CN114561303A

CN114561303A - 一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用

Info

Publication number: CN114561303A
Application number: CN202210135038.4A
Authority: CN
Inventors: 薛闯; 戴晓赞; 程驰
Original assignee: Dalian University of Technology; Ningbo Research Institute of Dalian University of Technology
Current assignee: Dalian University of Technology; Ningbo Research Institute of Dalian University of Technology
Priority date: 2022-02-14
Filing date: 2022-02-14
Publication date: 2022-05-31
Anticipated expiration: 2042-02-14
Also published as: CN114561303B

Abstract

本发明公开了一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用，属于生物能源与生物技术领域。本发明将膨胀素基因在里氏木霉RUT‑C30中过表达后，获得了一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株Swol‑9；本发明还公开了该工程菌株在固液联合诱导以及分阶段控制策略下发酵生产高膨胀素含量纤维素酶的方法以及所得的纤维素酶在降解玉米秸秆的应用。发酵7天后，里氏木霉工程菌株Swol‑9的滤纸酶活高达50.3FPU/mL，相比出发菌株RUT‑C30提高了49.5％；在相同酶用量下，里氏木霉工程菌株Swol‑9酶解液中葡萄糖产量相比出发菌株提高了36.8％～57.3％。该工程菌株所产酶系中膨胀素含量和产酶效率远高于出发菌株，可以高效降解玉米秸秆，显示出良好的工业开发和应用前景。

Description

一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物能源与生物技术领域，具体涉及一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用。

背景技术

全球经济的迅速发展，消耗了大量的化石能源，因此加速了化石能源的枯竭，并产生了一系列环境问题。近年来，利用生物技术将木质纤维素类生物质转化为能源、材料和化学品等受到人们的广泛关注。木质纤维素是自然界最丰富、最廉价并且可再生的生物质资源，全世界年产量多达2×10¹¹t。高效利用木质纤维素类资源对缓解全球能源紧张和解决环境问题具有重要意义。木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，其中纤维素和半纤维素占比高达75％。纤维素是由1000～10000个β-D-吡喃型葡萄糖单体以 β-1,4-糖苷键连接形成的直链多糖。半纤维素主要是由五碳糖和六碳糖构成的多聚体，糖基主要包括有D-木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、L-阿拉伯糖以及少量的L-鼠李糖和L-岩藻糖等。木质纤维素可以通过物理、化学和生物等方法降解为单糖或低聚糖，进而通过生物技术转化为能源、材料和化学品等。在木质纤维素降解过程中，纤维素酶是影响其降解效果的重要因素之一。

纤维素的降解至少需要三种酶的协同作用。内切葡聚糖酶作用于纤维素内部的非结晶区，沿纤维素链方向随意切断β-1,4-糖苷键，产生不同长度的寡糖，降低纤维素的聚合度；外切葡聚糖酶作用于纤维素结晶部分，以纤维二糖为产物，从纤维素两端切断β-1,4-糖苷键；β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和低分子量的纤维素水解为葡萄糖。随着木质纤维素降解酶研究的不断深入，研究人员发现了多种木质纤维素降解辅助蛋白。这类辅助蛋白自身不能降解木质纤维素，但可以协同纤维素酶有效的促进木质纤维素的降解，其可作为提高木质纤维素类生物质降解效率的一种手段。膨胀素(Swollenin)是一种与植物扩张蛋白高度同源的纤维素降解辅助蛋白，这种蛋白首先在土豆环腐病病原菌中发现，随后在里氏木霉中也发现这类蛋白的存在。研究发现，这类蛋白能够降低滤纸强度，破坏滤纸和棉花纤维的结构，同时不产生还原糖。膨胀素(Swollenin)的发现为木质纤维素降解酶的研究提供了新的发展方向，在木质纤维素降解方面具有良好的应用前景，对生物能源发展具有重要意义。

专利文献CN201110196055.0公开了一种海洋青霉Swollenin基因及其编码的蛋白质与应用。该专利将海洋青霉来源的Swollenin进行了异源表达并分离纯化，然后将海洋青霉来源的Swollenin与纤维素酶进行同步反应或者分步反应。结果表明海洋青霉来源的Swollenin能有效提高纤维素酶活性，促进结晶纤维素的水解效率。

研究人员通过异源表达的方式获得了重组蛋白膨胀素，证明了其具有膨胀植物细胞壁、提高木质纤维素降解效率的作用。尽管通过异源表达的方法可以获得大量的膨胀素重组蛋白，但是膨胀素重组蛋白的异源表达仍然存在一系列问题，比如发酵周期相对较长、重组蛋白的活性降低、分离纯化成本较高等。里氏木霉广泛应用于纤维素酶工业生产中，其可以产生纤维素降解所需的外切葡聚糖酶，内切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶。里氏木霉天然存在swo1 基因，但其细胞分泌物中的膨胀素含量较少，限制了所产纤维素酶整体糖化效率。因此，构建过表达swo1基因的里氏木霉工程菌株，提高里氏木霉所产酶系中膨胀素的含量以及产酶效率，进而提高纤维素酶整体糖化效率成为当前亟待研究的重要课题。

发明内容

针对现有技术中所存在的不足，本发明构建了一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株，并采用了固液联合诱导以及多阶段控制发酵条件的策略进行诱导产酶，有效地提高了里氏木霉工程菌株所产酶系中膨胀素含量以及产酶效率，进而提高了其降解木质纤维素类生物质的能力。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明提供一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株(Trichodermareesei)，该菌株是通过基因工程手段对里氏木霉RUT-C30进行改造获得，命名为里氏木霉Swol-9，该菌株已于2022年1月5日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，武汉大学，邮编 430072，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022022。

进一步地，所述的里氏木霉Swol-9过表达了swo1基因，使swo1基因大量表达，swo1基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述的swo1基因随机整合在里氏木霉RUT-C30的染色体中。

本发明另一方面提供所述分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)重组质粒的构建：以里氏木霉RUT-C30基因组为模板，通过PCR 扩增出如SEQID NO.1所示的swo1基因片段；用限制性内切酶XbaⅠ对质粒pCZF8进行单酶切，采用无缝克隆技术，将质粒pCZF8和swo1基因片段进行连接，得到重组质粒pCZF8-swo1；

(2)含有重组质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌AGL-1的制备：将步骤(1) 中的重组质粒pCZF8-swo1转化到大肠杆菌DH5α中，并提取重组质粒 pCZF8-swo1；通过电转化将重组质粒pCZF8-swo1转化至根瘤农杆菌感受态细胞AGL-1，得到含有重组质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌AGL-1；

(3)过表达swo1基因的里氏木霉工程菌株的构建：通过根瘤农杆菌介导，将含有重组质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌AGL-1与里氏木霉RUT-C30 分生孢子混合均匀，培养，筛选，验证，获得过表达swo1基因的里氏木霉工程菌株。

(4)摇瓶发酵筛选最优转化子：通过摇瓶发酵对步骤(2)获得的过表达swo1基因的里氏木霉工程菌株进行筛选，得到分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株。

进一步地，上述分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株的构建方法步骤如下：

(1)以P1(如SEQ ID NO.3)和P2为引物(如SEQ ID NO.4所示)，通过PCR从里氏木霉RUT-C30基因组中扩增出swo1基因片段(如SEQ ID NO.1所示)；用限制性内切酶XbaⅠ对质粒pCZF8进行单酶切，采用无缝克隆技术，将质粒pCZF8和swo1基因片段在37℃连接30～90min；

(2)将上述连接产物转化到大肠杆菌DH5α中，涂布于含有Kan的LB 抗性平板上，37℃培养12～16小时后，挑取转化子进行培养，提取质粒并酶切验证，对验证正确的转化子进行保菌；

(3)将含有重组质粒pCZF8-swo1的大肠杆菌DH5α接种于LB培养基中进行过夜培养，并提取重组质粒pCZF8-swo1，通过电转化将重组质粒 pCZF8-swo1转化至根瘤农杆菌感受态细胞AGL-1，涂布于含有Kan和Rif 的LB平板上，28℃培养24～48小时后，挑取转化子进行培养并验证，得到含有重组质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌AGL-1；

(4)将含有重组质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌AGL-1接种于含有Kan 和Rif的LB液体培养基，28℃，180rpm振荡培养，离心并用蒸馏水洗涤两次，收集根瘤农杆菌，用含有AS的IM培养基稀释后，继续培养；

(5)将里氏木霉RUT-C30按10％接种量接种于活化培养基，取活化菌液涂布于产孢培养基，28℃静置培养，用蒸馏水将平板上孢子洗下，六层纱布过滤除去菌丝，4000rpm离心5min，蒸馏水洗涤两次，弃去上清，用含 AS的IM培养基重悬，置于24℃培养箱预萌发2～3h；

(6)取100μL上述培养的含有重组质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌和 100μL里氏木霉RUT-C30分生孢子吹吸混匀，避光培养，涂布于铺有NC膜且含有AS的IM平板，22～24℃静置培养3d；将IM平板上的NC膜反铺于含有Hyg和Cef的PDA平板上，进行初步筛选并杀死根瘤农杆菌，直至长出转化子，将转化子转接于含有Hyg的PDA平板，进行复筛，挑取菌丝活化，进行菌落PCR验证，将验证成功的菌落反复传代，获得性状稳定的转化子；

(7)将上述的转化子和出发菌株RUT-C30等量孢子接种到种子培养基中，于25～30℃、100～300rpm培养18～36h，取10mL种子液接种到90mL 发酵培养基，于28℃，180rpm培养，每隔24h取4mL发酵液，12000rpm 离心10min，保存上清，用于测定纤维素酶酶活。

其中，所述种子培养基含有3～5g/L葡萄糖，8～12g/L玉米浆，溶剂为水， pH自然；

其中，所述发酵培养基含有15～25g/L液体诱导物，0.8～1.2g/L蛋白胨， 0.2～0.4g/L尿素，1.2～1.6g/L(NH₄)₂SO₄，1.5～2.5g/L KH₂PO₄，0.2～0.4g/L MgSO₄·7H₂O，0.3～0.5g/L CaCl₂，0.004～0.006g/L FeSO₄·7H₂O，0.0016～0.0018 g/L MnSO₄·H₂O，0.0013～0.0015g/L ZnSO₄·7H₂O，0.001～0.003g/L CoCl₂，溶剂为0.2M pH 5.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液；

其中，液体诱导物制备步骤如下：以pH 4.8 0.2M的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制600～900g/L葡萄糖溶液，按20～40CBU/g葡萄糖加入β-葡萄糖苷酶，于55℃、150rpm条件下反应72h后，并于90～120℃处理5min使β- 葡萄糖苷酶失活，得到所述液体诱导物。

本发明另一方面提供一种利用上述的分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株发酵生产高膨胀素含量纤维素酶粗酶液的方法，采用固液联合诱导以及分阶段控制策略，培养上述的里氏木霉工程菌株，经离心收集上清，得到高膨胀素含量纤维素酶粗酶液。

进一步地，所述方法具体包括如下步骤：

(1)将里氏木霉工程菌株接种于平板培养基中，于25～30℃培养4～10d，用无菌水洗下孢子，纱布过滤后，将孢子稀释，制得里氏木霉孢子悬液；

(2)将步骤(1)得到的里氏木霉孢子悬液接种于种子培养基，于 25～30℃、100～300rpm培养18～36h，得到里氏木霉种子液；按5～10％接种比例将里氏木霉种子液接种于含有固液联合诱导物的发酵培养基进行发酵，在发酵过程中对发酵条件进行多阶段控制，初始培养温度为28～30℃，初始转速为100～200rpm，初始通气量为1～2vvm；当发酵液中葡萄糖浓度低于 0.2g/L时，开始补料，使发酵液中葡萄糖浓度维持在0.1～0.3g/L左右，发酵时间为144h～192h。

(3)将步骤(2)得到的发酵液在5000rpm～12000rpm离心5min～30min，收集上清，即得高膨胀素含量纤维素酶粗酶液。

进一步地，步骤(2)中初始培养温度为28℃，初始转速为200rpm，初始通气量为2vvm；当发酵液中葡萄糖浓度低于0.2g/L时，开始补料，使发酵液中葡萄糖浓度维持在0.2g/L左右，发酵时间为180h。

进一步地，步骤(2)中所述方法通过多阶段控制发酵条件，包括：①温度控制：在补料之前培养温度为28℃；在补料之后培养温度为25℃。②pH 控制：在发酵前12h，发酵液pH不加控制；发酵12h之后，将发酵液pH 维持在4.2左右。③溶氧控制：在发酵前12h，发酵液溶氧不加控制；发酵 12h～36h之间，将发酵液溶氧控制在30％～50％之间；发酵36h之后，将发酵液溶氧控制在10％～20％之间。

进一步地，步骤(1)中所述平板培养基含有25～35g/L麦芽浸粉，15～20 g/L琼脂，溶剂为水，pH自然。

进一步地，步骤(2)中所述种子培养基含有3～5g/L葡萄糖，8～12g/L 玉米浆，溶剂为水，pH自然。

进一步地，步骤(2)中所述发酵培养基含有8～12g/L液体诱导物，8～12 g/L固体诱导物，0.8～1.2g/L蛋白胨，0.2～0.4g/L尿素，2.5～3.0g/L(NH₄) ₂SO₄，3～5g/L KH₂PO₄，0.4～0.8g/L MgSO₄·7H₂O，0.6～1.0g/L CaCl₂， 0.008～0.012g/L FeSO₄·7H₂O，0.0030～0.0038g/L MnSO₄·H₂O，0.0025～0.0030 g/L ZnSO₄·7H₂O，0.003～0.005g/L CoCl₂，0.1～0.3ml/L吐温80，1～3ml/L消泡剂，溶剂为水，pH自然；

其中，液体诱导物制备步骤如下：以pH 4.8 0.2M的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制600～900g/L葡萄糖溶液，按20～40CBU/g葡萄糖加入β-葡萄糖苷酶，于55℃、150rpm条件下反应72h后，并于90～120℃处理5min使β- 葡萄糖苷酶失活，得到所述液体诱导物；

所述固体诱导物为麦麸。

本发明还提供上述方法制备的高膨胀素含量纤维素酶粗酶液在降解木质纤维素类生物质中的应用。

所述高膨胀素含量纤维素酶粗酶液降解木质纤维素类生物质的过程为：木质纤维素类生物质经预处理后得到预处理后原料，添加所述的高膨胀素含量纤维素酶粗酶液，调节pH至4.5～5.0，于45℃～55℃酶解48～72h。

进一步地，所述木质纤维素类生物质包括但不限于玉米秸秆、水稻秸秆、玉米芯等，优选为玉米秸秆。

进一步地，所述预处理为稀硫酸预处理、氢氧化钠预处理、汽爆预处理、离子液体预处理，优选为稀硫酸预处理。

进一步地，所述稀硫酸预处理的稀硫酸浓度为0.5％～2％，稀硫酸和玉米秸秆的质量比例为5：1～20：1，反应条件为105℃～130℃处理60～120min。

进一步地，所述纤维素酶粗酶液添加量为每克原料添加1～40FPU。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

(1)本发明构建了一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株 Swol-9，在发酵罐中对该菌株进行了发酵，并测定该菌株所产纤维素酶酶活，结果表明工程菌株Swol-9所产酶系中膨胀素含量和纤维素酶酶活有了显著地提高；发酵7天后，里氏木霉工程菌株Swol-9的滤纸酶活高达50.3FPU/mL，相比出发菌株RUT-C30提高了49.5％；滤纸膨胀实验表明工程菌株Swol-9 所产纤维素酶对滤纸有更好的降解效率，这也表明工程菌株Swol-9所产纤维素酶中膨胀素含量增加。利用本发明的里氏木霉工程菌株Swol-9所产高膨胀素含量纤维素酶粗酶液对玉米秸秆进行水解，在相同酶用量下，里氏木霉工程菌株Swol-9酶解液中葡萄糖产量相比出发菌株RUT-C30提高了 36.8％～57.3％。

(2)本发明的分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株Swol-9在发酵过程中使用液体诱导物和固体诱导物同时诱导产酶，两种不同诱导物通过不同的方式激活细胞的产酶途径，实现了多种途径诱导产酶；在发酵过程中，对发酵条件进行了分阶段控制，将温度、pH、溶氧等发酵条件分阶段控制以满足微生物不同阶段对发酵条件需求，保证菌体处于良好的生长和产酶环境中，进而提高了工程菌株所产酶系中膨胀素含量和产酶效率，该工程菌株所产酶系中膨胀素含量和产酶效率显著高于出发菌株，可以高效降解木质纤维素类生物质，具有良好的工业应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例，下面将对实施例涉及的附图进行简单地介绍。

图1为实施例1重组质粒pCZF8-swo1图谱；

图2为实施例2中转化子筛选结果；

图3为实施例3中里氏木霉RUT-C30和工程菌株Swol 1-9摇瓶发酵的纤维素酶酶活比较；

图4为实施例4中里氏木霉RUT-C30和工程菌株Swol-9发酵罐发酵的纤维素酶酶活比较；

图5为实施例4中里氏木霉RUT-C30和工程菌株Swol-9粗酶液对滤纸的膨胀和降解效果；

图6为实施例5里氏木霉RUT-C30和工程菌株Swol-9粗酶液水解预处理玉米秸秆还原糖产量对比。

图7为实施例5里氏木霉RUT-C30和工程菌株Swol-9粗酶液水解预处理玉米秸秆葡萄糖产量对比。

具体实施方式

下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

重组质粒pCZF8-swo1的构建，包括以下步骤：

本发明涉及的swo1基因来自于里氏木霉RUT-C30(购买自美国农业研究菌种保藏中心)，swo1基因片段大小为2781bp，基因序列如SEQ ID NO.1所示，以正向引物P1和反向引物P2为引物，通过PCR从里氏木霉RUT-C30 基因组中扩增出swo1基因片段，PCR反应条件和体系见表1和表2。

正向引物P1：

5′-ATGGCATGATGCTAGTCTAGAACATGTCCGCGTCTAGTGATTT-3′ (SEQ ID NO.3)

反向引物P2:

5′-ACGTTAAGTGTATTCTCTAGACAACGTACCAAAGGATGTG-3′ (SEQ ID NO.4)

PCR反应条件如表1所示：

表1.PCR反应条件

PCR反应体系如表2所示：

表2.PCR反应体系

PCR反应体系	体积
		KOD FX DNA聚合酶	1μL
2×PCR Buffer for KOD FX	25μL
		dNTPs	10μL
DNA模板	2μL
		正向引物	1.5μL
反向引物	1.5μL
		水	至50μL

将质粒pCZF8用XbaⅠ在37℃进行单酶切，反应时间为90～120min，并进行纯化，酶切体系见表3。

表3.酶切体系

组分	体积
		pCZF8	12μL
XbaⅠ	0.5μL
		CutSmart	2μL
水	至20μL

采用无缝克隆技术，将质粒pCZF8和swo1基因片段在37℃进行连接，反应时间为30～90min，反应体系见表4。重组质粒pCZF8-swo1图谱见附图 1。

表4. 20μL连接反应体系

组分	体系内含量
		pCZF8	5μL
swo1基因片段	5μL
		ExnaseⅡ	2μL
5×CE Buffer	4μL
		水	Up to 20μL

取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，加入10μL重组质粒，轻轻摇晃混合均匀，冰浴30min；置于42℃水浴锅，热激90s后迅速转移到冰浴中冷却1 min；加入预热至37℃的LB培养基，37℃，200r/min条件下，培养45min～1 h；将培养好的细胞涂布于含有Kan的LB抗性平板，37℃，培养12～16h；挑取单个菌落，并将其接种在含有Kan的LB液体培养基中，37℃200rpm 培养10～14h；提取质粒，验证，获得正确的转化子。

构建含有质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌AGL-1菌株，包括以下步骤：

将含有重组质粒pCZF8-swo1的大肠杆菌DH5α接种于LB培养基过夜培养，提取质粒，使用电击法转化至根瘤农杆菌感受态细胞AGL-1；具体过程为：取100μL农杆菌感受态细胞，加入重组质粒pCZF8-swo1，混合均匀，置于电转杯中，预冷后释放电脉冲进行电转，迅速取出电转杯加入LB培养基，吹吸混合均匀，转入新的离心管中，28℃，180rpm振荡培养2～4h；取适量菌液涂布于含有Kan和Rif的LB平板，28℃静置培养24～48h，挑取单菌落活化后，采用PCR方式验证阳性转化子。

实施例2

含有pCZF8-swo1根瘤农杆菌AGL-1转化至里氏木霉RUT-C30中

挑取含有重组质粒pCZF8-swo1的根瘤农杆菌AGL-1于含有Kan和Rif 的LB液体培养基，28℃，180rpm振荡培养，离心并用蒸馏水洗涤两次，收集农杆菌菌体，用含有AS的IM培养基稀释后继续培养。

将里氏木霉RUT-C30菌保按照10％接种量接种于活化培养基，取活化菌液涂布于产孢培养基平板上，28℃静置培养7d，用蒸馏水将平板上孢子洗下，六层纱布过滤除去菌丝，4000rpm离心5min，蒸馏水洗涤两次，弃上清，用含有AS的IM培养基重悬，置于24℃培养箱预萌发2～3h。

取100μL培养的根瘤农杆菌AGL-1和100μL里氏木霉分生孢子吹吸混匀，避光培养1h，涂布于铺有NC膜且含有AS的IM平板，22～24℃静置培养3d；将IM平板上的NC膜反铺于含有Hyg和Cef的PDA平板上，进行初步筛选并杀死农杆菌，直至长出转化子；将转化子转接于含有Hyg的PDA 平板，进行复筛；挑取菌丝活化，进行菌落PCR验证。将验证成功的菌落反复传代，获得性状稳定的转化子，将生长状态良好、并具有孢子产生的转化子保存至20％甘油中，-80℃保存。结果如图2所示，经验证得到Swol-1、Swol-2、Swol-3、Swol-4、Swol-5、Swol-6、Swol-7、Swol-8、Swol-9共9株里氏木霉工程菌株。

实施例3

摇瓶发酵筛选最优转化子

将上述9株里氏木霉工程菌株和出发菌株RUT-C30等量孢子接种到种子培养基中，于28℃、180rpm培养24h，取10mL种子液接种到90mL发酵培养基，于28℃，180rpm培养，每隔24h取4mL发酵液，12000rpm离心 10min，保存上清，用于测定纤维素酶酶活。

其中，所述种子培养基含有4g/L葡萄糖，10g/L玉米浆，溶剂为水，pH 自然。

其中，所述发酵培养基含有20g/L液体诱导物，1g/L蛋白胨，0.3g/L 尿素，1.4g/L(NH₄)₂SO₄，2g/L KH₂PO₄，0.3g/L MgSO₄·7H₂O，0.4g/L CaCl₂， 0.005g/L FeSO₄·7H₂O，0.0017g/L MnSO₄·H₂O，0.0014g/L ZnSO₄·7H₂O，0.002 g/L CoCl₂，溶剂为0.2M pH 5.0的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液。

其中，液体诱导物制备步骤如下：以0.2M pH 4.8的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制850g/L葡萄糖溶液，按25CBU/g葡萄糖加入β-葡萄糖苷酶，于55 ℃、150rpm条件下反应72h后，并于105℃处理5min使β-葡萄糖苷酶失活，得到所述液体诱导物。

9株工程菌株和出发菌株RUT-C30纤维素酶酶活比较结果见图3，出发菌株RUT-C30滤纸酶活为0.798FPU/mL，工程菌株Swol-2，Swol-3，Swol-4， Swol-5，Swol-7，Swol-8和Swol-9的滤纸酶活分别为0.940FPU/mL，1.124 FPU/mL，0.812FPU/mL，0.995FPU/mL，0.801FPU/mL，1.105FPU/mL和 1.254FPU/mL，均高于出发菌株RUT-C30，其中转化子Swol-9的滤纸酶活最高，相比出发菌株RUT-C30提高了57.1％。

滤纸酶活测定方法:

酶活单位的定义：在50℃、pH 4.8条件下，每分钟水解whatman No.1 滤纸产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位。

滤纸酶活测定：首先，向比色管中加入0.5mL经稀释后的酶液、1.0mL 醋酸-醋酸钠缓冲液(0.2M，pH 4.8)和50mg Whatman NO.1滤纸，于50℃ 水浴锅中反应60min，反应结束后立即加入3mL DNS沸水浴5min终止酶反应，放入冷水中冷却后，测定生成还原糖的量。根据还原糖生成量计算滤纸酶活。

实施例4

里氏木霉出发菌株RUT-C30和工程菌株Swol-9在发酵罐中发酵生产纤维素酶

将里氏木霉出发菌株RUT-C30和工程菌株Swol-9分别接种于平板培养基中，于28℃培养7d，用无菌水洗下孢子，纱布过滤后，将孢子稀释，制得里氏木霉孢子悬液。将等量里氏木霉出发菌株RUT-C30和工程菌株Swol-9 的孢子悬液接种于种子培养基，于28℃、180rpm培养24h，得到里氏木霉种子液。按10％接种比例将里氏木霉种子液接种于含有固液联合诱导物的发酵培养基进行培养，发酵过程中对发酵条件进行多阶段控制。初始培养温度为28℃，初始转速为200rpm，初始通气量为2vvm。当发酵液中葡萄糖浓度低于0.2g/L时，开始补料，使发酵液中葡萄糖浓度维持在0.2g/L左右。培养时间为180h。将发酵液在10000rpm离心10min，收集上清，所得液体即为纤维素酶粗酶液。

其中，所述多阶段控制发酵条件方法包括：①温度控制：在补料之前培养温度为28℃；在补料之后培养温度为25℃。②pH控制：在发酵前12h 左右，发酵液pH不加控制；发酵12h之后，将发酵液pH维持在4.2左右。 ③溶氧控制：在发酵前12h左右，发酵液溶氧不加控制；发酵12h～36h之间，将发酵液溶氧控制在40％左右；发酵36h之后，将发酵液溶氧控制在20％左右。

其中，所述平板培养基含有30g/L麦芽浸粉，15g/L琼脂，溶剂为水，pH自然。

其中，所述发酵培养基含有10g/L液体诱导物，10g/L固体诱导物，1g/L 蛋白胨，0.3g/L尿素，2.8g/L(NH₄)₂SO₄，4g/L KH₂PO₄，0.6g/L MgSO₄·7H₂O， 0.8g/L CaCl₂，0.01g/LFeSO₄·7H₂O，0.0034g/L MnSO₄·H₂O，0.0028g/L ZnSO₄·7H₂O，0.004g/L CoCl₂，0.2ml/L吐温80，2ml/L消泡剂，溶剂为水， pH自然。

其中，液体诱导物制备步骤如下：以pH 4.8 0.2M的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制850g/L葡萄糖溶液，按25CBU/g葡萄糖加入β-葡萄糖苷酶，于 55℃、150rpm条件下反应72h后，并于105℃处理5min使β-葡萄糖苷酶失活，得到所述液体诱导物；

所述固体诱导物为麦麸。

里氏木霉出发菌株RUT-C30和工程菌株Swol-9发酵7天后纤维素酶酶活测定结果见图4，里氏木霉RUT-C30和工程菌株Swol-9粗酶液对滤纸的膨胀和降解效果见图5，结果表明工程菌株Swol-9所产酶系中膨胀素含量和纤维素酶酶活有了显著地提高。发酵7天，里氏木霉工程菌株Swol-9的滤纸酶活高达50.3FPU/mL，相比出发菌株RUT-C30提高了49.5％。进一步地，将里氏木霉出发菌株RUT-C30和工程菌株Swol-9的粗酶液按照相同比例稀释，加入到装有1cm×6cm Whatman NO.1滤纸的试管中，于50℃，150rpm进行处理1h。里氏木霉出发菌株RUT-C30所产纤维素酶处理后的滤纸无法充分降解，液体呈现浑浊状态，含有许多尺寸较大的悬浮物。工程菌株Swol-9所产纤维素酶处理后的滤纸蓬松度显著提高，悬浮物明显减少，悬浮物尺寸明显降低，液体更透明，蓬松度提升1-2倍，说明滤纸降解更充分，这表明工程菌株Swol-9所产纤维素酶中膨胀素含量显著增加，膨胀素可以破坏木质纤维素类底物的结构，使木质纤维素类底物变得更加蓬松，从而提高木质纤维素类底物的降解效率。

实施例5

里氏木霉出发菌株RUT-C30和工程菌株Swol-9粗酶液水解预处理玉米秸秆

1％H₂SO₄预处理玉米秸秆制备：将1％H₂SO₄溶液与玉米秸秆按固液比 10：1混合均匀，置于反应容器中，于121℃处理90min。预处理结束后，进行固液分离，将固体水洗至中性，烘干，备用。

玉米秸秆降解：将预处理后的玉米秸秆按10％固液比，重悬于去离子水中，添加不同比例的实施例4制备的里氏木霉出发菌株RUT-C30和工程菌株 Swol-9粗酶液，置于水浴摇床中，50℃150rpm反应72h。反应结束后，采用DNS法和生物传感分析仪测定还原糖含量和葡萄糖含量。

结果如图6和图7所示，在不同酶用量条件下，里氏木霉工程菌株Swol-9 酶解液中还原糖产量和葡萄糖产量始终高于出发菌株RUT-C30。里氏木霉工程菌株Swol-9酶解液中葡萄糖产量相比出发菌株RUT-C30提高了36.8％～ 57.3％。这是因为里氏木霉出发菌株RUT-C30粗酶液中膨胀素含量少，限制了纤维素酶的整体糖化效率；而工程菌株Swol-9粗酶液中膨胀素含量显著高于出发菌株，膨胀素可以增加对玉米秸秆结构的破坏，使玉米秸秆变得更加蓬松，进而提高玉米秸秆的降解效率。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 大连理工大学

<120> 一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株及其应用

<130> 20220106

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2781

<212> DNA

<213> Trichoderma reesei

<400> 1

acatgtccgc gtctagtgat ttatatgtag aatgatcaca attcatgtaa ctgcgttttc 60

gcacatgcaa aaagccctaa cgtgagactg agccacttcc tagttttcgt atcatgtcag 120

ttgcaaggtt acaccacaat gcagctcaac gagacaacgc tgccagccca taataatgga 180

tagctggttg tagagagatt aagaagagaa tgctgtttca gaaggaagac tatatcatag 240

cagctgctac atttccctct ttccctcttt ccatccctta atagatacgt acccttgcaa 300

ttggccgttt cggaagagct tttctgctta tcctaaccac ctacgccaga ataccggtgg 360

aataatcagt gctcaatagg gaaaccccca actgcagcat ataagcctat taacaagacg 420

tcccaacatg cattttcctt cagtccgcag caggctatag agagtaggca atttacacac 480

cacttttagc ctctgcacat atctcaccac atttgcatta cggcatccac tattacaacc 540

acttggcacc tgatggcttt gctctaccca tatcggtttt tacgttccgc tgtgttcagt 600

cgttaaatcc gtggtggagc agaacgacca gcttctcgta tcgggaactc cgcttatccg 660

ataccctcag tcgaaccctt cgtgatactc agcctaaata acatcgcatc gtagcagaca 720

acttcagtaa tttttgtggg gtaatggtca gatcgctcct cttatatata aagcagaggt 780

tagtgggcta aggaaattcg tggttcgctt atagtagagc tgtcagttgc ccttcccgaa 840

ctgttagacg ggatggctgg taagcttatc ctcgtggctc tagcaagcct tgtatcactc 900

tctattcagc agaattgcgc agcattattg taagagtgtt gagcgtgttg agtaccatct 960

gtatcgttgc taacgtaggc ttttagtggc caatgtggag gcatagggtg gtccggcacc 1020

acatgttgcg ttgctggcgc ccagtgcagt tttgtcaatg actggtactc ccagtgcctt 1080

gcgtcaaccg tatgagctcc gatccgggcc gtcaatatct tctaactcca gactgtacag 1140

ggcggaaacc ccccaaacgg aacaacttcc tctagcttgg tttcacggac gtcgtcagca 1200

tcctcatccg tcggctcgtc ttcacccggc ggcaactcac caactggcag tgcttccacc 1260

tacacaacca cagatacagc taccgtggct cctcattcgc agtctcctta ccccagcatt 1320

gccgcatcca gttgcggatc gtggaccctc gtggataatg tttgctgccc atcatattgt 1380

gctaatgatg acacatccga gtcatgctca ggctgcggta cctgcactac gccgccctcg 1440

gcggactgca aatccggaac catgtatcca gaggtccatc acgtatccag caacgagagc 1500

tggcactaca gtgtaagatg accaacgctg gggtatctaa tcctttgtct tcctcggcgt 1560

gctgaccttg gagcatttag agatcaaccc actttggcct aacgagcggc ggggcctgtg 1620

gctttggcct gtacggtctc tgcacaaagg gcagtgttac agccagctgg acggatccca 1680

tgcttggcgc gacgtgtgac gctttttgta cagcgtatcc cctgctttgc aaagacccta 1740

ccggcactac ccttcgtggc aacttcgcag ctccaaacgg cgattactac acccaagttg 1800

gggaccccga gaggcaatca ttttctggtg tagtattcac tgacagtgcg atagttctgg 1860

tcctcgttgc caggagccct cgataactac ctgtcctgcg gcgagtgcat tgagctgata 1920

caaacaaagc ccgatgggac cgattatgct gtcggagaag ccggctacac ggatccaatt 1980

actctcgaga ttgtggacag ctgcccgtgc agcgcgaact ccaagtggtg ctgtcagaga 2040

gccccgtcca tcccgtccat tgtactacat gcgccaaccg aatggccctg gctaacatct 2100

cgcaggtggt ccgggcgccg atcattgcgg agagatcgac ttcaaatacg gctgtcctct 2160

tcctgctgac agcattcatc tcgacctgtc agacattgcc atgggccgtt tgcagggcaa 2220

tggatcacta accaatggcg tcatcccgac tcgatataga agagtccaat gccccaaagt 2280

tgggaacgcc tacatttggc ttcgaaatgg cggagggcct tactattttg ctctcacggc 2340

agtcaacacc aacggaccgg gctcagtcac caaaatcgag atcaagggcg cagacaccga 2400

caactgggtt gccttggtcc atgacccaaa ctatacgagt agccgcccac aagaacgcta 2460

tggcagttgg gtaatcccac agggatcagg gccctttaac ttgcctgttg gaattcgtct 2520

gactagccca acgggggaac agattgtgaa tgaacaggcc atcaagacat tcactcctcc 2580

ggccacaggt gaccccaatt tttactacat tgacattggt gtgcagttta gccagaattg 2640

atggcaagca ttgggcaatg ggcttcttgc tgtgggacaa tgatgtaggc tagattctca 2700

atgcttcaag tatgtggtgt acgtcttcgt gtgtatagat aggtatgctg ttcacttaaa 2760

tacacatcct ttggtacgtt g 2781

<210> 2

<211> 493

<212> PRT

<213> Trichoderma reesei

<400> 2

Met Ala Gly Lys Leu Ile Leu Val Ala Leu Ala Ser Leu Val Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Gln Gln Asn Cys Ala Ala Leu Phe Gly Gln Cys Gly Gly Ile

20 25 30

Gly Trp Ser Gly Thr Thr Cys Cys Val Ala Gly Ala Gln Cys Ser Phe

35 40 45

Val Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu Ala Ser Thr Gly Gly Asn Pro

50 55 60

Pro Asn Gly Thr Thr Ser Ser Ser Leu Val Ser Arg Thr Ser Ser Ala

65 70 75 80

Ser Ser Ser Val Gly Ser Ser Ser Pro Gly Gly Asn Ser Pro Thr Gly

85 90 95

Ser Ala Ser Thr Tyr Thr Thr Thr Asp Thr Ala Thr Val Ala Pro His

100 105 110

Ser Gln Ser Pro Tyr Pro Ser Ile Ala Ala Ser Ser Cys Gly Ser Trp

115 120 125

Thr Leu Val Asp Asn Val Cys Cys Pro Ser Tyr Cys Ala Asn Asp Asp

130 135 140

Thr Ser Glu Ser Cys Ser Gly Cys Gly Thr Cys Thr Thr Pro Pro Ser

145 150 155 160

Ala Asp Cys Lys Ser Gly Thr Met Tyr Pro Glu Val His His Val Ser

165 170 175

Ser Asn Glu Ser Trp His Tyr Ser Arg Ser Thr His Phe Gly Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Gly Ala Cys Gly Phe Gly Leu Tyr Gly Leu Cys Thr Lys Gly

195 200 205

Ser Val Thr Ala Ser Trp Thr Asp Pro Met Leu Gly Ala Thr Cys Asp

210 215 220

Ala Phe Cys Thr Ala Tyr Pro Leu Leu Cys Lys Asp Pro Thr Gly Thr

225 230 235 240

Thr Leu Arg Gly Asn Phe Ala Ala Pro Asn Gly Asp Tyr Tyr Thr Gln

245 250 255

Phe Trp Ser Ser Leu Pro Gly Ala Leu Asp Asn Tyr Leu Ser Cys Gly

260 265 270

Glu Cys Ile Glu Leu Ile Gln Thr Lys Pro Asp Gly Thr Asp Tyr Ala

275 280 285

Val Gly Glu Ala Gly Tyr Thr Asp Pro Ile Thr Leu Glu Ile Val Asp

290 295 300

Ser Cys Pro Cys Ser Ala Asn Ser Lys Trp Cys Cys Gly Pro Gly Ala

305 310 315 320

Asp His Cys Gly Glu Ile Asp Phe Lys Tyr Gly Cys Pro Leu Pro Ala

325 330 335

Asp Ser Ile His Leu Asp Leu Ser Asp Ile Ala Met Gly Arg Leu Gln

340 345 350

Gly Asn Gly Ser Leu Thr Asn Gly Val Ile Pro Thr Arg Tyr Arg Arg

355 360 365

Val Gln Cys Pro Lys Val Gly Asn Ala Tyr Ile Trp Leu Arg Asn Gly

370 375 380

Gly Gly Pro Tyr Tyr Phe Ala Leu Thr Ala Val Asn Thr Asn Gly Pro

385 390 395 400

Gly Ser Val Thr Lys Ile Glu Ile Lys Gly Ala Asp Thr Asp Asn Trp

405 410 415

Val Ala Leu Val His Asp Pro Asn Tyr Thr Ser Ser Arg Pro Gln Glu

420 425 430

Arg Tyr Gly Ser Trp Val Ile Pro Gln Gly Ser Gly Pro Phe Asn Leu

435 440 445

Pro Val Gly Ile Arg Leu Thr Ser Pro Thr Gly Glu Gln Ile Val Asn

450 455 460

Glu Gln Ala Ile Lys Thr Phe Thr Pro Pro Ala Thr Gly Asp Pro Asn

465 470 475 480

Phe Tyr Tyr Ile Asp Ile Gly Val Gln Phe Ser Gln Asn

485 490

<210> 3

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggcatgat gctagtctag aacatgtccg cgtctagtga ttt 43

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

acgttaagtg tattctctag acaacgtacc aaaggatgtg 40

Claims

1.一株分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株(Trichoderma reesei)，其特征在于，命名为里氏木霉Swol-9，于2022年1月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022022。

2.根据权利要求1所述分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株，其特征在于，所述里氏木霉工程菌株是通过在里氏木霉RUT-C30中过表达swo1基因得到，所述swo1基因序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)通过PCR从里氏木霉RUT-C30基因组中扩增出如SEQ ID NO.1所示的swo1基因片段，采用无缝克隆技术，将质粒pCZF8和swo1基因片段进行连接，得到重组质粒pCZF8-swo1；

(2)通过根瘤农杆菌介导，将重组质粒pCZF8-swo1导入里氏木霉RUT-C30中，培养，筛选，验证，获得过表达swo1基因的里氏木霉工程菌株；

(3)通过摇瓶发酵对步骤(2)获得的过表达swo1基因的里氏木霉工程菌株进行筛选，得到分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株。

4.一种利用权利要求1或2所述分泌高性能纤维素酶的里氏木霉工程菌株发酵生产高膨胀素含量纤维素酶的方法，其特征在于，采用固液联合诱导以及分阶段控制策略，培养所述的里氏木霉工程菌株，离心收集上清，得到高膨胀素含量纤维素酶粗酶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

(1)将所述的里氏木霉工程菌株接种于平板培养基中，于25～30℃培养4～10d，用无菌水洗下孢子，稀释后制得孢子悬液；

(2)将步骤(1)得到的孢子悬液接种于种子培养基，于25～30℃、100～300 rpm培养18～36h，得到种子液；按5～10％接种比例将种子液接种于含有固液联合诱导物的发酵培养基中进行发酵；发酵过程中对发酵条件进行多阶段控制，初始培养温度为28～30℃，初始转速为100～200rpm，初始通气量为1～2vvm；当发酵液中葡萄糖浓度低于0.2g/L时，开始补料，使发酵液中葡萄糖浓度维持在0.1～0.3g/L，发酵时间为144h～192h；

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述发酵培养基中含有8～12g/L液体诱导物，8～12g/L固体诱导物，0.8～1.2g/L蛋白胨，0.2～0.4g/L尿素，2.5～3.0g/L(NH₄)₂SO₄，3～5g/L KH₂PO₄，0.4～0.8g/L MgSO₄·7H₂O，0.6～1.0g/L CaCl₂，0.008～0.012g/L FeSO₄·7H₂O，0.0030～0.0038g/L MnSO₄·H₂O，0.0025～0.0030g/L ZnSO₄·7H₂O，0.003～0.005g/L CoCl₂，0.1～0.3ml/L吐温80，1～3ml/L消泡剂，溶剂为水，pH自然；

其中，液体诱导物制备步骤如下：以pH 4.8 0.2M的Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液配制600～900g/L葡萄糖溶液，按20～40CBU/g葡萄糖加入β-葡萄糖苷酶，于55℃、150rpm条件下反应72h后，并于90～120℃使β-葡萄糖苷酶失活，得到所述液体诱导物；

所述固体诱导物为麦麸。

7.权利要求4-6任一项所述的方法制得的高膨胀素含量纤维素酶粗酶液在降解木质纤维素类生物质中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述高膨胀素含量纤维素酶粗酶液降解木质纤维素类生物质的过程为：木质纤维素类生物质经预处理后得到预处理后原料，按1～40FPU/g原料添加所述高膨胀素含量纤维素酶粗酶液，调节pH至4.5～5.0，于45℃～55℃酶解48～72h。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素类生物质包括但不限于玉米秸秆、水稻秸秆、玉米芯。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述预处理包括但不限于稀硫酸预处理、氢氧化钠预处理、汽爆预处理、离子液体预处理。