain may be a strain belonging to the genus Bifidobacterium ( Bifidobacterium sp. ).
  • the strain comprises a 16S rRNA having at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, at least about 99.5%, or at least about 99.9% sequence identity with SEQ ID NO: 1 it may be
  • the strain may contain the 16S rRNA of SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity refers to the degree of identity of amino acid residues or bases between sequences after aligning both sequences in a specific comparison region so as to match each other as much as possible. Sequence identity can be confirmed according to methods known in the art. The percent of sequence identity can be determined using a known sequence comparison program, examples of which include BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc), and the like.
  • the Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain may be a strain deposited under accession number KCCM12993P.
  • the strain deposited with the accession number may be a Bifidobacterium animalis subspecies lactis DS008 strain.
  • the strain may have a skin condition improving effect.
  • the skin condition improvement may be one or more of skin barrier strengthening, skin moisturizing, skin inflammation improvement, atopy improvement, and itching inhibition.
  • Another aspect provides a lysate of the strain, a culture medium, or an extract of the culture medium.
  • lysate may be used interchangeably with “lysate” and may refer to a product obtained by disrupting the cell wall of a strain by chemical or physical force.
  • the homogenate may include the homogenate itself, a concentrate or a lyophilized product thereof.
  • the term "culture medium” may be used interchangeably with “culture supernatant”, “conditioned culture medium” or “conditioned medium”, and is a method for growing and It may mean the entire medium including the strain obtained by culturing the strain for a certain period of time in a medium capable of supplying nutrients to survive, metabolites thereof, and extra nutrients.
  • the culture solution may mean a culture solution obtained by removing the cells from the cell culture solution obtained by culturing the strain.
  • the liquid from which the cells are removed from the culture solution is also called “supernatant", and the culture solution is left still for a certain period of time to take only the liquid of the upper layer except for the part sunk in the lower layer, remove the cells through filtration, or centrifuge the culture solution to It can be obtained by removing the precipitate and taking only the upper liquid.
  • the "cell” refers to the strain itself of the present invention, and includes the strain itself isolated and selected from a sample or the strain isolated from the culture solution by culturing the strain.
  • the cells can be obtained by centrifuging the culture solution and taking the part that has sunk to the lower layer, or it can be obtained by leaving it for a certain period of time and then removing the upper liquid because it sinks to the lower layer of the culture medium by gravity.
  • the culture solution may include the culture solution itself obtained by culturing the strain, its concentrate or lyophilisate, or the culture supernatant obtained by removing the strain from the culture solution, its concentrate or lyophilisate.
  • the culture medium and culture conditions for culturing the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain can be appropriately selected or modified by those skilled in the art.
  • the culture medium obtained by culturing in a medium eg, R2A medium, RCM medium or TSA medium
  • a medium eg, R2A medium, RCM medium or TSA medium
  • culture broth extract refers to an extract obtained from the culture medium or a concentrate thereof, and may include an extract, a dilution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or a crude or purified product thereof, or a fraction obtained by fractionating the same.
  • the strain, a lysate thereof, a culture medium, or an extract of the culture medium may be biologically pure.
  • the strain may be obtained by pure culture.
  • Another aspect provides a complex fermented extract obtained by fermenting a natural product complex extract with a Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain.
  • the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain may be the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain according to the above aspect.
  • the strain may be isolated from dog skin.
  • the strain has at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, at least about 99.5%, or at least about 99.9% sequence identity with SEQ ID NO: 1
  • It may include 16S rRNA having
  • the strain may be one containing the 16S rRNA of SEQ ID NO: 1.
  • the strain may be a strain deposited with accession number KCCM12993P.
  • the strain may be a DS008 strain.
  • the natural product composite extract may be a composite extract of at least one of licorice, thistle, and honeysuckle.
  • the natural product composite extract may be a composite extract of licorice, thistle, and honeysuckle. Therefore, the complex fermented extract may be a complex fermented extract obtained by fermenting complex extracts of licorice, thistle and honeysuckle with Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain.
  • the "licorice” may be a plant belonging to the genus Glycyrrhiza sp.
  • the licorice may be Glycyrrhiza uralensis Fischer , Glycyrrhiza glabra L., or Glycyrrhiza inflate Batal , but is not limited thereto.
  • the licorice may be Glycyrrhiza uralensis Fischer .
  • the "Ussuri thistle” is Cirsium japonicum var. may be maackii .
  • the "honeysuckle” is also referred to as “lonicer aflower” and may be Lonicera japonica .
  • any part of licorice, thistle, and honeysuckle may be used, such as a sheath, root, stem, and leaf, respectively.
  • the milk thistle root may be used.
  • the honeysuckle stem may be used as the honeysuckle.
  • the composite extract may be a composite extract of licorice, thistle root and honeysuckle stem.
  • the mixed weight ratio of licorice, thistle and honeysuckle is 1 to 100:1 to 100:1 to 100, 1 to 50:1 to 50:1 to 50, 1 to 20:1 ⁇ 20:1 ⁇ 20, 1 ⁇ 10:1 ⁇ 10:1 ⁇ 10, or 1 ⁇ 5:1 ⁇ 5:1 ⁇ 5, for example, it may be 1:5:4, but is not limited thereto.
  • extract includes all substances obtained by extracting components of natural substances, regardless of extraction method, extraction solvent, extraction conditions, extracted components or extract form, and is processed or treated by other methods after extracting components of natural products. It also includes materials that can be obtained by Therefore, the extract may include an extract, a dilution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or a crude or purified product thereof, or a fraction obtained by fractionating the same.
  • the extraction method known natural product extraction methods such as hot water extraction, ethanol extraction, heat extraction, cold extraction, reflux extraction, reflux cooling extraction, ultrasonic extraction, and subcritical extraction may be used, but are not limited thereto.
  • the extraction method may be hot water extraction.
  • the extraction method may be water bath extraction.
  • the extraction solvent may be selected from water, organic solvents, or mixtures thereof.
  • the water may be distilled water or purified water.
  • the organic solvent may include one or more of C1 to C6 lower alcohol, acetone, ether, ethyl acetate, diethyl ether, ethyl methyl ketone, and chloroform, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent of the extract may be water. Therefore, the composite extract of licorice, thistle, and honeysuckle may be a hot water extract.
  • the extraction conditions refer to conditions for extracting components of natural substances, such as extraction time and extraction temperature.
  • the extraction time is 30 minutes to 120 hours, 30 minutes to 100 hours, 30 minutes to 80 hours, 30 minutes to 60 hours, 30 minutes to 40 hours, 30 minutes to 20 hours, 30 minutes to 10 hours, 2 hours to 120 hours time, 2 hours to 100 hours, 2 hours to 80 hours, 2 hours to 60 hours, 2 hours to 40 hours, 2 hours to 20 hours, or 2 hours to 10 hours, but other conditions such as extraction solvent and extraction temperature can be selected appropriately.
  • the extraction temperature is 10 to 150 °C, 10 to 120 °C, 10 to 100 °C, 10 to 80 °C, 20 to 150 °C, 20 to 120 °C, 20 to 100 °C, 20 to 80 °C, 20 to 60 °C, 20 to 40 ° C., or room temperature, but may be appropriately selected according to other conditions such as extraction solvent and extraction time.
  • the complex fermented extract can be obtained by fermenting complex extracts of licorice, thistle and honeysuckle with Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain.
  • the complex fermented extract can be obtained by adding the complex extract of licorice, thistle and honeysuckle to a culture solution of Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain and fermenting.
  • the complex extract may be added in an amount sufficient for fermentation to the strain culture broth, for example, 0.01 to 20% by weight, 0.01 to 10% by weight, 0.01 to 5% by weight, 0.1 to 20% by weight, 0.1 to 10% by weight. It may be added at 0.1 to 5% by weight, 1 to 20% by weight, 1 to 10% by weight, or 1 to 5% by weight, but is not limited thereto.
  • a suitable temperature and time may be selected for fermentation using the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain.
  • the fermentation may be carried out at 20 to 40 ° C, but is not particularly limited thereto.
  • the fermentation may be performed for 1 to 200 hours, 1 to 180 hours, 24 to 200 hours, 24 to 180 hours, 24 to 120 hours, 48 to 200 hours, 48 to 180 hours, or 48 to 120 hours. , is not particularly limited thereto.
  • a medium suitable for fermentation using the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain may be selected.
  • a known medium or a conventional medium capable of culturing the strain of Bifidobacterium animalis subspecies lactis may be used.
  • Another aspect is a Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain, a lysate of the strain, a culture medium or an extract of the culture medium; Alternatively, a composite fermented extract obtained by fermenting a composite extract of licorice, thistle, and honeysuckle with the strain is provided.
  • the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain may be the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain according to the above aspect.
  • the strain may be isolated from dog skin.
  • the strain has at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, at least about 99.5%, or at least about 99.9% sequence identity with SEQ ID NO: 1 It may include 16S rRNA having
  • the strain may be one containing the 16S rRNA of SEQ ID NO: 1.
  • the strain may be a strain deposited with accession number KCCM12993P.
  • the strain may be a DS008 strain.
  • the use of the strain may include improving skin conditions, improving skin beauty, and preventing, improving or treating skin diseases.
  • the skin condition improvement or skin beauty improvement may be one or more of skin barrier strengthening, skin moisturizing, skin inflammation improvement, atopy improvement, and itching inhibition.
  • the strain increases the expression of one or more of hyaluronic acid synthase 3 (HAS3) and filaggrin; It may be to reduce the expression of one or more of IL-1 ⁇ and IL-6.
  • HAS3 hyaluronic acid synthase 3
  • filaggrin filaggrin
  • “Strengthening the skin barrier” may refer to any action that enhances the function of the skin barrier, which is located at the outermost layer of the skin and prevents loss of moisture and nutrients.
  • Skin moisturizing may refer to any action that maintains skin moisture or prevents moisture loss.
  • the skin moisturizing effect can help improve skin wrinkles and increase elasticity.
  • Inflammation improvement may be used interchangeably with “inhibition of inflammation” and “anti-inflammation”, and may mean any action in which NO production is suppressed by alleviating the immune response.
  • a “skin condition” may be a disease caused by impaired skin barrier function or skin inflammation.
  • prevention includes inhibiting the development of a disease.
  • treatment includes inhibition of the development of, alleviation of, or elimination of a disease.
  • improvement can mean any action that at least reduces a parameter associated with alleviation or treatment of a condition, eg, the severity of a symptom.
  • the skin inflammatory disease may be any one selected from the group consisting of dermatitis, atopic dermatitis, pruritus (pruritus), eczematous skin disease, dry eczema, erythema, urticaria, psoriasis, drug rash, and acne.
  • the skin inflammatory disease may be one or more of dermatitis, atopic dermatitis, and pruritus (itching).
  • composition according to one aspect includes the extract of the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain, its lysate, culture medium or culture medium; Alternatively, by including a complex fermented extract obtained by fermenting a complex extract of licorice, thistle, and honeysuckle with the above strain, the expression of HAS3 and filaggrin may be increased to exhibit skin barrier strengthening and skin moisturizing effects.
  • the composition according to one aspect includes the extract of the Bifidobacterium animalis subspecies lactis strain, its lysate, culture medium or culture medium; Or by including a complex fermented extract obtained by fermenting a complex extract of licorice, thistle and honeysuckle with the strain, reducing the expression of inflammatory cytokines (eg IL-1 ⁇ and IL-6), improving skin inflammation, or skin Inflammatory diseases, atopy, skin diseases such as itching can prevent, improve, or exhibit therapeutic effects.
  • inflammatory cytokines eg IL-1 ⁇ and IL-6
  • atopy skin diseases such as itching can prevent, improve, or exhibit therapeutic effects.
  • the strain may exhibit a synergistic effect when used together with other strains having a skin condition improving effect, for example, strains belonging to the genus Bifidobacterium.
  • the composition is 0.001% to 80% by weight, for example, 0.01% to 60% by weight, 0.01% to 40% by weight, 0.01% to 30% by weight, 0.01% to 20% by weight, based on the total weight of the composition. %, 0.01% to 10%, 0.01% to 5%, 0.05% to 60%, 0.05% to 40%, 0.05% to 30%, 0.05% to 20%, 0.05% to 10% by weight, 0.05% to 5% by weight, 0.1% to 60% by weight, 0.1% to 40% by weight, 0.1% to 30% by weight, 0.1% to 20% by weight, 0.1% by weight % to 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of the strain, its lysate, culture medium or extract of the culture medium, or the complex fermentation extract.
  • the term "included as an active ingredient” means that the strain of the present specification, its lysate, culture medium or culture medium extract, or complex fermentation extract is added to the extent that the above-mentioned effects can be exhibited, and drug delivery And it means that it is formulated in various forms by adding various components as subcomponents for stabilization and the like.
  • the composition may be in a liquid or dry state.
  • the composition may be in the form of a dry powder.
  • a drying method for preparing the composition in a dry state may use a method commonly used in the art, and is not particularly limited.
  • Non-limiting examples of the drying method include an air drying method, a natural drying method, a spray drying method, a freeze drying method, and the like. These methods may be used alone or at least two methods may be used together.
  • the composition may contain an additive in an effective amount sufficient to reduce deterioration of the strain, its lysate, culture broth or extract of the culture broth, or the complex fermentation extract.
  • the additive may be, for example, a binder, but is not limited thereto.
  • the composition may further include a cosmetically, pharmaceutically or food-acceptable carrier.
  • the composition may be formulated with a carrier and provided as cosmetics, drugs, food additives, and the like.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may further include ingredients commonly used in cosmetic compositions, functional additives, etc. in addition to the active ingredients disclosed herein, such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, surfactants, dispersants, emulsifiers, and preservatives. , conventional adjuvants such as vitamins, pigments, flavors, and the like, and carriers.
  • the cosmetic composition is not particularly limited to a specific formulation, and the formulation may be appropriately selected according to the purpose.
  • the cosmetic composition may have, for example, a solubilizing formulation, an emulsifying formulation, or a dispersion formulation.
  • the cosmetic composition may have, for example, a softening lotion, a nutrient lotion, a massage cream, a nutrient cream, an essence, a pack, a gel, an ampoule, or a skin-adhesive cosmetic formulation.
  • the composition may be a composition for external application for skin.
  • the external skin preparation may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal delivery patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the external skin preparation is a component usually used in external preparations for skin such as cosmetics or pharmaceuticals, for example, water-based components, oil-based components, powder components, alcohols, moisturizers, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, and fragrances. , colorants, various skin nutrients, or combinations thereof and may be suitably blended as needed.
  • metal sequestering agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, gluconic acid
  • drugs such as caffeine, tannin, bellapamil, licorice extract, glabridin, hot water extract of calin fruit, various herbal medicines, tocopherol acetate, glycylitnic acid, tranexamic acid and its derivatives or salts
  • Vitamin C magnesium ascorbyl phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid
  • Sugars such as glucose, fructose, and trehalose, etc. can also be mix
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, mannitol, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethylcellulose, sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be formulated for oral or parenteral administration.
  • Oral dosage forms may be granules, powders, liquids, tablets, capsules, dry syrups, and the like.
  • Parenteral dosage forms may be injections, ointments, and the like.
  • the composition may be a health functional food composition.
  • it may be formulated in the form of a conventional health functional food known in the art.
  • the health functional food composition may be used alone, or in combination with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to conventional methods. .
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • beverage compositions may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional components, like conventional beverages.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose; disaccharides such as maltose and sucrose; and polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins; It is a sugar alcohol, such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract, or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame may be used.
  • the food composition is also used in nutrients, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonated beverages carbonation agent, or a combination thereof.
  • the food composition may also contain natural fruit juice, fruit juice beverages, fruit flesh for preparing vegetable beverages, or a combination thereof.
  • Another aspect provides a method for preventing, ameliorating, or treating a condition in a subject in need thereof comprising administering to a subject in need thereof an effective amount of a composition described above.
  • the condition of the subject may be a skin related condition, a skin wound, or a condition related to skin inflammation.
  • administering introducing
  • implanting are used interchangeably herein, and according to one embodiment, a subject by a method or route that results in at least partial localization of a composition to a desired site. It can mean the placement of a composition according to one embodiment into.
  • Administration may be administered by a method known in the art. Administration may be administered directly to a subject by any means, for example, by routes such as intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. can The administration may be administered systemically or locally.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the subject may be a subject in need of skin improvement, for example, a subject in need of skin barrier strengthening, skin moisturizing, skin inflammation improvement, atopy improvement or itching inhibition effect.
  • the administration is 0.1 mg to 1,000 mg per day of the composition according to one embodiment, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg , 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate and reaction sensitivity, and those skilled in the art can Dosage can be appropriately adjusted in consideration of these factors.
  • the number of administrations can be once a day or two or more times within the range of clinically acceptable side effects, and administration can be performed at one or two or more sites, daily or at intervals of 2 to 5 days.
  • the number of administration days may be administered from 1 day to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after a titration period.
  • the same dosage per kg as for humans is used, or the above dosage is converted by the volume ratio (eg, average value) of the organ (heart, etc.) between the target animal and the human.
  • a single dose can be administered.
  • novel bifidobacterium animalis subspecies lactis strain or the natural complex fermented extract using the strain according to one aspect, it has the effect of strengthening the skin barrier, moisturizing the skin, improving skin inflammation, improving atopy, and inhibiting itching, It can be variously applied for improving, preventing, or treating skin conditions.
  • Example 1 is a result showing the relative expression level of HAS3 when the natural fermentation broth of Example 3 was treated with keratinocytes. None: not added; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing natural fermented liquid of Example 3; RA: retinoic acid addition group as a positive control group.
  • Example 2 is a result showing the relative expression level of HAS3 when the strain culture solution of Example 2 and the natural product fermentation broth of Example 3 were treated with keratinocytes. None: not added; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing natural fermented liquid of Example 3; DS008: strain culture solution addition group of Example 2; RA: retinoic acid addition group as a positive control group.
  • Example 3 is a result showing the relative expression level of filaggrin when the natural fermentation broth of Example 3 was treated with keratinocytes. None: not added; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing the natural fermented liquid of Example 3.
  • Example 4 is a result showing the relative expression level of filaggrin when the strain culture solution of Example 2 and the natural product fermentation broth of Example 3 were treated with keratinocytes. None: not added; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing natural fermented liquid of Example 3; DS008: strain culture solution addition group of Example 2.
  • Example 5 is a result showing the relative expression level of IL-1 ⁇ when the natural fermentation broth of Example 3 was treated with keratinocytes. None: Inflammation not induced and no addition group; (+): inflammation induction and no addition group; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing natural fermented liquid of Example 3; Dex: dexamethasone addition group as a positive control group.
  • Example 6 is a result showing the relative expression level of IL-1 ⁇ when keratinocytes were treated with the culture broth of Example 2 and the fermented natural product of Example 3. None: Inflammation not induced and no addition group; (+): inflammation induction and no addition group; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing natural fermented liquid of Example 3; DS008: strain culture solution addition group of Example 2; Dex: dexamethasone addition group as a positive control group.
  • Example 7 is a result showing the relative expression level of IL-6 when keratinocytes were treated with the culture broth of Example 2 and the fermented natural product of Example 3. None: Inflammation not induced and no addition group; (+): inflammation induction and no addition group; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing natural fermented liquid of Example 3; Dex: dexamethasone addition group as a positive control group.
  • Example 8 is a result showing the relative expression level of IL-6 when keratinocytes were treated with the culture broth of Example 2 and the fermented natural product of Example 3. None: Inflammation not induced and no addition group; (+): inflammation induction and no addition group; Medium: R2A medium addition group; Complex: the group containing natural fermented liquid of Example 3; DS008: strain culture solution addition group of Example 2; Dex: dexamethasone addition group as a positive control group.
  • Bifidobacterium animalis subspecies lactis strains were isolated and identified from the skin of healthy dogs.
  • a sample obtained by washing the skin of a healthy dog with sterile distilled water that is, canine epidermal keratinocyte
  • TSA Tryptic Soy Agar
  • BD Tryptic Soy Agar
  • the cultured colony was subjected to 16S rRNA gene sequence identification. At this time, primers designed to amplify in response to only bacteria were used. PCR amplification was carried out in 30 cycles of 95 ° C for 1 minute, 55 ° C for 1 minute, and 75 ° C for 1 minute and 30 seconds, and finally treated at 72 ° C for 8 minutes and stored at 4 ° C. After the PCR reaction, the DNA sequences of the isolated and cultured species were determined using ABI-3730XL (ABI, USA).
  • DS008 A new microbial Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain (hereinafter referred to as "DS008") of less than % was selected.
  • the selected DS008 strain was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center (KCCM) on May 28, 2021 and was given accession number KCCM12993P.
  • KCCM Korea Microorganism Conservation Center
  • Example 1 The DS008 strain of Example 1 was inoculated into R2A (Reasoner's 2A) medium (Becton Dickinson, Cockeysville, MD) and cultured for 72 hours at 37° C. under anaerobic conditions.
  • R2A Reasoner's 2A
  • Becton Dickinson Cockeysville, MD
  • HAS3 Hydrophilic acid synthase 3
  • human keratinocyte HaCaT cells were cultured in DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038) containing 10% fetal bovin serum. % CO 2 was performed in an incubator. The cultured cell line was treated with 1% (w/w) of the culture medium of Example 2 or 1% (w/w) of the fermentation broth of Example 3 and further cultured for 24 hours. As a positive control, 1 uM of retinoic acid (RA) was used.
  • Real-time polymerase chain reaction was performed in a real-time PCR machine using primers for HAS3 and filaggrin, which are factors related to skin barrier enhancement and skin moisturizing. The expression levels of HAS3 and filaggrin were finally analyzed through correction for the ⁇ -actin gene, and the results are shown in FIGS. 1, 2, 3 and 4, respectively.
  • 3 and 4 are results showing the relative expression level of filaggrin in keratinocytes.
  • the strain culture solution of Example 2 significantly increased the expression of HAS3.
  • the natural product fermentation broth of Example 3 significantly increased the expression of HAS3 and filaggrin.
  • the natural product fermentation broth of Example 3 had higher expression levels of HAS3 and filaggrin than the strain culture medium of Example 2.
  • human keratinocyte HaCaT cells were cultured in DMEM medium (Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038) containing 10% fetal bovin serum. % CO 2 was performed in an incubator. The medium was exchanged every 3 to 4 days, and subculture was performed when the cells proliferated excessively. Thereafter, the cells were dispensed at 5 ⁇ 10 5 /well and washed with phosphate buffered saline solution (PBS) after 24 hours of culture. Cells were seeded into each well containing DMEM medium without FBS, and inflammation was induced in the keratinocyte cell line by adding 10 ⁇ g/ml of Poly I:C and 10 ng/ml of IL-4.
  • DMEM medium Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-003082
  • PBS phosphate buffered saline solution
  • Example 2 the culture broth of Example 2 or the fermentation broth of Example 3 was treated at a concentration of 1% (w/w), followed by additional culture for 4 hours.
  • a positive control group 1 ⁇ M of dexamethasone was used.
  • Expression levels were analyzed in the same manner as in Experimental Example 1, except that primers for IL-1 ⁇ and IL-6 were used.
  • the expression level of the gene was finally analyzed through correction for the ⁇ -actin gene, and the results are shown in FIGS. 5 to 8.
  • 5 and 6 are results showing the relative expression level of IL-1 ⁇ in keratinocytes.
  • the culture medium of the strain of Example 2 significantly reduced the expression of IL-1 ⁇ and IL-6.
  • the natural product fermentation broth of Example 3 significantly reduced the expression of IL-1 ⁇ and IL-6.
  • the natural product fermentation broth of Example 3 had a greater reduction in the expression of IL-1 ⁇ and IL-6 than the strain culture broth of Example 2.
  • the Bifidobacterium animalis subspecies lactis DS008 strain or a natural product fermentation broth using the same increases the expression of HAS3 and filaggrin; It was confirmed that the expression of IL-1 ⁇ and IL-6 was reduced. Therefore, it was found that the DS008 strain and the fermented natural product using the same had the effects of strengthening the skin barrier, moisturizing the skin, improving skin inflammation, improving atopy, and inhibiting skin itching.

Abstract

신규한 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 DS008 균주, 상기 균주를 이용한 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합발효추출물, 및 이들의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다. 일 양상에 따른 신규 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주 또는 상기 균주를 이용한 천연물 복합발효추출물에 의하면, 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 염증 개선, 아토피 개선, 및 가려움증 억제 효과가 있으므로, 피부 상태의 개선, 예방, 또는 치료 용도로 다양하게 응용될 수 있다.

Description

비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도
본 출원은 2021년 9월 8일 출원된 대한민국 특허출원 제 10-2021-0119866호 를 우선권으로 주장하고, 상기 명세서 전체는 본 출원의 참고문헌이다.
신규한 미생물, 그의 파쇄액, 배양액, 추출액, 이를 이용한 천연물 복합발효추출물 및 이들의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다.
피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 인간은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 이들은 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화 되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속 지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부 장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어있다. 표피는 일명 '벽돌과 몰탈 구조'라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화 과정의 마지막을 거친 비늘(squames)은 끊임없이 피부 조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익 작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.
이에, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있는 피부상재균의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 신규한 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물; 또는 상기 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효량의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
일 양상은 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 균주를 제공한다.
상기 균주는 분리된 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "분리된(isolated)"이란 자연계에 존재하는 것이 아닌 인위적으로 분리하여 이용가능한 것을 의미한다. 상기 균주는 개 피부로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 균주는 개 각질세포로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 균주는 개 각질세포를 TSA(Tryptic Soy Agar)에 접종하여 배양된 콜로니를 순수 분리 배양하는 방법에 의해 분리된 균주일 수 있다.
상기 균주는 비피도박테리움 속(Bifidobacterium sp.)에 속하는 균주일 수 있다.
상기 균주는 서열번호 1과 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 당업계에 공지된 방법에 따라 확인될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
상기 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 균주는 기탁번호 KCCM12993P로 기탁된 균주일 수 있다. 상기 기탁번호로 기탁된 균주는 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 DS008 균주일 수 있다.
상기 균주는 피부 상태 개선 효과를 갖는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 피부 상태 개선은 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 염증 개선, 아토피 개선, 및 가려움증 억제 중 1종 이상일 수 있다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공한다.
상기 균주의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 "용해물"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다. 상기 파쇄액은 파쇄액 자체, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 한편, 상기 배양액 중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며, 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나, 배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의 균주 자체를 의미하는 것으로, 샘플 등으로부터 분리하여 선별한 균주 자체 또는 상기 균주를 배양하여 배양액으로부터 분리한 균주를 포함한다. 상기 균체는 배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해 배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간 동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물 또는 동결건조물, 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 배양액은 배지(예를 들면, R2A 배지, RCM 배지 또는 TSA 배지)에서 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 120시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액으로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 생물학적으로 순수한 것일 수 있다. 상기 균주는 순수배양(pure culture)에 의해 얻은 것일 수 있다.
또 다른 양상은 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주로 천연물 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 제공한다.
상기 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주는 상기 일 양상에 따른 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 균주는 개 피부로부터 분리된 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1과 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM12993P로 기탁된 균주일 수 있다. 상기 균주는 DS008 균주일 수 있다.
상기 천연물 복합 추출물은 감초, 엉겅퀴 및 인동 중 1종 이상의 복합 추출물일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 천연물 복합 추출물은 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물일 수 있다. 따라서, 상기 복합발효추출물은 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물일 수 있다.
상기 "감초(licorice)"는 감초속(Glycyrrhiza sp.)에 속하는 식물일 수 있다. 상기 감초는 Glycyrrhiza uralensis Fischer, Glycyrrhiza glabra L., 또는 Glycyrrhiza inflate Batal일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 감초는 Glycyrrhiza uralensis Fischer 일 수 있다.
상기 "엉겅퀴(Ussuri thistle)"는 Cirsium japonicum var. maackii 일 수 있다.
상기 "인동(honeysuckle)"은 "금은화(lonicer aflower)"라고도 하며, Lonicera japonica일 수 있다.
상기 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물에 있어서, 감초, 엉겅퀴 및 인동은 각각 그의 전초, 뿌리, 줄기, 잎 등 임의의 부위를 사용할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 엉겅퀴는 엉겅퀴 뿌리를 사용할 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 인동은 인동 줄기를 사용할 수 있다. 따라서, 상기 복합 추출물은 감초, 엉겅퀴 뿌리 및 인동 줄기의 복합 추출물일 수 있다.
상기 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물에 있어서, 감초, 엉겅퀴 및 인동의 혼합 중량비는 1~100:1~100:1~100, 1~50:1~50:1~50, 1~20:1~20:1~20, 1~10:1~10:1~10, 또는 1~5:1~5:1~5, 예를 들어 1:5:4일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 "추출물"은 추출 방법, 추출 용매, 추출 조건, 추출된 성분 또는 추출물의 형태를 불문하고, 천연물의 성분을 추출함으로써 얻어진 물질을 모두 포함하며, 천연물의 성분을 추출한 후 다른 방법으로 가공 또는 처리하여 얻어질 수 있는 물질도 포함한다. 따라서, 상기 추출물은 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
상기 추출 방법은 열수 추출, 에탄올 추출, 가열 추출, 냉침 추출, 환류 추출, 환류냉각 추출, 초음파 추출, 아임계 추출 등 공지된 천연물 추출 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 추출 방법은 열수 추출일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 추출 방법은 중탕 추출일 수 있다.
상기 추출 용매는 물, 유기 용매, 또는 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 상기 물은 증류수 또는 정제수일 수 있다. 상기 유기 용매는 C1 내지 C6의 저급 알코올, 아세톤, 에테르, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 에틸메틸케톤 및 클로로포름 중 1종 이상을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 일 구체예에서, 상기 추출물의 추출 용매는 물일 수 있다. 따라서, 상기 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물은 열수추출물일 수 있다.
상기 추출 조건은 추출 시간, 추출 온도 등 천연물의 성분을 추출하기 위한 조건을 의미한다. 상기 추출 시간은 30분 내지 120시간, 30분 내지 100시간, 30분 내지 80시간, 30분 내지 60시간, 30분 내지 40시간, 30분 내지 20시간, 30분 내지 10시간, 2시간 내지 120시간, 2시간 내지 100시간, 2시간 내지 80시간, 2시간 내지 60시간, 2시간 내지 40시간, 2시간 내지 20시간, 또는 2시간 내지 10시간일 수 있으나, 추출 용매, 추출 온도 등 다른 조건에 따라 적절히 선택할 수 있다. 상기 추출 온도는 10 내지 150℃, 10 내지 120℃, 10 내지 100℃, 10 내지 80℃, 20 내지 150℃, 20 내지 120℃, 20 내지 100℃, 20 내지 80℃, 20 내지 60℃, 20 내지 40℃, 또는 상온일 수 있으나, 추출 용매, 추출 시간 등 다른 조건에 따라 적절히 선택할 수 있다.
상기 복합발효추출물은 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득될 수 있다. 일 구체예에서, 상기 복합발효추출물은 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주 배양액에 상기 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 첨가하고 발효시킴으로써 수득될 수 있다. 상기 균주 배양액에 상기 복합 추출물은 발효되기에 충분한 양으로 첨가될 수 있으며, 예를 들어, 0.01 내지 20 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.01 내지 5 중량%, 0.1 내지 20 중량%, 0.1 내지 10 중량%, 0.1 내지 5 중량%, 1 내지 20 중량%, 1 내지 10 중량%, 또는 1 내지 5 중량%로 첨가될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 발효 조건은 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주를 이용한 발효에 적절한 온도 및 시간을 선택할 수 있다. 예를 들어, 상기 발효는 20 내지 40℃에서 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 발효는 1 내지 200시간, 1 내지 180시간, 24 내지 200시간, 24 내지 180시간, 24 내지 120시간, 48 내지 200시간, 48 내지 180시간, 또는 48 내지 120시간 동안 수행될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 발효 배지는 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주를 이용한 발효에 적절한 배지를 선택할 수 있다. 상기 배지는 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주를 배양할 수 있는 공지된 배지 또는 통상적인 배지를 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물; 또는 상기 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물; 또는 상기 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 용도 또는 조성물에 있어서, 상기 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주는 상기 일 양상에 따른 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 균주는 개 피부로부터 분리된 것일 수 있다. 다른 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1과 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 또는 약 99.9% 이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM12993P로 기탁된 균주일 수 있다. 상기 균주는 DS008 균주일 수 있다.
상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료를 포함할 수 있다.
상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 염증 개선, 아토피 개선, 및 가려움증 억제 중 1종 이상일 수 있다.
상기 균주는 HAS3(hyaluronic acid synthase 3) 및 필라그린(Filaggrin) 중 1종 이상의 발현을 증가시키거나; IL-1α 및 IL-6 중 1종 이상의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.
"피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
"피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다. 피부　보습　효과는 피부의 주름 개선, 탄력도 증가에 도움을 줄 수 있다.
"염증 개선"은 "염증 억제", "항염증"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
"피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환 또는 피부 염증일 수 있다. 용어 "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어 "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다. 용어 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
상기 피부 염증성 질환은 피부염, 아토피 피부염, 소양증(가려움증), 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다. 상기 피부 염증성 질환은 피부염, 아토피 피부염 및 소양증(가려움증) 중 1종 이상일 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 상기 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물; 또는 상기 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 포함함으로써, HAS3 및 필라그린의 발현을 증가시켜 피부 장벽 강화 및 피부 보습 효과를 나타낼 수 있다.
일 양상에 따른 조성물은 상기 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물; 또는 상기 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 포함함으로써, 염증성 사이토카인(예: IL-1α 및 IL-6)의 발현을 감소시켜, 피부 염증 개선, 또는 피부 염증성 질환, 아토피, 가려움증 등의 피부 질환 예방, 개선 또는 치료 효과를 나타낼 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 피부 상태 개선 효과를 갖는 다른 균주, 예를 들어, 비피도박테리움 속에 속하는 균주와 함께 사용되어 시너지 효과를 나타낼 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 상기 균주, 이의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물, 또는 상기 복합발효추출물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 이의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물, 또는 복합발효추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션(formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
상기 조성물은 액체 상태 또는 건조 상태인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 건조 분말 형태일 수 있다.
상기 조성물을 건조 상태로 제조하는 건조 방법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예는, 공기 건조 방법, 자연 건조 방법, 분무 건조 방법, 동결 건조 방법 등이 있다. 이들 방법은 단독으로 사용하거나 적어도 두 가지 방법을 함께 사용할 수 있다.
상기 조성물은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물, 또는 복합발효추출물의 열화(deterioration)를 감소시키기에 충분한 유효량의 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 예를 들어 결합제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 화장품학적으로, 약학적으로 또는 식품학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 담체와 함께 제형화되어 화장품, 약품, 식품 첨가제 등으로 제공될 수 있다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 본 명세서에 개시된 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 기능성 첨가물 등을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 분산제, 유화제, 방부제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 특정 제형에 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 제형을 적절히 선택할 수 있다. 상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 가용화 제형, 유화 제형, 또는 분산 제형을 갖는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제; 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종 생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염 등의 약제; 비타민 C, 마그네슘아스코빌포스페이트, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산; 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류 등도 적절하게 배합할 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 만니톨, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제 등일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 연고제 등일 수 있다.
상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다. 이 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물, 또는 복합발효추출물 단독을 사용하거나, 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드; 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또 다른 양상은 유효량의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 피부 상처, 또는 피부 염증과 관련된 상태일 수 있다.
본 명세서에서 용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고, 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부 개선을 필요로 하는 개체, 예를 들어 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 염증 개선, 아토피 개선 또는 가려움증 억제 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 예를 들면, 0.1 ㎎ 내지 500 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 100 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 50 ㎎, 0.1 ㎎ 내지 25 ㎎, 1 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 1 ㎎ 내지 500 ㎎, 1 ㎎ 내지 100 ㎎, 1 ㎎ 내지 50 ㎎, 1 ㎎ 내지 25 ㎎, 5 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 5 ㎎ 내지 500 ㎎, 5 ㎎ 내지 100 ㎎, 5 ㎎ 내지 50 ㎎, 5 ㎎ 내지 25 ㎎, 10 ㎎ 내지 1,000 ㎎, 10 ㎎ 내지 500 ㎎, 10 ㎎ 내지 100 ㎎, 10 ㎎ 내지 50 ㎎, 또는 10 ㎎ 내지 25 ㎎을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 따른 신규 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주 또는 상기 균주를 이용한 천연물 복합발효추출물에 의하면, 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 염증 개선, 아토피 개선, 및 가려움증 억제 효과가 있으므로, 피부 상태의 개선, 예방, 또는 치료 용도로 다양하게 응용될 수 있다.
도 1은 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 HAS3의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군; RA: 양성대조군으로서 레티노산 첨가군.
도 2는 실시예 2의 균주 배양액과 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 HAS3의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군; DS008: 실시예 2의 균주 배양액 첨가군; RA: 양성대조군으로서 레티노산 첨가군.
도 3은 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 필라그린의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군.
도 4는 실시예 2의 균주 배양액과 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 필라그린의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군; DS008: 실시예 2의 균주 배양액 첨가군.
도 5는 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 IL-1α의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 염증 미유도 및 미첨가군; (+): 염증 유도 및 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군; Dex: 양성대조군으로서 덱사메타손 첨가군.
도 6은 실시예 2의 균주 배양액과 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 IL-1α의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 염증 미유도 및 미첨가군; (+): 염증 유도 및 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군; DS008: 실시예 2의 균주 배양액 첨가군; Dex: 양성대조군으로서 덱사메타손 첨가군.
도 7은 실시예 2의 균주 배양액과 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 IL-6의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 염증 미유도 및 미첨가군; (+): 염증 유도 및 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군; Dex: 양성대조군으로서 덱사메타손 첨가군.
도 8은 실시예 2의 균주 배양액과 실시예 3의 천연물 발효액을 각질형성세포에 처리시 IL-6의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다. None: 염증 미유도 및 미첨가군; (+): 염증 유도 및 미첨가군; Medium: R2A 배지 첨가군; Complex: 실시예 3의 천연물 발효액 첨가군; DS008: 실시예 2의 균주 배양액 첨가군; Dex: 양성대조군으로서 덱사메타손 첨가군.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주의 분리 및 동정
건강한 개의 피부에서 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 균주를 분리 및 동정하였다.
구체적으로, 건강한 개의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 확보된 샘플, 즉, 개 각질세포(canine epidermal keratinocyte)를 TSA(Tryptic Soy Agar) 배지(BD)에 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 배양한 뒤 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 재배양 하였다.
배양이 완료된 집락은 16S rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안된 것을 사용하였다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시 하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다.
분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA 부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램을 사용하여 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였을 때 상동성 99% 이하의 신규 미생물 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 균주(이하 "DS008"라 함)를 선별하였다. 선별된 DS008 균주를 2021년 5월 28일자로 한국 미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12993P를 부여 받았다. DS008 균주는 서열번호 1(complementary DNA)의 16S rRNA 서열을 갖는다.
실시예 2. DS008 균주 배양액의 제조
실시예 1의 DS008 균주를 R2A(Reasoner's 2A) 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하여 37℃, 혐기 조건에서 72시간 배양하였다.
실시예 3. DS008 균주를 이용한 천연물 발효액의 제조
증류수 1 L당 감초 10 g, 엉겅퀴 뿌리 50 g 및 인동 줄기 40 g를 넣고, 1 기압 이상의 압력, 112℃에서 2시간 30분 동안 중탕추출하여 천연물 복합 추출물을 얻었다. R2A 배지에 상기 천연물 복합 추출물 5%(w/w)를 첨가하고 실시예 1의 DS008 균주를 접종하여 72시간 배양하고, 상층액을 수득하고 여과하여 발효액을 제조하였다.
실험예 1. 피부 장벽 강화 및 피부 보습 활성 분석 - HAS3 및 Filaggrin 발현 증가 확인
DS008 균주 배양액 또는 이를 이용한 천연물 발효액이 피부 장벽 강화 및 피부 보습 활성에 미치는 영향을 분석하기 위해, HAS3(Hyaluronic acid synthase 3) 및 필라그린(Filaggrin)의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청(fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 상기 실시예 2의 배양액 1%(w/w) 또는 실시예 3의 발효액 1%(w/w)을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 양성대조군으로는 레티노산(Retinoic acid, RA) 1 uM을 사용하였다. 피부 장벽 강화 및 피부 보습과 관련된 인자인 HAS3 및 필라그린에 대한 프라이머를 사용하여 실시간(real-time) PCR 기계에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. HAS3 및 필라그린의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 1, 2, 3 및 4에 각각 나타내었다.
도 1 및 2는 각질형성세포에서 HAS3의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다.
도 3 및 4는 각질형성세포에서 필라그린의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다.
도 1, 2, 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 균주 배양액은 HAS3의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 또한, 실시예 3의 천연물 발효액은 HAS3 및 필라그린의 발현을 유의적으로 증가시켰다. 특히, 실시예 3의 천연물 발효액은 실시예 2의 균주 배양액 보다 HAS3 및 필라그린의 발현량이 높음을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 DS008 균주 및 이를 이용한 천연물 발효액이 피부 장벽 강화 및 피부 보습에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
실험예 2. 항염증, 항아토피 및 가려움증 억제 활성 분석 - 염증성 사이토카인 발현 감소 확인
DS008 균주 배양액 또는 이를 이용한 천연물 발효액이 항염증, 항아토피 및 가려움증 억제 활성이 있는지 여부를 분석하기 위해, 염증성 사이토카인 IL-1α 및 IL-6의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청(fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 배지는 3~4일마다 교환해 주며 세포가 과다하게 증식되었을 때는 계대배양 하였다. 이후에 상기 세포를 5x105/웰로 분주하고 배양 24시간 후, 인산 완충 식염수 용액(PBS)으로 세척하였다. FBS를 포함하지 않은 DMEM 배지가 들어있는 각 웰에 세포를 분주하고, Poly I:C 10 ㎍/㎖, 및 IL-4를 10 ng/㎖로 첨가하여 각질형성 세포주에 염증을 유도하였다. 다음으로 상기 실시예 2의 배양액 또는 실시예 3의 발효액을 1%(w/w) 농도로 처리한 후, 4시간 동안 추가 배양하였다. 양성대조군으로는 덱사메타손(dexamethasone) 1 μM을 사용하였다. IL-1α 및 IL-6에 대한 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 발현량을 분석하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과를 도 5 내지 도 8에 나타내었다.
도 5 및 6은 각질형성세포에서 IL-1α의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다.
도 7 및 8은 각질형성세포에서 IL-6의 상대적인 발현 수준을 나타낸 결과이다.
도 5, 6, 7 및 8에 나타낸 바와 같이, 실시예 2의 균주 배양액은 IL-1α 및 IL-6의 발현을 유의적으로 감소시켰다. 또한, 실시예 3의 천연물 발효액은 IL-1α 및 IL-6의 발현을 유의적으로 감소시켰다. 특히, 실시예 3의 천연물 발효액은 실시예 2의 균주 배양액 보다 IL-1α 및 IL-6의 발현 감소량이 크다는 것을 확인할 수 있었다.
이러한 결과는 DS008 균주 및 이를 이용한 천연물 발효액이 피부 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 아토피의 예방, 개선, 또는 치료, 또는 가려움증(소양증)의 예방, 치료 또는 개선에도 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
종합하면, 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스 DS008 균주 또는 이를 이용한 천연물 발효액은 HAS3 및 필라그린의 발현을 증가시키며; IL-1α 및 IL-6의 발현을 감소시킴을 확인하였다. 따라서, DS008 균주 및 이를 이용한 천연물 발효액은 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 염증 개선, 아토피 개선, 피부 가려움증 억제 효과를 가짐을 알 수 있었다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다.
Figure PCTKR2022013369-appb-img-000001

Claims (12)

  1. 서열번호 1과 95% 이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA를 포함하는, 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 기탁번호 KCCM12993P로 기탁된 것인 균주.
  3. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 포함하는 화장료 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 피부 상태 개선용인 것인 화장료 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 피부 장벽 강화, 피부 보습, 피부 염증 개선, 아토피 개선, 및 가려움증 억제 중 1종 이상인 것인 화장료 조성물.
  6. 청구항 3에 있어서, HAS3(hyaluronic acid synthase 3) 및 필라그린(Filaggrin) 중 1종 이상의 발현을 증가시키거나; IL-1α 및 IL-6 중 1종 이상의 발현을 감소시키는 것인 화장료 조성물.
  7. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 청구항 1의 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 화장료 조성물.
  10. 청구항 1의 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 포함하는 피부 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 청구항 1의 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합발효추출물을 포함하는 피부 상태 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 비피도박테리움 애니멀리스 서브스페시스 락티스(Bifidobacterium animalis subsp. lactis) 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물; 또는 상기 균주로 감초, 엉겅퀴 및 인동의 복합 추출물을 발효시킴으로써 수득된 복합 발효 추출물의 용도.
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