WO2024005443A1 - 마이크로코커스 플라버스 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도 - Google Patents

마이크로코커스 플라버스 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도 Download PDF

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WO2024005443A1
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WO
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strain
skin
culture medium
micrococcus
lysate
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PCT/KR2023/008625
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김민지
김미선
백채윤
이동걸
강승현
박명삼
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코스맥스 주식회사
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    • C12N1/205—Bacterial isolates
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/265—Micrococcus
    • C12R2001/27—Micrococcus flavus

Definitions

  • It relates to novel microorganisms, their lysate, culture medium, and extract of the culture medium, and their use for improving skin condition.
  • the skin ecosystem provides various types of habitats for microorganisms, and a wide range of microorganisms live there. They form a symbiotic relationship with their human hosts, and are known to have many positive effects on the host.
  • the skin constitutes various types of habitats, including indentations and specialized crevices, and helps a wide range of microorganisms to grow. Basically, the skin forms a physical membrane and helps defend against potential hazards and toxic substances from the outside.
  • the skin serves as a point of contact with the external environment and is also a home for various microorganisms (e.g. fungi, bacteria, viruses, and small larvae). Depending on the selection of physical and chemical functions, microorganisms adapt to specialized niches and establish habitats.
  • the skin remains cool, acidic, and dry.
  • the epidermis forms the skin barrier and plays an important role in blocking the penetration of microorganisms and toxins and maintaining moisture.
  • the uppermost layer of the epidermis is composed of the stratum corneum.
  • the epidermis has a form called a 'brick and mortar structure'.
  • the skin tissue goes through a continuous self-recovery process, and the scales (squames) that have completed the differentiation process constantly repeat the process of being shed from the skin tissue.
  • Probiotics are a general term for microorganisms that have beneficial effects on the human body. They refer to microorganisms that benefit our bodies. Most probiotics known to date are known as lactic acid bacteria. Probiotics have been reported to produce effective effects through various beneficial effects on the human body, but research on the relationship between skin flora and skin is insufficient.
  • One aspect is to provide novel Micrococcus flavus strains.
  • Another aspect is to provide a lysate, culture medium, or extract of the culture medium of the strain.
  • Another aspect is to provide a use of the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium.
  • Another aspect is to provide a composition containing the strain, its lysate, culture medium, extract of the culture medium, or a mixture thereof.
  • Another aspect is to provide a method of preventing, ameliorating, or treating a condition in a subject comprising administering an effective amount of the composition described above to the subject in need thereof.
  • One aspect provides a strain of Micrococcus flavus.
  • the strain may be isolated.
  • isolated means something that does not exist in the natural world but can be artificially separated and used.
  • the strain may be isolated from human skin.
  • the strain may be a strain isolated by inoculating human skin cells into TSB (Tryptic Soy Broth) or R2A (Reasoner's 2A) medium and pure isolation and culturing of the cultured colonies.
  • the strain may be a strain belonging to the Micrococcus genus ( Micrococcus sp.).
  • the Micrococcus flavus strain may be a strain deposited under deposit number KCCM12997P.
  • the strain may be Micrococcus flavus MC-4 strain.
  • the Micrococcus flavus strain may contain 16S rRNA of SEQ ID NO: 1.
  • the strain is at least about 95%, at least about 96%, at least about 97%, at least about 98%, at least about 99%, at least about 99.5%, at least about 99.9%, at least 95% of SEQ ID NO: 1.
  • sequence identity refers to the degree of identity of amino acid residues or bases between sequences after aligning both sequences to be as consistent as possible in a specific comparison region. Sequence identity can be confirmed according to methods known in the art. The percent sequence identity can be determined using known sequence comparison programs, examples of which include BLASTN (NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM (DNASTAR Inc), etc.
  • the Micrococcus flavanus strain isolated from the skin increased the expression of COL1A1, decreased the expression of MMP-1, and inhibited melanin production. Additionally, it was confirmed that the strain promoted cell regeneration.
  • the strain according to one embodiment may have a skin condition improvement effect, for example, skin aging prevention, skin wrinkle improvement, skin elasticity enhancement, skin moisturization, skin barrier strengthening, or skin whitening effect. Additionally, the strain may have an effect on skin regeneration or prevention, improvement, or treatment of skin wounds.
  • a skin condition improvement effect for example, skin aging prevention, skin wrinkle improvement, skin elasticity enhancement, skin moisturization, skin barrier strengthening, or skin whitening effect.
  • the strain may have an effect on skin regeneration or prevention, improvement, or treatment of skin wounds.
  • the strain may have the effect of preventing skin aging, improving skin wrinkles, improving skin elasticity, skin whitening, skin regeneration, or wound recovery.
  • the strain may increase the expression of COL1A1 (collagen type I alpha 1 chain).
  • the strain may increase the expression of COL1A1, which was reduced by ultraviolet rays.
  • the strain may reduce or inhibit the expression of MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1).
  • MMP-1 Microx metalloproteinase-1
  • the strain may reduce or suppress the expression of MMP-1 increased by ultraviolet rays.
  • the strain may reduce or inhibit melanin production.
  • the strain may regenerate skin or repair wounds by moving fibroblasts.
  • Another aspect provides a lysate, culture fluid, or extract of the culture fluid of the strain.
  • lysate may be used interchangeably with “lysate” and may refer to a product obtained by breaking the cell wall of a strain by chemical or physical force.
  • the lysate may include the lysate itself, its concentrate, or its freeze-dried product.
  • culture medium may be used interchangeably with “culture supernatant,” “conditioned culture medium,” or “conditioned medium,” and refers to a medium that can supply nutrients to enable the strain to grow and survive in vitro. It may refer to the entire medium containing the strain, its metabolites, extra nutrients, etc. obtained by culturing the strain for a certain period of time. Additionally, the culture medium may refer to a culture medium obtained by removing the bacterial cells from the bacterial culture medium obtained by culturing the strain.
  • the liquid from which the bacteria have been removed from the culture medium is also called “supernatant", and the supernatant is obtained by leaving the culture solution still for a certain period of time and taking only the upper liquid excluding the part that has settled in the lower layer, or by removing the bacteria through filtration, or by removing the culture liquid. It can be obtained by centrifuging to remove the sediment at the bottom and taking only the liquid at the top.
  • the "bacteria” refers to the strain itself of the present invention, and includes the strain itself isolated and selected from a skin sample, etc., or a strain isolated from the culture medium by culturing the strain.
  • the bacterial cells can be obtained by centrifuging the culture medium and taking the part that sinks to the lower layer. Alternatively, since they sink to the lower layer of the culture medium by gravity, they can be obtained by leaving them still for a certain period of time and then removing the upper liquid.
  • Culture media and culture conditions for cultivating the above strain can be appropriately selected or modified by those skilled in the art.
  • the culture medium is cultured by culturing the strain in an appropriate medium (e.g., R2A medium, TSA medium, or TSB medium) at an appropriate temperature (e.g., either above 10°C or below 40°C) for a certain period of time (e.g., 4 to 120 hours). ) may have been obtained by culturing for a period of time.
  • an appropriate medium e.g., R2A medium, TSA medium, or TSB medium
  • an appropriate temperature e.g., either above 10°C or below 40°C
  • a certain period of time e.g., 4 to 120 hours.
  • the culture medium may include the culture medium itself, its concentrate, or freeze-dried product obtained by culturing the strain.
  • the culture medium may include a culture supernatant obtained by removing the strain from the culture medium, a concentrate thereof, or a freeze-dried product.
  • the culture supernatant of the strain may be obtained by removing the strain by centrifuging or filtering the strain culture fluid.
  • the concentrate may be obtained by concentrating the strain culture itself or the supernatant obtained after centrifuging or filtering the culture.
  • culture extract refers to an extract from the culture medium or its concentrate, and may include extracts, diluted or concentrated extracts, dried products obtained by drying the extracts, crude or purified products thereof, and fractions thereof. You can.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium may be biologically pure.
  • the strain may be obtained by pure culture.
  • Micrococcus flavus Another aspect provides the use of Micrococcus flavus , its lysate, culture, or extract of the culture.
  • a composition comprising a Micrococcus flavanus strain, its lysate, a culture medium, an extract of the culture medium, or a mixture thereof is provided.
  • the strain may be the Micrococcus flavus strain according to the above aspect. Therefore, the strain may be a Micrococcus flavanus MC-4 strain.
  • Uses of the strain may include improving skin condition, improving skin beauty, or preventing, improving or treating skin diseases.
  • the improvement of skin condition or skin beauty may be preventing skin aging (anti-aging), improving skin wrinkles (anti-wrinkle), improving skin elasticity, moisturizing skin, strengthening skin barrier, whitening skin, improving or healing wounds, or regenerating skin. .
  • skin aging refers to both tangible and intangible changes that occur in the skin as one ages. Skin aging includes, for example, a thinning of the epidermis, a decrease in the number of cells or blood vessels in the dermis, a decrease in the ability to repair DNA damage, an increase in the cell turnover cycle, a decrease in the ability to heal wounds, a weakening of the skin barrier function, a decrease in the moisture retention ability of the epidermis, These include reduced sweat secretion, reduced sebum secretion, reduced vitamin D production, reduced ability to defend against physical damage, reduced ability to eliminate chemicals, reduced immune response, weakened sensory function, and reduced body temperature regulation.
  • the prevention of skin aging may mean improving skin aging caused by extrinsic or endogenous factors.
  • the exogenous factors refer to various external factors, such as ultraviolet rays (light).
  • the endogenous factors are also referred to as chronological factors and mainly refer to factors that occur due to the passage of time.
  • the skin aging is specifically not only a symptom of premature aging induced by external stimuli such as ultraviolet rays, pollution, cigarette smoke, chemicals, etc., but also a natural aging phenomenon that occurs as the proliferation of skin cells decreases with age. It is a concept that includes wrinkles, loss of elasticity, skin sagging and dryness, etc.
  • wrinkles include stimulation caused by changes in internal and external factors that change the components that make up skin tissue, causing wrinkles.
  • the aging may be photoaging.
  • photoaging is a phenomenon caused by external environmental factors, the most representative factor being ultraviolet rays. Ultraviolet rays cause damage to biological components such as activation of proteolytic enzymes, chain cutting of matrix proteins, and abnormal cross-linking, and repetition of this mechanism causes skin aging that is evident in appearance.
  • wrinkle refers to a state in which the skin loses its elasticity and becomes loose, for example, the skin may be folded.
  • prevention or improvement of skin wrinkles may refer to any action that prevents or improves wrinkles by suppressing the expression of factors related to wrinkles, or increases the total amount of collagen.
  • promoting skin elasticity may refer to any action that improves the elasticity of loose skin.
  • skin moisturizing may refer to any action that maintains skin moisture or prevents moisture loss.
  • skin barrier strengthening may refer to any action that improves the function of the skin barrier, which is located on the outermost layer of the skin and prevents moisture and nutrition loss.
  • anti-inflammatory may be used interchangeably with “improvement of inflammation” and “inhibition of inflammation,” and may include, for example, all actions that inhibit the expression of inflammatory cytokines.
  • the “skin disease” may be a disease caused by damage to the skin barrier function, skin aging, skin wound, skin scar, or skin inflammatory disease.
  • the damage to the skin barrier function may mean any change that appears in the skin due to decreased or damaged skin barrier function. For example, it may include increased skin wrinkles, dryness, dermatitis, atopic dermatitis, allergic dermatitis, acne, etc.
  • the skin inflammatory disease may be any one selected from the group consisting of skin wounds, dermatitis, atopic dermatitis, pruritus, eczematous skin disease, dry eczema, erythema, urticaria, psoriasis, drug rash, and acne.
  • prevention includes suppressing the occurrence of a disease.
  • treatment includes inhibiting, alleviating, or eliminating the development of a disease.
  • improvement may refer to any action that results in at least reducing the severity of a parameter associated with the alleviation or treatment of a condition, such as symptoms.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium can reduce or inhibit the expression of MMP-1.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium can reduce or inhibit the expression of MMP-1 increased by ultraviolet rays. Accordingly, the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium may exhibit the effect of preventing skin aging, improving skin wrinkles, or improving skin elasticity.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium can increase the expression of COL1A1.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium can increase the expression of COL1A1, which is reduced by ultraviolet rays. Accordingly, the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium may exhibit the effect of preventing skin aging, improving skin wrinkles, or improving skin elasticity.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium can reduce or inhibit melanin production. Therefore, the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium can exhibit a skin whitening effect.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium may have the ability to migrate fibroblasts. Therefore, the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium may exhibit skin regeneration or wound recovery effects.
  • the strain can be used with other strains that have a skin-improving effect, such as strains belonging to the Micrococcus genus, to produce a synergistic effect.
  • Strains belonging to the Micrococcus genus include, for example, Micrococcus Antarcticacus , Micrococcus rirae, Micrococcus luteus , and Micrococcus terreus .
  • the composition may include the strain, its lysate, culture medium, extract of the culture medium, or a mixture thereof as an active ingredient.
  • the term "included as an active ingredient” means that the strain of the present specification, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium is added to the extent that it can exhibit the effects mentioned herein, and various ingredients are added for drug delivery and stabilization, etc. This means that it is formulated into various forms by adding as a secondary ingredient.
  • the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium is 0.0001% by weight to 99.9999% by weight, for example, 0.001% by weight to 80% by weight, 0.01% by weight to 60% by weight, 0.01% by weight, based on the total weight of the composition. to 40% by weight, 0.01% to 30% by weight, 0.01% to 20% by weight, 0.01% to 10% by weight, 0.01% to 5% by weight, 0.05% to 60% by weight, 0.05% to 40% by weight.
  • the content of the active ingredient can be selected by a person skilled in the art at an appropriate amount that can be formulated within a content range that can produce the effects mentioned in this specification.
  • the composition may be in a liquid state or a dry state. In one embodiment, the composition may be in dry powder form.
  • the drying method for preparing the composition in a dry state may be a method generally used in the art and is not particularly limited.
  • Non-limiting examples of the drying method include air drying method, natural drying method, spray drying method, freeze drying method, etc. These methods can be used alone or at least two methods can be used together.
  • the composition may contain an effective amount of additives sufficient to reduce deterioration of the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium.
  • the additive may be, for example, a binder, but is not limited thereto.
  • the composition may further include a cosmetically, pharmaceutically, or foodologically acceptable carrier.
  • the composition can be formulated with a carrier and provided as cosmetics, drugs, food additives, etc.
  • the composition may be a cosmetic composition.
  • the cosmetic composition may further include ingredients commonly used in cosmetic compositions, functional additives, etc., such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, surfactants, dispersants, emulsifiers, and preservatives. , conventional auxiliaries such as vitamins, pigments, fragrances, etc., and carriers.
  • the cosmetic composition is not particularly limited to a specific formulation, and the formulation may be appropriately selected depending on the purpose.
  • the cosmetic composition may have, for example, a solubilized formulation, an emulsified formulation, or a dispersed formulation.
  • the cosmetic composition includes, for example, lotion, cream, essence, cleansing foam, cleansing water, pack, ampoule, body lotion, body oil, body gel, shampoo, rinse, hair conditioner, hair gel, foundation, lipstick, mascara, and makeup. It may have a base or skin-adhesive cosmetic formulation.
  • the skin-adhesive cosmetic formulation may be, for example, a mask pack, but is not limited thereto.
  • composition may be a composition for external skin application.
  • the external skin preparation may be a cream, gel, ointment, skin emulsifier, skin suspension, transdermal delivery patch, drug-containing bandage, lotion, or a combination thereof.
  • the skin external preparations include ingredients commonly used in external skin preparations such as cosmetics and medicines, such as aqueous ingredients, oil-based ingredients, powder ingredients, alcohols, moisturizers, thickeners, ultraviolet absorbers, whitening agents, preservatives, antioxidants, surfactants, and fragrances. , colorants, various skin nutrients, metal ion sequestrants, sugars, or combinations thereof may be appropriately mixed as needed.
  • the composition may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may additionally include a pharmaceutically acceptable diluent or carrier.
  • the diluent may be lactose, corn starch, soybean oil, microcrystalline cellulose, mannitol, or a combination thereof.
  • the carrier may be an excipient, disintegrant, binder, lubricant, or a combination thereof.
  • the excipient may be microcrystalline cellulose, lactose, low-substituted hydroxycellulose, or a combination thereof.
  • the disintegrant may be calcium carboxymethyl cellulose, sodium starch glycolate, calcium monohydrogen phosphate, or a combination thereof.
  • the binder may be polyvinylpyrrolidone, low-substituted hydroxypropylcellulose, hydroxypropylcellulose, or a combination thereof.
  • the lubricant may be magnesium stearate, silicon dioxide, talc, or a combination thereof.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as an oral or parenteral dosage form.
  • Oral dosage forms may be granules, powders, solutions, tablets, capsules, dry syrup, etc.
  • Parenteral dosage forms may be injections, ointments, etc.
  • the composition may be a food composition.
  • the composition may be a health functional food composition. In this case, it can be formulated in the form of a typical health functional food known in the art.
  • the food composition may use the strain, its lysate, culture medium, or extract of the culture medium alone, or may be used together with other foods or food ingredients, and may be used appropriately according to conventional methods.
  • the mixing amount of the active ingredient can be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health, or therapeutic treatment).
  • beverage compositions may contain various flavoring agents or natural carbohydrates as additional ingredients like ordinary beverages.
  • the natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose and fructose, disaccharides such as maltose and sucrose; and polysaccharides such as dextrins and cyclodextrins; Sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • a sweetener natural sweeteners such as thaumatin and stevia extract or synthetic sweeteners such as saccharin and aspartame can be used.
  • the food composition is also used in nutritional supplements, vitamins, electrolytes, flavors, colorants, pectic acid and its salts, alginic acid and its salts, organic acids, protective colloidal thickeners, pH adjusters, stabilizers, preservatives, glycerin, alcohol, carbonated beverages. It may contain a carbonating agent, or a combination thereof.
  • the food composition may also contain pulp for the production of natural fruit juice, fruit juice beverage, vegetable beverage, or a combination thereof.
  • Another aspect provides a method of preventing, ameliorating, or treating a condition in a subject comprising administering an effective amount of the composition described above to the subject in need thereof.
  • the condition of the subject may be a condition related to the skin, and specifically, it may be a disease caused by damage to the skin barrier function, skin aging, or a skin wound.
  • administering is used interchangeably, and are used interchangeably, and are used interchangeably, to introduce an agent into an individual by a method or route that results in at least partial localization of the composition according to one embodiment to the desired site. It may refer to the arrangement of the composition according to the specific example.
  • Administration may be by methods known in the art.
  • the administration method such as administration route and administration frequency, can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • Administration may be administered directly to the subject by any means, such as, for example, intravenous, intramuscular, oral, transdermal, mucosal, intranasal, intratracheal or subcutaneous administration. You can.
  • the administration may be administered systemically or locally.
  • the administration may include application to the skin.
  • the subject may be a mammal, such as a human, cow, horse, pig, dog, sheep, goat, or cat.
  • the object may be an object in need of skin condition improvement, for example, an object in need of skin aging prevention, skin wrinkle improvement, skin elasticity enhancement, skin moisturization, skin barrier strengthening, skin whitening, skin regeneration, and wound recovery effect. there is.
  • the administration of the composition according to one embodiment is 0.1 mg to 1,000 mg per day, for example, 0.1 mg to 500 mg, 0.1 mg to 100 mg, 0.1 mg to 50 mg, 0.1 mg to 25 mg, 1 mg to 1 mg. 1,000 mg, 1 mg to 500 mg, 1 mg to 100 mg, 1 mg to 50 mg, 1 mg to 25 mg, 5 mg to 1,000 mg, 5 mg to 500 mg, 5 mg to 100 mg, 5 mg to 50 mg, 5 mg to 25 mg, 10 mg to 1,000 mg, 10 mg to 500 mg, 10 mg to 100 mg, 10 mg to 50 mg, or 10 mg to 25 mg may be administered.
  • the dosage may be prescribed in various ways depending on factors such as formulation method, administration method, patient's age, weight, gender, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity, and those skilled in the art will Taking these factors into consideration, the dosage can be adjusted appropriately.
  • the frequency of administration can be once a day or two or more times within the range of clinically acceptable side effects.
  • the administration site it can be administered at one or two or more locations, and the total number of administration days can be from 1 to 30 days for one treatment, either daily or at intervals of 2 to 5 days. If necessary, the same treatment can be repeated after an appropriate period.
  • the dosage per kg is the same as for humans, or the above dosage is converted into, for example, the volume ratio (e.g., average value) of the organs (heart, etc.) between the target animal and human.
  • One dose can be administered.
  • Another aspect provides the use of the strain, its lysate, culture, or extract of the culture for use in preparing a composition for improving skin condition.
  • Another aspect provides the use of the strain, its lysate, culture, or extract of the culture for use in preparing a medicament for skin regeneration or wound repair.
  • Redundant content is omitted in consideration of the complexity of the present specification, and terms not otherwise defined in the present specification have meanings commonly used in the technical field to which the present invention pertains.
  • the new Micrococcus flavius strain has the effect of improving skin conditions such as preventing skin aging, improving skin wrinkles, improving skin elasticity, skin whitening, skin regeneration, and wound recovery, so it is useful in cosmetics, medicine, food, etc. can be used
  • Figure 1 shows the results showing the effect of a strain on the expression of COL1A1 according to one embodiment.
  • Figure 2 is a result showing the effect of a strain on the expression of MMP-1 according to one embodiment.
  • Figure 3 is a result showing the effect of a strain according to one embodiment on the production of melanin.
  • Figure 4 is a result showing the effect of the strain according to one embodiment on skin regeneration and wound recovery.
  • Micrococcus flavus strains were isolated and identified from the skin of healthy women.
  • the skin of a healthy woman was washed with sterile distilled water and human epidermal keratinocytes were obtained as a sample.
  • the obtained samples were inoculated into R2A (Reasoner's 2A) medium (Becton Dickinson, Cockeysville, MD). After inoculation, the colonies were cultured in an incubator at 28°C for 48 hours, and then 100 colonies formed were isolated and cultured in pure form, and re-cultured in an incubator at 28°C for 48 hours.
  • the 16S rRNA gene sequence of the colonies after completion of culture was identified.
  • the primers used at this time were designed to react and amplify only bacteria, and the primer sequences are as follows.
  • MC-4 microorganism Micrococcus flavus strain
  • the selected MC-4 strain was deposited at the Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) on May 28, 2021, and was given the deposit number KCCM12997P.
  • Strain MC-4 has the 16S rRNA sequence of SEQ ID NO: 1 (complementary DNA).
  • a culture medium of Micrococcus flavus MC-4 strain was prepared.
  • Example 1 the MC-4 strain isolated in Example 1 was cultured in R2A medium. The bacteria were removed through centrifugation, and the MC-4 strain culture medium was prepared through supernatant recovery and filtration.
  • strains according to one embodiment were analyzed.
  • MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) breaks down collagen in the skin. Therefore, reducing or suppressing the expression of MMP-1 inhibits the breakdown of collagen in the skin, thereby improving skin elasticity and improving skin wrinkles, thereby preventing or improving skin aging (eg, photoaging).
  • COL1A1 (Collagen type I alpha 1 chain) is a factor related to improving skin wrinkles and improving skin elasticity, so increased expression of COL1A1 can have an anti-aging effect on the skin.
  • the human fibroblast cell line Human dermal fibroblast, Hs68
  • Hs68 human dermal fibroblast, Hs68
  • DPBS Dulbecco's phosphate-buffered saline
  • UVB 12 mJ/cm 2 was irradiated or not.
  • FBS fetal bovin serum
  • RA Retinoic acid
  • cDNA was synthesized (C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, USA). Using the synthesized cDNA as a template, Cybergreen (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA) and primers (primers for COL1A1, or primers for MMP-1) were added to the real-time PCR machine (Step One Plus, Applied Biosystems). , USA), real-time polymerase chain reaction was performed. The expression level of the gene was finally analyzed through correction for the ⁇ -actin gene.
  • Figure 1 is a graph showing the effect of a strain on the expression of COL1A1 according to one embodiment.
  • Figure 2 is a graph showing the effect of a strain on the expression of MMP-1 according to one embodiment.
  • the Micrococcus flavanus MC-4 strain increases the expression of COL1A1 and reduces the expression of MMP-1, thereby improving skin elasticity and skin wrinkles, thereby improving skin aging (e.g. It was confirmed that it has the effect of preventing or improving photoaging.
  • strain according to one embodiment affects skin whitening.
  • B16F10 a pigmented cell line (melanoma)
  • melanoma a pigmented cell line
  • the medium was replaced, and 10 nM of ⁇ -melanocyte stimulating hormone ( ⁇ -MSH) and 1% (w/w) of the culture medium of the MC-4 strain were treated and cultured for an additional 48 hours.
  • ⁇ -MSH ⁇ -melanocyte stimulating hormone
  • R2A medium containing no vehicle or strain culture medium was used.
  • cells were recovered by washing with Phosphate Buffered Saline (PBS) and treatment with Trypsin-EDTA.
  • PBS Phosphate Buffered Saline
  • Figure 3 is a result showing the effect of a strain according to one embodiment on the production of melanin.
  • Example 2 strain culture medium significantly reduced the melanin content compared to the negative control group.
  • Micrococcus flavus MC-4 strain according to one embodiment can be usefully used for skin whitening by inhibiting melanin production.
  • strain according to one embodiment affects skin regeneration and wound recovery.
  • the human fibroblast cell line Human dermal fibroblast, Hs68
  • Hs68 Human dermal fibroblast, Hs68
  • the center of the cultured cells was scratched using a cell scraper to create a wound, and then treated with 1% (w/w) of the culture medium of the MC-4 strain and further cultured for 24 hours.
  • R2A medium containing no culture media treatment group and strain culture media was used. During the culture period, once every 2 hours, the extent to which wounds randomly applied to cells had recovered was photographed and the cell density of the wound area was measured.
  • Figure 4 is a result showing the effect of the strain according to one embodiment on skin regeneration and wound recovery.
  • Example 2 strain culture medium
  • Example 2 strain culture medium
  • Micrococcus flavus MC-4 strain promotes skin regeneration and can be usefully used to prevent or treat wounds.
  • Micrococcus flavanus MC-4 strain reduced the expression of MMP-1, which was increased by ultraviolet irradiation; Increases the expression of COL1A1, which was decreased by ultraviolet irradiation; Reduce melanin production; It was confirmed that it promoted fibroblast migration. Therefore, it was found that the MC-4 strain has the effects of preventing skin aging (e.g., photoaging) (anti-aging), improving skin wrinkles (anti-wrinkle), improving skin elasticity, skin whitening, skin regeneration, and wound recovery.
  • skin aging e.g., photoaging
  • anti-aging improving skin wrinkles
  • skin elasticity e.g., skin whitening, skin regeneration, and wound recovery.

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Abstract

신규한 마이크로코커스 플라버스 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다. 상기 균주는 피부 상태 개선 효과를 가지므로, 화장품, 의약품, 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

마이크로코커스 플라버스 균주 및 그의 피부 상태 개선 용도
신규한 미생물, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 및 이들의 피부 상태 개선 용도에 관한 것이다.
피부의 생태계는 미생물에게 다양한 형태의 서식처를 제공하며, 광범위한 미생물들이 살고 있다. 이들은 숙주인 인간과 공생관계를 이루고 있으며, 숙주에 많은 긍정적인 영향을 미친다고 알려져 있다. 피부는 함입부, 특화되어있는 틈새 등 다양한 형태의 서식처를 구성하고 있으며, 넓은 분포의 미생물이 자랄 수 있도록 돕는다. 기본적으로 피부는 물리적인 막을 형성하며, 외부로부터 잠재적인 위험요소 및 독성물질들로부터 방어를 하도록 도와준다. 피부는 외부환경과의 접속 지점이 되며, 다양한 미생물들(예: 진균, 세균, 바이러스 및 작은 유충)의 집합소이기도 하다. 물리적, 화학적 기능의 선택에 맞게 미생물들은 특화된 틈새에 적응하여 서식처를 마련한다. 일반적으로 피부는 차갑고, 산성 성질을 나타내며, 건조된 상태로 유지된다. 구조적으로 표피(epidermis)는 피부 장벽을 이루고 있으며, 미생물과 독소가 침투하는 것을 차단하고, 수분을 유지하는 중요한 역할을 한다. 표피의 최상위층은 각질층(stratum corneum)으로 구성되어있다. 표피는 일명 '벽돌과 몰탈 구조'라고 불리는 형태를 띠고 있는데, 피부 조직은 계속적인 자가 회복 과정을 거치고, 분화 과정의 마지막을 거친 비늘(squames)은 끊임없이 피부조직에서 탈락되는 과정을 반복하게 된다.
프로바이오틱스(Probiotics)는 인체에 유익한 작용을 하는 미생물을 총칭하는 말로 우리 몸에 유익(benefit)을 주는 미생물을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 유산균으로 알려져 있다. 프로바이오틱스는 인체에 여러 가지 유익 작용을 통해 효과적인 효능이 발생되는 것으로 보고되었지만, 피부상재균과 피부의 상호관계에 대한 연구는 미비한 실정이다.
이에, 피부 관련된 상태에 유용하게 사용될 수 있는 피부상재균의 개발이 필요한 실정이다.
일 양상은 신규한 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 유효량의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주를 제공한다.
상기 균주는 분리된 것일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "분리된(isolated)"이란 자연계에 존재하는 것이 아닌 인위적으로 분리하여 이용가능한 것을 의미한다. 상기 균주는 인간 피부로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 균주는 인간 피부 세포를 TSB(Tryptic Soy Broth) 또는 R2A(Reasoner's 2A) 배지에 접종하여 배양된 콜로니를 순수 분리 배양하는 방법에 의해 분리된 균주일 수 있다.
상기 균주는 마이크로코커스 속(Micrococcus sp.)에 속하는 균주일 수 있다.
상기 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주는 기탁번호 KCCM12997P로 기탁된 균주일 수 있다. 상기 균주는 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) MC-4 균주일 수 있다.
상기 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다. 일 구체예에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1과 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98% 이상, 약 99% 이상, 약 99.5% 이상, 약 99.9% 이상, 95% 내지 100%, 96% 내지 100%, 97% 내지 100%, 98% 내지 100%, 99% 내지 100%, 99.5% 내지 100%, 또는 99.9% 내지 100%의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은 특정 비교 영역에서 양 서열을 최대한 일치되도록 얼라인시킨 후 서열간의 아미노산 잔기 또는 염기의 동일한 정도를 의미한다. 서열 동일성은 당업계에 공지된 방법에 따라 확인될 수 있다. 상기 서열 동일성의 퍼센트는 공지의 서열 비교 프로그램을 사용하여 결정될 수 있으며, 일례로 BLASTN(NCBI), CLC Main Workbench (CLC bio), MegAlignTM(DNASTAR Inc) 등을 들 수 있다.
일 실시예에서는 피부로부터 분리된 마이크로코커스 플라버스 균주가 COL1A1의 발현을 증가시키고, MMP-1의 발현을 감소시키며, 멜라닌 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 또한, 상기 균주가 세포 재생을 촉진하는 것을 확인하였다.
따라서, 일 구체예에 따른 균주는 피부 상태 개선 효과, 예를 들면, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 또는 피부 미백 효과를 갖는 것일 수 있다. 또한, 상기 균주는 피부 재생 또는 피부 상처의 예방, 개선 또는 치료 효과를 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주는 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 미백, 피부 재생, 또는 상처 회복 효과를 갖는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주는 COL1A1(collagen type I alpha 1 chain)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 균주는 자외선에 의해 감소된 COL1A1의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주는 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 발현을 감소 또는 억제시키는 것일 수 있다. 상기 균주는 자외선에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 감소 또는 억제시키는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주는 멜라닌 생성을 감소 또는 억제시키는 것일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주는 섬유아세포를 이동시킴으로써 피부를 재생시키거나 상처를 회복시키는 것일 수 있다.
다른 양상은 상기 균주의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물을 제공한다.
상기 균주의 상세는 전술한 바와 같다.
본 명세서에서 용어 "파쇄액"은 "용해물"과 상호교환적으로 사용될 수 있으며, 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 균주의 세포벽을 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다. 상기 파쇄액은 파쇄액 자체, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액"은 "배양 상층액", "조건 배양액" 또는 "조정 배지"와 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기 균주가 시험관 내에서 성장 및 생존할 수 있도록 영양분을 공급할 수 있는 배지에 상기 균주를 일정기간 배양하여 얻는 상기 균주, 이의 대사물, 여분의 영양분 등을 포함하는 전체 배지를 의미할 수 있다. 또한, 상기 배양액은 균주를 배양하여 얻은 균체 배양액에서 균체를 제거한 배양액을 의미할 수 있다.　한편, 상기　배양액　중 균체를 제거한 액체를 "상층액"이라고도 하며,　상기 상층액은 배양액을 일정시간 가만히 두어 하층에 가라앉은 부분을 제외한 상층의 액체만을 취하거나, 여과를 통해 균체를 제거하거나,　배양액을 원심분리하여 하부의 침전을 제거하고 상부의 액체만을 취하여 획득할 수 있다. 상기 "균체"는 본 발명의　균주　자체를 의미하는 것으로 피부 샘플 등으로부터 분리하여 선별한　균주　자체 또는 상기　균주를 배양하여　배양액으로부터 분리한　균주를 포함한다. 상기 균체는　배양액을 원심분리하여 하층에 가라앉은 부분을 취하여 획득할 수 있고, 또는 중력에 의해　배양액의 하층으로 가라앉으므로 일정 시간 동안 가만히 두었다가 상부의 액체를 제거함으로써 획득할 수 있다.
상기 균주를 배양하기 위한 배양용 배지 및 배양 조건은 통상의 지식을 가진 자가 적절하게 선택하거나 변형하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 상기 배양액은 균주를 적절한 배지(예: R2A 배지, TSA 배지 또는 TSB 배지)에서 적절한 온도(예: 10℃ 초과 또는 40℃ 미만 중 어느 온도)에서 일정 시간(예: 4 내지 120시간) 동안 배양하여 수득된 것일 수 있다.
상기 배양액은 균주를 배양하여 수득된 배양액 자체, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다. 상기 배양액은 배양액로부터 균주를 제거하여 수득된 배양 상층액, 그의 농축물 또는 동결건조물을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 균주의 배양 상층액은 균주 배양액을 원심분리 또는 여과시켜 균주를 제거하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
다른 구체예에서, 농축물은 상기 균주 배양액 자체, 또는 상기 배양액을 원심분리 또는 여과한 후 수득된 상층액을 농축하는 단계에 의해 수득될 수 있다.
본 명세서에서 용어 "배양액 추출물"은 상기 배양액 또는 그의 농축액로부터 추출한 것을 의미하며, 추출액, 추출액의 희석액 또는 농축액, 추출액을 건조하여 얻어지는 건조물, 또는 이들 조정제물 또는 정제물, 이를 분획한 분획물을 포함할 수 있다.
상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 생물학적으로 순수한 것일 수 있다. 상기 균주는 순수배양(pure culture)에 의해 얻은 것일 수 있다.
또 다른 양상은 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus), 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다. 상세하게는, 마이크로코커스 플라버스 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 용도 또는 조성물에 있어서, 상기 균주는 상기 일 양상에 따른 마이크로코커스 플라버스 균주일 수 있다. 따라서, 상기 균주는 마이크로코커스 플라버스 MC-4 균주일 수 있다.
상기 균주의 용도는 피부 상태 개선, 피부 미용 개선, 또는 피부 질환의 예방, 개선 또는 치료를 포함할 수 있다.
상기 피부 상태 개선 또는 피부 미용 개선은 피부 노화 방지(항노화), 피부 주름 개선(항주름), 피부 탄력 증진, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 미백, 상처 개선 또는 치유, 또는 피부 재생일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "피부 노화"란 나이가 들어가면서 피부에 나타나게 되는 유형과 무형상의 변화를 통틀어 말한다. 피부 노화는 예컨대 표피 두께가 얇아지는 현상, 진피의 세포 수나 혈관 수의 감소, DNA 손상 복구 능력의 감소, 세포교체주기의 증가, 상처 회복 능력 감소, 피부 장벽기능 약화, 표피의 수분 유지 능력 감소, 땀분비 감소, 피지분비 감소, 비타민D 생산 감소, 물리적 손상 방어 능력 감소, 화학물질 제거능력 감소, 면역반응 감소, 감각 기능 약화, 체온조절의 감소 등을 포함한다.
상기 피부 노화 방지는 외인성 요인 또는 내인성 요인에 의해 유발되는 피부 노화를 개선하는 것일 수 있다. 상기 외인성 요인은 여러 가지 외부 요인, 예컨대 자외선(광)을 말한다. 상기 내인성 요인은 연대기적 요인이라고도 지칭되며 주로 시간의 흐름에 의해 발생하는 요인을 말한다. 즉, 상기 피부 노화는 구체적으로는 자외선, 공해, 담배연기, 화학물질 등에 의한 외부 자극에 의해 유도되는 조기 노화 증상뿐만 아니라, 나이가 들어감에 의해 피부세포의 증식이 감소함에 따라 발생하는 자연노화 현상을 포함하며, 주름 및 탄력 감소, 피부 처짐 및 건조 현상 등을 모두 포함하는 개념이다. 또한 주름은 내ㆍ외부 요인의 변화에 의한 자극이 피부조직을 구성하고 있는 성분을 변화시켜 주름을 유발하는 것을 포함한다.
상기 노화는 광노화일 수 있다. 용어 "광노화(Photoaging)"는 외부 환경적인 요인에 의해 유발되는 현상으로, 가장 대표적인 인자로는 자외선이 있다. 자외선은 단백질 분해효소의 활성화와 기질단백질의 사슬절단 및 비정상적인 교차결합 등의 생체 구성 성분들의 손상을 가져오고, 이러한 메커니즘의 반복은 외관상으로도 확연한 피부노화를 초래하게 된다.
용어 "주름"은 피부의 탄력성이 상실되어 느슨해진 상태를 의미하며, 예를 들면 피부가 접히는 것일 수 있다. "피부 주름 예방 또는 개선"이란 주름과 관련된 인자의 발현을 억제하여 주름을 방지 또는 개선하거나, 콜라겐 총량을 증가시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 탄력 증진"은 느슨해진 피부의 탄력성을 증진시키는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 보습"은 피부 수분을 유지하거나 수분 손실을 방지하는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "피부 장벽 강화"는 피부 가장 바깥쪽에 위치하여 수분과 영양 손실을 막아주는 피부 장벽의 기능이 증진되는 모든 작용을 의미할 수 있다.
상기 "항염증"이란 "염증 개선", "염증 억제"과 혼용될 수 있으며, 예를 들어 염증성 사이토카인의 발현이 억제되는 모든 작용을 포함할 수 있다.
상기 "피부 질환"은 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처, 피부 흉터, 또는 피부 염증 질환일 수 있다.
상기 피부 장벽 기능 손상은 피부 장벽의 기능이 저하되거나 손상되어 피부에 나타나는 모든 변화를 의미할 수 있다. 예를 들어, 피부 주름 증가, 건조, 피부염, 아토피 피부염, 알레르기성 피부염, 여드름 등을 포함할 수 있다.
상기 피부 염증 질환은 피부 상처, 피부염, 아토피 피부염, 소양증, 습진성 피부질환, 건성 습진, 홍반, 두드러기, 건선, 약발진, 및 여드름으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있다.
용어, "예방"은 질병의 발생을 억제하는 것을 포함한다. 용어, "치료"는 질병의 발전의 억제, 경감, 또는 제거를 포함한다. 용어 "개선"은 상태의 완화 또는 치료와 관련된 파라미터, 예를 들면 증상의 정도를 적어도 감소시키는 모든 행위를 의미할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 MMP-1의 발현을 감소 또는 억제시킬 수 있다. 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 자외선에 의해 증가된 MMP-1의 발현을 감소 또는 억제시킬 수 있다. 따라서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진 효과를 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 COL1A1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일 구체예에서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 자외선에 의해 감소된 COL1A1의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선 또는 피부 탄력 증진 효과를 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 멜라닌 생성을 감소 또는 억제시킬 수 있다. 따라서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 피부 미백 효과를 나타낼 수 있다.
일 구체예에서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 섬유아세포 이동능을 가질 수 있다. 따라서, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 피부 재생 또는 상처 회복 효과를 나타낼 수 있다.
상기 균주는 피부 개선 효과를 갖는 다른 균주, 예컨대 마이크로코커스 속에 속하는 균주와 함께 사용되어 시너지 효과를 나타낼 수 있다. 상기 마이크로코커스 속에 속하는 균주는 예를 들어, 마이크로코커스 안타르크티쿠스(Micrococcus Antarcticacus), 마이크로코커스 리래(Micrococcus rirae), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 마이크로코커스 테리우스(Micrococcus terreus) 등이 있다.
상기 조성물은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물, 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 "유효성분으로 포함"은 본 명세서에서 언급한 효과를 나타낼 수 있는 정도로 본 명세서의 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물이 첨가되는 것을 의미하고, 약물전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화(formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.
상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 중량% 내지 99.9999 중량%, 예를 들면, 0.001 중량% 내지 80 중량%, 0.01 중량% 내지 60 중량%, 0.01 중량% 내지 40 중량%, 0.01 중량% 내지 30 중량%, 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 60 중량%, 0.05 중량% 내지 40 중량%, 0.05 중량% 내지 30 중량%, 0.05 중량% 내지 20 중량%, 0.05 중량% 내지 10 중량%, 0.05 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 60 중량%, 0.1 중량% 내지 40 중량%, 0.1 중량% 내지 30 중량%, 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 5 중량%로 포함될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 유효성분의 함량은 통상의 기술자가 본 명세서에서 언급한 효과를 나타낼 수 있을 정도의 함량 범위 내에서, 제형화 가능한 적절한 함량을 선택할 수 있다.
상기 조성물은 액체 상태 또는 건조 상태인 것일 수 있다. 일 구체예에서, 상기 조성물은 건조 분말 형태일 수 있다.
상기 조성물을 건조 상태로 제조하는 건조 방법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 특별히 제한되지 않는다. 상기 건조 방법의 비제한적인 예는, 공기 건조 방법, 자연 건조 방법, 분무 건조 방법, 동결 건조 방법 등이 있다. 이들 방법은 단독으로 사용하거나 적어도 두 가지 방법을 함께 사용할 수 있다.
상기 조성물은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물의 열화(deterioration)를 감소시키기에 충분한 유효량의 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 예를 들어 결합제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 화장품학적으로, 약학적으로 또는 식품학적으로 허용가능한 담체를 더 포함할 수 있다. 상기 조성물은 담체와 함께 제형화되어 화장품, 약품, 식품 첨가제 등으로 제공될 수 있다.
상기 조성물은 화장료 조성물일 수 있다.
상기 화장료 조성물은 본 명세서에 개시된 유효성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들, 기능성 첨가물 등을 추가로 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 계면활성제, 분산제, 유화제, 방부제, 비타민, 안료, 향료 등과 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물은 특정 제형에 특별히 한정되지 않으며, 목적하는 바에 따라 제형을 적절히 선택할 수 있다. 상기 화장료 조성물은, 예를 들어, 가용화 제형, 유화 제형, 또는 분산 제형을 갖는 것일 수 있다. 상기 화장료 조성물은 예를 들면, 화장수, 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 앰플, 바디 로션, 바디 오일, 바디 젤, 샴푸, 린스, 헤어 컨디셔너, 헤어 젤, 파운데이션, 립스틱, 마스카라, 메이크업 베이스, 또는 피부 점착 타입의 화장료 제형을 갖는 것일 수 있다. 상기 피부 점착 타입의 화장료 제형은 예를 들어, 마스크팩일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 조성물은 피부외용제용 조성물일 수 있다.
상기 피부외용제는 크림, 겔, 연고, 피부 유화제, 피부 현탁액, 경피전달성 패치, 약물 함유 붕대, 로션, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 피부외용제는 통상 화장품이나 의약품 등의 피부외용제에 사용되는 성분, 예를 들면 수성성분, 유성성분, 분말성분, 알코올류, 보습제, 증점제, 자외선흡수제, 미백제, 방부제, 산화방지제, 계면활성제, 향료, 색제, 각종 피부 영양제, 금속이온봉쇄제, 당류, 또는 이들의 조합과 필요에 따라서 적절하게 배합될 수 있다.
상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 희석제는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 만니톨, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 담체는 부형제, 붕해제, 결합제, 활택제, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 부형제는 미결정 셀룰로오즈, 유당, 저치환도 히드록시셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 붕해제는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산 나트륨, 무수인산일수소 칼슘, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 결합제는 폴리비닐피롤리돈, 저치환도 히드록시프로필셀룰로오즈, 히드록시프로필셀룰로오즈, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 활택제는 스테아린산 마그네슘, 이산화규소, 탈크, 또는 그 조합일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형으로 제형화될 수 있다. 경구 투여 제형은 과립제, 산제, 액제, 정제, 캅셀제, 건조시럽제 등일 수 있다. 비경구 투여 제형은 주사제, 연고제 등일 수 있다.
상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 상기 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다. 이 경우, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능식품의 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 식품 조성물은 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액 또는 배양액의 추출물 단독을 사용하거나, 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합 양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 건강기능식품의 종류 중 음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드; 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드; 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제, 또는 그 조합을 함유할 수 있다. 상기 식품 조성물은 또한, 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료, 야채 음료의 제조를 위한 과육, 또는 그 조합을 함유할 수 있다.
다른 양상은 유효량의 상기한 조성물을 그를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 개체의 상태를 예방, 개선, 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 개체의 상태는 피부와 관련된 상태일 수 있고, 구체적으로, 피부 장벽 기능 손상에 의한 질환, 피부 노화, 피부 상처일 수 있다.
용어 "유효량"이란 상기에서 언급한 효과를 나타낼 수 있을 정도로 유효한 양을 의미한다.
용어, "투여하는", "도입하는", 및 "이식하는"은 상호교환적으로 사용되고, 일 구체예에 따른 조성물의 원하는 부위로의 적어도 부분적 국소화를 초래하는 방법 또는 경로에 의한 개체 내로의 일 구체예에 따른 조성물의 배치를 의미할 수 있다.
투여는 당업계에 알려진 방법에 의한 것일 수 있다. 투여 경로, 투여 횟수 등의 투여 방법은 통상의 기술자가 적절히 선택할 수 있다. 투여는 예를 들면, 정맥내, 근육내, 경구, 경피(transdermal), 점막, 코안(intranasal), 기관내(intratracheal) 또는 피하 투여와 같은 경로로, 임의의 수단에 의하여 개체로 직접적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 전신적으로 또는 국부적으로 투여될 수 있다. 상기 투여는 피부에의 도포를 포함할 수 있다.
상기 개체는 포유동물, 예를 들면, 사람, 소, 말, 돼지, 개, 양, 염소, 또는 고양이일 수 있다. 상기 개체는 피부 상태 개선을 필요로 하는 개체, 예를 들어 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 보습, 피부 장벽 강화, 피부 미백, 피부 재생, 상처 회복 효과를 필요로 하는 개체일 수 있다.
상기 투여는 일 구체예에 따른 조성물을 개체당 일당 0.1 mg 내지 1,000 mg, 예를 들면, 0.1 mg 내지 500 mg, 0.1 mg 내지 100 mg, 0.1 mg 내지 50 mg, 0.1 mg 내지 25 mg, 1 mg 내지 1,000 mg, 1 mg 내지 500 mg, 1 mg 내지 100 mg, 1 mg 내지 50 mg, 1 mg 내지 25 mg, 5mg 내지 1,000 mg, 5 mg 내지 500 mg, 5 mg 내지 100 mg, 5 mg 내지 50 mg, 5 mg 내지 25 mg, 10mg 내지 1,000 mg, 10 mg 내지 500 mg, 10 mg 내지 100 mg, 10 mg 내지 50 mg, 또는 10 mg 내지 25 mg을 투여하는 것일 수 있다. 다만, 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있고, 당업자라면 이러한 요인들을 고려하여 투여량을 적절히 조절할 수 있다. 투여 횟수는 1일 1회 또는 임상적으로 용인가능한 부작용의 범위 내에서 2회 이상이 가능하다. 투여 부위에 대해서도 1개소 또는 2개소 이상에 투여할 수 있으며, 매일 또는 2 내지 5일 간격으로 총 투여 일수는 한번 치료 시 1일에서 30일까지 투여될 수 있다. 필요한 경우, 적정 시기 이후에 동일한 치료를 반복할 수 있다. 인간 이외의 동물에 대해서도, kg당 인간과 동일한 투여량으로 하거나, 또는 예를 들면 목적의 동물과 인간과의 기관(심장 등)의 용적비(예를 들면, 평균값) 등으로 상기의 투여량을 환산한 양을 투여할 수 있다.
다른 양상은 피부 상태 개선용 조성물을 제조하는 데 사용하기 위한, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다.
다른 양상은 피부 재생 또는 상처 회복용 약제를 제조하는 데 사용하기 위한, 상기 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 또는 배양액의 추출물의 용도를 제공한다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
일 양상에 따른 신규 마이크로코커스 플라버스 균주에 의하면, 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 미백, 피부 재생, 상처 회복 등의 피부 상태 개선 효과가 있으므로, 화장품, 의약품, 식품 등에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주가 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주가 멜라닌의 생성에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
도 4는 일 구체예에 따른 균주가 피부 재생 및 상처 회복에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 균주의 분리 및 동정
건강한 여성의 피부에서 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주를 분리 및 동정하였다.
구체적으로, 건강한 여성의 피부를 멸균 증류수로 세척하여 인체 표피 각질형성세포(human epidermal keratinocyte)를 샘플로 확보하였다. 확보된 샘플을 R2A(Reasoner's 2A) 배지(Becton Dickinson, Cockeysville, MD)에 접종하였다. 접종 후 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 배양한 뒤, 형성된 집락 100개를 순수 분리 배양하여, 48시간 동안 28℃ 인큐베이터에서 재배양 하였다. 배양이 완료된 집락은 16S rRNA 유전자 서열 동정을 실시하였다. 이때 사용된 프라이머는 박테리아에만 반응하여 증폭하도록 고안되었으며, 프라이머 서열은 다음과 같다. 27F, 정방향 프라이머: 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' (서열번호 2); 1492R, 역방향 프라이머: 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3 (서열번호 3). PCR 증폭은 95℃ 1분, 55℃ 1분, 75℃ 1분30초씩 30 사이클로 실시 하였으며, 마지막으로 72℃에서 8분간 처리한 후 4℃에서 보관하였다. PCR 반응이 끝난 뒤 분리 배양된 종들의 DNA 서열은 ABI-3730XL(ABI, USA)를 이용하여 결정하였다.
미국 국립생물정보센터(NCBI, National Center for Biotechnology Information) 홈페이지에서 제공되는 BLAST 프로그램을 사용하여, 분리 배양된 미생물 집락 중 결정된 16S rRNA 부위의 염기서열을 NCBI에 등록된 다른 균주들과 비교 분석 하였다. 그중 상동성 99% 이하의 신규성 있는 종들만 선별하였으며, 그에 따라 신규 미생물 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주(이하 "MC-4"이라 함)을 선별하였다.
선별된 MC-4 균주를 2021년 5월 28일자로 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM12997P를 부여 받았다. MC-4 균주는 서열번호 1(complementary DNA)의 16S rRNA 서열을 갖는다.
실시예 2. 균주 배양액의 제조
마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) MC-4 균주의 배양액을 제조하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 분리한 MC-4 균주를 R2A 배지에서 배양하였다. 원심분리를 통해 균체를 제거하고 상등액 회수 및 여과를 통해 MC-4 균주 배양액을 제조하였다.
[실험예]
실험예 1. 항노화, 항주름, 피부 탄력 증진 활성 분석
일 구체예에 따른 균주가 자외선(UV) 조사에 의한 피부 노화 및 주름 생성과 관련된 인자에 미치는 영향을 분석하였다.
MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)은 피부의 콜라겐을 분해한다. 따라서, MMP-1의 발현을 감소 또는 억제시키면, 피부의 콜라겐 분해가 억제되므로, 피부 탄력이 증진되고, 피부 주름이 개선되어, 피부 노화(예: 광노화)를 예방 또는 개선할 수 있다.
COL1A1(Collagen type I alpha 1 chain)은 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진과 관련된 인자이므로, COL1A1의 발현이 증가하면 피부 노화 방지 효과를 나타낼 수 있다.
구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주(Human dermal fibroblast, Hs68)를 6 웰 플레이트에 3.5x105로 분주한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 DPBS(Dulbecco's phosphate-buffered saline)를 넣은 후 12 mJ/cm2의 UVB를 조사하거나 조사하지 않았다. UVB 조사 직후 DPBS를 제거하고 FBS(fetal bovin serum)가 없는 배지로 갈아 준 후, 상기 MC-4 균주의 배양액(1%(w/w))을 처리하고 24시간 동안 추가 배양하였다. 음성 대조군으로 자외선 처리 및 균주 배양액을 포함하지 않는 R2A 배지를 사용하였다. 양성 대조군으로 레티논산(Retinoic acid, RA) 1 μM을 사용하였다.
그 후, 각 시료의 세포에서 트리졸(RNA iso, DAKARA, 일본)을 이용하여 RNA를 분리한 뒤 나노드롭(nanodrop)으로 260㎚에서 RNA를 정량한 후, 각각 2㎍의 RNA를 사용하여 증폭기에서 cDNA를 합성하였다(C1000 Thermal Cycler, Bio-Rad, 미국). 합성된 cDNA를 주형으로 사이버그린 (SYBR Green supermix, Applied Biosystems, USA) 및 프라이머(COL1A1용 프라이머, 또는 MMP-1용 프라이머)를 첨가하여 실시간(real-time) PCR 기계 (Step One Plus, Applied Biosystems, 미국)에서 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 유전자의 발현량은 β-actin 유전자에 대한 보정을 통해 최종적으로 분석하였다.
도 1은 일 구체예에 따른 균주가 COL1A1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 2는 일 구체예에 따른 균주가 MMP-1의 발현에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포에 자외선을 처리함으로써 COL1A1 발현이 감소하였고, 실시예 2(균주 배양액) 처리에 의하여 COL1A1의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 섬유아세포에 자외선을 처리함으로써 MMP-1의 발현이 증가하였고, 실시예 2(균주 배양액) 처리에 의하여 MMP-1의 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 마이크로코커스 플라버스 MC-4 균주는 COL1A1의 발현을 증가시키고, MMP-1의 발현을 감소시킴으로써, 피부 탄력을 증진시키고, 피부 주름을 개선하므로, 피부 노화(예를 들면, 광노화)의 예방 또는 개선 효능을 가짐을 확인하였다.
실험예 2. 피부 미백 활성 분석
일 구체예에 따른 균주가 피부 미백에 영향을 미치는지 여부를 분석하였다.
구체적으로, 색소 세포주(melanoma)인 B16F10를 12-웰 플레이트에 접종하여 24시간 배양하였다. 이후 배지를 교체하고, α-멜라닌세포자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone: α-MSH) 10 nM과 상기 MC-4 균주의 배양액 1%(w/w)를 처리하여 48시간 동안 추가로 배양하였다. 음성대조군으로 비히클 및 균주 배양액을 포함하지 않는 R2A 배지를 사용하였다. 이후, 인산완충생리식염수(Phosphate Buffered Saline: PBS)로 세척하고, 트립신(Trypsin)-EDTA를 처리하여 세포를 회수하였다. 회수한 세포를 PBS로 세척한 후, 10% DMSO(Dimethyl sulfoxide)가 함유된 1N NaOH 100 ㎕를 처리하고 80℃에서 1시간 열을 가한 후 이를 식혔다. 이후, ELISA microplate reader를 이용하여 405 ㎚에서 흡광도를 측정하여 멜라닌 생성능을 확인하였다.
도 3은 일 구체예에 따른 균주가 멜라닌의 생성에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 실시예 2(균주 배양액)는 음성대조군과 비교하여 멜라닌 함량을 유의하게 감소시키는 것을 확인할 수 있었다.
따라서, 일 구체예에 따른 마이크로코커스 플라버스 MC-4 균주는 멜라닌 생성을 억제함으로써 피부 미백에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 3. 피부 재생 및 상처 회복 활성 분석
일 구체예에 따른 균주가 피부 재생 및 상처 회복에 영향을 미치는지 여부를 분석하였다.
구체적으로, 인간 섬유아세포 세포주 (Human dermal fibroblast, Hs68)를 6-웰 플레이트에 4×105의 밀도로 접종한 후, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 24시간 동안 배양하여 100% 포화된(confluent) 상태를 만들어 주었다. 이후 세포 스크래퍼(cell scrapper)를 이용하여 배양된 세포 중심을 긁어 상처를 낸 후, 상기 MC-4 균주의 배양액 1%(w/w)을 처리하여 24시간 동안 추가로 배양하였다. 음성대조군으로 배양액 비처리군 및 균주 배양액을 포함하지 않는 R2A 배지를 사용하였다. 배양 기간 동안 2시간에 한번씩, 세포에 임의로 낸 상처가 어느 정도 회복되었는지 촬영하여 상처 부위의 세포 밀도를 측정하였다.
도 4는 일 구체예에 따른 균주가 피부 재생 및 상처 회복에 미치는 영향을 나타낸 결과이다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 실시예 2(균주 배양액)는 시간이 증가함에 따라 손상 부위로 섬유아세포가 이동(migration)함으로써 상처 회복에 효과적인 것을 확인할 수 있었다. 구체적으로, 음성대조군과 비교하여 회복된 부위의 세포 밀도가 증가함에 따라 상처 회복 효과가 더욱 효과적인 것을 확인할 수 있었다.
즉, 일 구체예에 따른 마이크로코커스 플라버스 MC-4 균주는 피부 재생을 촉진하고 상처의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
종합하면, 마이크로코커스 플라버스 MC-4 균주는 자외선 조사에 의하여 증가된 MMP-1의 발현을 감소시키고; 자외선 조사에 의하여 감소된 COL1A1의 발현을 증가시키며; 멜라닌 생성을 감소시키고; 섬유아세포 이동을 촉진시킴을 확인하였다. 따라서, MC-4 균주는 피부 노화(예를 들면, 광노화) 방지(항노화), 피부 주름 개선(항주름), 피부 탄력 증진, 피부 미백, 피부 재생, 상처 회복 효과를 가짐을 알 수 있었다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(KCCM)
수탁번호 : KCCM12997P
수탁일자 : 20210528
Figure PCTKR2023008625-appb-img-000001

Claims (10)

  1. 마이크로코커스 속(Micrococcus sp.)에 속하는 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCCM12997P로 기탁된 것인 균주.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1과 97% 이상의 서열 동일성을 갖는 16S rRNA를 포함하는 것인 균주.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 균주는 MMP-1(Matrix metalloproteinase-1)의 발현을 감소 또는 억제시키거나; COL1A1의 발현을 증가시키거나; 멜라닌 생성을 감소 또는 억제시키거나; 섬유아세포의 이동을 촉진시키는 것인 균주.
  5. 청구항 1의 균주의 배양액.
  6. 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 화장료 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 피부 상태 개선용인 것인 화장료 조성물.
  8. 청구항 7에 있어서, 상기 피부 상태 개선은 피부 노화 방지, 피부 주름 개선, 피부 탄력 증진, 피부 미백, 피부 재생 또는 상처 개선인 것인 화장료 조성물.
  9. 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 함유하는 상처의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  10. 마이크로코커스 플라버스(Micrococcus flavus) 균주, 그의 파쇄액, 배양액, 배양액의 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식품 조성물.
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