WO2021060654A1 - 스타필로코커스 에피더미디스 st-6 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도 - Google Patents

스타필로코커스 에피더미디스 st-6 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도 Download PDF

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WO2021060654A1
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WO
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skin
strain
staphylococcus
culture solution
staphylococcus epidermidis
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PCT/KR2020/007002
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김민지
김미선
강승현
박명삼
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코스맥스 주식회사
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K8/00—Cosmetics or similar toiletry preparations
    • A61K8/18—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition
    • A61K8/96—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution
    • A61K8/99—Cosmetics or similar toiletry preparations characterised by the composition containing materials, or derivatives thereof of undetermined constitution from microorganisms other than algae or fungi, e.g. protozoa or bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61Q—SPECIFIC USE OF COSMETICS OR SIMILAR TOILETRY PREPARATIONS
    • A61Q19/00—Preparations for care of the skin
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    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/44—Staphylococcus

Definitions

  • the skin ecosystem provides a variety of habitats for microorganisms, and a wide range of microorganisms live there.
  • Humans which are hosts, have a symbiotic relationship with them, and are known to have many positive effects on the host.
  • the skin consists of various types of habitats such as depressions and specialized crevices, and helps a wide distribution of microorganisms to grow. Basically, the skin forms a physical film and helps to defend against potential hazards and toxic substances from the outside.
  • the skin becomes a point of connection with the external environment and is also a collection of various microorganisms (fungi, bacteria, viruses and small larvae). In accordance with the choice of physical and chemical functions, microorganisms prepare habitats by adapting to specialized niches.
  • the skin is cold, acidic, and remains dry. Structurally, the epidermis forms the skin barrier, blocks the penetration of microorganisms and toxins, and plays an important role in maintaining moisture.
  • the uppermost layer of the epidermis is composed of the stratum corneum.
  • the epidermis has a shape called'brick and mortar structure', and the skin tissue goes through a continuous self-healing process, and the scales that have gone through the end of the differentiation process are constantly being removed from the skin tissue.
  • Probiotics is a generic term for microorganisms that have a beneficial effect on the human body, and refers to microorganisms that provide benefits to our body. Most of the probiotics known to date are known as lactobacilli. Probiotics have been reported to produce effective effects through various beneficial actions on the human body, but studies on the relationship between skin flora and skin are insufficient.
  • One aspect is to provide a Staphylococcus epidermidis ST-6 (Staphylococcus epidermidis ST-6) strain belonging to the genus Staphylococcus sp.
  • Another aspect is to provide a lysate of the strain, a culture medium, or an extract of the culture medium.
  • Another aspect is to provide a composition
  • a composition comprising the strain, a lysate thereof, a culture medium, and an extract of the culture medium.
  • Another aspect is to provide a method for improving, preventing, or treating a skin condition comprising administering the strain, its lysate, a culture medium, and an extract of the culture medium to an individual.
  • One aspect provides a Staphylococcus epidermidis ST-6 strain.
  • the Staphylococcus epidermidis ST-6 strain may be a strain deposited under the accession number KCCM12551P.
  • the Staphylococcus epidermidis ST-6 strain may be a strain containing 16s rRNA of SEQ ID NO: 1.
  • the strain may be one having an effect of improving skin beauty, for example, inhibiting skin aging, whitening skin, strengthening skin barrier, inhibiting skin wrinkles, or moisturizing skin.
  • the strain may be one that increases the expression of hyaluronic acid synthase 3 (HAS3: Hyaluronan synthase 3) or filaggrin.
  • HAS3 Hyaluronan synthase 3
  • filaggrin filaggrin
  • Another aspect provides a lysate of the strain, a culture medium, or an extract of the culture medium.
  • the strain is as described above.
  • culture medium may be used interchangeably with “culture supernatant”, “conditional culture medium” or “conditioned medium”, and Staphylococcus epidermidis ST-6 strain can grow and survive in vitro. It may mean a whole medium including the strain, its metabolites, and extra nutrients obtained by culturing the strain in a medium capable of supplying nutrients for a certain period of time.
  • the culture solution may mean a culture solution in which cells are removed from the cell culture solution obtained by culturing the strain.
  • the liquid from which the cells have been removed from the culture solution is also referred to as the "supernatant solution", and the culture solution is left for a certain period of time to take only the liquid in the upper layer excluding the submerged part, or remove the cells through filtration, or It can be obtained by removing the precipitation of and taking only the upper liquid.
  • the "bacterial body” refers to the strain itself of the present invention, and includes the strain itself or separated from the culture solution by culturing the strain selected by separating from skin samples and the like.
  • the cells can be obtained by taking the part that has settled in the lower layer by centrifuging the culture solution, or by allowing it to stand still for a certain period of time and then removing the upper liquid because it sinks into the lower layer of the culture solution by gravity.
  • the culture solution may include a culture solution itself obtained by culturing a strain, a concentrate thereof, or a culture supernatant obtained by removing a strain from a lyophilisate or a culture solution, a concentrate thereof, or a lyophilisate.
  • the culture medium is Staphylococcus epidermidis ST-6 strain in a medium (for example, R2A medium or TSA medium) at any temperature of more than 10 °C or less than 40 °C for a certain period of time, for example, 4 to 50 hours. It may be obtained by culturing.
  • a medium for example, R2A medium or TSA medium
  • the culture supernatant of the strain may be obtained by centrifuging or filtering the strain culture solution to remove the strain.
  • the concentrate may be obtained by concentrating the obtained supernatant after filtering the strain culture solution itself or the culture solution using a centrifuge or filter.
  • the culture medium and culture conditions for culturing the Staphylococcus epidermidis ST-6 strain may be appropriately selected or modified by a person of ordinary skill in the art.
  • lysate may refer to a product obtained by crushing the cell wall of the strain itself by chemical or physical force.
  • culture solution extract refers to extraction from the culture solution or its concentrate, and includes an extract, a dilution or concentrate of the extract, a dried product obtained by drying the extract, or these preparations or purified products, and a fraction obtained by fractionating them. I can.
  • Another aspect provides the use of the strain, a lysate of the strain, a culture solution, or an extract of the culture solution. Specifically, it provides a composition comprising a Staphylococcus epidermis ST-6 strain, a lysate, a culture solution, or an extract of a culture solution thereof.
  • the use of the strain may include improving skin conditions, improving skin beauty, preventing, improving or treating skin diseases, preventing, improving, or treating inflammatory diseases of the skin.
  • the skin condition improvement or skin beauty improvement may be suppressing or improving skin aging, anti-wrinkle, skin whitening, skin barrier strengthening, or skin moisturizing.
  • skin aging refers to the morphological and intangible changes that appear in the skin as we age, for example, the phenomenon of thinning the thickness of the epidermis, the number of cells or blood vessels in the dermis, the ability to repair DNA damage, the cell replacement cycle, It refers to the reduction of wound recovery, skin barrier function, epidermal moisture retention, sweat secretion, sebum secretion, vitamin D production, physical damage protection, chemical removal ability, immune response, sensory function, and body temperature regulation.
  • the strain or a culture solution thereof may be for improving skin aging caused by an exogenous factor or an endogenous factor.
  • the exogenous factor refers to various external factors, such as ultraviolet (light), and the endogenous factor is also referred to as a chronological factor, and refers mainly to a factor caused by the passage of time.
  • the skin aging is not only a symptom of premature aging induced by external stimuli caused by ultraviolet rays, pollution, tobacco smoke, chemical substances, etc., but also a natural aging phenomenon that occurs as the proliferation of skin cells decreases with age. It includes, and includes all of wrinkles, elasticity reduction, sagging and dryness of the skin.
  • wrinkles include that irritation caused by changes in internal and external factors causes wrinkles by changing components constituting the skin tissue.
  • the aging may be photoaging.
  • photoaging is a phenomenon caused by external environmental factors, and the most representative factor is ultraviolet rays. Ultraviolet rays cause damage to biological components such as activation of proteases, chain cleavage of matrix proteins, and abnormal cross-linking, and repetition of this mechanism causes apparent skin aging.
  • wrinkle refers to a state in which the elasticity of the skin is lost and loosened, and for example, the skin may be folded.
  • Pigmentation refers to a condition in which the amount of pigment in the body is abnormal or where the pigment appears, and may be, for example, spots and freckles.
  • skin wrinkle prevention or improvement may mean any action of preventing or improving wrinkles by inhibiting the expression of factors related to wrinkles, or increasing the total amount of collagen.
  • skin whitening may mean not only brightening skin tone by inhibiting the synthesis of melanin pigment, but also improving skin hyperpigmentation such as spots and freckles caused by ultraviolet rays, hormones, or genetics.
  • skin barrier strengthening may refer to any action that enhances the function of the skin barrier, which is located on the outermost side of the skin and prevents moisture and nutrient loss.
  • skin moisturizing may mean any action of maintaining skin moisture or preventing moisture loss.
  • anti-inflammatory may be used interchangeably with “inhibitory or ameliorating inflammation”, and may mean any action in which the immune response is alleviated and NO production is suppressed.
  • the "skin disease” may be a disease caused by impaired skin barrier function, skin aging, skin wounds, skin scars, or skin inflammation.
  • prevention includes inhibiting the occurrence of a disease.
  • treatment includes inhibition, alleviation, or elimination of the development of a disease.
  • the damage to the skin barrier function may mean all changes that appear on the skin due to a decrease or damage to the function of the skin barrier. For example, it may include increased skin wrinkles, dryness, dermatitis, atopic dermatitis, allergic dermatitis, acne, and the like.
  • the skin inflammatory disease may be any one selected from the group consisting of skin wounds, dermatitis, atopic dermatitis, pruritus, eczema skin disease, dry eczema, erythema, urticaria, psoriasis, weak rash, and acne.
  • the strain may be used together with a strain belonging to the genus Staphylococcus other strains having a skin improvement effect to exhibit a synergistic effect.
  • strains belonging to the genus Staphylococcus are S. argenteus , S. aureus , S. schweitzeri , S. simiae, S. auricularis, S. carnosus , S. condimenti , S. debuckii , S. massiliensis , S. piscifermentans , S. simulans, S. capitis , S. caprae , S. epidermidis , S. saccharolyticus, S. devriesei , S.
  • strains belonging to the genus Staphylococcus include Staphylococcus capitis ST-1, Staphylococcus lentus ST-2, Staphylococcus lentus ST-2, and Staphylococcus cornii.
  • Staphylococcus cohnii ST-3 Staphylococcus gallinarum ST-4, Staphylococcus saprophyticus ST-5, Staphylococcus saprophyticus ST-5, Staphylococcus epi Staphylococcus epidermidis ST-6, Staphylococcus sciuri ST-7, Staphylococcus haemolyticus ST-8, Staphylococcus haemolyticus ST-8, Staphylococcus simul Staphylococcus simulans ST-9, Staphylococcus xylosus ST-10, Staphylococcus intermedius ST-11, Staphylococcus intermedius ST-11, and Staphylococcus Reneri ST-12 ( Staphylococcus warneri ST-12), or Staphylococcus schleiferi ST-13 (Staphylococcus schleiferi ST-13).
  • the composition is from 0.001% to 80% by weight based on the total weight of the composition, for example, from 0.01% to 60% by weight, from 0.01% to 40% by weight, from 0.01% to 30% by weight, from 0.01% to 20% by weight %, 0.01% to 10%, 0.01% to 5%, 0.05% to 60%, 0.05% to 40%, 0.05% to 30%, 0.05% to 20%, 0.05% to 10% by weight, 0.05% to 5% by weight, 0.1% to 60% by weight, 0.1% to 40% by weight, 0.1% to 30% by weight, 0.1% to 20% by weight, 0.1% by weight % To 10% by weight, or 0.1% to 5% by weight of the strain, a lysate thereof, a culture solution, or an extract of a culture solution thereof.
  • the term "included as an active ingredient” means that the strain of the present specification, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium thereof is added to the extent that the above-mentioned effect can be exhibited, and various It means that the ingredients are added as an auxiliary ingredient to be formulated in various forms.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may be, for example, a softening lotion, a nutritional lotion, a massage cream, a nutritional cream, an essence, a pack, a gel, an ampoule, or a cosmetic formulation of a skin adhesion type.
  • ingredients included in the cosmetic composition may include ingredients commonly used in cosmetic compositions in addition to the composition as an active ingredient.
  • conventional adjuvants and carriers such as stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances It may include.
  • composition may be a composition for external application for skin.
  • the external preparation for skin may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal delivery patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the above skin external preparations are ingredients commonly used in external preparations for skin such as cosmetics and pharmaceuticals, such as aqueous ingredients, oily ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, fragrances. , Colorants, various skin nutrients, or a combination thereof and may be appropriately formulated according to need.
  • the external preparations for the skin include metal sequestering agents such as disodium edetate, trisodium edetate, sodium citrate, sodium polyphosphate, sodium metaphosphate, and gluconic acid, caffeine, tannin, bellapamil, licorice extract, glavidine, and caline.
  • Hot water extract of fruit, various herbal medicines, drugs such as tocopherol acetate, glytilithic acid, tranexamic acid and derivatives or salts thereof, vitamin C, ascorbic acid magnesium phosphate, ascorbic acid glucoside, arbutin, kojic acid, glucose, fructose, Sugars such as trehalose can also be appropriately blended.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, or mannitol, and as a lubricant, magnesium stearate, talc, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, a disintegrant, a binder, a lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethylcellulose, sodium starch glycolate, anhydrous calcium monohydrogen phosphate, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as an oral or parenteral dosage form.
  • the oral dosage form may be a granule, a powder, a liquid, a tablet, a capsule, a dry syrup, or a combination thereof.
  • the parenteral dosage form may be an injection.
  • the composition may be a health functional food composition.
  • the health functional food composition may be used alone or in combination with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient may be appropriately determined according to the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the composition of the present specification may be added in an amount of 15 parts by weight or less based on the raw material.
  • the beverage composition may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as an additional component, like ordinary beverages.
  • the natural carbohydrates are monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose, and polysaccharides such as dextrin and cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • sweetener natural sweeteners such as taumatin and stevia extract, and synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the health food composition may also be used in nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols, carbonated beverages. Carbonating agents used, or combinations thereof.
  • the health functional food composition may also contain natural fruit juice, fruit juice beverage, pulp for the production of vegetable beverages, or a combination thereof.
  • Another aspect also provides a method of preventing, ameliorating, or treating a condition in an individual comprising the step of treating or administering to an individual in need thereof an effective amount of the above composition.
  • the condition of the individual may be a condition related to skin or a condition related to inflammation.
  • administering is used interchangeably and one embodiment into a subject by a method or route that results in at least partial localization of a composition to a desired site according to one embodiment. It may mean the arrangement of the composition according to the example.
  • Administration can be administered by a method known in the art. Administration may be administered directly to a subject by any means, for example by routes such as intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. I can. The administration can be administered systemically or locally.
  • the subject may be a mammal, for example a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the individual may be an individual in need of an effect of improving skin beauty, for example, moisturizing the skin, strengthening the skin barrier, inhibiting skin inflammation, and improving skin wrinkles.
  • the administration is 0.1 mg to 1,000 mg per subject per day, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to the composition according to an embodiment.
  • 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
  • the dosage may be variously prescribed according to factors such as formulation method, administration mode, patient's age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, route of administration, excretion rate, and response sensitivity. In consideration of these factors, the dosage can be appropriately adjusted.
  • the number of administration can be once a day or two or more times within the range of clinically tolerable side effects, and the administration site can be administered at one or two or more locations, daily or at intervals of 2 to 5 days.
  • the number of days of administration can be administered from 1 to 30 days per treatment. If necessary, the same treatment can be repeated after an appropriate time period.
  • 1 is a graph showing the effect of the strain on the expression of COL1A1 according to an embodiment.
  • FIG. 2 is a graph showing the effect of the strain on the expression of MMP-1 according to an embodiment.
  • FIG. 3 is a graph showing the effect of the strain on the expression of HAS3 according to an embodiment.
  • Figure 4 is a graph showing the effect of the strain on the expression of pilagrin according to an embodiment.
  • a sample human epidermal keratinocyte obtained by washing the skin of a healthy woman with sterile distilled water was inoculated into R2A medium (Becton Dickinson, Cockeysville, MD). After culturing in a 28°C incubator for 48 hours after inoculation, 100 colonies formed were separated and cultured with pure water, and cultivated in a 28°C incubator for 48 hours. The cultured colonies were subjected to 16s rRNA gene sequence identification. The primers used at this time were designed to amplify in response to only bacteria (SEQ ID NOs: 2 and 3).
  • PCR amplification was carried out in 30 cycles of 95°C for 1 minute, 55°C for 1 minute, 75°C for 1 minute and 30 seconds, and finally treated at 72°C for 8 minutes and then stored at 4°C.
  • DNA sequences of the isolated and cultured species were determined using ABI-3730XL (ABI, USA).
  • the nucleotide sequence of the 16S rRNA site determined among the isolated and cultured microbial colonies was compared with other strains registered with the BLAST program provided on the website of the National Center for Biotechnology Information (NCBI), when compared with 98% homology.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • ST-6 novel microorganism Staphylococcus epidermidis ST-6 (hereinafter referred to as "ST-6") having a homology of 98% or less was selected.
  • the selected ST-6 strain was deposited with the Korean Microbial Conservation Center on June 11, 2019, and was given the accession number KCCM12551P, and the ST-6 strain has a 16s rRNA sequence of SEQ ID NO: 1 (complementary DNA).
  • Type Strain KCCM 35494 Staphylococcus epidermidis strain (sold in Korea Microbial Conservation Center) (hereinafter referred to as "Type Strain") was used.
  • the human fibroblast cell line Human dermal fibroblast, Hs68
  • Hs68 human dermal fibroblast, Hs68
  • DPBS phosphatidylcholine
  • Real-time polymerase chain reaction was performed in (Step One Plus, Applied Biosystems, USA). The expression level of the gene was finally analyzed through correction for the ⁇ -actin gene, and the results are shown in FIGS. 1 and 2.
  • strain culture solution The effect of the strain culture solution on skin barrier strengthening and skin moisturizing activity was analyzed.
  • HaCaT cells a human keratinocyte
  • DMEM medium Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-00308
  • the cultured cell line was treated with the culture solution (1% (w/w)) of the ST-6 strain and further cultured for 24 hours.
  • the expression level of HAS3 and filaggrin was measured in the same manner as in the above experimental example, except that primers for HAS3 (hyaluronic acid synthase) and filaggrin, which are factors related to skin barrier strengthening and moisturizing, were used. I did. The results are shown in FIGS. 3 and 4, respectively.

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Abstract

신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.

Description

스타필로코커스 에피더미디스 ST-6 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도
신규한 미생물, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부상태 개선 용도에 관한 것이다.
피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 숙주인 인간은 이들과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속지점이 되며, 다양한 미생물들(진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어있다. 표피는 일명 '벽돌과 몰탈 구조'라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화과정의 마지막을 거친 비늘(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.
이에, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있는 피부상재균의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 스타필로코커스 속(Staphylococcus sp.)에 속하는 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6(Staphylococcus epidermidis ST-6) 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄물, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄물, 배양액, 배양액의 추출물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 상태를 개선, 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6(Staphylococcus epidermidis ST-6) 균주를 제공한다.
상기 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6(Staphylococcus epidermidis ST-6) 균주는 기탁번호 KCCM12551P로 기탁된 균주일 수 있다.
상기 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6(Staphylococcus epidermidis ST-6) 균주는 서열번호 1의 16s rRNA를 포함하는 균주일 수 있다.
상기 균주는 피부 미용 개선 효과, 예를 들면, 피부 노화 억제, 피부 미백, 피부 장벽 강화, 피부 주름 억제, 또는 피부 보습 효과를 갖는 것일 수 있다.
상기 균주는 히알루론산 합성 효소 3(HAS3: Hyaluronan synthase　3), 또는 필라그린(filaggrin)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄물, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공한다.
상기 균주에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 용어"배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 호환적으로 사용될 수 있고, 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다. 　한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상등액"이라고도 하며,　배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주　자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물, 또는 동결건조물 또는 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
상기 배양액은 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6 균주를 배지(예를 들면, R2A 배지 또는 TSA 배지) 에서 10 ℃ 초과 또는 40 ℃ 미만 중 어느 온도에서 일정 시간, 예를 들면, 4 내지 50시간 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리나 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리나 필터를 이용하여 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
상기 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 균주, 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 그의 배양액의 추출물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료, 피부 염증성 질환의 예방, 개선, 또는 치료 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 억제 또는 개선, 항 주름, 피부 미백, 피부 장벽 강화, 또는 피부 보습일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말하는 것으로, 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수, DNA 손상복구 능력, 세포교체주기, 상처 회복, 피부장벽기능, 표피의 수분 유지, 땀분비, 피지분비, 비타민D 생산, 물리적 손상방어, 화학물질 제거능력, 면역반응, 감각 기능, 체온조절의 감소를 말한다.
상기 균주 또는 이의 배양액은 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화 개선용일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말하고 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상 뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며 주름, 탄력 감소, 피부 쳐짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.
상기 노화는 광노화일 수 있다. 용어 "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.
본 명세서에서 용어 "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. 색소 침착은 체내에 있는 색소의 양이 비정상적인 경우 또는 색소가 나타나는 장소에 이상이 있는 상태를 의미하며, 예를 들면 기미 및 주근깨 등인 것일 수 있다. 상기 "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 미백"은　멜라닌 색소의 합성을 저해함으로써 피부 톤을 밝게 할 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착을 개선하는 것을 의미할 수 있다.
상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
용어, "항염증"이란 "염증 억제 또는 개선"과 혼용될 수 있으며, 면역 반응이 완화되어 NO 생성이 억제되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증일 수 있다. 용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다.
상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 염증성 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 균주는 피부 개선 효과를 갖는 다른 균주 스타필로코커스 속에 속하는 균주와 함께 사용되어 시너지 효과를 나타낸 것일 수 있다. 상기 스타필로코커스 속에 속하는 균주의 예는 S. argenteus,　S. aureus,　S. schweitzeri,　S. simiae, S. auricularis, S. carnosus,　S. condimenti,　S. debuckii,　S. massiliensis,　S. piscifermentans,　S. simulans, S. capitis,　S. caprae,　S. epidermidis,　S. saccharolyticus, S. devriesei,　S. haemolyticus,　S. hominis, S. hyicus-intermedius, S. agnetis,　S. chromogenes,　S. cornubiensis,　S. felis,　S. delphini,　S. hyicus,　S. intermedius,　S. lutrae,　S. microti,　S. muscae,　S. pseudintermedius,　S. rostri,　S. schleiferi, S. lugdunensis, S. arlettae,　S. caeli,　S. cohnii,　S. equorum,　S. gallinarum,　S. kloosii,　S. leei,　S. nepalensis,　S. saprophyticus,　S. succinus,　S. xylosus, S. fleurettii,　S. lentus,　S. sciuri,　S. stepanovicii,　S. vitulinus, S. simulans, 　S. pasteuri,　또는 S. warneri를 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 스타필로코커스 속에 속하는 균주의 예는 스타필로코커스 캐피티스 ST-1(Staphylococcus capitis ST-1), 스타필로코커스 렌투스 ST-2(Staphylococcus lentus ST-2), 스타필로코커스 코니이 ST-3(Staphylococcus cohnii ST-3), 스타필로코커스 갈리나룸 ST-4(Staphylococcus gallinarum ST-4), 스타필로코커스 사프로파이티쿠스 ST-5(Staphylococcus saprophyticus ST-5), 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6(Staphylococcus epidermidis ST-6), 스타필로코커스 시우리 ST-7(Staphylococcus sciuri ST-7), 스타필로코커스 헤몰리티쿠스 ST-8(Staphylococcus haemolyticus ST-8), 스타필로코커스 시뮬란스 ST-9(Staphylococcus simulans ST-9), 스타필로코커스 자일로수스 ST-10(Staphylococcus xylosus ST-10), 스타필로코커스 인터미디우스 ST-11(Staphylococcus intermedius ST-11), 스타필로코커스 와르네리 ST-12(Staphylococcus warneri ST-12), 또는 스타필로코커스 스클레이페리 ST-13(Staphylococcus schleiferi ST-13)를 포함할 수 있다.
상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 중량% 내지 80 중량%, 예를 들면, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물을 포함할 수 있다.
용어, "유효성분으로 포함"은 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 이의 파쇄액, 배양액, 또는 이의 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 포뮬레이션 (formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 에센스, 팩, 젤, 앰플 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다.
상기 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 상기 조성물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.
본 명세서에서, 상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다. 상기 피부외용제는, 에데트산이나트륨, 에데트산삼나트륨, 시트르산나트륨, 폴리인산나트륨, 메타인산나트륨, 글루콘산 등의 금속봉쇄제, 카페인, 탄닌, 벨라파밀, 감초추출물, 글라블리딘, 칼린의 과실의 열수추출물, 각종생약, 아세트산토코페롤, 글리틸리틴산, 트라넥삼산 및 그 유도체 또는 그 염등의 약제, 비타민 C, 아스코르브산인산마그네슘, 아스코르브산글루코시드, 알부틴, 코지산, 글루코스, 프룩토스, 트레할로스 등의 당류등도 적절하게 배합할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제, 또는 그 조합일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제일 수 있다.
상기 조성물은 건강기능식품 조성물을 일 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물은 상기 균주 또는 이의 배양액 단독 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에 본 명세서의 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하의 양으로 첨가될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 건강식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 건강기능식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
또한, 다른 양상은 유효한 양의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 처리 또는 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태, 또는 염증과 관련된 상태일 수 있다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피 (transdermal), 점막, 코안 (intranasal), 기관내 (intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부미용 개선, 예를 들어 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 염증 억제, 피부 주름 개선 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하고, 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
일 양상에 신규 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6 균주에 의하면, 피부 관련 상태 또는 염증 관련 상태의 예방, 개선, 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주가 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주가 HAS3의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 4는 일 구체예에 따른 균주가 필라그린의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예. 균주의 분리 및 동정
건강한 여성의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 확보된 샘플(human epidermal keratinocyte)을 R2A 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 배양한 뒤 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 재배양 하였다. 배양이 완료된 집락은 16s rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안(서열번호 2 및 3)되었다. PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시 하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다. 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA부위의 염기서열을 미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램으로 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였을 때 상동성 98% 이하의 신규성 있는 종들만 선별하여 사용하였고, 그 중 상동성 98% 이하의 신규 미생물 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6(Staphylococcus epidermidis ST-6) 균주(이하 "ST-6"이라 함)을 선별하였다. 선별된 ST-6 균주를 2019년 6월 11일자로 한국 미생물 보존센터에 기탁하여 기탁번호 KCCM12551P를 부여 받았고, ST-6 균주는 서열번호 1(complementary DNA)의 16s rRNA 서열을 갖는다.
실험예. 균주의 활성
본 실험예에서는 상기 동정된 균주의 활성을 확인하였고, 대조 균주로서 KCCM 35494 스타필로코커스 에피더미디스 균주(한국미생물보존센터에서 분양 받음)(이하에서 "Type Strain"라 함)를 사용하였다.
항노화 및 항주름 활성 분석
상기 균주 배양액이 자외선(UV) 조사에 의한 노화피부 노화 및 주름 생성과 관련된 인자에 미치는 영향을 분석하였다.
구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68) 를 6 웰 플레이트에 3.5x105로 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS를 넣은 후 12 mJ/cm2의 UVB를 조사하거나 조사하지 않았다. UVB 조사 직후 DPBS를 제거하고 FBS가 없는 배지로 갈아 준 후, 상기 ST-6 균주의 배양액(1%(w/w))을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 음성 대조군으로 자외선 처리 및 균주 배양액 비처리군을 사용하였다. 그 후 각 시료의 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 nanodrop으로 260㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 타겟 유전자인 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1) 및 COL1A1에 대하여 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA)을 프라이머 및 cDNA와 함께 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였고, 그 결과는 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 자외선에 의해 감소된 COL1A1의 발현을 유의적으로 증가시킴을 알 수 있었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 자외선 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 유의적으로 감소시킴을 알 수 있었다.
이러한 결과는 일 구체예에 따른 ST-6 균주가 노화(예를 들면, 광노화)를 개선할 수 있는 효과가 있음을 의미한다.
피부장벽 강화 및 피부 보습 활성 분석
상기 균주 배양액이 피부장벽강화 및 피부 보습 활성에 미치는 영향을 분석하였다.
구체적으로, 인간 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT 세포를 10% 우혈청 (fetal bovin serum)을 포함한 DMEM 배지(Dulbecco'smodified Eagle's Medium, Gibco 1210-0038)에서 배양하였고, 배양은 모두 37℃, 5% CO2 배양기에서 수행하였다. 상기 배양된 세포주에 상기 ST-6 균주의 배양액(1%(w/w))을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 피부 장벽 강화 및 보습과 관련된 인자인 HAS3(히알루론산 합성 효소) 및 필라그린(filaggrin)에 대한 프라이머를 사용한 것만을 제외하고는 상기 실험예와 동일한 방법으로 HAS3 및 필라그린(filaggrin)의 발현량을 측정하였다. 상기 결과는 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다.
도 3 및 4에 나타낸 바와 같이, 일 구체예에 따른 균주는 HAS3 및 필라그린의 발현량을 모두 유의적으로 증가시킴을 알 수 있었다.
이러한 결과는, 일 구체예에 따른 ST-6 균주가 피부장벽 강화 및 피부 보습에 유용하게 사용될 수 있음을 의미한다.
Figure PCTKR2020007002-appb-I000001

Claims (4)

  1. 기탁번호 KCCM12551P로 기탁된, 스타필로코커스속(Staphylococcus)에 속하는 스타필로코커스 에피더미디스 ST-6(Staphylococcus epidermidis ST-6) 균주.
  2. 청구항 1의 균주의 파쇄액, 또는 배양액.
  3. 청구항 1의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물.
  4. 청구항 3에 있어서, 피부 미용 개선용인 것인 화장료 조성물.
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