KR101874595B1

KR101874595B1 - 유산균 발효 복합생약추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기 조성물

Info

Publication number: KR101874595B1
Application number: KR1020160167877A
Authority: KR
Inventors: 마진열; 유재명; 조원경; 양주혜; 박광일; 박은희
Original assignee: 한국한의학연구원
Priority date: 2016-12-09
Filing date: 2016-12-09
Publication date: 2018-07-05
Also published as: KR20180066941A; WO2018105926A1

Abstract

본 발명은 고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로, 고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 비염 또는 알레르기성 결막염에 대한 예방 또는 치료용 조성물, 상기 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 알레르기성 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

Description

유산균 발효 복합생약추출물을 유효성분으로 하는 항알레르기 조성물 {Anti-allergic Composition Comprising Herbal Extract fermented by Lactic acid Bacteria as an Active Ingredient}

최근 알레르기성 질환이 증가 추세에 있는바 이에 대한 치료제의 연구 및 개발도 함께 진행되고 있다. 알레르기성 질환은 면역과민반응에 의해 발생하는 질환을 의미하는 것으로, 알레르기 반응은 다양한 세포와 매개물질이 참여하는 복잡한 반응인 동시에 다양한 질환의 원인으로 작용한다. 따라서, 알레르기 반응의 조절을 통하여 다양한 질병에 대한 치료가 가능할 것으로 예상되고 있고 이에 대한 연구가 지속되고 있다. 알레르기성 질환에는 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 피부염 등이 포함된다.

아토피 피부염은 어느 연령대나 발생할 수 있는 세계적으로 흔한 질병으로 70% 내지 95%는 5세 이하의 유아시기에 발병된다. 국내의 경우도 이미 아토피 피부염에 의하여 발생되는 사회적 그리고 의료적인 문제가 심각한 수준에 이르고 있다. 다양한 보고에 의하면 국내 전체 국민의 약 15%가 아토피 피부염 환자이며, 이중 1 내지 4 세 유아 100 명당 18 내지 22 명이 아토피 환자로 알려져 있다. 최근 어린이는 물론 성인 아토피 피부염 환자의 증가도 심각해지고 있으며, 심한 경우 취업 및 결혼 등 사회생활에 지장을 초래하기까지 하여 심각한 사회문제가 되고 있다. 이러한 경우, 심하면 심각한 정신적 스트레스로 대인기피 및 우울증을 유발하기도 한다. 이렇듯 아토피 피부염이 심각한 사회적, 의학적 문제가 되고 있음에도 불구하고 현재까지 효율적인 치료제가 없는 실정이다.

알레르기성 비염은 가장 흔한 알레르기성 질환이며, 점차 그 발병률이 증가하고 있어 생활의 질에 영향을 주고, 생산능력의 감소와 치료비 부담의 증가로 인해 사회 및 경제적으로 문제가 되고 있으나, 뚜렷한 치료법이 아직 없는 실정이다. 현재 사용되고 있는 약물요법은 알레르기성 비염의 기본적인 치료지만 약제 중단 시 재발이 흔하고 심각한 부작용을 일으킬 수 있으며, 면역요법은 유일하게 변형된 면역체계를 원상회복시키는 근본 치료가 될 수 있지만 비용상 문제가 있다.

알레르기성 결막염은 특정 알레르기 유발 물질에 의한 알레르기 반응으로 발생한 결막 (흰자위)의 염증 질환을 의미하는 알레르기성 질환으로서, 봄철의 꽃가루, 공기 중 먼지, 동물의 비듬 등과 같은 알레르기 유발물질이 눈의 결막에 접촉하여 비만세포, 호산구 또는 호염기구 등의 면역세포를 통한 알레르기 반응이 유발하게 되면, 히스타민, 염증성 사이토카인 (Cytokines) 및 염증성 지질대사체 (Prostaglandins & Leukotrienes)과 같은 여러 염증유발물질이 분비되어 결막의 염증 반응을 유발하게 된다. 이러한 알레르기성 결막염의 경우 글루코코르티코이드 계통의 스테로이드 안약으로 치료할 수 있으나, 이러한 항염증 약물은 장기간 사용 후 갑자기 투약을 중지하거나 장기간 과잉 사용하는 경우, 급성 부신 기능 부전 등으로 전신 쇠약감, 발열, 안압상승, 녹내장, 백내장 등의 부작용이 발생할 수 있어, 이와 같은 문제점이 없는 항 알레르기제가 요구되고 있다.

이러한 배경 하에, 본 발명자들은 알레르기성 질환을 효과적으로 치료하면서도, 천연물에서 유래되어 안전성을 확보할 수 있는 약물을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근의 유산균 발효 추출물의 경우, 독성이 없으면서도 상기 생약 단독에 비하여 현저히 우수한 항알레르기 효과를 나타내어 우수한 알레르기성 질환 예방 또는 치료 효과를 가짐을 확인하였다. 이에, 상기 유산균 발효 복합생약추출물을 알레르기성 질환의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은, 고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은, 고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 "고삼 (Sophora Root)"은 도둑놈의지팡이·너삼·뱀의정자나무라고도 불리는 쌍떡잎식물 장미목 콩과의 여러해살이 식물로서, 소화불량·신경통·간염·황달·치질 등에 처방되는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "당귀 (Angelica gigas)"는 미나리과에 속하는 다년생 방향성 초본 식물로, 피가 부족할 때 피를 생성해 주는 보혈 작용, 항암효과 및 혈압강하 효과 등이 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 " 우방자 (Arctium lappa fruit) "는 국화과에 속한 우엉의 성숙한 종자를 건조한 것으로, 우엉은 높이가 1.5 m 정도로서 줄기는 위에서 가지가 갈라지고 뿌리는 굵고 길게 자라는 것으로 알려져 있다. 악실, 서점자 등으로도 불리며, 배뇨 장애, 습진, 부스럼 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "호장근 (Polygonum cuspidatum)"은 마디풀과의 여러해살이 식물로서, 한방에서는 뿌리를 이뇨제, 진정제 등으로 사용하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근은 자연에서 채취된 것으로 사용하거나, 상업적으로 판매되는 것을 구입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 고삼, 당귀 및 우방자 발효 추출물과, 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근의 복합 발효 추출물을 제조하여 그 효능을 비교한 결과, 상기 생약 원료를 단독으로 사용한 경우에 비하여, 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근의 복합 발효 추출물을 사용한 경우, 더욱 우수한 항알레르기 활성을 나타냄을 확인하여, 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용될 수 있음을 확인하였다 (도 3 및 도 5).

상기 추출물의 제조에 사용되는 용매로는 물, 탄소수 1(C₁) 내지 탄소수 4(C₄) 알코올, 바람직하게는 메탄올, 에탄올 또는 부탄올, 또는 이들의 혼합 용매를 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 추출방법으로는 용매 추출, 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출, 초음파 추출, 또는 증기 추출 등의 방법을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 유산균 발효 추출물에서, 유산균으로는 분리 균주 또는 시판중인 다양한 유산균을 제한 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 유산균 발효는 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 애시도필루스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 델브루에키 아종 락티스, 락토바실러스 가세리 및 비피도박테리움 브레베로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주로 이루어질 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 유산균 발효는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus)로 이루어질 수 있다. 다만, 사용될 수 있는 유산균이 상기 예시된 유산균에 한정되는 것은 아니며, 유산균 배양 배지 역시 각각의 유산균에 맞게 MRS (Man-Rogosa-Sharpe), 락토오스, M17 및 APT 배지(Asparagine Enrichment Broth)로 부터 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 "알레르기성 질환"은 면역과민반응에 의해 발생하는 질환을 의미하며, 알레르기 반응은 다양한 세포와 매개물질이 참여하는 복잡한 반응인 동시에 다양한 질환의 원인으로 작용한다. 구체적으로, 상기 알레르기성 질환은 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 비염 또는 알레르기성 결막염일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

천식은 기도의 만성염증으로 인해서 기도가 과민해지고 간헐적인 기도 수축이 발생하여 호흡곤란 증상을 유발하는 만성질병이다. 천식은 외부환경에 존재하는 집먼지 진드기나 꽃가루 등의 알레르기 유발물질 (알레르겐)이 원인이 되어 과도한 면역반응 (알레르기반응)을 보임에 따라 기도 점막조직에 염증이 발생하고, 이에 따라 기침, 호흡곤란 등의 천식 증상이 발생하게 된다 (Lemanske RF Jr. JAMA 1997, 278, 1855-1873). 최근 면역학 및 분자유전학의 발전에 따라 천식의 병태생리에 대한 이해와 이에 따른 새로운 치료제의 개발에도 불구하고 천식으로 인한 유병률은 증가하고 있는 실정이다. 특히, 기존의 치료약제로 사용되는 스테로이드제 또는 기관지 확장제는 질병의 근본적인 치유가 아닌 증상의 조절 및 예방을 위한 약제로 평생 사용해야 하고 이로 인해 개인 및 사회의 경제적 부담이 큰 문제가 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 알레르기 반응이 유도된 비만세포에 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근의 발효 추출물을 처리한 결과, 비만세포로부터의 β-Hexosaminidase (탈과립 생체표지인자)의 분비를 농도 의존적으로 억제하였을 뿐 아니라, 기존의 생약 발효 추출물에 비해 알레르기 유발물질의 분비를 농도의존적으로 더욱 억제함을 확인하여, 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 비염, 알레르기성 결막염 또는 류마티스 관절염과 같은 알레르기성 질환에 대한 예방 또는 치료용 조성물로서 사용될 수 있음을 확인하였다 (도 4 내지 도 8).

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료방법을 제공한다.

상기 알레르기성 질환의 예방 또는 치료방법에 대하여, 고삼, 당귀, 우방자, 호장근, 유산균 발효, 또는 알레르기성 질환은 상기 설명한 바와 같다.

본 발명에서, "예방"이란 조성물의 투여에 의해 염증의 증상을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 염증에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 용어, "투여"란 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한, 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 구체적으로, 구강, 직장, 국소, 정맥 내, 복강 내, 근육 내, 동맥 내, 경피, 비측 내, 흡입 또는 피내 경로를 통하여 통상적인 방식으로 투여될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근의 발효 추출물은 세포독성을 거의 유발하지 않았을 뿐 아니라 (도 9), FcεRI 수용체 신호 전달 체계의 율속단계의 신호전달 단백질인 Syk, Fyn, Lyn 중 Syk, Lyn의 인산화을 억제하였으며 (도 11), 상기 Lyn의 활성화 억제에 의해 하위 신호전달체계인 탈과립화 관련 기전 (PLCγ1/2 - PKCδ 경로)을 억제하고 (도 12), 사이토카인 생성 관련 기전 (JNK, ERK1/2, p38, Akt의 인산화)의 활성화를 억제할 수 있음을 확인하여 (도 13), 알레르기성 질환에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 수동피부과민증 모델 마우스에 상기 발효 추출물을 처리한 결과 음성 대조군에 비해 알레르기 반응이 억제되었으며, 특히 양성 대조군인 덱사메타손에 비해 더욱 우수한 항알레르기 활성을 나타냄을 확인하여, 알레르기성 질환에 대한 예방 또는 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다 (도 14).

본 발명의 조성물은 투여를 위하여, 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀롤로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명의 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사 용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는, 제형화할 경우 통상 사용 하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 시간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근 혼합물의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형으로는 특별히 한정되는 것은 아니지만 피부 외용제의 제형인 것이 바람직하며, 상기 피부 외용제 제형의 한 바람직한 형태로는 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물을 들 수 있고, 다른 바람직한 형태로는 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피 투여형의 제형을 들 수 있다. 또한, 각 제형의 외용제 조성물에 있어서, 상기한 필수 성분 이외의 다른 성분들은 기타 외용제의 제형 또는 사용 목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 고삼, 당귀, 우방자 및 호장근 혼합물의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 발효 추출물은 알레르기성 질환의 개선을 목적으로 건강식품에 첨가될 수 있으며, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에는 생약 추출물 또는 생약 발효물이 원료에 대하여 30 중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는 조성물은 종래 알려진 항알레르기 추출물에 비하여 알레르기 유발 물질 생성을 더욱 효과적으로 억제할 수 있으므로, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은, 비만세포로부터의 β-Hexosaminidase의 분비에 대한 F-PASA 추출물의 억제 효능을 도식화한 그래프이다. (**P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비)
도 2는, F-PASA 추출물과 KIOM-MA128의, 비만세포로부터의 β-Hexosaminidase의 분비 억제 효능을 비교하여 도식화한 그래프이다. (##P < 0.01은 KIOM-MA128 각 농도 그룹 대비)
도 3은, F-PASA 추출물과 우방자 발효 추출물, 당귀 발효 추출물, 고삼 발효 추출물의, 비만세포로부터의 β-Hexosaminidase의 분비 억제 효능을 비교하여 도식화한 그래프이다. (**P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비, ##P < 0.01은 F-PASA 그룹 대비)
도 4는, 비만세포로부터의 TNF-α의 생성에 대한 F-PASA 추출물의 억제 효능을 도식화한 그래프이다. (**P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비)
도 5는, F-PASA 추출물과 우방자 발효 추출물, 당귀 발효 추출물, 고삼 발효 추출물의, 비만세포로부터의 TNF-α의 생성 억제 효능을 비교하여 도식화한 그래프이다. (**P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비, ##P < 0.01은 F-PASA 그룹 대비)
도 6은, F-PASA 추출물의 IL-4 (Interleukin 4) 생성 억제 효능을 도식화한 그래프이다. (**P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비)
도 7은, F-PASA 추출물의 PGD₂ (Prostaglandin D₂) 생성 억제 효능을 도식화한 그래프이다. (**P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비)
도 8은, F-PASA 추출물의 LTC₄ (Leukotriene C₄) 생성 억제 효능을 도식화한 그래프이다. (**P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비)
도 9는, F-PASA 추출물의 세포 독성 유발 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10은, cPLA₂ (Cytosolic phospholipase A₂)와 5-LO (5-Lipoxygenase)의 인산화, COX-2 (Cyclooxygenase-2), PGDS (Prostaglandin-D synthase) 및 LTC₄S (Leukotriene C₄ synthase)에 대한 F-PASA 추출물의 인산화 및 발현 억제 정도를 나타낸 웨스턴블럿 결과의 전기영동 사진이다.
도 11은, FcεRI 수용체 신호 전달 체계의 신호전달 단백질인 Syk, Fyn, Lyn의 인산화에 대한 F-PASA 추출물의 활성 억제 정도를 나타낸 웨스턴블럿 결과의 전기영동 사진이다.
도 12는, F-PASA 추출물의 탈과립화 관련 기전 (PLCγ1/2 - PKCδ 경로)의 활성화에 대한 억제 정도를 나타낸 웨스턴블럿 결과의 전기영동 사진이다.
도 13은, F-PASA 추출물의 사이토카인 생성 관련 기전 (JNK, ERK1/2, p38, Akt의 인산화)의 활성화에 대한 억제 정도를 나타낸 웨스턴블럿 결과의 전기영동 사진이다.
도 14는, 수동피부과민증 모델 생쥐에 대한 F-PASA 추출물의 항알레르기 효능 검증을 위해 Evans blue 흡광도를 측정한 결과를 도식화한 그래프이다. (*P < 0.05, **P < 0.01은 DNP-IgE/DNP-HSA 그룹 대비)

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: F- PASA 추출물 제조

본 발명의 F-PASA 추출물 (당귀, 고삼, 우방자, 호장근 혼합 추출물의 발효물)을 제조하기 위해, 1 kg의 PASA (당귀:고삼:우방자:호장근 = 1:1:1:1 (w/w/w/w))를 10 리터의 증류수에 넣고, 약 3 시간 동안 115℃의 온도로 가열하였다. 이를 통해 얻은 용액을 150 내지 500 μm의 지름을 갖는 거름망으로 거른 다음 약 5 분 동안 가열하여 멸균하였다. 1N 수산화나트륨 (NaOH)을 이용하여 멸균된 추출물의 pH를 7.0으로 보정한 후에 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus (KFRI 128, FCTC 2182))를 접종하여 37℃에서 이틀간 발효시켰다. 이후 상기 발효물은 60μm의 지름을 갖는 나일론망으로 거른 다음 하루 동안 정치시켰다. 상층액을 취하여 동결건조하여 F-PASA 추출물 (건조물)을 얻었다. 상기 건조물은 -20℃의 온도에서 보관하였으며, 모든 실험에서 10%의 DMSO 용액에 녹여서 사용하였다.

비교예 1: 생약 추출물의 유산균 발효물 제조

실시예 1에 따라 제조된 F-PASA 추출물과의 항알레르기 효능 비교를 위해, 본 발명자의 선행 발명인 한국공개특허 제10-2010-0093901호에 기재된 방법과 동일하게 생약 추출물의 유산균 발효물 (KIOM-MA128)을 제조하였다.

구체적으로, 생약 추출물은 고삼, 감초, 금은화, 당귀, 독활, 목향, 방풍, 산조인, 어성초, 연교, 우방자, 음양곽, 인삼, 자근, 지유, 천궁, 현삼 및 호장근을 추출하여 제조되는 한방 제제로서, 고삼 160 g, 감초 80 g, 금은화 80 g, 당귀 80 g, 독활 80 g, 목향 80 g, 방풍 80 g, 산조인 80 g, 어성초 160 g, 연교 80 g, 우방자 160 g, 음양곽 80 g, 인삼 160 g, 자근 80 g, 지유 80 g, 천궁 80 g, 현삼 160 g 및 호장근 80 g의 비율로 생약 혼합물을 제조한 후, 이를 상기 생약 혼합물 1,840 g의 10 배량인 18.4 ℓ의 증류수에 넣어 1 시간 동안 침지시킨 후 115℃에서 3시간 동안 초고속 진공저온 추출기(한국, 경서추출기 cosmos-600), 표준 시험용 체(standard testing sieve, Aperture 500 ㎛와 150 ㎛)를 이용하여 여과하여 생약 추출물을 제조하였다.

상기 생약 추출물을 유산균 발효하기 위해, 락토바실러스 애시도필루스 (KFRI #128), 락토바실러스 카세이 (KFRI #127), 락토바실러스 플란타룸 (KFRI #144, KFRI #402), 락토바실러스 퍼멘텀 (KFRI #164), 락토바실러스 불가리쿠스 (KFRI #344), 락토바실러스 델브루에키 아종 락티스 (KFRI #442), 락토바실러스 가세리 (KFRI #658, KCTC 3163) 및 비피도박테리움 브레베 (KFRI #744)를 사용하였으며, 구체적인 발효 과정은 한국공개특허 제10-2010-0093901호에 기재된 바와 같다.

비교예 2: 발효 우방자 추출물, 발효 당귀 추출물, 및 발효 고삼 추출물의 제조

실시예 1에 따라 제조된 F-PASA 추출물과의 항알레르기 효능 비교를 위해 발효 우방자 추출물 (F-우방자), 발효 당귀 추출물 (F-당귀), 발효 고삼 추출물 (F-고삼)을 각각 제조하였으며, 구체적인 발효 추출물의 제조 방법은 실시예 1에 따라 제조되었으며, 각각의 발효를 위한 균주는 한국공개특허 제10-2010-0054272호; 서민준 외 대한본초학회지 제28권 제 5호: 39-44, 2013; 및 한국공개특허 제10-2014-0008618호에 기재된 균주를 사용하였다.

실험예 1: F- PASA 추출물의 항알레르기 활성 측정

1-1. 비만세포의 알레르기 반응 유도

상기 실시예 1에서 제조한 F-PASA 추출물, 비교예 1 및 2에서 제조한 발효 추출물의 항알레르기 활성을 비교하기 위하여 비만세포에서 알레르기 반응을 유도하였다.

RBL-2H3 세포를 24-웰 플레이트에 1×10⁵ 세포/웰의 농도로 분주하고, 100 units/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신 (streptomycin)과 5% (v/v) 소태아혈청이 함유된 MEM-α 배지에서 37℃, 5%의 CO₂, 가습 조건에서 밤새 배양하였다. 배양 완료 후, 세포를 1×PBS 완충액으로 세척하고, DNP-IgE 50 ng/mL (Sigma, Co., Ltd)와 함께 24 시간 배양하여 세포를 감작시켰다.

감작된 세포에 실시예 1에서 제조한 F-PASA 추출물; 비교예 1에서 제조한 생약 추출물의 유산균 발효물; 및 비교예 2에서 제조한 발효 우방자 추출물, 발효 당귀 추출물 및 발효 고삼 추출물을 각각 농도별로 넣고 1 시간 동안 배양한 후, 과민반응을 유도하기 위하여 DNP-HSA (Dinitrophenyl-human serum albumin) 0.1㎍/mL (Sigma, Co.,Ltd.)를 가하여 다시 4 시간 동안 배양하였다. 상등액을 취하여 4℃에서 17,000g으로 10 분 간 원심분리하고, 상등액을 -80℃에서 보관하였으며, 해동하여 분석에 사용하였다.

1-2. F- PASA 추출물의 비만세포에 대한 알레르기 유발물질 분비 억제 효과 검정

탈과립의 표식자인 β-Hexosaminidase의 활성을 측정하는 것에 의해 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비 억제 효과를 검정하였으며, 검정방법은 아래와 같다.

세포로부터 배지로 분비된 β-헥소사미니다아제 (β-Hexosaminidase)의 활성을 측정하기 위하여, 상기 1-1의 상등액 25 ㎕와 0.1M 나트륨 시트레이트 (Sodium citrate) 완충액 (pH 4.5)으로 제조한 10 mM p-NAG (4-Nitropheyl N-acetyl-β-D-glucosaminide) 50 ㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 37℃에서 배양하였다. 배양 1시간 후 0.1M Na₂CO₃ 완충액 (pH 10.0)으로 반응을 종결하고 405 nm에서의 흡광도로 p-니트로페놀 (p-Nitrophenol)의 양을 측정하여 β-헥소사미니다아제 (β-Hexosaminidase)의 활성을 결정하였다. 각 결과는 세 번의 실험의 평균값으로 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 F-PASA 추출물은 비만세포로부터의 β-Hexosaminidase의 분비를 농도 의존적으로 억제할 수 있으며, IC₅₀값은 510.9 ㎍/mL임을 확인하였다. 특히, F-PASA 추출물은 2 ㎎/mL의 농도에서 알레르기 유발물질 분비를 75% 이상 억제할 수 있었다 (도 1).

또한, 비교예 1인 기존의 생약 발효 추출물 (KIOM-MA128)에 비해 F-PASA 추출물이 비만세포로부터 알레르기 유발물질의 분비를 농도의존적으로 더욱 억제하는 것을 알 수 있으며, 최대 농도인 2 mg/mL에서는 4 내지 5 배 정도로 더 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있었다 (도 2). 추가적으로 선행기술시료에 관한 비교예 2의 추출물과 F-PASA 추출물을 동일 농도 (0.5 mg/mL)에서 비만세포로부터의 β-hexosaminidase의 분비 억제 효능을 비교하였을 때, 비교예 2의 추출물은 탈과립화를 억제하지 못한 반면에 F-PASA는 약 50% 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 3).

1-3. F- PASA 추출물의 비만세포에 대한 사이토카인 생성 억제 효과 검정

알레르기에 관계된 비만세포에서 분비되는 사이토카인으로 잘 알려진 종양괴사인자-α(TNF-α) 생성에 대한 F-PASA 추출물의 억제효과를 아래와 같은 방법으로 관측하였다.

보다 구체적으로, 상기 실험예 1-1의 알레르기 반응 유도된 비만세포의 상등액 중 TNF-α의 농도를 ELISA 키트(e-Bioscience, Inc.)를 사용하여 제조자의 매뉴얼에 따라 측정하고 그 결과를 도 4 및 도 5에 각각 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 F-PASA 추출물을 처리한 경우, 농도의존적으로 TNF-α의 생성을 현저히 억제하였으며, 특히 1 ㎎/mL의 농도에서 80% 이상 TNF-α의 생성을 억제할 수 있음을 확인하였다 (도 4).

또한, 단일 물질의 발효물에 관한 비교예 2의 추출물에 비해 본 발명의 F-PASA 추출물이 더욱 우수한 비만세포의 TNF-α 생성 억제능을 나타내는 것을 확인하였다 (도 5).

1-4. F- PASA 추출물의 비만세포에 대한 프로스타글란딘과 류코트리엔 생성 억제 효과 검정

염증 및 알레르기 질환을 매개하는 핵심적인 매개물질로 알려진 염증성 지질매개체인 프로스타글란딘과 류코트리엔의 비만세포에서의 생성 억제효과를 아래와 같은 방법으로 관측하였다.

상기 실험예 1-1의 알레르기 반응 유도된 비만세포의 상등액 중 IL-4 (Interleukin 4), PGD₂ (Prostaglandin D₂) 및 LTC₄ (Leukotriene C₄)의 농도를 EIA 키트 (Cayman Chemical, Inc.)를 사용하여 각각 제조자의 매뉴얼에 따라 측정하고 그 결과를 도 6 내지 도 8에 각각 나타내었다.

그 결과, 본 발명의 F-PASA 추출물은 도 6의 IL-4, 도 7의 PGD₂ 및 도 8의 LTC₄의 생성을 모두 유의적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다. 특히 본 발명의 F-PASA 추출물은 0.2 mg/mL의 농도에서 IL-4의 생성을 100% 가까이 억제하였으며, 0.5 mg/mL 농도에서 PGD₂ 생성을 약 98% 정도 억제하였음을 확인하였다.

실험예 2: F- PASA 추출물의 세포 독성 측정

세포 생존능의 지표로서 WST-1의 수용성 테트라졸륨 염으로의 미토콘드리아 의존성 환원으로 세포 호흡을 아래와 같은 방법으로 측정하였다.

보다 상세하게는, RBL-2H3 세포를 96-웰 플레이트에 1×10⁴ 세포/웰의 농도로 분주한 후, 5%(v/v) 소태아혈청이 함유된 MEM-α 배지에서, 37℃의 온도에서 12 시간 동안 배양하였다. 다음날 배양한 세포를 1×PBS 완충액으로 세척하고, DNP-IgE (Dinitrophenyl-immunoglobulin E) 50 ng/mL(Sigma, Co., Ltd.)와 함께 24 시간 배양하여 세포를 감작시켰다.

감작된 세포에 실시예 1에서 제조한 F-PASA (0 mg/mL, 0.125 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL)을 넣고 1 시간 추가로 배양한 후, WST-1 시약 (Daeil Lab Service. Co., Ltd.) 10 ㎕와 DNP-HSA (Dinitrophenyl-human serum albumin) 0.1 ㎍/mL(Sigma, Co., Ltd.)를 동시에 가하여 다시 4 시간 동안 배양하였다. 세포 생존능을 확인하기 위하여 마이크로-플레이트 리더(Micro-plate reader) (Emax, Molecular Devices Inc. Sunnyvale, California, USA)를 사용하여 450 nm에서의 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 그 결과, 본 발명의 F-PASA 추출물은 2 mg/mL의 농도까지 세포독성을 전혀 유발하지 않았음을 확인하였다 (도 9).

실험예 3: F- PASA 추출물의 FcεRI 수용체 신호 전달 체계에 대한 효과 측정

실험예 1-1에서 제조한 알레르기 반응 유도된 세포를 용해하여 총단백질을 추출한 후에 FcεRI 수용체 신호전달 체계의 단백질을 웨스턴블럿에 의해 정량하였다. 웨스턴블럿에 사용한 항체는 Cell signaling Technology, Inc. 구입하여 사용하였다.

상기 웨스턴블럿 결과의 전기영동 사진을 도 10 내지 도 13에 나타내었다. 여기서, 로딩 대조군으로는 β-액틴 (β-actin)을 사용하였다.

그 결과, 본 발명의 F-PASA 추출물은 Syk (Spleen Tyrosine Kinase)의 하위 신호전달체계인 아라키돈산 연쇄반응 (Arachdonate cascade)의 관련 효소인 cPLA₂ (Cytosolic phospholipase A₂)와 5-LO (5-Lipoxygenase)의 인산화 및 COX-2 (Cyclooxygenase-2)의 발현을 억제함을 확인할 수 있다. 또한, F-PASA 추출물은 PGDS (Prostaglandin-D synthase) 및 LTC₄S (Leukotriene C₄ synthase)의 발현을 억제하였다 (도 10). 여기서, cPLA₂는 아라키돈산 연쇄반응의 율속단계에 관여하는 효소이며, 5-LO는 류코트리엔 생성의 율속단계에 관여하는 효소이고, COX-2는 프로스타글란딘 생성의 율속단계에 관여하는 효소이다. PGDS는 PGD₂ 생성 관련 효소이고, LTC₄S는 LTC₄ 생성 관련 효소이다.

또한, 본 발명의 F-PASA 추출물은 FcεRI 수용체 신호 전달 체계의 율속단계의 신호전달 단백질인 Syk, Fyn, Lyn 중 Syk, Lyn의 인산화을 억제하였으며 (도 11), 상기 Lyn의 활성화 억제에 의해 하위 신호전달체계인 탈과립화 관련 기전 (PLCγ1/2 - PKCδ 경로)을 억제하는 것을 확인하였다 (도 12). 나아가, 본 발명의 F-PASA 추출물은 사이토카인 생성 관련 기전 (JNK, ERK1/2, p38, Akt의 인산화)의 활성화를 억제할 수 있음을 확인하여 (도 13), 항알레르기 물질로 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

실험예 4: F- PASA 추출물의 수동피부과민증 모델 생쥐에 대한 항알레르기 효능 검증

수동피부과민증 모델 생쥐를 제조하기 위해, ICR 생쥐의 귀에 DNP-IgE (100 ng)을 피내 주사하였다. 1일이 경과한 후, 0, 12.5, 25, 50 및 100 mg/kg의 F-PASA 를 각각 경구 투여하고, 1 시간 후에 100 μg의 DNP-HSA가 포함된 0.5% 에반스 블루 (Evans blue) 수용액을 미정맥에 주사하였다. 양성 대조군으로 항알레르기 약물로 상용되는 덱사메타손 (Dexamethasone)을 경구 투여하였다. 30 분 후에 상기 마우스를 안락사시킨 다음 귀를 절취하여 1 ml의 포름아마이드 (Formamide)에 넣고 80℃의 온도에서 2 시간 동안 추출물을 추출하였다. 상기 추출물을 원심분리한 다음 상층액을 취하여 620 nm에서 흡광도를 측정하여, 도 14에 나타내었다.

그 결과, F-PASA 또는 양성 대조군이 투여되지 않은 음성 대조군에서는 DNP-HSA와 DNP-IgE에 의한 알레르기 반응에 의해, 높은 흡광도를 나타내었으나, 본 발명의 F-PASA 추출물을 투여한 경우 흡광도가 낮아져 알레르기 반응이 억제됨을 확인하였다 (도 14). 특히, 100 mg/kg의 F-PASA 추출물을 투여할 경우, 양성 대조군인 덱사메타손에 비해 더욱 우수한 항알레르기 활성을 나타냄을 확인함으로써, 본 발명의 발효 추출물이 항알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 사용될 수 있음을 확인하였다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서,
상기 유산균 발효 추출물은 100 내지 3000 μg/ml의 농도로 포함되는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유산균 발효는 락토바실러스 람노서스, 락토바실러스 애시도필루스, 락토바실러스 카세이, 락토바실러스 플란타룸, 락토바실러스 퍼멘텀, 락토바실러스 불가리쿠스, 락토바실러스 델브루에키 아종 락티스, 락토바실러스 가세리 및 비피도박테리움 브레베로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주로 이루어지는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유산균 발효는 락토바실러스 람노서스 (Lactobacillus rhamnosus)로 이루어지는 것인, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 알레르기성 질환은 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 비염 또는 알레르기성 결막염인 것인, 조성물.
고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 치료방법으로서,
상기 유산균 발효 추출물은 100 내지 3000 μg/ml의 농도로 포함되는 것인, 치료방법.
제5항에 있어서, 상기 알레르기성 질환은 아토피 피부염, 천식, 알레르기성 비염 또는 알레르기성 결막염인 것인, 방법.
고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 화장료 조성물로서,
상기 유산균 발효 추출물은 100 내지 3000 μg/ml의 농도로 포함되는 것인, 조성물.
고삼 (Sophora Root), 당귀 (Angelica gigas), 우방자 (Arctium lappa fruit) 및 호장근 (Polygonum cuspidatum)의 유산균 발효 추출물을 포함하는, 알레르기성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로서,
상기 유산균 발효 추출물은 100 내지 3000 μg/ml의 농도로 포함되는 것인, 건강기능식품.