KR20230075107A

KR20230075107A - 민물김 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20230075107A
Application number: KR1020210161378A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 김성규; 박상희; 김동선; 이화평; 김동삼; 장석구; 황선자
Original assignee: 삼척시
Priority date: 2021-11-22
Filing date: 2021-11-22
Publication date: 2023-05-31

Abstract

본 발명은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 민물김 추출물을 염증성 폐질환이 유발된 동물 모델에 처리하는 경우, 폐조직 내의 IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α, IFN-γ 등 염증성 사이토카인이 농도 의존적으로 감소시키며 면역세포의 이동을 감소시킴으로써 민물김 추출물을 염증성 폐질환의 예방 또는 치료를 위한 천연물로 사용할 수 있다.

Description

민물김 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물{Composition for preventing or treating inflammatory lung diseases comprising Prasiola japonica extract or fraction thereof as active ingredient}

본 발명은 민물김의 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 민물김의 에탄올-클로로포름 분획물을 유효성분으로 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

폐(lung)는 인체에서 호흡을 담당하는 기관으로, 공기의 들숨과 날숨을 통해 산소를 얻고 이산화탄소를 배출하는 기관이다. 최근 산업화 도시화와 공해, 호흡기 감염증, 흡연, 등의 여러 가지 인자들이 복합적으로 관여하며, 염증성 폐질환의 발생이 증가하고 있다.

폐렴은 폐 말초 부위의 염증성 폐질환이다. 항생제가 발명되기 전인 1900년대 초까지는 폐렴이 가장 흔한 사망 원인이었으며 항생제가 다양하게 개발된 현재에도 5~6번째의 사망 원인이며, 개발도상국가에서는 여전히 입원을 요하는 가장 흔한 원인이 되고 있다. 염증성 폐질환의 원인은 다양하나 일반적으로는 세균에 의한 폐감염에 의하여 발생하며, 2019년 중국 후베이성 우한시에서 시작된 신종 코로나바이러스 (SARS-CoV-2)에 의한 COVID-19는 심각한 후유증을 동반하는 폐렴을 일으킨다. 또한 최근 미세먼지, 초미세먼지의 농도 증가는 여러 호흡기 질환을 일으키며, 폐 세포 내 염증성 사이토카인을 증가시키며 염증성 폐질환을 유도한다. 이에 염증성 페질환을 예방 또는 치료할 수 있는 천연물에 대한 연구가 시급한 실정이다.

한편, 민물김(Prasiola japonica)은 물김이라는 이름으로 구전되어 왔으며, 현대에 이르러 민물김으로 알려지고 있다. 민물김은 홍조류인 바다김과 달리 녹조류(Green algae, Phylum Chlorophyta)로서 바다가 아닌 민물에서 생육하며, 민물파래과(Prasiolacease)에 포함된다(Park, M. K. et al., J. Plant Bio., 13, 1-10, 1970). 일본에서는 민물김을 카와노리(하천김)라는 이름으로 부르고 있으며, 하천김과 같은 민물 조류를 인공배양하여 높은 상업적 이윤을 창출하고 있다. 우리나라 민물김은 1938년 일본 학자인 Okada가 함경남도 문천군 문천면에서 최초로 채취하여 Prasiola formosana var. coreana Okada로 명명하여 발표한 것이 효시이며 (Okada, Y., J. Jpn. Bot., 15, 449-452, 1939), 삼척군의 집단에 대한 형태 및 생태학적 연구가 수행된 바가 있다(Park, M. K. et al., J. Plant Bio., 13, 1-10, 1970). 우리나라에서는 산업화에 따른 인위적 영향으로 40여년 전에 이미 사라진 종으로 알려졌으나 아직 강원도 삼척시의 소한천에 민물김이 분포하고 있음이 밝혀졌다.

민물김과 같은 녹조류 유래 추출물이 항고혈압 및 미코스포린-유사 아미노산(mycosporine-like amino acids, MAAs)에 의한 자외선 차단 등의 활성을 가지는 것으로 보고되었다(Cha, S. H. et al., J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 35, 307-314, 2006; Groniger, A. et al., J. Photochem. Photobiol. B., 66, 54-59, 2002). 한편 일본에서 민물유래 식용김으로 사용하고 있는 스이젠지노리(Suizenzinori, Aphanothece sacrum)에는 고 함량의 철분 및 칼슘 등 미네랄 성분이 풍부한 것으로 조사되었으며, 알러지성 피부염을 억제하는 성분인 사크란 (Sacran, sulfated polysaccharide)이 함유되어 있어 약리학적 활용도가 높게 평가되고 있다(Ngatu, N. R. et al., Ann. Allergy Asthma Immunol., 108, 117-122, 2012). 그러나, 국내 자생 민물김에 대한 생리활성물질 성분분석 및 약리학적 분석에 대한 연구는 아직까지 충분히 이루어지지 않고 있는 실정이다.

한국등록특허 제10-2261340호, 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 피부 질환 예방 또는 치료용 조성물, 2021년06월01일, 등록. 한국등록특허 제10-2181090호, 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료용 조성물, 2020년11월16일, 등록.

Cha, S. H. et al., Screening of extracts from marine green and brown algae in Jeju for potent marine angiotension-I converting enzyme(ACE) inhibitory activity, J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 35, 307-314, 2006. Groniger, A. et al., Induction of the synthesis of an UV-absorbing substance in the green alga Prasiola stipitata, J. Photochem. Photobiol. B., 66, 54-59, 2002. Ngatu, N. R. et al., Anti-inflammatory effects of sacran, a novel polysaccharide from Aphanothece sacrum, on 2,4,6- trinitrochlorobenzene-induced allergic dermatitis in vivo, Ann. Allergy Asthma Immunol., 108, 117-122, 2012. Okada, Y., On a new Prasiola from Corea, J. Jpn. Bot., 15, 449-452, 1939. Park, M. K. et al., Ecological and morphological studies on the Prasiola sp. in the Samchuck-Chodang, J. Plant Bio., 13, 1-10, 1970. Sa, J. H. et al., Chemical Characteristics and Physiological Activities from Freshwater Laver Grown in the Area of Samcheokcity, Rep. Inst. Health & Environ., 25, 52-62, 2014. Seo, D. W. et al., Screening of functional components derived from fresh water laver, Prasiola japonica, and its pharmacological properties, J. Biomed. Res., 14(2), 83-90, 2013. Heung Man Lee et al., Expression of MMP-9 and TIMP-1 in the Nasal Mucosa of Allergic Rhinitis, Korean Journal of Otorhinolaryngology-Head and Neck Surgery 2000;43(6): 604-609.

본 발명의 목적은 민물김 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 민물김은 녹조류로 홍조류인 바다김과는 달리 바다가 아닌 민물에서 생육하며, 민물파래과(Prasiolacease)에 속한다.

상기 민물김 추출물은 민물김을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 에틸아세테이트, n-부탄올, 아세톤, 헥산, 디클로로메탄으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출하여 얻을 수 있으며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 민물김 추출물은 보다 바람직하게는 민물김을 알코올 또는 알코올 수용액으로 추출한 다음 농축 및 물에 현탁하고, 이를 헥산, 클로로포름, n-부탄올 및 물로 순차적으로 추출한 분획물일 수 있다. 더욱 바람직하게는 민물김을 에탄올 또는 에탄올 수용액으로 추출한 다음 농축 및 물에 현탁하고, 이를 클로로포름으로 분획한 분획물이다.

추출 또는 분획시 사용되는 용매는 사용되는 민물김 중량 대비 1~100배 부피를 사용할 수 있으며 상기 과정을 1~5회 반복하는 것도 가능하다.

또한, 상기 추출물 또는 분획물의 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 1일 이내에 추출 또는 분획하는 것이 바람직하며, 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기 등을 이용하여 통상적으로 사용되는 모든 추출 또는 분획방법, 예컨대, 가압 추출, 침지(냉침, 온침), 초음파 추출, 환류 추출법 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 추출물 또는 분획물은 상기 과정으로부터 얻은 추출 또는 분획액, 추출 또는 분획액의 희석액이나 농축액, 추출 또는 분획액의 건조물, 추출 또는 분획액의 조정제물이나 정제물, 또는 이들의 혼합물 등, 추출 또는 분획액 자체 및 이를 이용하여 형성 가능한 모든 제형의 추출물 또는 분획물을 포함한다.

상기 염증성 폐질환이란 폐렴(대엽성 폐렴, 소엽성 폐렴, 급성 괴사성 폐렴, 급성 간질성 폐렴), 만성 폐쇄성 폐질환, 폐농양 및 폐결핵 등과 같은 폐와 관련되어 염증반응으로 야기되는 질환을 의미한다.

상기 폐렴(pneumonia)이란 폐포 내 또는 간질내의 염증을 말하나 일반적으로 폐렴이라고 할 경우는 폐포 내에 염증성 삼출액이 출연하는 경우로서, 폐렴은 직접사인이 될 수 있는 기초 질환의 종류와 상관없이 사망 직전에 폐렴을 합병하는 경우가 많으며, 염증범위에 따라 대엽성과 기관지성 폐렴(소엽성 폐렴)으로 분류한다.

만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease)이란 유해한 입자나 가스의 흡입에 의해 폐에 비정상적인 염증 반응이 일어나면서 폐 기능 저하 및 호흡곤란을 유발하게 되는 호흡기 질환이다.

폐농양(lung abcess)은 조직의 액화 괴사를 동반한 화농성 염증으로, 기관지 폐렴의 합병증 또는 세균, 오염된 이물이 기관지를 통하여 들어왔을 때도 일어나기 쉽다. 발열, 체중감소, 곤봉지(clubbing of fingers), 냄새 나는 객담 및 기침 등과 백혈구 증가증, 글로불린 증가 등이 관찰된다.

폐결핵(pulmonary tuberculosis)은 마이크로박테리움 투버큘로시스(mycobacterium tuberculosis)에 의해 발병되며, 결핵균 중 인간형(human type)은 전염성이 있어 폐결핵 환자가 직접적인 감염원이 된다. 결핵에 의한 사망률은 BCG의 접종과 항결핵제의 보급 및 생활 수준의 향상 등에 의해서 현저하게 감소되었으나, 저개발 국가에 서는 아직도 많은 것으로 알려져 있다.

상기 염증성 폐질환은 공해, 호흡기 감염증, 흡연 등에 의하여 발생할 수 있으며, 특히 미세먼지에 의하여 발생한 염증성 폐질환일 수 있다.

상기 염증성 폐질환의 예방 또는 치료는 염증이 유발된 폐조직 또는 기관지폐포 세척액 내의 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10, IFN-γ 등 염증성 사이토카인의 농도를 감소시키거나 이들 염증성 사이토카인의 유전자 발현을 저감시키거나 면역세포의 이동을 억제하는 것일 수 있다.

상기 염증성 폐질환의 예방 또는 치료는 인산화된 p38, ERK, c-FOS, c-Jun의 단백질 발현을 감소시키는 것일 수 있으며, 이는 AP-1 신호전달 경로의 단백질들의 발현이 현저히 감소시키는 것일 수 있다.

상기 염증성 폐질환의 예방 또는 치료는 또한 면역세포의 폐조직으로의 이동을 억제하는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 적합한 형태로 제형화될 수 있다. “약학적으로 허용 가능”이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 또한, 상기 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로즈, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아라비아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미결정셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산프로필, 탈크, 스테아르산마그네슘 및 광물유를 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 안정화제, 결합제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 미결정셀룰로오스, 수크로스 또는 락토오스, 저치환도히드록시프로필셀룰로오스, 히프로멜로오스 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아르산마그네슘, 탈크 같은 활택제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 유동파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 상기 추출물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질과 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다.

본 발명에 개시된 추출물을 유효성분으로 포함하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여시간, 투여경로, 약물의 흡수, 분포 및 배설률, 사용되는 다른 약물의 종류 및 처방자의 판단 등에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 민물김 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

상기 건강기능식품은 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 또는 가공한 식품을 지칭하는 것으로, 예를 들어 건강보조식품, 기능성 식품, 영양제, 보조제 등을 모두 포함한다.

상기 민물김 추출물은 전체 건강기능식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001중량% 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001중량% 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001중량% 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 및 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명 민물김 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.

도 1은 민물김 에탄올 추출물 및 이의 각 분획물 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 세포생존률(A) 및 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포주에서 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)의 농도별 처리에 따른 RAW 264.7 세포의 세포생존률(A) 및 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포주에서 NO 생성 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포주에서 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)의 농도별 처리에 따른 INOS(A) 및 COX-2(B) 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포주에서 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)의 농도별 처리에 따른 TNF-α(A), IL-1β(B), IL-6(C), IL-10(D) 유전자의 발현 변화를 나타낸 그래프이다.
도 5는 LPS로 유도한 RAW 264.7 세포주에서 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)의 농도별 처리에 따른 AP-1 신호전달 경로의 단백질들의 발현 변화를 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 기관지폐포 세척액(BALF) 내 단백질 양(A) 및 적출된 폐조직의 건조중량(B)을 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 폐조직(Lung) 및 기관지폐포 세척액(Balf) 내의 IL-1β의 농도를 측정한 그래프이다.
도 8은 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 폐조직(Lung) 및 기관지폐포 세척액(Balf) 내의 IL-4의 농도를 측정한 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 폐조직(Lung) 및 기관지폐포 세척액(Balf) 내의 IL-6의 농도를 측정한 그래프이다.
도 10은 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 폐조직(Lung) 및 기관지폐포 세척액(Balf) 내의 IL-12의 농도를 측정한 그래프이다.
도 11은 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 폐조직(Lung) 및 기관지폐포 세척액(Balf) 내의 TNF-α의 농도를 측정한 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 폐조직(Lung) 및 기관지폐포 세척액(Balf) 내의 IFN-γ의 농도를 측정한 그래프이다.
도 13은 본 발명에 따른 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물 (Pj-EE-CF)을 농도 별로 급이 후 UPM1648a로 폐렴 유도된 ICR 마우스의 폐조직의 H&E 염색 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

< 실시예 1. 민물김 추출물 제조>

본 발명의 발명자들은 우리나라에서 유일하게 삼척시 소한계곡 1km내에서만 자생하는 귀중한 생물자원인 민물김의 생물학적 활성성분을 연구하면서 선행발명(출원번호 10-2020-0154950)을 통하여 각 분획물 중 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)이 염증관련 유전자 발현 수준을 억제하는 것을 확인하였으며, 특히 폐렴을 포함하는 염증성 폐질환에 효과적인 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 민물김(Prasiola japonica)은 삼척시에서 채취한 민물김을 사용하였다.

삼척시에서 채취한 민물김은 불순물들을 제거하기 위해 수돗물로 세척하였고, 70%[v/v] 에탄올을 이용하여 살균 처리 후, 증류수로 세척하여 동결 건조하였다. 동결 건조한 민물김을 곱게 파쇄하고, 파쇄된 민물김 100g에 80%[v/v] 에탄올 1ℓ을 넣고 실온에서 24시간 동안 침지시켰다. 이러한 과정을 3회 반복하여 얻은 추출액을 와트만 여과지(filter paper)로 여과시킨 후, 증발기(evaporator)를 이용하여 용매를 증발시켜 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)을 확보하였다.

상기 수득한 민물김 에탄올 추출물(Pj-EE)은 물에 용해시킨뒤 헥산을 넣어 녹아나오는 상층액을 따로 분리한 뒤 진공농축기를 이용하여 상층액에 포함된 용매를 제거시켰다. 용매가 제거되어 남아 있는 용매 분획물을 3번 반복하여 수득하여 헥산 분획물(Pj-EE-HF)을 제조하였다. 그 뒤 녹아나오지 않는 하층부 용액에 클로로포름을 넣고 상기 과정과 같은 과정을 통해 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF) 을 수득하였고, 이후 남아있는 침전용용액에 n-부탄올(Pj-EE-BF), 물(Pj-EE-WF)을 각각 순차적으로 넣어 분획물을 제작하였다. 수득한 각 분획물은 물과 혼합한 뒤, 진공 농축을 통해 용매를 증발시켜 제거한 다음, 남은 시료를 동결건조한 후, 용매(DMSO 또는 CMC)을 사용하여 소정의 농도로 녹여 사용하였다.

< 실시예 2. 민물김 추출물 분획물의 세포 생존률 및 NO생성에 미치는 효과 확인>

2.1 민물김 추출물 분획물에서의 RAW 264.7 세포의 세포 생존률 확인

RAW 264.7 세포에서 민물김 에탄올 추출물 및 각 분획물의 세포 독성 여부를 확인하고자, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 실시하였다. RAW 264.7 세포 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin) 및 100 IU/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

배양한 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 민물김 에탄올 추출물(Pi-EE) 및 민물김 에탄올 추출물의 헥산 분획물(Pj-EE-HF), 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF), n-부탄올 분획물(Pj-EE-BF) 및 물 분획물(Pj-EE-WF)을 50 ㎍/㎖ 가 되도록 시료 50㎕씩 각 웰에 처리하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 상기 배양액의 상등액 100㎕를 제거하고, 5㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 10㎕씩 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응하였다. 이 후 반응액을 제거하고 각 웰 당 반응정지 용액(10% SDS in 0.1N HCl) 100㎕를 가하여 24시간 동안 반응한 뒤, 570㎚에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 1A에 나타내었다. 이 때, 아무것도 처리하지 않은 RAW 264.7 세포의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여, 시료를 처리한 세포의 생존율을 계산하였다.

도 1A에서 보는 바와 같이, 민물김 에탄올 추출물 및 민물김 에탄올 추출물의 헥산 분획물(Pj-EE-HF), 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF), n-부탄올 분획물(Pj-EE-BF)은 모두 50 ㎍/㎖ 처리 시까지 세포 독성을 나타내지 않았으며, 물 분획물(Pj-EE-WF)에서 80% 이상의 세포 생존률을 나타내었다.

2.2 민물김 추출물 분획물의 NO생성에 미치는 효과 확인

RAW 264.7 세포에서 민물김 추출물의 NO 생성에 미치는 효과를 확인하였다. 상기 실시예 4에서 배양한 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 민물김 에탄올 추출물(Pi-EE) 및 민물김 에탄올 추출물의 헥산 분획물(Pj-EE-HF), 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF), n-부탄올 분획물(Pj-EE-BF) 및 물 분획물(Pj-EE-WF)을 50 ㎍/㎖ 가 되도록 시료 50㎕씩 각 웰에 처리하고, 30분간 배양한 다음, RAW 264.7 세포의 염증반응을 유도하는 LPS(lipopolysaccharide)를 최종 농도가 1㎎/㎖가 되도록 50㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 새로운 96웰 플레이트에 상기 세포 배양액의 상등액 100㎕과 NO의 양을 정량할 수 있는 Griess 용액(0.5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H3PO4) 100㎕를 더한 다음 570㎚에서의 흡광도를 측정하여 NO 생성능을 분석하고 이를 도 1B에 나타내었다.

도 1B에서 보는 바와 같이, 염증이 유발된 대식세포인 RAW 264.7 세포에 본 발명의 이후 민물김 에탄올 추출물(Pi-EE) 및 민물김 에탄올 추출물의 헥산 분획물(Pj-EE-HF), 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF), n-부탄올 분획물(Pj-EE-BF), 물 분획물(Pj-EE-WF)을 처리하는 경우, 민물김 에탄올 추출물(Pi-EE)은 염증이 유발된 대식세포 RAW 264.7 세포의 증가된 NO 생성을 감소시켰으며, 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 LPS에 의하여 증가된 NO 생성을 약 75% 감소시켰다. 이는 민물김 에탄올 추출물 중 클로로포름에 의하여 용해되어 농축된 유효 성분이 염증이 유발로 인한 NO 생성량을 현저히 감소시키는 것으로 볼 수 있다.

< 실시예 3. 민물김 추출물 클로로포름 분획물의 세포 생존률 및 NO생성에 미치는 효과 확인>

3.1 민물김 추출물 클로로포름 분획물에서의 RAW 264.7 세포의 세포 생존률 확인

민물김 추출물 클로로포름 분획물의 세포 독성 여부를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포에서 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물의 세포 생존률을 확인하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 실시하였다. RAW 264.7 세포 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린(penicillin) 및 100 IU/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)을 첨가한 RPMI 1640(Roswell Park Memorial Institute) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다.

배양한 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)을 0, 12.5, 25, 50, 100, 200 ㎍/㎖ 가 되도록 시료 100㎕씩 각 웰에 처리하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후에 상기 배양액의 상등액 100㎕를 제거하고, 5㎎/㎖ 농도의 MTT 용액을 10㎕씩 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 반응하였다. 이 후 반응액을 제거하고 각 웰 당 반응정지 용액(10% SDS in 0.1N HCl) 100㎕를 가하여 24시간 동안 반응한 뒤, 570㎚에서 흡광도를 측정하여 그 결과를 도 2A에 나타내었다. 이 때, 아무것도 처리하지 않은 RAW 264.7 세포의 세포 생존율을 100% 기준으로 하여, 시료를 처리한 세포의 생존율을 계산하였다.

도 2A에서 보는 바와 같이, 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 25 ㎍/㎖ 처리 시까지 세포 독성을 나타내지 않았으며, 50 ㎍/㎖에서 90% 이상의 세포 생존률을 나타내었다. 따라서, 이후 실험은 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF) 농도를 최대 50 ㎍/㎖로 하여 실험을 수행하였다.

3.2 민물김 에탄올 추출물 클로로포름 분획물의 LPS 유도 RAW 264.7 세포주에서 산화질소 생성 억제 효과 확인

RAW 264.7 세포에서 에탄올 추출물 클로로포름 분획물의 NO 생성에 미치는 효과를 확인하였다. 상기 실시예 4에서 배양한 RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁵개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 18시간 동안 배양하였다. 이후 농도별로 민물김 에탄올 추출물 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF) 50㎕씩 각 웰에 처리하고 30분간 배양한 다음, RAW 264.7 세포의 염증반응을 유도하는 LPS(lipopolysaccharide)를 최종 농도가 1㎎/㎖가 되도록 50㎕씩 첨가하여 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 새로운 96웰 플레이트에 상기 세포 배양액의 상등액 100㎕과 NO의 양을 정량할 수 있는 Griess 용액(0.5% naphthylethylenediamine dihydrochloride, 5% sulfanilamide, 25% H3PO4) 100㎕를 더한 다음 570㎚에서의 흡광도를 측정하여 NO 생성능을 분석하고 이를 도 2B에 나타내었다.

도 2B에서 보는 바와 같이, 염증이 유발된 대식세포인 RAW 264.7 세포에 본 발명의 Pj-EE-CF 을 처리하는 경우 농도 의존적으로 염증 물질인 NO 생성량이 감소하는 것을 확인하였다.

< 실시예 4. 민물김 추출물의 LPS 유도 RAW 264.7 세포주에서 iNOS 및 COX-2 발현량에 미치는 효과 확인>

대식세포는 선천면역뿐만 아니라 획득 면역 등 다양한 숙주 반응에 관여하여 항상성 유지에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 대식세포는 iNOS에 의해서 만들어지는 일산화질소(NO)와 COX-2에 의해 과량 만들어지는 prostaglandin E2 (PGE2) 등과 같은 염증촉진 인자들을 생성하는 것으로 알려져 있다. 쥐의 대식세포주인 따라서 RAW 264.7 세포에서 민물김 추출물의 iNOS 및 COX-2 발현량에 미치는 효과를 확인하였다.

RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁶개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양한 후, 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)을 농도별(0, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 처리하여 30분 뒤 LPS ㎍/㎖이 되도록 각 웰에 처리하고 24시간 배양하였다. 이 후 trizol을 이용하여 세포를 용해 시킨뒤, cDNA synthesis kit (K1621, thermo)를 이용하여 cDNA 를 합성하고 real time PCR 분석을 통해 세포내 iNOS(inducible nitric oxide synthase) 및 COX-2(cyclooxygenase-2) 유전자 발현을 측정하여 도 3A 및 도 3B에 나타내었다.

도 3A 및 도 3B에서 보는 바와 같이, 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 유전자 발현을 억제하였다. 따라서 상기 실험을 통하여 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 항염활성을 갖는 것을 확인하였다.

< 실시예 5. 민물김 추출물의 LPS 유도 RAW 264.7 세포주에서 염증 관련 사이토카인 유전자 발현에 미치는 효과>

쥐의 대식세포주인 따라서 RAW 264.7 세포에서 민물김 추출물의 염증 관련 사이토카인 유전자 발현에 미치는 효과를 확인하였다. RAW 264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×10⁶개의 세포가 되도록 100㎕씩 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양한 후, 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)을 농도별(0, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖)로 처리하고 30분 뒤 LPS ㎍/㎖이 되도록 각 웰에 처리하고 24시간 배양하였다. 이 후 trizol을 이용하여 세포를 용해 시킨뒤, cDNA synthesis kit (K1621, thermo)를 이용하여 cDNA 를 합성하고 real time PCR 분석을 통해 세포내 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 IL-10의 유전자 발현 변화를 측정하여 도 4A 내지 도 4D에 나타내었다.

도 4A 내지 도 4D에 서 보는 바와 같이, TNF-α(도 4A), IL-1β(도 4B), IL-6(도 4C) 및 IL-10(도 4D)는 모두 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF) 농도 의존적으로 유전자 발현이 억제되었다. 따라서 상기 실험을 통하여 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 항염활성을 갖는 것을 확인하였다.

< 실시예 6. 민물김 추출물의 LPS 유도 RAW 264.7 세포주에서 염증 신호전달 경로 단백질의 발현에 미치는 효과 확인>

배양한 RAW 264.7 세포를 10% FBS(fetal bovine serum)와 1% 페니실린/스트렙토마이신(100 IU/㎖)을 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하여 플레이트(30㎜)에 웰 당 2×10⁶개의 세포가 되도록 분주하고, 37℃, 5% CO₂조건에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, Pj-EE-CF을 0, 12.5, 25, 50 ㎍/㎖가 되도록 처리한 다음 37℃, 5% CO₂조건에서 30분간 배양하였다. 여기에 RAW 264.7 세포의 염증반응을 유도하는 LPS(lipopolysaccharide)를 최종 농도가 1㎎/㎖가 되도록 첨가하고 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 2회 세척하고 PBS를 완전히 제거한 후 세포 용해 및 염색 시약인 RIPA 버퍼 200㎕를 처리하였다. 그 다음 BCA assay로 단백질을 정량한 후 10% SDS-PAGE를 이용하여 전기영동을 수행하였다. 전기영동한 SDS-PAGE 젤의 단백질을 PVDF 막으로 이동시킨 후, 단백질 이동이 완료된 PVDF 막을 상온에서 TBS-T(in 100mM NaCl, 10mM Tris, 0.1%(v/v) Tween-20, pH 7.4 (PBST)containing 3% BSA)로 블록킹하였다. 그 다음 TBS-T를 사용하여 10분간 3회 세척한 후, 3% BSA를 녹인 TBS-T에 1차 항체를 1시간 처리하고, TBS-T로 충분히 세척하였다. 그리고 2차 항체를 1시간 동안 처리하고 PBS-T로 10분씩 3회 세척하였다. 그 다음 ECL detection system을 사용하여 염증 질환 관련 인자인 c-Jun, c-FOS, ERK, JNK, p38 및 이들의 인산화된 단백질 발현을 확인하고 그 결과를 도 5에 나타내었다. 단백질 양의 보정은 PVDF 막을 재활용(stripping)하여 액틴 단백질의 양을 확인함으로써 동량임을 확인하였으며, 각각의 항체는 Cell signaling 및 Santacruz에서 구입하였다.

도 5에서 보는 바와 같이, LPS에 의하여 염증이 유발된 대식세포는 인산화된 c-Jun, c-FOS, ERK, p38의 단백질 발현이 증가하였으며, 이는 본 발명의 Pj-EE-CF 을 처리하는 경우, 그 발현 이 감소하였다.

상기 결과를 통하여 본 발명 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 인산화된 p38, ERK, c-FOS, c-Jun의 단백질 발현을 감소시킴으로써 염증 신호전달 경로 단백질 발현을 억제하고 이를 통해 염증 반응이 감소됨을 확인하였으며, 특히 AP-1 신호전달 경로의 단백질들의 발현이 현저히 감소함을 확인함으로써 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 ap-1을 하향조절하여 항염증효과를 나타냄을 확인하였다. 이로부터 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물(Pj-EE-CF)은 항염증용 조성물로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

< 실시예 7. 폐렴 유도 동물 모델에서 민물김 추출물의 효과 확인>

7.1 UPM1648a(실험용미세먼지)를 이용한 폐렴 유도 동물 모델 제작

민물김 추출물의 염증성 폐질환에 대한 효과를 확인하기 위하여 도시미세먼지(Urban particiulate matter, UPM1648a)를 이용한 폐렴 유도 동물 모델 확립하였다. 8주령 ICR 마우스를 이용하여 UPM1648a (실험용미세먼지)(sigma NIST1648A)를 코로 50mg/ml 농도로 각각 10ul 씩 주입하여 폐렴을 유도하고 12 시간 후, 폐렴이 유도된 쥐를 안락사 시킨 뒤 폐를 적출하고 적출된 폐조직에서 기관지폐포 세척액(BALF)를 추출하여 Bradford 법으로 단백질의 농도를 측정하였다. 염증이 진행되면 기관지폐포 세척액 내에 사이토카인 및 염증성 단백질 등의 증가로 단백질 총량이 증가하게 된다. 측정결과 미세먼지를 주입한 쥐에서 단백질 총량이 증가한 것을 확인함으로써 폐렴 유도된 동물 모델을 확립하였다(도 6A).

7.2 민물김 추출물의 폐렴 유도 동물 모델의 폐조직 내 기관지폐포 세척액 내 단백질 총량에 대한 효과 확인

폐렴 유도된 동물 모델에서 민물김 추출물의 염증성 폐질환에 대한 효과를 확인하였다. 8주령ICR 마우스를 이용하여 2주동안 1회/1일 본 발명에 따른 Pj-EE-CF을 농도 별로 0, 25, 50, 100 ㎎/㎏이 되도록 먹인 뒤 UPM1648a를 코로 50mg/ml 농도로 각각 10ul 씩 주입하여 폐렴을 유도하였다. 12 시간 후, 폐렴이 유도된 쥐를 안락사시킨 뒤, 폐를 적출하고 적출된 폐조직에서 기관지폐포 세척액(BALF)를 추출하여 단백질의 농도를 측정하여 도 6A에 나타내었다.

도 6A에서 보는 바와 같이, 민물김에탄올추출-클로로포름 분획물이 폐 염증을 완화시킴을 확인하였다.

7.3 민물김 추출물의 폐렴 유도 동물 모델의 폐조직의 건조중량에 대한 효과 확인

폐렴이 유도되면, 폐 조직 내에 점액질 및 사이토카인 등의 분비가 증가하여 폐조직이 건조중량이 증가하게 된다. 폐렴 유도 동물 모델의 폐조직에서 본 발명의 민물김 추출물이 건조중량에 미치는 효과를 확인하였다. 8주령 ICR 마우스를 이용하여 2주동안 1회/1일 본 발명에 따른 Pj-EE-CF을 농도 별로 0, 25, 50, 100 ㎎/㎏이 되도록 먹인 뒤 UPM1648a를 코로 50mg/ml 농도로 각각 10ul 씩 주입하여 폐렴을 유도하였다. 12 시간 후, 폐렴이 유도된 쥐를 안락사시킨 뒤, 폐를 적출하고 적출된 폐조직의 건조중량을 측정하여 도 6B에 나타내었다.

도 6B에서 보는 바와 같이, 민물김에탄올추출-클로로포름 분획물은 폐렴 유도에 의하여 증가된 폐조직의 건조중량을 감소시켰다.

<실시예 8. 민물김 추출물의 폐렴 유도 동물 모델의 폐조직의 사이토카인 농도에 미치는 효과 확인>

8주령ICR 마우스를 이용하여 2주동안 1회/1일 시료를 각 농도 별로 0, 25, 50, 100 ㎎/㎏이 되도록 먹인 뒤 UPM1648a를 코로 50mg/ml 농도로 각각 10ul 씩 주입하여 폐렴을 유도하였다. 12 시간 후, 폐렴이 유도된 쥐를 안락사시킨 뒤, 폐를 적출하고 적출된 폐조직(Lung) 및 기관지세포 세척액(Balf)에서 IL-1β ELISA kit(R&D system MLB00C), IL-4 ELISA kit(R&D system M4000B), IL-6 ELISA kit(R&D system M6000B), IL-12 ELISA kit(R&D system M1270), TNF-α ELISA kit(R&D system MTA00B) 및 IFN-γ ELISA kit(R&D system MIF00)를 이용하여 각 사이토카인의 농도를 분석하여 도 7 내지 도 12에 나타내었다.

도 7 내지 도 12에서 보는 바와 같이, IL-1β, IL-6, IL-12, TNF-α 및 IFN-γ는 각각 폐조직(Lung) 및 기관지세포 세척액(Balf)에서 농도 의존적으로 감소하였으며, IL-4의 경우, 기관지세포 세척액(Balf)에서만 UPM1648a 에 의해 증가된 IL-4 의 양이 감소된 것을 확인하였다.

< 실시예 9. 민물김 추출물의 폐렴 유도 동물 모델의 면역세포 이동에 미치는 효과 확인>

폐에 염증이 진행되면 NK세포, T세포, B세포, 수지상세포 등 면역관련 세포(이하 면역세포)가 폐조직으로 이동하게 된다. 8주령 ICR 마우스를 이용하여 2주동안 1회/1일 본 발명에 따른 Pj-EE-CF을 농도 별로 0, 25, 50, 100 ㎎/㎏이 되도록 먹인 뒤 UPM1648a를 코로 50mg/ml 농도로 각각 10ul 씩 주입하여 폐렴을 유도하였다. 12 시간 후, 폐렴이 유도된 쥐를 안락사시킨 뒤, 폐를 적출하고, 적출된 폐조직을 고정액(3.6~4% formaldehyde)에 3일 간 고정시킨 뒤 파라핀 블록을 제작하였다. 제작된 파라핀 블록을 슬라이스하여 H&E 염색을 진행하고 그 결과를 도 13에 나타내었다.

도 13에서 보는 바와 같이, UPM1648a를 처리한 폐렴 유도된 폐조직에서는 보라색으로 염색된 세포핵이 폐렴 유도되지 않은 폐조직보다 선명하게 확인되어 면역세포들이 폐조직으로 이동한 것을 확인하였으며, 본 발명에 따른 Pj-EE-CF 농도 의존적으로 대조군과 유사하게 면역세포의 이동이 감소함을 확인함으로써 폐조직 내에서 본 발명에 따른 Pj-EE-CF이 항염증 효과가 있음을 확인하였다.

< 제제예 1. 정제의 제조>

본 발명 민물김 추출물 또는 분획물 20g을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

< 제제예 2. 캡슐제의 제조>

본 발명 민물김 추출물 또는 분획물 100㎎, 옥수수전분 100㎎, 유당 100㎎ 및 스테아린산 마그네슘 2㎎을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

< 제제예 3. 주사제의 제조>

본 발명 민물김 추출물 또는 분획물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

< 제제예 4. 건강기능식품의 제조>

제제예 4-1. 건강기능식품의 제조

본 발명의 민물김 추출물 또는 분획물 2g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.

제제예 4-2. 건강기능성 음료의 제조

본 발명의 민물김 추출물 또는 분획물 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.

Claims

민물김(Prasiola japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 민물김의 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, n-부탄올 및 물로 순차적으로 추출하여 수득한 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물인 것을 특징으로 하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서
상기 염증성 폐질환은 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 만성세기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것인 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 폐질환은 미세먼지에 의하여 유도 염증성 폐질환인 것을 특징으로 하는 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 폐질환의 예방 또는 치료는 인산화된 p38, ERK, c-FOS, c-Jun의 단백질 발현을 감소시키는 것임을 특징으로 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 폐질환의 예방 또는 치료는 폐조직 또는 기관지폐포 세척액 내의 염증성 사이토카인의 농도를 감소시키며, 상기 염증성 사이토카인은 TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-10 및 IFN-γ로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 폐질환의 예방 또는 치료는 p-p38, p-ERK, p-c-FOS 및 p-c-Jun로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질 발현을 감소시키는 것임을 특징으로 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 염증성 폐질환의 예방 또는 치료는 면역세포의 폐조직으로의 이동을 억제하는 것임을 특징으로 염증성 폐질환의 예방 또는 치료용 조성물.
민물김(Prasiola japonica) 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증성 폐질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제9항에 있어서,
상기 민물김 추출물은 민물김의 에탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, n-부탄올 및 물로 순차적으로 추출하여 수득한 민물김 에탄올 추출물의 클로로포름 분획물인 것을 특징으로 하는 염증성 폐질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제9항에 있어서,
상기 염증성 폐질환은 폐렴, 천식, 만성 기관지염, 만성세기관지염, 진폐증, 결핵, 폐기종 및 낭포성 섬유증 중 어느 하나인 것인 염증성 폐질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.