CN108347928A - 包含黄腐酚的抗微生物剂及其在食物产品中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及食物防腐的领域，更具体地涉及包含黄腐酚的组合物，组合物作为抗微生物剂与其他抗微生物剂结合用在食物防腐中。特别地，本发明提供包含黄腐酚和另外的抗微生物剂的组合物作为抗乳酸菌的抗微生物组合物的用途。本发明还涵盖这种组合物和包含这种组合物的食物产品。

Description

包含黄腐酚的抗微生物剂及其在食物产品中的用途
技术领域
本发明涉及包含黄腐酚(xanthohumol)和第二或另外的微生物剂的组合物作为抗乳酸菌和/或霉菌的抗微生物组合物的用途。本发明还涉及所述组合物本身及其在食物产品中作为抗乳酸菌和/或霉菌的抗微生物组合物的用途。本发明还涉及包含所述抗微生物组合物的食物产品。
背景技术
食物产品和饮品容易生长腐败微生物，很多时候这会限制这些产品的货架期(shelf life)并对消费者造成健康问题的威胁。实际上，在食物行业中，在例如新鲜肉类、禽肉、鱼肉、加工肉类、熟肉、腌肉、腌鱼、焙烤产品、蛋糕、即食餐食、(烹饪)酱料、熟食沙拉、点心、预加工食物或液态食物的加工和储存方面，微生物食物腐败并因此消费者安全是关注重点。微生物生长会缩短这些产品的货架期，在所述产品的生产、储存和分销期间，防止污染和腐败是要求很高的任务。
在肉类和预制食物中，引起关注的其中一种类型的腐败菌是乳酸菌(乳杆菌目(Lactobacillales)，LAB)，即，细菌的乳杆菌(Lactobacillus)属的成员。现今，现代的食物生产过程包括气调包装，气调包装使用提高的二氧化碳水平抑制微生物的生长。很遗憾，乳酸菌不易受二氧化碳影响。此外，属于乳杆菌目的成员诸如寡发酵乳杆菌(Lactobacillusoligofermentans)和明串珠菌(Leuconostoc gasicomitatum)都是抗寒乳酸菌。这严重限制了例如新鲜产品诸如肉类的冷链储存的效用。
经常引起食物腐败的其他类微生物是霉菌。虽然有些霉菌是某些食物产品的必要部分，但霉菌的生长经常使食物产品产生浓烈的异味并且外表恶化，致使食物产品不适合人类食用。此外，有些霉菌能产生有毒代谢物，称为霉菌毒素，霉菌毒素与许多人类疾病相关，从胃肠疾病到癌症。
为了充分防止食物腐败，食物行业中使用各种方法和(人造)防腐剂防止微生物污染或抑制微生物生长。然而，这些防腐剂通常本质上是合成的，例如亚硝酸盐、苯甲酸盐、山梨酸钾等。此外，可能使食物产品产生异味的若干防腐剂以及在食物中使用这些化合物随之而来的健康问题很大程度上削弱了其效用。消费者对于防腐剂的来源也变得越来越挑剔，而且不太愿意消费其中已经使用了非天然防腐剂的食物产品。
因此，仍需要有效防止或抑制乳酸杆菌和霉菌生长的抗微生物剂，其产生较弱的异味或不产生异味而且其是源自天然来源的抗微生物剂。
发明内容
本发明的第一方面涉及组合物作为抗乳酸菌和/或抗霉菌的抗微生物剂的用途，其中该组合物包含具有分子式(1)的作为第一抗微生物剂的黄腐酚，
或其盐，以及第二或另外的微生物剂。
本发明人意外地发现包含黄腐酚的组合物抗乳酸菌和霉菌非常有效。此外，由于黄腐酚源自蛇麻(啤酒花，Humulus lupulus)(通常称为忽布(hop))的花穗，因此它被视为天然产品。这是有利的，因为消费者变得越来越关心非天然成分在食物中的使用。发明人还发现，与其他抗微生物剂结合得以显著减少引起食物腐败的微生物的生长，特别是乳酸菌和霉菌。
本发明的第二方面涉及适合用在食物产品中的抗微生物组合物，该抗微生物组合物包含：
-按重量计0.001至50％的黄腐酚，或其盐，具有分子式(1)；以及
-按重量计0.01至20％的至少一种另外的抗微生物剂。
还发现黄腐酚与其他抗微生物剂结合使用是有利的。发明人发现，黄腐酚与其他抗微生物剂结合使用造成引起食物腐败的微生物的生长显著减少，特别是乳酸菌和霉菌。
本发明的第三方面涉及所述抗微生物组合物在食物产品中作为抗乳酸菌和/或霉菌的抗微生物剂的用途。
本发明的第四方面涉及包含所述抗微生物组合物的食物产品。
定义
本文所用术语“抗微生物剂(antimicrobial agent)”或“抗微生物(antimicrobial)”具有其常规含义，指抑制或防止食物产品上或附近的微生物生长并能杀死食物产品上或附近的微生物的剂。
本文所用术语“乳酸菌”具有其常规含义，指革兰氏阳性菌，其产生作为糖类发酵的主要代谢终产物的乳酸。乳酸菌的主属是乳杆菌属(Lactobacillus)。
本文所用术语“霉菌(mold)”或“霉菌(mould)”可以互换，具有其常规含义，指丝状真菌。
本文所用术语“最低抑菌浓度”或“MIC”具有其常规含义，可以用例如按重量计％或以mg/ml或百万分率(ppm)表示，指抗微生物剂抑制或杀死微生物的最低浓度，评估为对过夜孵育后微生物的体外可见生长的抑制。
附图说明
图1丙酸钙和/或黄腐酚对罗克福尔青霉菌(P.roquefortii)的抑制。
图2丙酸钙和/或黄腐酚对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的抑制。
图3丙酸钙和/或黄腐酚对多变拟青霉(P.variotii)的抑制。
图4丙酸钙和/或黄腐酚对黄曲霉(A.flavus)的抑制。
图5丙酸钙和/或黄腐酚对密丛毛霉(M.plumbeus)的抑制。
具体实施方式
本发明的第一方面涉及组合物作为抗乳酸菌和/或抗霉菌的抗微生物剂的用途，其中组合物包含具有分子式(1)的作为第一抗微生物剂的黄腐酚，
或其盐，以及第二或另外的微生物剂。优选地，根据本发明的组合物在食物产品中用作抗微生物剂。
本发明人发现，当组合物包含黄腐酚或其盐结合第二或另外的抗微生物剂、优选抗真菌剂、优选抗霉剂和/或抗酵母剂和/或对抗LAB有活性的剂时，得到特别好的效果。不欲束缚于任何理论，假设通过不同剂对同一腐败微生物进行多重攻击会防止微生物从这种攻击中恢复的可能性。特别有利的是使用利用不同生物机制攻击所述微生物的抗微生物剂。
第二或另外的抗微生物剂优选地为包含丙酸盐、可选地还有其他有机酸或其盐诸如乳酸和乙酸的丙酸杆菌属(Propionibacterium)发酵糖组合物。第二或另外的抗微生物剂还可以是肉桂酸或其可食用盐，诸如肉桂酸钾。香柏油或有机酸诸如丙酸、乳酸或乙酸或其盐、优选地丙酸钙也可以用作第二或另外的抗微生物剂。在这点上，要注意的是任何上述剂的组合也可以与包含黄腐酚的剂结合使用。
黄腐酚可以从蛇麻(大麻科(Cannabaceae))的树脂类雌性花序中获得，其通常称为忽布花穗或球果，由于其苦涩芳香的性质，主要在酿造工业中使用。黄腐酚是新鲜忽布中最丰富的异戊烯基黄酮，通过熟知的提取技术可以从中取出。
在本领域中，已经描述了将黄腐酚用作抗生物膜剂防止在食物加工设备中生长细菌。关于此，参考Rozalski等人在BioMed Research International,2013pp.1-7的文章。然而，现在惊人地发现，黄腐酚不仅可以在食物加工设备中用作抗细菌的抗生物膜剂，还可以与其他抗微生物剂结合用作抗乳酸菌和霉菌的抗微生物剂。
具体地，发现黄腐酚可以在食物产品中用作抗微生物剂，优选地在新鲜肉类、禽肉、鱼肉、熟肉、即食餐食、酱料、点心、面包、焙烤产品或液态食物中用作抗微生物剂。
此外，由于黄腐酚源自蛇麻的花穗，因此它被视为天然产品。这是有利的，因为消费者变得越来越关心非天然成分在食物中的使用。
虽然在有些食物产品中，生长乳酸菌是有意为之的，但许多食物产品中应避免生长乳酸菌，因为乳酸菌会产生异味和/或限制食物产品的货架期。利用本发明的组合物，现在可以有效地防止或抑制乳酸菌的生长，无需使用非天然抗微生物剂。
根据本发明的组合物优选地用作抗食物产品中常见的乳酸菌的抗微生物剂，乳酸菌诸如嗜酸乳杆菌(Lactobacillus adidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、森基乳杆菌(Lactobacillus sunkii)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteriodes)，优选嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、香肠乳杆菌、森基乳杆菌(Lactobacillussunkii)、肠膜明串珠菌。
还发现，根据本发明的包含黄腐酚的组合物还可以用于抑制或防止霉菌的生长。与乳酸菌一样，有些食物产品在其中生长霉菌认为是有益的。然而，在许多食物产品中应防止生长霉菌，因为霉菌对所述食物产品的口味和外观有不利影响。
根据本发明的组合物优选地用作抗来自曲霉属(Aspergillus)或青霉菌属(Penicillium)的霉菌的抗微生物剂。优选地，根据本发明的组合物用于抗以下霉菌或其组合：密丛毛霉(Mucor plumbeus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillusniger)、多变拟青霉(Paecilomyces variotii)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黑根霉(Rhizopus stolonifer)、罗克福尔青霉菌(Penicillium roqueforti)。更优选地，根据本发明的组合物用于抗以下霉菌或其组合：密丛毛霉、黄曲霉、多变拟青霉、尖孢镰刀菌、罗克福尔青霉菌。
蛇麻(通常称为“忽布”)的花穗是黄腐酚的丰富来源。市场上可以买到包含黄腐酚的忽布提取物，然而，之前没有报道过其作为抗微生物剂抗乳酸菌和/或霉菌的用途。之前也未报道过黄腐酚提取物可以用作抗食物产品中存在的乳酸菌和霉菌的抗微生物剂。
因此，在一种实施方式中，本发明涉及根据本发明的包含黄腐酚的抗微生物的组合物的用途，其中，该组合物包含蛇麻提取物，该提取物以干重算包含按重量计至少5％的黄腐酚，优选地按重量计至少50％的黄腐酚，最优选地按重量计至少80％的黄腐酚。
本发明的组合物中使用的蛇麻提取物优选为水提取物，其制备通过首先通过对例如忽布(蛇麻的花穗)进行超临界二氧化碳提取法和/或乙醇提取法制备蛇麻提取物。这些方法是本领域公知的，如在上文提及的Rozalski等人2013年的文章所述的。在进一步的步骤中，用这些方法中的一者或两者得到的提取物在60℃或更高的温度下经受水提取。其中有黄腐酚的水提取物可以直接用作抗微生物剂，然而，还可以对所述提取物进行浓缩或者甚至进行干燥。
适合应用于本发明的各方面的典型可市购的蛇麻提取物是在硅藻土上从忽布中分离出的黄黄素提取物(Xantho-Flav Extract)(Hopsteiner,Simon H.Steiner,Hopfen,GmbH，美因堡，德国)。
本发明的组合物中黄腐酚的总量优选地按重量计在0.001至50％之间。更优选地，本发明的组合物中黄腐酚的量按重量计在0.005％至20％之间，最优选地按重量计在0.01％至10％之间。
对于根据本发明的包含黄腐酚的抗微生物组合物的大部分目前可预见的实际应用中，方便的是将所述组合物配制为可倾倒的制剂，例如制剂中包含稀释剂，优选水、乙醇、油、丙二醇，更优选水、丙二醇。此外，在本发明的抗微生物组合物中掺入稀释剂诸如例如水和/或丙二醇使得能更方便并准确地调节例如黄腐酚以及可选地包含在所述组合物中的一种或多种另外的抗微生物剂的浓度。
因此，在实施方式中，本发明提供包含黄腐酚的抗微生物组合物的用途，其中，组合物包含按重量计至少1％的稀释剂，优选水、乙醇、油、丙二醇，更优选水和/或丙二醇。
根据本发明的抗微生物组合物优选地用于延长食物、食物产品、预加工食物和预制食物——通常称为“食物产品”——的货架期。
通常因其容易被乳酸菌污染和/或被霉菌污染而为人所知的食物产品特别是，新鲜肉类、禽肉、鱼肉、加工肉类、腌肉、熟肉、即食餐食、(烹饪)酱料、熟食沙拉、蛋黄酱沙拉、谷物棒、(浓缩)肉汁、点心和液态食物、果汁、不含二氧化碳的饮品、焙烤产品、蛋糕、蘸料、涂抹酱、食物馅料、食物填陷和餐食成分。优选地，根据本发明的包含黄腐酚的抗微生物组合物因此用于保存这些食物产品并防止它们腐败。
因此，根据本发明的抗微生物组合物优选地在食物产品中用作抗微生物剂，优选地在新鲜肉类、禽肉、鱼肉、熟肉、即食餐食、酱料、点心、面包、焙烤产品或液态食物中用作抗微生物剂。
其中使用本发明的组合物作为抗乳酸菌或霉菌的抗微生物剂的食物产品优选地包含按重量计0.00010至0.05％、优选地按重量计从0.001至0.01％的黄腐酚或其可食用盐。已经发现这些浓度的黄腐酚有效地抑制或防止乳酸菌和/或霉菌的生长。
对于此，本发明的第二方面涉及适合用在食物产品中的抗微生物组合物，该抗微生物组合物包含：
-按重量计0.001至50％的黄腐酚或其盐，具有分子式(1)；以及
-按重量计0.01至20％的至少一种另外的抗微生物剂。
试验表明，当与第二或另外的抗微生物剂结合时，用黄腐酚对食物产品进行抗微生物处理的功效提高。不欲束缚于任何理论，假设通过不同剂对同一腐败微生物进行多重攻击会防止微生物从这种攻击中恢复的可能性。特别有利的是使用利用不同生物机制攻击所述微生物的抗微生物剂。
在本发明的优选实施方式中，第二或另外的抗微生物剂是抗真菌剂，优选抗霉菌剂或抗酵母剂和/或对抗LAB有活性的剂。
将黄腐酚与其他抗微生物剂结合的其他原因是只需使用一种抗微生物组合物就可以避免特定食物产品中生长不同的微生物。例如，公知的是某些产品诸如新鲜肉类或焙烤产品的食物腐败是由不同的微生物引起的。因此，有利的是将有效抗乳酸菌和/或霉菌的黄腐酚与其他抗微生物剂结合使用。
如上所述，包含黄腐酚的本组合物特别适合作为抗来自曲霉属或青霉菌属下的霉菌的抗微生物剂，特别是以下霉菌：密丛毛霉、黄曲霉、黑曲霉、多变拟青霉、尖孢镰刀菌、黑根霉、罗克福尔青霉菌，更特别地抗密丛毛霉、黄曲霉、多变拟青霉、尖孢镰刀菌、罗克福尔青霉菌。
此外，包含黄腐酚的本组合物还特别适合作为抗乳酸菌的抗微生物剂，乳酸菌诸如：嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、香肠乳杆菌、森基乳杆菌(Lactobacillus sunkii)、食果糖乳杆菌、肠膜明串珠菌。
优选地，另外的抗微生物剂选自：包含丙酸盐和乙酸盐的丙酸杆菌属发酵糖组合物；肉桂酸或其盐，优选肉桂酸钾；香柏油；或有机酸，诸如丙酸、乳酸或乙酸或其任何盐，优选丙酸钙；或任何这些剂的组合。
对于肉桂酸及其盐例如肉桂酸钾(“Kcin”)，要注意其是具有抗微生物活性的天然产品。在文献中，已描述了其在抗微生物组合物中用作唯一的抗微生物剂。因此，根据本发明，将黄腐酚与肉桂酸或其盐特别是Kcin结合使用是有利的。
还已报道Kcin与香草醛结合在相对较低的浓度对抑制霉菌生长就已有积极作用。因此，在可替换的实施方式中，本发明的组合物包含有效量的黄腐酚、香草醛和肉桂酸或其盐，诸如Kcin。
虽然各种有机酸及其盐的抗微生物活性是本领域已知的，但惊人地发现将黄腐酚与有机酸诸如丙酸、乳酸或乙酸结合会导致显著抑制霉菌的生长。因此，根据本发明的抗微生物组合物优选地包含黄腐酚以及一种或多种有机酸，优选丙酸或其盐，诸如丙酸钙。
还发现，将黄腐酚与丙酸杆菌属发酵糖组合物结合对乳酸菌的生长有显著抑制作用。该发酵糖组合物优选地包括丙酸盐和乙酸盐。
丙酸杆菌属发酵糖组合物一般至少含有丙酸盐和乙酸盐。如果应用两步发酵法，(即第1)步，糖至乳酸，以及第2)步，乳酸至丙酸)和/或如果向发酵产品添加乳酸，则发酵糖组合物中也将存在乳酸盐。优选的发酵糖组合物包含按重量计15至33％的丙酸盐、按重量计5至17％的乙酸盐和10至33％的乳酸盐。特别优选的发酵糖组合物包含按重量计15至20％的丙酸盐、按重量计5至10％的乙酸盐和10至20％的乳酸盐。可替代地，特别优选的发酵糖组合物包含按重量计25至33％的丙酸盐、按重量计8至17％的乙酸盐和17至33％的乳酸盐，这些均以干重算。使用在本发明的组合物中有利的可商购产品是荷兰Corbion销售的Verdad F95。
因此，在本发明的组合物的优选实施方式中，组合物包含
-按重量计0.001至50％的黄腐酚；以及
-按重量计0.01至20％的丙酸杆菌属发酵糖组合物，其包含按重量计15至20％的丙酸盐、按重量计5至10％的乙酸盐和10至20％的乳酸盐。
最优选地，发酵糖组合物是Verdad F95。
还发现，将黄腐酚与香柏油结合对各种乳酸菌的生长有显著强劲的协同作用。
根据本发明的抗微生物组合物优选地配制为可倾倒的制剂，例如制剂中包含稀释剂，优选水、乙醇、油、丙二醇，更优选水、丙二醇。此外，在本发明的抗微生物组合物中掺入稀释剂诸如例如水和/或丙二醇使得能较方便、较准确地调节例如包含在所述组合物中的黄腐酚以及可选的一种或多种另外的抗微生物剂的浓度。
在根据本发明的抗微生物组合物中，可以使用黄腐酚本身。然而，还可以在组合物中使用蛇麻提取物，该提取物包含黄腐酚。取决于所述提取物中黄腐酚的量，需要使用相对大量或少量的提取物以获得组合物中所需的黄腐酚含量。对于此，还要注意的是还可以使用提取物本身。
在本发明的优选实施方式中，使用所谓的蛇麻水提取物作为黄腐酚的来源。可以按照上文关于本发明的第一方面已描述的那样制备该水提取物。
在使用蛇麻提取物的情况下，组合物可以配制成干式的，并且可以包含硅藻土作为载体。在本发明的组合物的实施方式中，组合物包含按重量计60至99％的硅藻土作为载体。在将组合物应用于食物产品之前，将所述组合物与溶剂诸如水一起孵育，以将黄腐酚和另外的抗微生物剂从硅藻土中分离出来。随后，可以将该液相与食物产品混合或应用至食物产品。
在特别优选的实施方式中，根据本发明的抗微生物组合物包含：
-按重量计0.001至50％的黄腐酚；
-按重量计0.01至20％的香柏油或丙酸或其盐，优选丙酸钙，或包含丙酸盐和乙酸盐的丙酸杆菌属发酵糖组合物；以及
-按重量计60至99％的硅藻土。
在另一优选的实施方式中，根据本发明的抗微生物组合物包含黄腐酚和丙交酯。因此，本发明的特别优选的实施方式是根据本发明的抗微生物组合物，其中，该组合物包含：
-按重量计0.001至50％的黄腐酚；
-按重量计0.01至20％的丙交酯，优选按重量计0.05至5％、更优选按重量计0.1至0.5％的丙交酯。
根据本发明的抗微生物组合物优选地配制成液态的或粉末状的。最优选地，该组合物配制为液态的。
本发明的第三方面涉及上述抗微生物组合物在食物产品中作为抗乳酸菌和/或霉菌和/或酵母的抗微生物剂的用途。
所述抗微生物组合物优选地用于抗来自曲霉属或青霉菌属的霉菌，特别是以下霉菌：密丛毛霉、黄曲霉、黑曲霉、多变拟青霉、尖孢镰刀菌、黑根霉、罗克福尔青霉菌，更特别是以下霉菌：密丛毛霉、黄曲霉、多变拟青霉、尖孢镰刀菌、罗克福尔青霉菌。组合物还可以用于抗以下乳酸菌：嗜酸乳杆菌、短乳杆菌、弯曲乳杆菌、植物乳杆菌、香肠乳杆菌、森基乳杆菌(Lactobacillus sunkii)、食果糖乳杆菌、肠膜明串珠菌。
第四方面涉及包含所述抗微生物组合物的食物产品。由于黄腐酚对于抗乳酸菌或霉菌特别有效，因此有利的是将组合物用在面包、焙烤产品、新鲜肉类、禽肉、鱼肉、熟肉、即食餐食、酱料、点心、乳制品或液态食物中。
将通过以下非限制性实施例进一步对本发明进行说明。
实施例
实施例1：用于本发明的各方面的黄腐酚的制备
将硅藻土上的一份黄腐酚黄黄素提取物(Xantho-Flav Extract)(含有2％的黄腐酚)与9份100℃热水一起孵育，煮沸<1分钟，同时剧烈摇晃。孵育后，丢弃固体物质。这样，就得到含有10％的黄黄素(Xanthoflav)或约0.2％的黄腐酚(2mg/ml)的储备溶液，其在下面的实施例中使用。
对比实验1：仅包含黄腐酚的组合物的抗微生物活性
为了测试抗微生物活性，应用了包含黄腐酚的测试组合物。测试组合物制备如下。在最高浓度将100μl的2mg/ml黄腐酚储备水溶液(见实施例1)添加至100μl的2倍浓度的MRS培养基中，提供包含MRS培养基中按重量计1mg/ml的黄腐酚的测试组合物。
使用标准技术培养测试细菌的预培养物。在开始实验之前将细菌在MRS培养基中培养48小时。
将五μl细菌预培养物放入200μl的测试培养基(培养基+成分+水)并与一系列浓度的包含黄腐酚的测试组合物混合。在开始过夜实验时的最终细菌密度为105cfu/ml。测试的黄腐酚浓度最高达0.01mg/ml(基于最高达0.05％w/w的黄黄素(Xanthoflav)的添加水平)。阴性对照是接种的肉汤(broth)，阳性对照是接种的MRS培养基。表1列出了测试有机体，如下。在30℃下过夜培养细菌培养物，期间持续摇晃。孵育后，记录每种测试有机体的最低抑菌浓度(表1)。
表1：包含黄腐酚的组合物对乳酸菌的最低抑菌浓度的评估
结果表明包含黄腐酚的组合物有效抑制各种乳酸菌的生长。
实施例2：包含黄腐酚和Verdad F95的组合物对抑制各种乳酸菌的抗微生物效力
在pH＝5.8下将不同乳酸菌以105微生物每ml的水平接种于MRS肉汤中。以相同的方式，将它们接种于含有0.13％w/w的实施例1的工作溶液的肉汤(因此含有0.013％的黄黄素，相当于0.00026％的黄腐酚)中。还将它们接种于含有1.5％的Purac Verdad 95(荷兰Corbion Purac)——含有约25％丙酸钠的培养糖——的肉汤中。还将它们接种于含有1.5％的Verdad F95和0.13％的黄腐酚储备溶液的肉汤中。30℃下孵育72小时后，测量波长595nm处的光密度，作为72小时内生长的细胞量的测量。
表2：通过测量OD595黄腐酚、Verdad F95以及这些剂的结合对乳酸菌的生长的作用
实施例3：包含黄腐酚和丙酸盐的组合物对抑制各种霉菌的抗微生物效力
测试了黄腐酚与丙酸钙结合对五种霉菌——罗克福尔青霉菌、黄曲霉、尖孢镰刀菌、多变拟青霉和密丛毛霉——的结合作用。在该实施例中，采用以与上述实施例1所述相似的方式制备的0.52％w/w的黄黄素(XanthoFlav)(相当于0.0104％w/w的黄腐酚)储备溶液以及1.6％w/w的丙酸钙储备溶液。通过将50g的麦芽提取物肉汤(Malt Extract broth)(Oxoid公司)与7.5g的细菌学琼脂(Bacteriological Agar)No.1(Oxoid公司)混合以产生2x还原的琼脂MEA，以此制备改性半固态MEA琼脂。在120℃下对其进行15分钟的高压灭菌。使MEA瓶保持在50℃，直到可以进行接种，此时以大约104孢子每ml将上文所列霉菌的单菌株接种于其中。该水平的接种确保96孔板中每孔有500-1000个孢子。所有培养基设为pH 6。
使用自动化装板器(plate filler)将2x MEA与黄腐酚、丙酸钙的储备溶液和作为稀释剂的无菌H2O在96孔板中进行混合，以产生沿一条轴线丙酸钙从0％到0.5％、沿另一条轴线黄腐酚从0％到0.00195％的浓度梯度。两种抗微生物剂均含有0％的孔用作对照。这允许在一块板上测试这两种抗微生物剂大约24种不同的组合。每个孔含有75μL的接种的2x还原琼脂MEA和75μL的抗微生物剂/稀释剂的混合物，并在琼脂凝固后覆以75μL的石蜡油。然后用透氧膜密封九十六孔板，以防止孔污染。
大约每天进行一次OD测量，并随时间跟踪长出物(通过OD增加进行测量)。将最终读数(第13天)时的测量结果放入3D图，将两种抗微生物剂的累加效应形象化为每种跨板增加的水平。
图1-图5的图形象化了结果。可以看出黄腐酚自身就已具有抑制作用，丙酸钙与黄腐酚的结合导致其单独成分无法轻易达到的抑制水平。
实施例4：包含黄腐酚和丙酸盐的组合物对抑制各种霉菌的抗微生物效力
测试了黄腐酚与丙酸盐结合对两种霉菌——黑曲霉和罗克福尔青霉菌——的结合作用。将真菌孢子接种于MEA肉汤，达到104个孢子每ml的浓度。在该实施例中，采用上文实施例1所述的黄腐酚储备溶液。将4ml所述储备溶液加入96ml的肉汤，以获得肉汤中0.008％w/w的溶液。
加入丙酸盐，在肉汤中达到终浓度为0.085％的丙酸盐。还制备肉汤中有0.008％w/w的黄腐酚和0.085％的丙酸盐的溶液。使用不含抗微生物成分的肉汤作为对照实验。将所有培养基的pH设为3.5。25℃下孵育14天后，检查肉汤中霉菌菌丝是否有可见的生长。表3描述了这些测试的结果。
表3黄腐酚、丙酸盐以及这些剂的结合对霉菌的生长的作用
对比实验2：包含黄腐酚的组合物在被乳杆菌污染的食物产品中的抗微生物作用
在该实施例中，评估了黄腐酚对植物乳杆菌在婴儿食物和意大利面酱中的生长的影响。为此目的，对婴儿食物进行了灭菌并将pH调节至pH 4.8，并对意大利面酱进行灭菌并将pH调节至pH 4.2。
在时间点t＝0处，将植物乳杆菌起子培养物(发酵剂，starter culture)接种于婴儿食物和意大利面酱二者的各三份样品，达到大约1*104个细胞/ml的最终乳杆菌细胞密度。对于婴儿食物和意大利面酱，在存在按重量计0.2％的黄腐酚组合物的情况下对每一份样品进行接种，达到食物产品中0.004mg/ml的最终黄腐酚浓度。在t＝0和t＝24小时测定食物产品中的植物乳杆菌细胞密度。表4提供了黄腐酚对植物乳杆菌生长的效果。
根据表4可以清楚的是，使用黄腐酚对婴儿食物和意大利面酱中的植物乳杆菌有强烈的抑制作用。
表4：黄腐酚对食物产品中植物乳杆菌的生长的作用
实施例5：香肠的货架期延长
在实施例7中，分析了仅黄黄素(Xanthoflav)对延长香肠的货架期的影响或黄黄素(Xanthoflav)与“ACE 50”或丙交酯或这二者结合对延长香肠的货架期的影响。Ace 50是最佳形式粉末Ace S50，市面上可从Corbion Purac(荷兰)购得。它是包含49.5％乳酸钠和49.5％醋酸钠的粉末。丙交酯(Corbion Purac(荷兰)的CAS 4511-42-6和95-96-5PURALACT)是乳酸的二聚环酯，其以三种光学异构体存在：由两个L-乳酸分子形成的L-丙交酯；由两个D-乳酸分子形成的D-丙交酯；以及由L-乳酸和D-乳酸形成的内消旋丙交酯。
制备
按照以下程序生产香肠。使用表5中限定的重量百分比的配料制备香肠。使用黄黄素(Xanthoflav)本身，不进行诸如实施例1中应用的制备步骤。
首先将肉切碎，加入盐、三聚磷酸盐和一半的水。混合均匀后，添加其他配料。将肉团放入烹饪用卷曲袋(cook crimp bag)并进行真空密封。密封后将袋子装罐。在烹饪柜中75℃下将香肠烹饪120分钟，之后冷却至15℃。在0℃下储存最终的香肠。
观察到在烹饪期间香肠没有出现水分损失。香肠的pH为6.6，除非加入丙交酯(用于实验“配料：Nr.3、Nr.6、Nr.7”；见表5)。对于其中包括丙交酯的实验，由于丙交酯至少部分降解为乳酸，因此pH为5.3-5.5。
表5用黄腐酚和其他防腐剂制备的香肠的配料
微生物抗性的评价
在第一步，如下制备接种物。从板开始培养乳酸菌(弯曲乳杆菌、3x植物乳杆菌和肠膜明串珠菌)，在30℃下在含有10ml MRS肉汤的螺旋盖试管(100x 16mm)中孵育过夜。
对香肠进行接种，达到约1000(103)CFU每g产品的最终水平。将1％接种物接种于香肠(大约5ml接种物每500克碎肉)。将碎香肠称重放入袋滤器，真空密封(Turbovac，真空时间：6，气体时间：G，密封时间：2)并在7℃下储存。
以适当的时间间隔，每批接种碎香肠取样三份进行微生物分析。打开装有样品的袋滤器，用无菌稀释液(8.5％(w/w)NaCl和0.1％(w/v)的细菌蛋白胨)稀释3倍。在Stomacher中将混合物搅匀1分钟。并在无菌稀释液中制作另外的稀释液。
随后使用Eddyjet型1.23螺旋接种仪(IUL Instruments(IUL仪器)公司，西班牙，巴塞罗那)将五十μl匀浆或稀释液接种在MRS琼脂上。将板在30℃下孵育48小时或在室温下孵育72小时。使用Synoptics软件包用Acolyte Supercount自动菌落计数器(Synoptics公司，英国，剑桥)对菌落进行计数。
表6按天数给出了板计数达到对数值7之前测试的结果。
表6表明分别具有1％ACE 50(Nr 2)、0.8％丙交酯(Nr 3)、0.2％黄黄素(Xanthoflav)(Nr 4)或1％ACE 50+0.2％黄素素(Nr 5)的变体与对照相比货架期延长了约4天。在0.2％黄黄素+0.8％丙交酯(Nr 6)的情况下，货架期延长得更多，与对照相比延长了约14天。与对照相比，具有1％ACE 50+0.2％黄黄素+0.8％丙交酯(Nr 7)的变体表现出最好的货架期，增加超过19天。
表6香肠的货架期

Claims (24)

1.一种组合物作为抗乳酸菌和/或抗霉菌的抗微生物剂的用途，其中，所述组合物包含具有分子式(1)的作为第一微生物剂的黄腐酚，
或其盐以及第二或另外的微生物剂。
2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述第二或另外的抗微生物剂为抗真菌剂，优选抗霉菌剂和/或抗酵母剂和/或对抗乳酸菌有活性的剂。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其中，所述第二或另外的抗微生物剂选自：包含丙酸盐和乙酸盐的丙酸杆菌属(Propionibacterium)发酵糖组合物；肉桂酸或其盐，优选肉桂酸钾；香柏油；有机酸，诸如丙酸、乳酸或乙酸或其任何盐；优选丙酸钙、丙交酯、ACE 50或任何这些剂的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述第二或另外的抗微生物剂选自有机酸，优选丙酸或其盐，最优选丙酸钙。
5.根据权利要求中1-4任一项所述的用途，其中，所述第二或另外的抗微生物剂选自包含丙酸盐和乙酸盐的丙酸杆菌属发酵糖组合物，优选Verdad F95。
作为抗乳酸菌和/或抗霉菌的抗微生物剂。
6.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物用作抗嗜酸乳杆菌(Lactobacillus adidophilus)、短乳杆菌(Lactobacillus brevis)、弯曲乳杆菌(Lactobacillus curvatus)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、香肠乳杆菌(Lactobacillus farciminis)、森基乳杆菌(Lactobacillus sunkii)、食果糖乳杆菌(Lactobacillus fructivorans)、肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteriodes)或抗其组合的抗微生物剂。
7.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物用作抗密丛毛霉(Mucorplumbeus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、多变拟青霉(Paecilomyces variotii)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、黑根霉(Rhizopusstolonifer)、罗克福尔青霉菌(Penicillium roqueforti)或抗其组合的抗微生物剂。
8.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物包含蛇麻(Humuluslupulus)提取物，所述提取物以干重算包含按重量计至少2％的黄腐酚，优选地按重量计至少50％的黄腐酚，最优选地按重量计至少80％的黄腐酚。
9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述蛇麻提取物为水提取物，其通过包括以下步骤的方法制备：
a)通过超临界二氧化碳提取法和/或乙醇提取法制备蛇麻提取物；以及
b)在60℃或更高的温度下对获得的提取物进行水提取，以提供蛇麻的水提取物。
10.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物包含按重量计至少1％的稀释剂，优选水、乙醇、油、丙二醇，更优选水、丙二醇或其组合。
11.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述组合物在食物产品中用作抗微生物剂，优选地在新鲜肉类、禽肉、鱼肉、熟肉、即食餐食、酱料、点心、面包、焙烤产品或液态食物中用作抗微生物剂。
12.根据前述权利要求中任一项所述的用途，其中，所述食物产品包含按重量计0.00010至0.05％、优选按重量计0.0010至0.01％的黄腐酚或其可食用盐。
13.适合用在食物产品中的抗微生物组合物，包含：
-按重量计0.001至50％的黄腐酚，或其盐，具有分子式(1)；以及
-按重量计0.01至20％的至少一种另外的抗微生物剂。
14.根据权利要求13所述的抗微生物组合物，还包含按重量计60至99％的硅藻土作为载体。
15.根据权利要求13或14所述的抗微生物组合物，其中，所述另外的抗微生物剂为抗真菌剂，优选抗霉菌剂和/或抗酵母剂和/或对抗乳酸菌有活性的剂。
16.根据权利要求13-15中任一项所述的抗微生物组合物，其中，第二或另外的抗微生物剂选自：包含丙酸盐和乙酸盐的丙酸杆菌属发酵糖组合物；肉桂酸或其盐，优选肉桂酸钾；香柏油；有机酸，诸如丙酸、乳酸或乙酸或其任何盐；优选丙酸钙、丙交酯、ACE 50或任何这些剂的组合。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的抗微生物组合物，其中，所述组合物包含：
-按重量计0.001至50％的黄腐酚；
-按重量计0.01至20％的香柏油或丙酸或其盐，优选丙酸钙或包含丙酸盐和乙酸盐的丙酸杆菌属发酵糖组合物；以及
-按重量计60至99％的硅藻土。
18.根据权利要求13-17中任一项所述的抗微生物组合物，其中，所述组合物包含：
-按重量计0.001至50％的黄腐酚；
-按重量计0.01至20％的丙交酯。
19.根据权利要求13-18中任一项所述的抗微生物组合物，其中，所述组合物包含蛇麻提取物。
20.根据权利要求19所述的抗微生物组合物，其中，所述蛇麻提取物为通过包括以下步骤的方法获得的水提取物：
a)通过超临界二氧化碳提取法和/或乙醇提取法制备蛇麻提取物；以及
b)在60℃或更高的温度下将获得的提取物进行水提取，以提供蛇麻的水提取物。
21.根据权利要求13-20中任一项所述的抗微生物组合物，其中，所述组合物配制为液态的或粉末的，优选为液态的。
22.根据权利要求13-21中任一项所述的抗微生物组合物在食物产品中作为抗乳酸菌和/或霉菌和/或酵母的抗微生物剂的用途。
23.食物产品，包含根据权利要求13-22中任一项所述的抗微生物组合物。
24.根据权利要求23所述的食物产品，其中，所述产品是面包、焙烤产品、新鲜肉类、禽肉、鱼肉、熟肉、即食餐食、酱料、点心或液态食物。
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