DE69028529T2 - Verfahren zum abtöten von zellen ohne zellyse - Google Patents
Verfahren zum abtöten von zellen ohne zellyseInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft das Abtöten von Zellen während des Wachstums vom Fermentationstyp von Hefen, Bakterien oder Pilzen.
- Bei den verschiedenen Verfahren zum Kultivieren oder Fermentieren von Mikroorganismen ist es beim Abschluß des Wachstums der Kultur oder beim Abschluß des Fermentationsverfahrens manchmal notwendig, die aktiven Zellen im Gemisch abtöten zu können, sodaß die Wachstumsaktivität abgebrochen wird und das gewünschte Produkt aus der Kultur oder dem Fermentationsgemisch gewonnen werden kann. Das gilt insbesondere dann, wenn Organismen, die rekombinante DNA enthalten, als Produktionswirte gezüchtet werden und es notwendig ist, zu verhindern, daß irgendwelche lebensfähigen rekombinanten Organismen an die Umwelt abgegeben werden.
- Es ist manchmal wünschenswert, die Zellen zum Zeitpunkt ihres Abtötens auch zu lysieren, um irgendein gewünschtes Produkt zu gewinnen, das intrazellulär hergestellt wird. Eine herkömmliche Art des Abtötens und Lysierens von Zellen ist die unter Verwendung von Hitze. Die US-A-4.601.986 an Wegner et al. ist ein Beispiel für den Einsatz von Hitze zum Abtöten der Zellen und Abbrechen des Wachstums der Mikroorganismuskulturen. Ein weiteres bei bestimmten Mikroorganismen nützliches Verfahren besteht darin, den osmotischen Druck zu ändern, was Zellyse verursacht. Ein Beispiel für dieses Verfahren wird in der US-A-4.299.858 an Aubert et al. veranschaulicht. Ein weiteres herkömmliches Verfahren, das zur Zellyse verwendet wird, ist das Einbringen von Enzymen, die die Zellwände oder -membranen aufbrechen. Beispiele für dieses Verfahren werden in der US-A-3.816.260 an Sugiyama, der US-A- 3.890.198 an Kobayashi et al. und der US-A-3.917.510 an Kitamura et al. geoffenbart. Diese Offenbarungen der obigen Patente sind hier durch Verweis eingeschlossen.
- In anderen Fällen ist es jedoch wünschenswert, die Zellen einfach abzutöten, um die Mikroorganismusaktivität abzubrechen, ohne die Zellen zu lysieren. Das gilt besonders für Systeme, bei denen die Zellen das gewünschte Produkt erzeugen und ausscheiden. Bei solchen Systemen ist es in hohem Maße wünschenswert, die Zellen ohne Zellyse abzutöten, weil durch die Zellyse zusätzlich Zellbruchstücke und -materialien freigesetzt werden, wodurch die Gewinnung und Reinigung des gewünschten ausgeschiedenen Produktes schwieriger und kostspieliger gemacht wird. Daher ist, wenn die Zellen in einem solchen System abgetötet werden können, ohne sie zu lysieren, Verfahrenseffizienz bei der Gewinnung und Reinigung der ausgeschiedeen Produkte zu bemerken.
- Bei vielen Systemen ist es schwierig, den Wirtsmikroorganismus abzutöten, beispielsweise bei Pilzen. Herkömmliche Verfahren, wie Hitze, sind zu aggressiv und zerstören oder verändern das gewünschte ausgeschiedene Produkt, bevor die Zellen abgetötet sind. Bei solchen Systemen muß das Produkt gewonnen werden, ohne die Zellen abzutöten, was den Einsatz langwieriger und kostspieliger Einschlußverfahren und -ausrüstungen erforderlich macht.
- Bei kommerziellen Fermentationsverfahren im großen Maßstab ist es wünschenswert, effizientere und raschere Verfahren zum Abtöten der Zellen und Abbrechen des Zellwachstums zur Verfügung zu haben, sodaß das resultierende Fermentationsgemisch verarbeitet werden kann, um das gewünschte Produkt zu extrahieren und zu gewinnen, wobei dieses ohne Zellyse hergestellt wird und somit die Notwendigkeit des Einschlußes eliminiert wird. Das Erhitzungsverfahren und andere bekannte Verfahren zum Abtöten von Zellen sind für den kommerziellen Einsatz zu langsam und energieineffizient und führen oft zur unerwünschten Lyse der Zellen. Außerdem sind viele der herkömmlichen Techniken zum Abtöten von Zellen nicht mit Kultivierungs- und Fermentationsverfahren zur mikrobiellen Produktion von Enzymen kompatibel. Herkömmliche Verfahren denaturieren oder verändern das gewünschte Enzym oft, bevor es isoliert und gewonnen werden kann, oder diese Verfahren bringen Materialien, z.B. andere Enzyme, ein, die das Isolieren, Gewinnen und Reinigen des gewünschten Enzymproduktes schwieriger, weniger effizient und folglich teurer machen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein rascheres, effizienteres Verfahren zum Abtöten von Zellen und zur Vorbereitung einer Fermentation oder Kultur eines Mikroorganismus zur Verarbeitung im Sinne von Extraktion und Produktgewinnung bereit.
- Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur wirksamen Durchführen der gewünschten Zellabtötung bereit, das mit der mikrobiellen Produktion von Enzymen und der Gewinnung und Reinigung solcher mikrobiell erzeugter Enzyme kompatibel ist.
- Gemäß einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Abtöten von Zellen ohne Lyse in einer Hefe-, Bakterien- oder Pilzzucht, -kultur oder -fermentation bereit, um die Gewinnung eines von den Zellen ausgeschiedenen Produktes durchzuführen, wobei das Verfahren umfaßt (a) das Einstellen des pH-Werts des die Hefe, das Bakterium oder den Pilz enthaltenden Zucht-, Kultur- oder Fermentationsgemisches auf einen Wert gleich oder unter dem pKa einer vorgewählten organischen Säure, (b) das Zugeben einer ausreichenden Menge einer vorgewählten organischen Säure oder eines Salzes davon, um im wesentlichen vollständiges Abtöten der Zellen im Gemisch durchzuführen, und (c) das Gewinnen des ausgeschiedenen Produkts.
- Vorzugsweise wird der pH-Wert des die Hefe, das Bakterium oder den Pilz enthaltenen Zucht-, Kultur- oder Fermentationsgemisches auf etwa 4,75 oder weniger eingestellt, und vorzugsweise ist die verwendete organische Säure Essigsäure.
- Bei der Entwicklung der vorliegenden Erfindung ist festgestellt worden, daß allein durch die Änderung des pH-Werts eines Fermentationsgemisches kein vollständiges oder ausreichendes Abtöten von Zellen erreicht wird. Beispielsweise wird bei einer Fermentation eines Aspergillus Niger zur Herstellung von Chymosin durch Absenken des pH-Werts auf etwa 2 unter Verwendung von Schwefelsäure das gewünschte Ausmaß an Zellabtötung nicht erreicht. Daher war es in der Vergangenheit nötig, das Fermentationsgemisch zu erhitzen, um die Zellen ausreichend abzutöten, um den Fermentationsvorgang abzubrechen, um das Gemisch zur Gewinnung des Chymosinprodukts vorzubereiten.
- Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist festgestellt worden, daß Essigsäure zum Abtöten von Zellen in Fermentationsverfahren besonders nützlich ist, vorausgesetzt, der pH-Wert des Fermentationsgemisches wird zuerst durch die Zugabe einer Mineralsäure, wie Schwefelsäure, auf etwa 4,75 oder darunter eingestellt und die Essigsäure wird dann zugegeben. Überraschenderweise ist festgestellt worden, daß beim Einsatz dieses Verfahrens die Essigsäuremenge, die erforderlich ist, um ein im wesentlichen vollständiges Abtöten der Zellen im Fermentationsgemisch zu erreichen, relativ gering ist. im allgemeinen wird nach diesem Verfahren ein vollständiges Abtöten der Zellen mit nur etwa 1 bis 2 Gew.-% Essigsäure erzielt. Bei manchen Kultur- oder Fermentationsgemischen kann es notwendig sein, höhere Mengen an Essigsäure, wie etwa 10 Gew.-% oder mehr, ausgehend vom Gesamtgewicht des Gemisches, zu verwenden, während bei anderen Verfahren ein zufriedenstellendes Ausmaß an Zellabtötung schon mit nur 0,25 Gew.-% Essigsäure erzielt werden kann. Im allgemeinen jedoch ist festgestellt worden, daß die nach dem Einstellen des pH-Werts des Gemisches zugegebene Essigsäuremenge zwischen etwa 0,5 Gew.-% und etwa 10 Gew.-%, vorzugsweise zwischen etwa 0,75 Gew.-% und 5 Gew.-%, mehr bevorzugt zwischen etwa 1 Gew.-% und 3 Gew.-% liegt.
- Allgemeiner gesagt kann das erfindungsgemäße Verfahren unter Einsatz jeder gewünschten organischen Säure nach den obigen Schritten eingesetzt werden, vorausgesetzt, daß der pH-Wert des Kultur- oder Fermentationsgemisches zuerst unter Verwendung einer Mineralsäure auf einen pH-Wert eingestellt wird, der in etwa gleich dem oder geringer als der pKa der zur Verwendung zur Zellabtötung gewählten organischen Säure ist, wobei, nachdem der pH-Wert auf den richtigen Wert eingestellt wurde, die organische Säure in einer Menge zugegeben wird, die ausreicht, um die gewünschte Zellabtötung zu bewirken. Wenn beispielsweise Ameisensäure verwendet werden soll, um die Zellabtötung zu erreichen, wird der pH-Wert des Gemischs mit einer Mineralsäure auf etwa 3,75 oder weniger eingestellt, und dann wird Ameisensäure zugegeben, um die Zellabtötung zu erreichen. Wenn Propionsäure zur Verwendung ausgewählt wird, wird der pH-Wert auf etwa 4,87 oder weniger eingestellt und dann die Propionsäure dem Gemisch zugegeben. Die organische Säure kann jede geeignete und kompatible Säure mit 1 bis etwa 5 Kohlenstoffatomen sein. Die gewählte organische Säure sollte mit dem gewünschten im Kultur- oder Fermentationsgemisch erzeugten Produkt kompatibel sein und es nicht zerstören und sollte die Trenn-, Gewinnungs- und Reinigungsverfahren nicht stören, die zur Gewinnung des gewünschten Produktes aus dem Gemisch eingesetzt werden.
- Es ist auch festgestellt worden, daß es nicht notwendig ist, den pH-Wert des Gemisches vor der Zugabe der organischen Säure einzustellen. Die organische Säure kann dem Gemisch zugegeben werden und dann die Mineralsäure zugegeben werden, um den pH-Wert auf den für die Praxis der vorliegenden Erfindung bevorzugten Wert einzustellen. Wie nachstehend erwähnt, gilt dasselbe für die Verwendung des Salzes der organischen Säure. Das Salz kann zugegeben und dann der pH-Wert eingestellt werden. Gemäß ihrem allgemeinsten Aspekt ist es bei der praktischen Durchführung der vorliegenden Erfindung lediglich wichtig, daß die organische Säure oder deren Salz im Gemisch vorliegt, das einen pH-Wert gleich oder unter dem pka-Wert der zur Verwendung ausgewählten organischen Säure aufweist.
- Die vorliegende Erfindung ist zwar nicht notwendigerweise auf die folgende Theorie beschränkt oder darauf aufbauend, es wird jedoch angenommen, daß sie durch den folgenden Mechanismus unerwartet effiziente und vollständige Zellabtötung erreicht. Durch Absenken des pH-Werts des Gemisches oder Mediums auf einen Wert gleich oder unter dem pKa der zu verwendenden organischen Säure wird die Säure protoniert oder entladen und wird für die Zelle als Säure "unsichtbar". Die Zelle kann dann die neutrale Säureverbindung auf die üblicher Weise als Nährstoff aufnehmen oder importieren, weil die Zelle die Verbindung nicht als Säure erkennt. Sobald sie sich innerhalb der Zelle befindet, wird die Säure reionisiert und ändert dann den pH-Wert innerhalb der Zelle, wodurch die Zelle abgetötet wird. Nach dieser Theorie des Mechanismus ist es offensichtlich wünschenswert, eine organische Säure auszuwählen, bei der es wahrscheinlich ist, daß die Zelle sie in der protonierten Säureform als Nährstoff aufnimmt. Eine bevorzugte Säure ist Essigsäure, weil sie bei einem weiten Bereich von Zellen wirksam ist und weil es sich um eine der kostengünstigst erhältlichen Säuren handelt. Je nach den betroffenen Zellkulturen und der Verfahrensökonomie können auch andere wirksame Säuren verwendet werden.
- Die Konzentration der organischen Säure ist nicht entscheidend, sollte aber hoch genug sein, damit das Zellgemisch nicht übermäßig verdünnt wird, wenn die organische Säure zugegeben wird. Wenn Essigsäure verwendet wird, ist Eisessig eine zweckmäßige Form.
- Fachleute werden auch erkennen, daß Salze der organischen Säuren ebenfalls verwendet werden können. Beispielsweise kann anstelle von Essigsäure Natriumacetat verwendet werden, um Essigsäure in situ zu bilden. Das Säuresalz oder zumindest ein Teil davon wird in der Lösung protoniert, in der der pH-wert durch die Mineralsäure auf einen Wert unter den pKa der organischen Säure abgesenkt worden ist. Wie Fachleute ebenfalls erkennen können, ist die pH-Einstellung der Lösung bei Verwendung eines Säuresalzes eine andere als bei Verwendung der Säure selbst, weil das Salz den pH- Wert im Gegensatz zur organischen Säure nicht beeinflußt. Es kann jedes beliebige organische Säuresalz verwendet werden, das mit der Lösung und den Komponenten der Lösung kompatibel ist, die nach Durchführung der Zellabtötung aus der Lösung gewonnen werden sollen. Wie oben erwähnt, kann der pH-Wert des Gemisches auf den Säure-pKa-Wert oder darunter eingestellt werden, bevor oder nachdem die organische Säure oder deren Salz dem Gemisch zugegeben wird. Jedoch besteht eine bevorzugte Praxis der vorliegenden Erfindung darin, den pH-Wert zuerst mit einer Mineralsäure auf den gewünschten Wert einzustellen und dann die organische Säure zuzugeben.
- Zu den Mineralsäuren, die verwendet werden können, um den pKa der Gemische nach dem erfindungsgemäßen Verfahren einzustellen, gehören Schwefelsäure, Salzsäure und andere Mineralsäuren, die den pH-Wert des Zellgemisches absenken und auf einen Wert bringen können, der dem pKa der zum Abtöten der Zellen im Gemisch zu verwendenden organischen Säure entspricht oder darunter liegt. Es ist wünschenswert, zum Einstellen des pH-Werts eine Mineralsäure zu wählen, die mit den Verfahren und der Ausrüstung kompatibel ist, die zum Abtrennen oder Extrahieren des gewünschten Produktes aus dem Fermentations- oder Kulturgemisch oder -medium verwendet werden sollen. Die Konzentration der verwendeten Mineralsäure sollte hoch genug sein, damit der pH-Wert des Zellgemisches auf den gewünschten Wert eingestellt werden kann, ohne das Gemisch unangemessen zu verdünnen.
- Nach der allgemeinen Beschreibung von Aspekten der vorliegenden Erfindung wird diese nun durch spezifische Ausführungsformen veranschaulicht, die in den folgenden Beispielen beschrieben werden.
- In den folgenden Beispielen wurden die Proben durch die Fermentation eines Aspergillus niger var. awamori erhalten, der typischerweise mit 6% oder 10% Sojamehl/Glukose gezüchtet und nach 4 bis 5 Tagen geerntet wurde. Es ist nicht wichtig, bestimmte Zellproduktionstechniken zu verwenden, um die durch die vorliegende Erfindung bewirkte Zellabtötung zu testen. Die folgenden Vergleichsergebnisse veranschaulichen verschiedene Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, wobei ein Standard-Reihenverdünnungstest verwendet wird, um die Menge an lebenden Zellen zu ermitteln, die nach Durchführung der Zellabtötung zurückbleiben. Nach der Zellabtötungsbehandlung wurden die Proben auf pH 5,5 gebracht, mit 0,85% NaCl reihenverdünnt, auf CMA-Platten ausplattiert bzw. ausgestrichen, bei 37ºC 72 h lang inkubiert und in CFU/ml angegeben.
- Das vorliegende Beispiel veranschaulicht die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens bei der Durchführung von im wesentlichen vollständiger Zellabtötung eines A.niger var. awamori.
- Zwei Proben eines A. niger var. awamori-Fermentationsgemisches wurden mit Schwefelsäure auf pH 2,0 eingestellt. Nachdem die Säure gründlich eingemischt worden war, wurden einer Probe 4 Vol.-% Eisessig zugegeben. Beide Proben wurden über Nacht in einem kalten Raum gelagert und dann auf Zellabtötung getestet. Die Reihenverdünnungstestergebnisse waren die folgenden:
- (TNTC bedeutet, daß die Zellzuchtkulturen zu zahlreich waren, um sie zu zählen.)
- Dieses Beispiel zeigt, daß die Schwefelsäure allein keine vollständige Zellabtötung bewirkte, während die Kombination aus Schwefelsäure und Essigsäure vollständige Zelabtötung bewirkte.
- In diesem Beispiel wurde ein Teil eines Fermentationsgemisches, das jenem von Beispiel I ähnlich war, auf 12ºC abgekühlt und 60 h auf dieser Temperatur gehalten. Aus dem Gemisch wurden 3 Proben genommen: eine wurde nicht behandelt und eine wurde mit H&sub2;SO&sub4; allein auf pH 2,0 gebracht. Die dritte Probe wurde mit H&sub2;SO&sub4; auf pH 2,0 gebracht, Eisessig wurde in einer Menge von 1 Gew.-% der Gemischprobe zugegeben, und dann wurde das Gemisch etwa 1 h lang belüftet und gerührt. Alle drei Proben wurden mit NaOH auf pH 5,5 eingestellt, reihenverdünnt, ausplattiert und 5 Tage lang bei 37ºC inkubiert. Die Testergebnisse waren die folgenden:
- Dieses Beispiel zeigt, daß die Essigsäurelschwefelsäure-Behandlung für eine zumindest 6log-Reduktion der Zellzahl sorgt.
- In diesem Beispiel wurde eine Fermentationsbrühe ähnlich der von Beispiel I verwendet, um die Wirkung der pH-Einstellung auf die Zellabtötung zu zeigen. Auch wird in diesem Beispiel anstelle der organischen Säure das organische Säuresalz verwendet. In der Folge wurden die Proben 1-5 im Ursprungszustand verwendet, und den Proben 6-10 waren vor der pH-Einstellung 2% Acetat (als 4,53 g Natriumacetat pro 100 ml) zugegeben worden. Der pH der Proben 1 bis 5 vor dem Einstellen lag bei etwa 5,8 und jener der Proben 6 bis 10 bei etwa 6,0. Der pH-Wert aller Proben wurde dann auf die nachstehend gezeigten Werte eingestellt, mit Ausnahme von Probe 4, die nicht eingestellt wurde und als Vergleichsprobe für die Brühe diente. Der pH-Wert wurde bei jeder Probe mit H&sub2;SO&sub4; oder NH&sub4;OH eingestellt, um den angegebenen pH-Wert zu erhalten.
- Alle Proben wurden 4 h lang auf Eis gelagert, dann wurde der pH-Wert auf 5,5 eingestellt, um sie auf CMA-Platten mit Antibiotika auszuplattieren. Die Platten wurden 7 h lang bei SPC inkubiert. Die Testergebnisse waren die folgenden:
- Dieses Beispiel zeigt, wie wichtig es ist, den pH-Wert des Gemisches auf einen Wert von oder vorzugsweise unter dem pKa der verwendeten organischen Säure einzustellen.
- Bei Verwendung höherer Acetatmengen, wie 4%, würde eine vollständigere Zelabtötung in niedrigeren pH-Bereichen erreicht werden. Jedoch wurde in diesem Beispiel die geringere Acetatmenge verwendet, um die Wirkung des pH-Werts zu zeigen.
- Dieses Beispiel veranschaulicht die Anwendung der vorliegenden Erfindung zum Abtöten von Hefezellen. Für diese Probe wurde eine als Saccharomyces cerevisiae bekannte Hefe auf einem bei Difco erhältlichen Standard-"YM"-Medium mit 250 UpM 24 h lang bei 37ºC gezüchtet. Wie im obigen Beispiel 3 wurden 10 Proben entnommen, die Proben 6-10 mit 2%Acetat (als Natriumacetat) behandelt, der pH-Wert auf den nachstehend gezeigten Wert eingestellt, dann ausplattiert und 4 h lang inkubiert.
- Wie aus obigen Daten geschlossen werden kann, wurde bei pH 2,8 eine etwa 20%ige Abtötung erreicht, bei pH 3,6 etwa 30% und bei pH 4,7, 5,7 oder 6,75 keine wesentliche Abtötung. Während diese Beispiel durchgeführt wurde, um die Wirkung des pH-Wert auf die Wirksamkeit des Abtötens zu ermittelt, ist offensichtlich, daß bei höheren Acetatmengen, z.B. 4%, eine wirksamere Abtötung erreicht werden kann. Es wird auch anerkannt werden, daß es schwieriger ist, präzise Zellabtötung und Kulturwachstum für Hefe als für Pilze zu quantifizieren, aber dieses Beispiel zeigt die Nützlichkeit der vorliegenden Erfindung für Hefe.
- Nachdem die Erfindung beschrieben worden ist und bestimmte Ausführungsformen der Erfindung dargestellt worden sind, wird nun der Schutzumfang der Erfindung durch die folgenden Ansprüche definiert.
Claims (6)
1. Verfahren zum Abtöten von Zellen ohne Lyse im Verlauf des Wachstums, des
Züchtens oder der Fermentation von Hefen, Bakterien oder Pilzen, um die Gewinnung
eines von den Zellen ausgeschiedenen Produktes durchzuführen, wobei das Verfahren
umfaßt:
(a) das Einstellen des pH-Werts des Wachstums-, Zucht-, oder Fermentationsgemischs,
das die Hefen, Bakterien oder Pilze enthält, auf einen Wert, der dem pKa einer
vorgewählten organischen Säure entpricht oder darunter liegt;
(b) das Zugeben einer ausreichenden Menge dieser vorgewählten organischen Säure
oder eines Salzes davon zum Gemisch, um eine im wesentlichen vollständige
Zellabtötung im Gemisch zu bewirken; und
(c) das Gewinnen des ausgeschiedenen Produktes.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin die organische Säure Ameisensäure, Essigsäure,
Propionsäure oder ein Salz davon ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin der pH-Wert durch Zugabe einer
Mineralsäure zum Gemisch eingestellt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, worin die organische Säure Essigsäure ist und der pH-
Wert des Gemischs auf etwa 4,75 oder weniger eingestellt wird.
5. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der pH-Wert vor der
Zugabe der organischen Säure oder des Salzes eingestellt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-4, worin die organische Säure oder das Salz
vor dem Einstellen des pH-Werts zugegeben wird.
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