CN101970673A - 真核细胞中的丁醇生产 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及能够以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例生产丁醇和乙醇的真核细胞。本发明还涉及用于制备丁醇和乙醇的方法，所述方法包括：在合适的发酵液中发酵真核细胞，其中丁醇和乙醇以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例被生产，还涉及从其中丁醇∶乙醇的比例在1∶2到1∶100之间的包含丁醇和乙醇的水性溶液中回收丁醇和乙醇的方法，所述方法包括：从水性溶液中分离乙醇/丁醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离丁醇/水混合物；和回收丁醇和乙醇。

Description

真核细胞中的丁醇生产
发明领域
本发明涉及能够生产丁醇和乙醇的真核细胞，用于制备丁醇和乙醇的方法，和用于从水性溶液中回收乙醇和丁醇的方法。
乙醇目前是最大量的替代性(生物)燃料，其主要通过糖的大规模酵母发酵和之后通过蒸馏分离乙醇而制成。乙醇发酵中使用的主要糖主要来自于甘蔗或玉米。因为乙醇的价格可能大幅波动，所以存在在相同的乙醇生产设施中生产替代性产物的需要。
可以在乙醇发酵过程中生产的一种有吸引力的产物是丁醇。丁醇适合用作替代性的发动机燃料。丁醇具有比乙醇更高的贮能量(energycontent)，腐蚀性比乙醇更低，并可可以通过现有的化石燃料管道和加油站来运输。丁醇还可用作重要的工业化学品，例如作为多种化学品和纺织过程的溶剂，用于塑料的有机合成中，用作化学品中间产物，和在涂层和食品和调味剂工业中用作溶剂。
可以使用细菌Clostridium acetobutylicum或其它Clostridium物种进行的丙酮-丁醇-乙醇(ABE)过程，通过发酵实现丁醇和乙醇的生物合成，其中A∶B∶E的比例一般为3∶6∶1。然而，Clostridium发酵不适合大规模进行，因为它们需要无菌的工艺条件，并且通常对噬菌体感染易感。另一缺点是Clostridium发酵需要在严格的厌氧条件下进行。
真核细胞例如酵母提供了一种非常合适的替代方式，原因是因为基于真核生物的发酵过程可以在低pH下运行，所以真核细胞对噬菌体或其它感染不易感。因此，真核细胞的使用不需要无菌的过程，从而降低了感兴趣的产物的成本价格。
从WO2007/041269中已知一种生产丁醇的酵母。WO2007/041269公开了重组的Saccharomyces cerevisiae，其用至少一种编码下述多肽的DNA分子转化，所述多肽催化丁醇途径的反应之一。然而，本领域已知的经遗传修饰的该Saccharomyces菌株生产的丁醇量对于经济上有吸引力的生产丁醇和乙醇的方法而言仍然不足。
本发明的目的是用于在真核细胞中生产丁醇和乙醇的改进的方法。
根据本发明，用能够以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例生产丁醇和乙醇的真核细胞实现了该目的。
令人惊讶地发现，根据本发明的真核细胞可有利地用于乙醇发酵过程中，例如用于大规模乙醇生产过程中，仅对发酵和蒸馏设备进行较小的改造或不改造，并且与其中溶剂仅为乙醇的乙醇发酵过程中的溶剂产率相比，仅导致略微更低的溶剂(丁醇加乙醇)产率(g溶剂/g糖)。另外，因为与乙醇相比，丁醇对真核细胞更有毒性，所以发现与其中丁醇为唯一溶剂的发酵过程相比，除了丁醇以外还生产乙醇，得到经济的溶剂(丁醇+乙醇)产率是有利的。
根据本发明的真核细胞生产的丁醇∶乙醇比例优选地在1∶3和1∶80之间，优选地在1∶3和1∶50、1∶4到1∶40、1∶5到1∶30之间，优选地在1∶5和1∶20之间，或在1∶5到1∶15之间或1∶6到1∶14之间，或1∶7到1∶13之间，或更优选地在1∶8到1∶12之间，更优选地在1∶9到1∶11之间。在本文中使用时，丁醇∶乙醇的比例以w/w比例为基础。
惊讶地发现，当根据本发明的真核细胞以优选的比例生产丁醇和乙醇时，丁醇在水中天然较差的溶解度可被用于从发酵液中分离丁醇。
优选地，根据本发明的发酵液中真核细胞生产的丁醇量至少为0.4g/l，优选地为0.5g/l，优选地至少为0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或至少15或20g/l丁醇，并通常低于30g/l。
在本文中使用时，术语丁醇被用于表示正丁醇或1-丁醇。
根据本发明的真核细胞通常是重组的真核细胞。重组的真核细胞被定义为下述细胞，所述细胞含有酵母中天然不存在的核苷酸序列和/或蛋白质，或者用酵母中天然不存在的核苷酸序列对所述细胞进行了转化或遗传修饰，或者所述细胞含有内源核酸序列(或蛋白质)的额外的一个或多个拷贝，或者所述细胞含有内源核酸序列的突变、缺失或断裂。
优选地，根据本发明的真核细胞对丁醇和乙醇具有高度耐受。
根据本发明的能够生产丁醇的真核细胞可以是包含生产丁醇的任何合适途径的任何合适的真核细胞。一种合适的途径可以例如是Atsumi et al.(2008)，Nature Letters，Vol.451，p.86-90公开的用于将2-酮酸降解为醇的非发酵途径。优选地，能够生产丁醇的真核细胞包含一种或多种生产乙酰乙酰基-CoA、3-羟基丁酰基-CoA、丁烯酰基-CoA、丁酰基-CoA、丁酰基醛和丁醇的酶。
催化这些产物形成的合适的酶例如是乙酰-CoA乙酰基转移酶或硫解酶(E.C.2.3.1.9)(SEQ ID NO：1)、3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶(E.C.1.1.1.1.57)(SEQ ID NO：2)、3-羟基丁酰基-CoA脱水酶(E.C.4.2.1.55)(SEQ ID NO：3)、丁酰基-CoA脱氢酶(E.C.1.3.99.2)(SEQ ID NO：4)、NAD(P)H-依赖性丁醇脱氢酶(E.C.1.1.1.-)(SEQ ID NO：5)和醇/醛脱氢酶(E.C.1.1.1.1/E.C.1.2.1.10)(SEQ ID NO：6)，丁醇途径的酶可以是与真核细胞同源的和/或异源的。酶可例如来自Clostridium sp.例如Clostridium acetobutylicum或Clostridiumbeijerinckii。
根据本发明的真核细胞可以是任何合适的微生物细胞，优选地是酵母或丝状真菌。优选地，真核细胞属于Pichia、Kluyveromyces、Candida、Saccharomyces、Yarrowia或Rhizopus属。一种更优选的真核细胞属于物种Pichia stipidis、Kluyveromyces lactis、Yarrowia lipolytica、Brettanomycesbruxellensis、Zygosaccharomyces bailii。优选地，根据本发明的真核细胞是酵母细胞，优选地为Saccharomyces sp.，优选地为Saccharomycescerevisiae。
优选地，根据本发明的真核细胞是包含至少一种失活的核苷酸序列的真核细胞，所述核苷酸序列编码生产乙醇所需要的酶。优选地，至少一种失活的核苷酸序列编码醇脱氢酶。
对编码酶的核苷酸序列的失活可以通过核苷酸序列(的部分)的突变、缺失或断裂来实现。
在另一个实施方案中，根据本发明的真核细胞优选地包含编码丁酰基-CoA脱氢酶的核苷酸序列，和至少一种编码异源电子传递黄素蛋白(ETF)的核苷酸序列。根据本发明的真核细胞中的异源电子传递黄素蛋白可以来自任何合适的起源。优选地，ETF来自与丁酰基-CoA脱氢酶相同的起源。优选地，ETF来自原核起源，优选地来自Clostridium sp.，优选地来自Clostridium acetobutylicum，其中ETF包含两个亚基：α亚基(SEQ ID NO：7)和β亚基(SEQ ID NO：9)。
优选地，根据本发明的真核细胞还包含编码异源酶的核苷酸序列，所述异源酶在胞质溶胶中具有将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性。
可能是优选地，具有在胞质溶胶中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性的异源酶是催化丙酮酸转化成为乙酰-CoA的酶，例如丙酮酸：NADP氧化还原酶(E.C.1.2.1.51)。
或者，真核细胞包含编码异源酶的核苷酸序列，所述异源酶催化乙酸转化成为乙酰-CoA，例如乙酰-CoA合成酶(E.C.6.2.1.1)。
优选地，根据本发明的真核细胞包含编码异源酶的核苷酸序列，所述异源酶催化乙醛转化成为乙酰-CoA，优选地为乙酰基化乙醛脱氢酶(E.C.1.2.1.3、E.C.1.2.1.4或E.C.1.2.1.5)。
用于指出给定的(重组)核酸或多肽分子与给定的宿主生物或宿主细胞之间关系时，术语“同源的”被理解为表示在自然界中，核酸或多肽分子由相同物种、优选相同变种或菌株的宿主细胞或生物生产。
当关于核酸(DNA或RNA)或蛋白质使用时，术语“异源的”表示在其存在的生物、细胞、基因组或DNA或RNA序列中天然不作为一部分存在的核酸或蛋白质，或者存在于与其天然存在的不同的细胞或基因组或DNA或RNA序列的一个或多个位置中。异源核酸或蛋白质对于引入它的细胞而言不是内源的，而是得自另一细胞或者是合成或重组生产的。
在本文中使用时，术语“核苷酸序列”包括单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚体，即多核苷酸，并且除非另有限制，其包括具有天然核苷酸主要特性的已知类似物，因为它们能够以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如肽核酸)。多核苷酸可以是天然或异源的结构基因或调节基因的全长或亚序列。除非另有说明，该术语包括特定的序列及其互补序列。因此，主链为了稳定性或其它原因而被修饰的DNA或RNA是该术语在本文中所指的“多核苷酸”。另外，包含稀有碱基(例如肌苷)或经修饰的碱基(例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA是本文所用的术语多核苷酸，其中仅指出两个例子。应当理解，已对DNA和RNA进行了大量不同的修饰，所述修饰发挥了本领域技术人员已知的许多有用目的。在本文中使用时，术语多核苷酸包括这些经化学、酶促或代谢修饰的多核苷酸形式，以及病毒和细胞的特征性DNA和RNA化学形式，所述细胞尤其包括简单细胞和复杂细胞。
在另一方面，本发明涉及在根据本发明能够生产丁醇的真核细胞中提高丁醇生产的方法，所述方法包括对能够生产丁醇的真核细胞种群进行诱变；并针对提高的丁醇生产选择突变的真核细胞种群。优选地进行诱变，使得与初始的真核细胞种群相比，突变的真核细胞种群的20％显示提高的丁醇生产。
可以通过本领域已知的多种方法进行诱变，例如紫外光(UV)诱变、电离辐射或使用诱变剂(mutagentia)。合适的诱变剂是甲磺酸乙酯(EMS)、硫酸二乙酯(DES)、甲磺酸甲酯(MMS)、硫酸二甲酯(DMS)、硝基喹啉氧化物(NQO)、亚硝基胍(NTG)、氮芥(HN2)、β-丙内酯、亚硝酸、亚硝基咪唑烷酮(NIL)和氚标记尿苷。优选地，诱变包括将真核细胞种群在存在NTG时孵育30到60分钟，优选地孵育40到50分钟；并针对提高的丁醇生产选择突变的真核细胞种群。优选地，将存在NTG时真核细胞的所述孵育和针对提高的丁醇生产选择突变的真核细胞重复一次、两次或三次。
优选地，根据本发明的真核细胞包含下述突变，所述突变导致与不包含所述突变的细胞相比提高的丁醇生产，所述突变可以通过根据本发明的用于提高丁醇生产的方法获得。
惊讶地发现，与未进行所述诱变的真核细胞相比，进行了本发明的提高丁醇生产的方法的真核细胞所生产的丁醇量被提高了至少5％，优选地至少10％，优选地至少20％或40％。
优选地，根据本发明的真核细胞是保藏号为CBS 122885的Saccharomyces cerevisiae，或保藏号为CBS 123039的Saccharomycescerevisiae。
优选地，根据本发明的真核细胞能够在任何合适的碳源和/或酵素上生长并将其转化为丁醇和乙醇。合适的碳源为纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖和甘油。
在另一方面，本发明涉及制备丁醇和乙醇的方法，包括在合适的发酵液中发酵根据本发明的真核细胞，其中丁醇和乙醇以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例被生产。根据本发明的丁醇和乙醇制备方法中优选的丁醇∶乙醇比例和优选的生产的丁醇量如上文所述。
惊讶地发现，通过发酵设备的较小改变或者不改变，并且在乙醇和丁醇的回收中不需要额外的能量需求，就可将根据本发明的方法有利地应用于大规模乙醇发酵工厂中。
尽管已知真核细胞例如Saccharomyces cerevisiae生产乙醇和丁醇，但是我们首先发现以工业规模发酵能够生产丁醇和乙醇的真核细胞是经济上有吸引力的方法。因此，根据本发明的用于生产丁醇和乙醇的方法优选地以工业规模进行。
在本文中使用工业规模表示丁醇和乙醇的制备，所述制备在至少1、2、4、5、10m3(立方米)，优选地至少20、30、50或至少100m3(立方米)，200或500m3或至少1000到2000m3的(发酵)体积中进行。丁醇和乙醇制备方法中的真核细胞可以是如上文所述根据本发明能够生产丁醇的任何合适的真核细胞。
根据本发明的丁醇和乙醇制备方法中的发酵液可包含特定真核细胞生长和丁醇与乙醇的发酵生产所必需的任何合适的养分。真核细胞生长和丁醇生产的必需养分是本领域技术人员已知的。优选地，发酵液包含碳源例如纤维素、半纤维素、果胶、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、果糖、麦芽糖、麦芽糖糊精、核糖、核酮糖或淀粉、淀粉衍生物、蔗糖、乳糖、脂肪酸、甘油三酯和甘油。碳源可来自甜菜、甘蔗或玉米，但不限于此，优选地为含有纤维素或半纤维素的来源。优选地，发酵液包含氮源例如尿素，或铵盐例如硫酸铵、氯化铵、硝酸铵或磷酸铵。
根据本发明的用于生产丁醇和乙醇的发酵过程可以是需氧或厌氧的发酵过程。
厌氧的发酵过程在本文中定义为在无氧时或者基本不消耗氧，优选地消耗少于5、2.5或1mmol/L/h氧时运行的发酵过程，并且其中有机分子发挥电子供体和电子受体两种作用。根据本发明的发酵过程也可以首先在需氧条件下运行，随后在厌氧条件下运行。
发酵过程也可以在氧有限的、或微需氧的条件下运行。或者，发酵过程可以首先在需氧条件下运行，随后在氧有限的条件下运行。氧有限的发酵过程是下述过程，其中氧消耗受到从气体转移至液体的氧的限制。氧限制的程度由进入气流的量和组成以及使用的发酵设备的实际混合/物量转移特性决定。优选地，在氧有限条件下的过程中，氧消耗速率为约5.5mmol/L/h，更优选地约为6mmol/L/h，进一步更优选地约为7mmol/L/h。
根据本发明的生产丁醇和乙醇的方法可以在任何合适的温度下进行，优选地在10和45℃之间，优选地在15和40℃之间，优选地在20和35℃之间，或在25和40℃之间。根据本发明的生产丁醇和乙醇的方法可以在任何合适的pH值下进行，例如在2和9之间，优选地在2.5和8之间。发酵液中的pH优选地具有低于7、6，优选地低于5.5，优选地低于5，优选地低于4.5，优选地低于4的值，优选地低于pH 3.5或低于pH 3.0，优选地高于pH 2.5。
在一个优选的实施方案中，根据本发明的用于生产丁醇和乙醇的方法包括从乙醇中分离丁醇，以获得含有少于1％w/w(优选地少于0.5％w/w)丁醇的乙醇，和包含少于1％w/w(优选地少于0.5％w/w)乙醇的丁醇。优选地，所述从乙醇中分离丁醇如下文所述通过蒸馏进行。
在根据本发明的方法的一个优选的实施方案中，从发酵液中回收丁醇和乙醇。
对丁醇和乙醇的回收可以通过本领域已知的任何合适的方法进行，所述方法例如蒸馏、吸附、真空提取、溶剂提取或渗透蒸发(pervaporation)。优选通过蒸馏从发酵液中回收丁醇和乙醇。优选通过下文所述用于回收丁醇和乙醇的方法回收在根据本发明的丁醇和乙醇制备方法中生产的丁醇和乙醇。
在另一方面，本发明涉及从水性溶液中回收丁醇和乙醇的方法，所述水性溶液以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例包含丁醇和乙醇，所述方法包括从水性溶液中分离乙醇/丁醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离丁醇/水混合物；和回收丁醇和乙醇。
惊讶地发现，根据本发明的从包含丁醇和乙醇的水性溶液中回收丁醇和乙醇的方法可通过蒸馏设备的较小改变，有利地用于大规模乙醇发酵过程中。包含丁醇和乙醇的水性溶液可以是任何合适的水性溶液。优选所述水性溶液是发酵液。发酵液可以以1∶2到1∶100的比例包含丁醇和乙醇。优选地，通过制备丁醇和乙醇的下述方法获得发酵液，所述方法包括发酵上文所公开的根据本发明的真核细胞。水性溶液优选地以上文确定的优选的丁醇∶乙醇比例包含丁醇和乙醇。
通常，从以1∶2到1∶100的比例包含丁醇∶乙醇的水性溶液中分离乙醇/丁醇/水混合物通过通常在塔中的蒸馏(提馏)，在任何合适的温度下进行，所述温度可取决于水性溶液中丁醇和乙醇的浓度和比例。优选地在塔中通过蒸馏进行乙醇/丁醇/水混合物的分离，其中底部温度在90℃到110℃之间，优选地在95℃和105℃之间，优选地在98℃和102℃之间，优选地在99℃和101℃之间。优选地，在本发明的回收方法中用于分离(蒸馏)乙醇/丁醇/水混合物的塔顶部的温度在70℃和90℃之间，优选地在75℃和85℃之间，优选地在78℃和83℃之间，优选地在79℃和81℃之间进行。用于蒸馏丁醇/乙醇/水混合物的塔的顶部和底部温度通常取决于乙醇/丁醇/水混合物中丁醇和乙醇的浓度和比例，和操作压强。
从水性溶液中分离的乙醇/丁醇/水混合物可包含任何合适的溶剂浓度。在本文中使用时，溶剂被定义为乙醇和丁醇的总和。优选地，乙醇/丁醇/水混合物包含40和80wt％之间的溶剂，优选地45和75wt％之间、优选地50和70wt％之间、优选地55和65wt％之间、优选地58和63wt％之间的溶剂。
通常，通过通常在塔中的蒸馏从乙醇/丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物，其中底部温度在90℃和110℃之间，优选地在95℃和105℃之间，优选地在98℃和102℃之间，优选地在99℃和101℃之间。通过蒸馏分离乙醇/水混合物的塔顶部的温度在70℃和90℃之间，优选地在75℃和85℃之间，优选地在78℃和83℃之间，优选地在79℃和81℃之间。用于分离乙醇/水混合物的塔的顶部和底部温度通常取决于乙醇/丁醇/水混合物中丁醇和乙醇的浓度和比例，以及操作压强。
通常，通过通常在塔中进行的蒸馏，从乙醇/丁醇/水混合物中分离丁醇/水混合物。优选地，用于分离丁醇/水混合物的塔的底部温度在100℃和140℃之间，例如在105℃和135℃、110℃和130℃、115℃和128℃之间，118℃和127℃之间，或119℃和125℃之间。通过蒸馏分离丁醇/水混合物的塔顶部优选地具有70℃和100℃之间，例如75℃和95℃之间，78℃和90℃之间的温度。用于分离丁醇/水混合物的塔的顶部和底部温度通常取决于乙醇/丁醇/水混合物中丁醇和乙醇的浓度和比例，以及操作压强。
在分离乙醇/水混合物之后进行丁醇/水混合物分离的情况下，丁醇/水混合物的分离用下述(第二)乙醇/丁醇/水/混合物进行，所述混合物通常包含提高的丁醇比乙醇的比例。
从乙醇/丁醇/水混合物中(优选地通过蒸馏)分离丁醇/水混合物可包括使部分乙醇/丁醇/水混合物达到10℃和40℃之间，优选地20℃和30℃之间的温度。优选地，达到所述温度范围的部分乙醇/丁醇/水混合物包含比乙醇更大量的丁醇，优选地5wt％和90wt％之间，10wt％和80wt％之间，20wt％和70wt％之间，优选地30wt％和60wt％之间，优选地40wt％和60wt％之间的丁醇，和0.1wt％和10wt％之间，例如1wt％和5wt％之间的乙醇。优选地，将冷却的乙醇/丁醇/水混合物加入不混溶的液液分离器中，优选地加入重力倾析器中，所述冷却的乙醇/丁醇/水混合物即达到10℃和40℃之间温度范围的乙醇/丁醇/水混合物。发现使部分乙醇/丁醇/水混合物达到10℃和40℃之间的温度是有利的，因为这导致以较小的投资和对乙醇回收过程的改变有效地回收丁醇。
在根据本发明的用于回收乙醇和丁醇的方法中，乙醇和丁醇可以以任何合适的形式被回收。乙醇和/或丁醇可包含水，这是所谓的含水乙醇和/或含水丁醇。含水乙醇或含水丁醇典型地包含至少2v/v％的水，例如至少5、10、20或30％v/v的水，但是通常低于50％v/v的水。
或者，可以以无水形式回收乙醇和/或丁醇，即乙醇和/或丁醇包含1v/v％或更少的水。在以无水形式回收丁醇和/或乙醇的情况下，根据本发明的用于回收丁醇和乙醇的方法还包括干燥乙醇/水混合物和/或丁醇/水混合物和/或乙醇/丁醇/水混合物，获得无水乙醇和/或无水丁醇。干燥可以通过已知技术进行，例如共沸剂蒸馏(entrainer distillation)、分子筛、膜气相分离或渗透蒸发。
根据本发明的用于回收丁醇和乙醇的方法中，不同的蒸馏步骤和/或干燥可以以任何合适的顺序进行。优选地，根据本发明的用于回收丁醇和乙醇的方法包括从水性溶液中分离乙醇/丁醇/水混合物的第一步骤。对乙醇/水混合物和丁醇/水混合物的分离可以同时或相继进行。
根据本发明的用于回收丁醇和乙醇的方法可以在任何合适的压强下进行，优选地在大气压下进行。应当理解，当蒸馏期间的压强偏离大气压时，上文定义的不同混合物的蒸馏(分离)所优选的温度范围可以改变。压强和温度之间的关系是本领域技术人员已知的。
优选地，用于回收丁醇和乙醇的方法以工业规模进行。优选地，用于以工业规模回收丁醇和乙醇的方法包括用于蒸馏的塔，所述塔可包含5到60个理论级，优选地包含10到50个理论级，优选地包含15到30个理论级。理论级是蒸馏技术领域的技术人员的普遍理解。优选地，用于蒸馏的塔的直径为0.5米到10米，优选地在1米和5米之间。不同的蒸馏可包含大小不同的塔。
可以纯化从水性溶液中回收的丁醇。丁醇的纯化可以通过蒸馏或者本领域技术人员已知的任何其它分离步骤进行。
以下的附图说明展示了根据本发明的用于回收乙醇和丁醇的方法的优选的实施方案。
图1显示的框图阐述了通过发酵对乙醇和丁醇的生产及其回收。设备1在水性环境中包含能够在本领域技术人员已知的条件下生产乙醇和丁醇的真核细胞。流046由真核细胞生产乙醇和丁醇所需要的以及真核细胞的生长所需要的所有底物组成。离开设备1的流048是以1∶2到1∶100的丁醇∶乙醇比例包含丁醇和乙醇的水性流。流048被补入设备2中，在设备2中溶剂从水流中被回收。大部分水作为流049离开设备2，而乙醇和丁醇分别作为流045和047离开设备2。
图2展示的框图展示了来自图1的设备2的一种优选的实施方案。包含乙醇和丁醇的水性流010被补入塔3中。在进入塔之前，可以通过例如与流002热交换将流010预热。在塔3中，从流010中脱去溶剂，产生不含溶剂的水性底部流002和塔3顶部富含溶剂的蒸汽流001。塔3包含用于分离乙醇和丁醇的足量理论级。可以通过再沸器或直接注入蒸汽对塔3供热。任选地使用小型冷凝器产生一些回流。在这种情况下，001应当是从接近塔顶部处抽取的测流。将离开塔3的蒸汽流001补入塔4中，所述塔4包含通过回流在塔顶部浓缩不含丁醇的乙醇的足量级别。接近共沸物的乙醇水混合物作为流003离开塔4顶部。从塔中抽取富含丁醇的液体测流006，冷却至10-40℃后补入不混溶的液液分离器5中，优选地补入重力倾析器中。冷却的液体会在含8-12wt％溶剂的流009和含约70-80wt％溶剂的流007中分离。在低于测流抽取塔盘处，将009层补入塔3中，并将007层循环进塔4中。任选地使用热流006加热其它冷流。脱水丁醇从塔4底部作为流004抽取。任选地，更高级的醇(杂醇)从塔4中作为测流005抽取。通过再沸器对塔4供热。在丁醇流004包含杂质的情况下，可优选将流004补入塔6中，在塔6中沸腾温度比丁醇更高的组分通过回流作为底部流008与丁醇分离。丁醇作为塔6的顶部产物，作为流050被收集。使用再沸器对塔6供热。
图3中展示了来自图1的用于回收丁醇和乙醇的设备2的另一个优选的实施方案。图3显示框图，其中包含乙醇和丁醇的水性流044被补入塔7中。在进入柱之前，可以通过例如与物理036热交换而预热流044。在塔7中，从流044中脱去溶剂，产生不含溶剂的水性底部流036和塔7顶部富含溶剂的蒸汽流035。塔7具有用于分离的足量理论级。可以通过再沸器或直接注入蒸汽对塔7供热。任选地使用小型冷凝器产生一些回流。在这种情况下，035应当是从接近塔顶部处抽取的测流。将离开塔7的蒸汽流035补入塔8中，所述塔8具有通过回流在塔顶部浓缩不含丁醇的乙醇的足量理论级。将接近共沸物的乙醇水混合物作为流037从该塔顶部抽取。从塔中抽取富含丁醇的液体测流040，冷却至20-30℃后补入不混溶的液液分离器9中，优选地补入重力倾析器中。冷却的液体会在约含8-12wt％溶剂的流043和约含70-80wt％溶剂的流041中分离。在高于测流抽取塔盘处，将流043循环进塔8中。将流041补入塔10中，在塔10中丁醇在回流条件下被脱水。经脱水的丁醇作为底部流042离开塔10，任选地该流被引入分离的塔例如塔6中，以进一步纯化产物。水和剩余的乙醇作为流038离开塔10，并且可以被循环进塔7中。任选地使用热流040加热其它冷流。从塔8底部抽取不含溶剂的水作为流038。任选地，从塔8中抽取更高级的醇(杂醇)作为测流039。通过再沸器或直接注入蒸汽对塔8供热。
图4中展示了图1的用于回收丁醇和乙醇的设备2的另一个优选的实施方案。图4展示了包含水性流012的框图，所述水性流012包含乙醇和丁醇，其被补入塔11中。在进入塔之前，可以通过例如与流013热交换将流012预热。在塔11中，从流012中脱去溶剂，产生不含溶剂的水性底部流013和塔11顶部富含溶剂的蒸汽流011。塔11包含用于溶剂分离的足量理论级。可以通过再沸器或直接注入蒸汽对塔11供热。任选地使用小型冷凝器产生一些回流。在这种情况下，011应当是从接近塔顶部处抽取的测流。将离开塔11的蒸汽流011补入塔12中，所述塔12具有通过回流在塔顶部浓缩不含丁醇的乙醇的足量理论级。从该塔顶部抽取接近共沸物的乙醇水混合物作为流014。任选地，更高级的醇(杂醇)从塔4中作为测流018抽取。离开塔12底部的流015含有大部分水和丁醇，其被补入塔13中。由于在塔13中的回流，乙醇和一些水作为顶部流017离开该塔。从塔中抽取富含丁醇的测流019，并且在冷却至20-30℃后补入不混溶的液液分离器14中，优选地补入重力倾析器中。冷却的液体会在约含8-12wt％溶剂的流023和约含70-80wt％溶剂的流020中分离。在低于测流抽取塔盘处，将023层补入塔11中，并将020层循环进塔13中。任选地使用热流019加热其它冷流。脱水丁醇从塔13底部作为流016抽取。通过再沸器对塔13供热。可以将流016补入塔185中，在塔15中沸腾温度比丁醇更高的组分通过回流作为底部流022与丁醇分离。丁醇作为塔15的顶部产物，作为流021被收集。使用再沸器对塔15供热。
图5中展示了图1中设备2的另一个优选的实施方案。图5展示了包含水性流025的框图，所述水性流025包含乙醇和丁醇，其被补入塔16中。在进入塔之前，可以通过例如与流026热交换将流025预热。在塔16中，从流025中脱去溶剂，产生不含溶剂的水性底部流026和塔16顶部富含溶剂的蒸汽流024。可以通过再沸器或直接注入蒸汽对塔16供热。任选地使用小型冷凝器产生一些回流。在这种情况下，024应当是从接近塔16顶部处抽取的测流。将离开塔16的蒸汽流024补入塔17中，所述塔17具有通过回流在塔顶部浓缩乙醇和丁醇的足量理论级。从塔17顶部抽取接近共沸物的乙醇/丁醇/水混合物作为流027。将流027引入分子筛
Figure GPA00001008987800131
变压体系18中用于脱水。将富含水的流051补回塔17，并将经脱水的流029补入塔19中。任选地，更高级的醇(杂醇)从塔17中作为测流032抽取。水作为流028离开塔17底部。在塔19中，流029通过回流分为由脱水乙醇组成的顶部流031，和由脱水丁醇组成的底部流030。使用再沸器对塔19供热。可以将流030补入塔20中，在塔20中通过回流，更高的沸腾组分作为底部流034与丁醇分离。丁醇作为塔20的顶部产物，作为流033被收集。使用再沸器对塔20供热。
本发明另一方面涉及下述发酵液，所述发酵液可以通过根据本发明的用于以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例制备丁醇和乙醇的方法获得。
本发明还涉及通过根据本发明的方法回收的丁醇和/或乙醇作为化学品或作为燃料的用途。丁醇作为化学品的用途的例子是例如在有机化学中丁醇作为溶剂的用途，或者作为生产丁酯或醚例如丙烯酸丁酯的原材料的用途。或者，本发明的丁醇可以被用作燃料，例如用作燃料例如汽油或柴油的添加剂。
附图说明
图1.框图，其阐述了通过在设备1中发酵和在设备2中从水性流中分离乙醇和丁醇，生产乙醇和丁醇的方法。
图2.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中乙醇作为含水乙醇和含水丁醇被回收。
图3.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中乙醇作为含水乙醇被回收，无水丁醇以无水形式被回收。
图4.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中乙醇作为含水乙醇和含水丁醇被回收。
图5.图1的设备2的一个例子的框图，其用于从水性流中回收乙醇和丁醇，其中回收无水乙醇和无水丁醇。
以下的实施例仅用于阐述的目的，不应理解为限制本发明。
实施例
实施例1构建包含adh敲除、ETF和acdh的Saccharomyces cerevisiae， 和之后的经典菌株选育(CSI)。
1.1.构建生产丁醇的酵母菌株并敲除ADH1和ADH2基因
表1中列出该实验中使用的从乙酰-CoA生物合成丁醇中涉及的Clostridium acetobutylicum酶。如WO2008/000632中所述，针对S.cerevisiae对该酶进行了密码子对优化，并且其通过表1中所列的酵母启动子和终止子进行表达。
在GENEART AG(Regensburg，德国)设计并合成两种酵母整合启动子(pBOL34[SEQ ID NO：13]和pBOL36[SEQ ID NO：14])，所述启动子中每一种含有涉及丁醇生物合成的来自pBOL34[SEQ ID NO：13]andpBOL36[SEQ ID NO：14]的六种经密码子对优化的基因中的三种。
基因ThiL、Hbd和Crt通过含有AmdS选择标记物的pBOL34表达。最后三种基因Bcd、BdhB和AdhE通过具有AmdS选择标记物的、称作pBOL36的整合载体表达。
表1：用于在S.cerevisiae中生产丁醇的基因和酶，包含启动子(1000bp)和终止子(500bp)。
  基因   活性   启动子   终止子
  ThiL   乙酰CoA c-乙酰基转移酶[E.C.2.3.1.9]SEQ ID NO：1   ADH1   TDH1
  Hbd   3-羟基丁酰-CoA脱氢酶[E.C.1.1.1.157]SEQ ID NO：2   ENO1   PMA1
  Crt   3-羟基丁酰-CoA脱氢酶[E.C.4.2.1.55]SEQ ID NO：3   TDH1   ADH1
  Bcd   丁酰基-CoA脱氢酶[E.C.1.3.99.2]SEQ ID NO：4   PDC1   TDH1
  BdhB   NADH-依赖性丁醇脱氢酶[E.C.1.1.1.-]SEQ ID NO：5   ENO1   PMA1
  adhE   醇/乙醛CoA脱氢酶[E.C.：1.1.1.1/1.2.1.10]SEQ ID NO：6   TDH1   ADH2
为了整合进ADH2基因座中，通过BsaBI消化将pBOL36线性化。用线性化的片段转化S.cerevisiae CEN.PK113-5D(MATa MAL2-8c SUC2ura3-52)，并在含YCB(Difco)和5mM乙酰胺作为氮源的平板上培养。
通过将转化体在2ml管中YEPD中于30℃培养6小时，通过重组去除AmdS标记物。随后将细胞涂布在1.8％琼脂培养基上，所述培养基含有YCB(Difco)和40mM氟乙酰胺和30mM磷酸盐缓冲液pH 6.8，其仅支持丢失AmdS标记物的细胞生长。通过PCR验证正确的整合和重组。使用以下的引物验证上游片段的正确整合：
P1：5’-GAATTGAAGGATATCTACATCAAG-3’和
P2：5’-CCCATCTACGGAACCCTGATCAAGC-3’。
用以下的引物验证下游片段的正确整合：
P3：5’-GATGGTGTCACCATTACCAGGTCTAG-3’和
P4：5’-GTTCTCTGGTCAAGTTGAAGTCCATTTTGATTGATTTGACTGTGTTATTTTGCGTG-3’。
得到的菌株命名为BLT021。
通过PsiI消化线性化pBOL34，并整合进BLT021的ADH1基因座中。在含有YCB(Difco)和5mM乙酰胺的平板上培养转化体。为了去除AmdS选择标记物，将菌落接种于YEPD中并在2ml管中于30℃培养6小时。将细胞涂布在YCB(Difco)和40mM氟乙酰胺和0.1％硫酸铵上。
通过PCR验证正确的整合和重组。使用以下的引物组验证上游片段的正确整合：
P5：5’-GAACAATAGAGCGACCATGACCTTG-3’和
P6：5’-GACATCAGCGTCACCAGCCTTGATG-3’。
使用以下的引物组验证下游片段的正确整合：
P7：5’-GATTGAAGGTTTCAAGAACAGGTGATG-3’和
P8：5’-GGCGATCAGAGTTGAAAAAAAAATG-3’。
得到的菌株命名为BLT057。
1.2.在BLT057中引入ETFα、ETFβ和AcDH67(lin1129)
如WO2008/000632中所述，将电子传递黄素蛋白ETFα[SEQ ID NO：7]、ETFβ[SEQ ID NO：9]和乙酰基化乙醛脱氢酶Listeria Innocua lin1129(本文中称作Acdh67)[SEQ ID NO：11]针对S.cerevisiae进行了密码子对优化，并通过如表2中所列的酵母启动子和终止子表达。
表2：用于在S.cerevisiae中表达密码子对经优化的(CpO)ETF基因和Acdh67基因的启动子和终止子
  启动子   终止子
  Etfα(CpO)SEQ ID NO：8   tef1   tdh2
  Etfβ(CpO)SEQ ID NO：10   tdh2   tef1
  Acdh 67(lin 1129Ec)SEQ ID NO：12   tdh3   Adh
表达ETFα、ETFβ和Acdh67(pBOL120，[SEQ ID NO：15])的整合载体由Geneart AG合成。
用StuI线性化载体，并整合进菌株BLT057的ura3-52基因座中。
在含有/不含有氨基酸+2％半乳糖的YNB(Difco)中培养转化体，以选择尿嘧啶原养型菌株。基因组中整合了pBOL120的来自菌株BLT057的菌株被命名为菌株：BLT075。
1.3.亚硝基胍诱变(NTG)诱变
在含Verduyn培养基(Verduyn et al.，1992，Yeast 8：501-517)+4％半乳糖的25ml摇瓶中，用甘油菌种接种菌株BLT075。在OD600～1时将培养物离心。
用15ml无菌MilliQ和tris马来酸盐缓冲液重悬沉淀物。
接着添加0.025、0.05或0.1mg/ml NTG，并在摇动的水浴中于25℃孵育45分钟。通过添加Na2S2O3·5H2O(1.67％w/v终浓度)终止诱变。将细胞离心并用生理盐水冲洗。将突变的批次涂板并在30℃孵育，测定存活率。
选择的突变体来自于存活率在14％和73％之间的批次。
在含有4ml Verduyn培养基和4％(w/v)半乳糖的24孔平板中针对丁醇生产筛选数千菌落。在30℃培养72小时后，将24孔板离心，并通过GC分析测定上清液中的丁醇浓度。
选择最好的500个在摇瓶中进一步测试。用来自24孔板预培养物的0.5ml培养物接种含50ml Verduyn培养基(含4％半乳糖)的100ml摇瓶。将摇瓶在Infors摇床中于180rpm和30℃下培养72小时。将培养物离心，并如下文所述通过GC测定上清液中的丁醇和乙醇浓度。
针对提高的丁醇生产选择突变体Saccharomyces cerevisiae BLT196和BLT189(表3)。这些突变体根据布达佩斯条约的条款于2008年4月25日和2008年6月16日分别以登录号CBS 122885和CBS 123039保藏于CBS(Centraalbureau voor Schimmelcultures，P.O.Box 85167，3508AD UTRECHT，荷兰)。
表3：丁醇相对于糖的产率(Ybs)，以克/克为单位。乙醇相对于糖的产率(Yes)和丁醇∶乙醇比例。
  菌株   Ybs(g/g)   Yes(g/g)   比例
  BLT196CBS 122885   0.026   0.257   1∶10
  BLT189CBS 123039   0.023   0.258   1∶11
  BLT075   0.017   0.211   1∶12
  CEN.PK113-7D   0   0.34   -
该实施例显示：在生产丁醇的酵母中，诱变提高了丁醇生产。
1.4.GC分析
测定培养物上清液中的丁醇浓度。在装有火焰电离检测器和自动注射体系的HS-GC上分析样品。柱J&W DB-1长度30m，id 0.53mm，df 5μm。使用以下条件：使用氦作为载气，流速5ml/分钟。将柱温度设定为110℃。将注射器设定为140℃并在300℃下进行检测。使用Chromeleon软件获得数据。在顶空采样器中将样品于60℃加热20分钟。1ml顶空挥发物被自动地注射在柱上。
实施例2将现有的乙醇蒸馏系统改造为能够回收乙醇和丁醇二者的系 统。
使用过程模型软件包(Process modeling package)Aspen Plus 2006.5模拟现有乙醇工厂的蒸馏部分，并且计算将该工厂转化为乙醇/丁醇工厂所需的改造。
2.1.针对乙醇生产，模拟现有乙醇工厂
模拟其中仅生产乙醇的现有乙醇工厂。在这种情况下，仅使用图2的塔3和塔4。乙醇从洗提塔(stripper column)3中回收，其中在与洗提塔3的底部流热交换后，将约含7.3wt％乙醇的发酵液010补入塔顶部。通过直接注入流，将乙醇从发酵液中脱去，得到包含63.5wt％乙醇的蒸汽流001。离开洗提塔底部的液体流002包含0.01wt％乙醇。将富含乙醇的蒸汽补入塔4中，其中通过回流将乙醇在塔顶部浓缩至93.2wt％乙醇。离开塔4底部的水包含少于0.01wt％的乙醇。通过直接注入流对塔供热。用于两种塔的流为130℃。
2.2.针对乙醇和丁醇生产，模拟现有的乙醇工厂
模拟现有的乙醇工厂其中丁醇和乙醇溶液以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例生产。仅使用图2的塔3和塔4。假设用丁醇代替补料中的部分乙醇，得到6.3wt％乙醇和1wt％丁醇。这导致离开塔3顶部的蒸汽流，其含有54.6wt％乙醇和8.7wt％丁醇。离开塔3底部的水包含少于0.01wt％的乙醇和少于0.01wt％丁醇。在塔4中，在塔顶部浓缩并收获乙醇和丁醇二者。乙醇和丁醇浓度分别为66.8wt％和10.6wt％，这表示该流中剩余22.6wt％水。塔4中达到的浓缩因数是最小的。
2.3.针对乙醇和丁醇生产，模拟改造的乙醇工厂
模拟改造的乙醇工厂，其中以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例生产丁醇和乙醇溶液，如图2中所示。假设用丁醇代替补料中的部分乙醇，得到6.3wt％乙醇和1wt％丁醇。这导致离开塔3顶部的蒸汽流，其含有54.6wt％乙醇和8.7wt％丁醇。离开塔3底部的水包含少于0.01wt％的乙醇和少于0.01wt％的丁醇。
通过从塔4中抽取含54.7wt％丁醇、2.2wt％乙醇和43.1wt％水的测流并将其冷却至30℃，使用相分离的天然趋势破坏丁醇-水共沸物。测流质量流(mass flow)约为来自塔3的补料流的1.3倍。在比抽取测流的塔盘低一个塔盘处，将富含溶剂的相007补回塔4中。富含溶剂的相由73.6wt％丁醇、2.5wt％乙醇和23.9wt％水组成。水层由89.3wt％水、9.2wt％丁醇和1.5wt％乙醇组成，并且被补入塔3中。藉此可以在塔4底部收获纯丁醇，同时仍然在整流器顶部生产含7wt％水的含水乙醇。使用再沸器提供塔4需要的热。该丁醇-乙醇回收体系的每吨溶剂的总热量需求与乙醇回收体系相似。用于回收丁醇和乙醇的塔3和塔4中的气流也与用于单独回收乙醇的塔3和塔4中的气流相当。
该实施例显示，为了从以100∶1到2∶1的比例制备乙醇∶丁醇的方法中回收乙醇和丁醇二者，需要对现有乙醇蒸馏装置进行较小的改造(安装倾析器和再沸器)。
 申请人或代理人文件参考编号26630WO   国际申请号：
与被保藏的微生物相关的说明
(PCT Rule 13bis)
Figure GPA00001008987800201
 申请人或代理人文件参考编号26630WO   国际申请号：
与被保藏的微生物相关的说明
(PCT Rule 13bis)
序列表
<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司
L.M.拉姆斯多克
E.K.迪克
<120>用于制备丁醇和乙醇的方法
 
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<140>26630WO
<141>2008-07-11
 
<160>23
 
<170>PatentIn version 3.2
 
<210>1
<211>392
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>1
 
Met Lys Glu Val Val Ile Ala Ser Ala Val Arg Thr Ala Ile Gly Ser
1               5                   10                  15
Tyr Gly Lys Ser Leu Lys Asp Val Pro Ala Val Asp Leu Gly Ala Thr
            20                  25                  30
Ala Ile Lys Glu Ala Val Lys Lys Ala Gly Ile Lys Pro Glu Asp Val
        35                  40                  45
Asn Glu Val Ile Leu Gly Asn Val Leu Gln Ala Gly Leu Gly Gln Asn
    50                  55                  60
Pro Ala Arg Gln Ala Ser Phe Lys Ala Gly Leu Pro Val Glu Ile Pro
65                  70                  75                  80
Ala Met Thr Ile Asn Lys Val Cys Gly Ser Gly Leu Arg Thr Val Ser
                85                  90                  95
Leu Ala Ala Gln Ile Ile Lys Ala Gly Asp Ala Asp Val Ile Ile Ala
            100                 105                 110
Gly Gly Met Glu Asn Met Ser Arg Ala Pro Tyr Leu Ala Asn Asn Ala
        115                 120                 125
Arg Trp Gly Tyr Arg Met Gly Asn Ala Lys Phe Val Asp Glu Met Ile
    130                 135                 140
Thr Asp Gly Leu Trp Asp Ala Phe Asn Asp Tyr His Met Gly Ile Thr
145                 150                 155                 160
Ala Glu Asn Ile Ala Glu Arg Trp Asn Ile Ser Arg Glu Glu Gln Asp
                165                 170                 175
Glu Phe Ala Leu Ala Ser Gln Lys Lys Ala Glu Glu Ala Ile Lys Ser
            180                 185                 190
Gly Gln Phe Lys Asp Glu Ile Val Pro Val Val Ile Lys Gly Arg Lys
        195                 200                 205
Gly Glu Thr Val Val Asp Thr Asp Glu His Pro Arg Phe Gly Ser Thr
    210                 215                 220
Ile Glu Gly Leu Ala Lys Leu Lys Pro Ala Phe Lys Lys Asp Gly Thr
225                 230                 235                 240
Val Thr Ala Gly Asn Ala Ser Gly Leu Asn Asp Cys Ala Ala Val Leu
                245                 250                 255
Val Ile Met Ser Ala Glu Lys Ala Lys Glu Leu Gly Val Lys Pro Leu
            260                 265                 270
Ala Lys Ile Val Ser Tyr Gly Ser Ala Gly Val Asp Pro Ala Ile Met
        275                 280                 285
Gly Tyr Gly Pro Phe Tyr Ala Thr Lys Ala Ala Ile Glu Lys Ala Gly
    290                 295                 300
Trp Thr Val Asp Glu Leu Asp Leu Ile Glu Ser Asn Glu Ala Phe Ala
305                 310                 315                 320
Ala Gln Ser Leu Ala Val Ala Lys Asp Leu Lys Phe Asp Met Asn Lys
                325                 330                 335
Val Asn Val Asn Gly Gly Ala Ile Ala Leu Gly His Pro Ile Gly Ala
            340                 345                 350
Ser Gly Ala Arg Ile Leu Val Thr Leu Val His Ala Met Gln Lys Arg
        355                 360                 365
Asp Ala Lys Lys Gly Leu Ala Thr Leu Cys Ile Gly Gly Gly Gln Gly
    370                 375                 380
Thr Ala Ile Leu Leu Glu Lys Cys
385                 390
 
<210>2
<211>282
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>2
 
Met Lys Lys Val Cys Val Ile Gly Ala Gly Thr Met Gly Ser Gly Ile
1               5                   10                  15
Ala Gln Ala Phe Ala Ala Lys Gly Phe Glu Val Val Leu Arg Asp Ile
            20                  25                  30
Lys Asp Glu Phe Val Asp Arg Gly Leu Asp Phe Ile Asn Lys Asn Leu
        35                  40                  45
Ser Lys Leu Val Lys Lys Gly Lys Ile Glu Glu Ala Thr Lys Val Glu
    50                  55                  60
Ile Leu Thr Arg Ile Ser Gly Thr Val Asp Leu Asn Met Ala Ala Asp
65                  70                  75                  80
Cys Asp Leu Val Ile Glu Ala Ala Val Glu Arg Met Asp Ile Lys Lys
                85                  90                  95
Gln Ile Phe Ala Asp Leu Asp Asn Ile Cys Lys Pro Glu Thr Ile Leu
            100                 105                 110
Ala Ser Asn Thr Ser Ser Leu Ser Ile Thr Glu Val Ala Ser Ala Thr
        115                 120                 125
Lys Arg Pro Asp Lys Val Ile Gly Met His Phe Phe Asn Pro Ala Pro
    130                 135                 140
Val Met Lys Leu Val Glu Val Ile Arg Gly Ile Ala Thr Ser Gln Glu
145                 150                 155                 160
Thr Phe Asp Ala Val Lys Glu Thr Ser Ile Ala Ile Gly Lys Asp Pro
                165                 170                 175
Val Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Phe Val Val Asn Arg Ile Leu Ile
            180                 185                 190
Pro Met Ile Asn Glu Ala Val Gly Ile Leu Ala Glu Gly Ile Ala Ser
        195                 200                 205
Val Glu Asp Ile Asp Lys Ala Met Lys Leu Gly Ala Asn His Pro Met
    210                 215                 220
Gly Pro Leu Glu Leu Gly Asp Phe Ile Gly Leu Asp Ile Cys Leu Ala
225                 230                 235                 240
Ile Met Asp Val Leu Tyr Ser Glu Thr Gly Asp Ser Lys Tyr Arg Pro
                245                 250                 255
His Thr Leu Leu Lys Lys Tyr Val Arg Ala Gly Trp Leu Gly Arg Lys
            260                 265                 270
Ser Gly Lys Gly Phe Tyr Asp Tyr Ser Lys
        275                 280
 
<210>3
<211>261
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>3
 
Met Glu Leu Asn Asn Val Ile Leu Glu Lys Glu Gly Lys Val Ala Val
1               5                   10                  15
Val Thr Ile Asn Arg Pro Lys Ala Leu Asn Ala Leu Asn Ser Asp Thr
            20                  25                  30
Leu Lys Glu Met Asp Tyr Val Ile Gly Glu Ile Glu Asn Asp Ser Glu
        35                  40                  45
Val Leu Ala Val Ile Leu Thr Gly Ala Gly Glu Lys Ser Phe Val Ala
    50                  55                  60
Gly Ala Asp Ile Ser Glu Met Lys Glu Met Asn Thr Ile Glu Gly Arg
65                  70                  75                  80
Lys Phe Gly Ile Leu Gly Asn Lys Val Phe Arg Arg Leu Glu Leu Leu
                85                  90                  95
Glu Lys Pro Val Ile Ala Ala Val Asn Gly Phe Ala Leu Gly Gly Gly
            100                 105                 110
Cys Glu Ile Ala Met Ser Cys Asp Ile Arg Ile Ala Ser Ser Asn Ala
        115                 120                 125
Arg Phe Gly Gln Pro Glu Val Gly Leu Gly Ile Thr Pro Gly Phe Gly
    130                 135                 140
Gly Thr Gln Arg Leu Ser Arg Leu Val Gly Met Gly Met Ala Lys Gln
145                 150                 155                 160
Leu Ile Phe Thr Ala Gln Asn Ile Lys Ala Asp Glu Ala Leu Arg Ile
                165                 170                 175
Gly Leu Val Asn Lys Val Val Glu Pro Ser Glu Leu Met Asn Thr Ala
            180                 185                 190
Lys Glu Ile Ala Asn Lys Ile Val Ser Asn Ala Pro Val Ala Val Lys
        195                 200                 205
Leu Ser Lys Gln Ala Ile Asn Arg Gly Met Gln Cys Asp Ile Asp Thr
    210                 215                 220
Ala Leu Ala Phe Glu Ser Glu Ala Phe Gly Glu Cys Phe Ser Thr Glu
225                 230                 235                 240
Asp Gln Lys Asp Ala Met Thr Ala Phe Ile Glu Lys Arg Lys Ile Glu
                245                 250                 255
Gly Phe Lys Asn Arg
            260
 
<210>4
<211>379
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>4
 
Met Asp Phe Asn Leu Thr Arg Glu Gln Glu Leu Val Arg Gln Met Val
1               5                   10                  15
Arg Glu Phe Ala Glu Asn Glu Val Lys Pro Ile Ala Ala Glu Ile Asp
            20                  25                  30
Glu Thr Glu Arg Phe Pro Met Glu Asn Val Lys Lys Met Gly Gln Tyr
        35                  40                  45
Gly Met Met Gly Ile Pro Phe Ser Lys Glu Tyr Gly Gly Ala Gly Gly
    50                  55                  60
Asp Val Leu Ser Tyr Ile Ile Ala Val Glu Glu Leu Ser Lys Val Cys
65                  70                  75                  80
Gly Thr Thr Gly Val Ile Leu Ser Ala His Thr Ser Leu Cys Ala Ser
                85                  90                  95
Leu Ile Asn Glu His Gly Thr Glu Glu Gln Lys Gln Lys Tyr Leu Val
            100                 105                 110
Pro Leu Ala Lys Gly Glu Lys Ile Gly Ala Tyr Gly Leu Thr Glu Pro
        115                 120                 125
Asn Ala Gly Thr Asp Ser Gly Ala Gln Gln Thr Val Ala Val Leu Glu
    130                 135                 140
Gly Asp His Tyr Val Ile Asn Gly Ser Lys Ile Phe Ile Thr Asn Gly
145                 150                 155                 160
Gly Val Ala Asp Thr Phe Val Ile Phe Ala Met Thr Asp Arg Thr Lys
                165                 170                 175
Gly Thr Lys Gly Ile Ser Ala Phe Ile Ile Glu Lys Gly Phe Lys Gly
            180                 185                 190
Phe Ser Ile Gly Lys Val Glu Gln Lys Leu Gly Ile Arg Ala Ser Ser
        195                 200                 205
Thr Thr Glu Leu Val Phe Glu Asp Met Ile Val Pro Val Glu Asn Met
    210                 215                 220
Ile Gly Lys Glu Gly Lys Gly Phe Pro Ile Ala Met Lys Thr Leu Asp
225                 230                 235                 240
Gly Gly Arg Ile Gly Ile Ala Ala Gln Ala Leu Gly Ile Ala Glu Gly
                245                 250                 255
Ala Phe Asn Glu Ala Arg Ala Tyr Met Lys Glu Arg Lys Gln Phe Gly
            260                 265                 270
Arg Ser Leu Asp Lys Phe Gln Gly Leu Ala Trp Met Met Ala Asp Met
        275                 280                 285
Asp Val Ala Ile Glu Ser Ala Arg Tyr Leu Val Tyr Lys Ala Ala Tyr
    290                 295                 300
Leu Lys Gln Ala Gly Leu Pro Tyr Thr Val Asp Ala Ala Arg Ala Lys
305                 310                 315                 320
Leu His Ala Ala Asn Val Ala Met Asp Val Thr Thr Lys Ala Val Gln
                325                 330                 335
Leu Phe Gly Gly Tyr Gly Tyr Thr Lys Asp Tyr Pro Val Glu Arg Met
            340                 345                 350
Met Arg Asp Ala Lys Ile Thr Glu Ile Tyr Glu Gly Thr Ser Glu Val
        355                 360                 365
Gln Lys Leu Val Ile Ser Gly Lys Ile Phe Arg
    370                 375
 
<210>5
<211>390
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>5
 
Met Val Asp Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Thr Arg Ile Phe Phe Gly Lys
1               5                   10                  15
Asp Lys Ile Asn Val Leu Gly Arg Glu Leu Lys Lys Tyr Gly Ser Lys
            20                  25                  30
Val Leu Ile Val Tyr Gly Gly Gly Ser Ile Lys Arg Asn Gly Ile Tyr
        35                  40                  45
Asp Lys Ala Val Ser Ile Leu Glu Lys Asn Ser Ile Lys Phe Tyr Glu
    50                  55                  60
Leu Ala Gly Val Glu Pro Asn Pro Arg Val Thr Thr Val Glu Lys Gly
65                  70                  75                  80
Val Lys Ile Cys Arg Glu Asn Gly Val Glu Val Val Leu Ala Ile Gly
                85                  90                  95
Gly Gly Ser Ala Ile Asp Cys Ala Lys Val Ile Ala Ala Ala Cys Glu
            100                 105                 110
Tyr Asp Gly Asn Pro Trp Asp Ile Val Leu Asp Gly Ser Lys Ile Lys
        115                 120                 125
Arg Val Leu Pro Ile Ala Ser Ile Leu Thr Ile Ala Ala Thr Gly Ser
    130                 135                 140
Glu Met Asp Thr Trp Ala Val Ile Asn Asn Met Asp Thr Asn Glu Lys
145                 150                 155                 160
Leu Ile Ala Ala His Pro Asp Met Ala Pro Lys Phe Ser Ile Leu Asp
                165                 170                 175
Pro Thr Tyr Thr Tyr Thr Val Pro Thr Asn Gln Thr Ala Ala Gly Thr
            180                 185                 190
Ala Asp Ile Met Ser His Ile Phe Glu Val Tyr Phe Ser Asn Thr Lys
        195                 200                 205
Thr Ala Tyr Leu Gln Asp Arg Met Ala Glu Ala Leu Leu Arg Thr Cys
    210                 215                 220
Ile Lys Tyr Gly Gly Ile Ala Leu Glu Lys Pro Asp Asp Tyr Glu Ala
225                 230                 235                 240
Arg Ala Asn Leu Met Trp Ala Ser Ser Leu Ala Ile Asn Gly Leu Leu
                245                 250                 255
Thr Tyr Gly Lys Asp Thr Asn Trp Ser Val His Leu Met Glu His Glu
            260                 265                 270
Leu Ser Ala Tyr Tyr Asp Ile Thr His Gly Val Gly Leu Ala Ile Leu
        275                 280                 285
Thr Pro Asn Trp Met Glu Tyr Ile Leu Asn Asn Asp Thr Val Tyr Lys
    290                 295                 300
Phe Val Glu Tyr Gly Val Asn Val Trp Gly Ile Asp Lys Glu Lys Asn
305                 310                 315                 320
His Tyr Asp Ile Ala His Gln Ala Ile Gln Lys Thr Arg Asp Tyr Phe
                325                 330                 335
Val Asn Val Leu Gly Leu Pro Ser Arg Leu Arg Asp Val Gly Ile Glu
            340                 345                 350
Glu Glu Lys Leu Asp Ile Met Ala Lys Glu Ser Val Lys Leu Thr Gly
        355                 360                 365
Gly Thr Ile Gly Asn Leu Arg Pro Val Asn Ala Ser Glu Val Leu Gln
    370                 375                 380
Ile Phe Lys Lys Ser Val
385                 390
 
<210>6
<211>858
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>6
 
Met Lys Val Thr Asn Gln Lys Glu Leu Lys Gln Lys Leu Asn Glu Leu
1               5                   10                  15
Arg Glu Ala Gln Lys Lys Phe Ala Thr Tyr Thr Gln Glu Gln Val Asp
            20                  25                  30
Lys Ile Phe Lys Gln Cys Ala Ile Ala Ala Ala Lys Glu Arg Ile Asn
        35                  40                  45
Leu Ala Lys Leu Ala Val Glu Glu Thr Gly Ile Gly Leu Val Glu Asp
    50                  55                  60
Lys Ile Ile Lys Asn His Phe Ala Ala Glu Tyr Ile Tyr Asn Lys Tyr
65                  70                  75                  80
Lys Asn Glu Lys Thr Cys Gly Ile Ile Asp His Asp Asp Ser Leu Gly
                85                  90                  95
Ile Thr Lys Val Ala Glu Pro Ile Gly Ile Val Ala Ala Ile Val Pro
            100                 105                 110
Thr Thr Asn Pro Thr Ser Thr Ala Ile Phe Lys Ser Leu Ile Ser Leu
        115                 120                 125
Lys Thr Arg Asn Ala Ile Phe Phe Ser Pro His Pro Arg Ala Lys Lys
    130                 135                 140
Ser Thr Ile Ala Ala Ala Lys Leu Ile Leu Asp Ala Ala Val Lys Ala
145                 150                 155                 160
Gly Ala Pro Lys Asn Ile Ile Gly Trp Ile Asp Glu Pro Ser Ile Glu
                165                 170                 175
Leu Ser Gln Asp Leu Met Ser Glu Ala Asp Ile Ile Leu Ala Thr Gly
            180                 185                 190
Gly Pro Ser Met Val Lys Ala Ala Tyr Ser Ser Gly Lys Pro Ala Ile
        195                 200                 205
Gly Val Gly Ala Gly Asn Thr Pro Ala Ile Ile Asp Glu Ser Ala Asp
    210                 215                 220
Ile Asp Met Ala Val Ser Ser Ile Ile Leu Ser Lys Thr Tyr Asp Asn
225                 230                 235                 240
Gly Val Ile Cys Ala Ser Glu Gln Ser Ile Leu Val Met Asn Ser Ile
                245                 250                 255
Tyr Glu Lys Val Lys Glu Glu Phe Val Lys Arg Gly Ser Tyr Ile Leu
            260                 265                 270
Asn Gln Asn Glu Ile Ala Lys Ile Lys Glu Thr Met Phe Lys Asn Gly
        275                 280                 285
Ala Ile Asn Ala Asp Ile Val Gly Lys Ser Ala Tyr Ile Ile Ala Lys
    290                 295                 300
Met Ala Gly Ile Glu Val Pro Gln Thr Thr Lys Ile Leu Ile Gly Glu
305                 310                 315                 320
Val Gln Ser Val Glu Lys Ser Glu Leu Phe Ser His Glu Lys Leu Ser
                325                 330                 335
Pro Val Leu Ala Met Tyr Lys Val Lys Asp Phe Asp Glu Ala Leu Lys
            340                 345                 350
Lys Ala Gln Arg Leu Ile Glu Leu Gly Gly Ser Gly His Thr Ser Ser
        355                 360                 365
Leu Tyr Ile Asp Ser Gln Asn Asn Lys Asp Lys Val Lys Glu Phe Gly
    370                 375                 380
Leu Ala Met Lys Thr Ser Arg Thr Phe Ile Asn Met Pro Ser Ser Gln
385                 390                 395                 400
Gly Ala Ser Gly Asp Leu Tyr Asn Phe Ala Ile Ala Pro Ser Phe Thr
                405                 410                 415
Leu Gly Cys Gly Thr Trp Gly Gly Asn Ser Val Ser Gln Asn Val Glu
            420                 425                 430
Pro Lys His Leu Leu Asn Ile Lys Ser Val Ala Glu Arg Arg Glu Asn
        435                 440                 445
Met Leu Trp Phe Lys Val Pro Gln Lys Ile Tyr Phe Lys Tyr Gly Cys
    450                 455                 460
Leu Arg Phe Ala Leu Lys Glu Leu Lys Asp Met Asn Lys Lys Arg Ala
465                 470                 475                 480
Phe Ile Val Thr Asp Lys Asp Leu Phe Lys Leu Gly Tyr Val Asn Lys
                485                 490                 495
Ile Thr Lys Val Leu Asp Glu Ile Asp Ile Lys Tyr Ser Ile Phe Thr
            500                 505                 510
Asp Ile Lys Ser Asp Pro Thr Ile Asp Ser Val Lys Lys Gly Ala Lys
        515                 520                 525
Glu Met Leu Asn Phe Glu Pro Asp Thr Ile Ile Ser Ile Gly Gly Gly
    530                 535                 540
Ser Pro Met Asp Ala Ala Lys Val Met His Leu Leu Tyr Glu Tyr Pro
545                 550                 555                 560
Glu Ala Glu Ile Glu Asn Leu Ala Ile Asn Phe Met Asp Ile Arg Lys
                565                 570                 575
Arg Ile Cys Asn Phe Pro Lys Leu Gly Thr Lys Ala Ile Ser Val Ala
            580                 585                 590
Ile Pro Thr Thr Ala Gly Thr Gly Ser Glu Ala Thr Pro Phe Ala Val
        595                 600                 605
Ile Thr Asn Asp Glu Thr Gly Met Lys Tyr Pro Leu Thr Ser Tyr Glu
    610                 615                 620
Leu Thr Pro Asn Met Ala Ile Ile Asp Thr Glu Leu Met Leu Asn Met
625                 630                 635                 640
Pro Arg Lys Leu Thr Ala Ala Thr Gly Ile Asp Ala Leu Val His Ala
                645                 650                 655
Ile Glu Ala Tyr Val Ser Val Met Ala Thr Asp Tyr Thr Asp Glu Leu
            660                 665                 670
Ala Leu Arg Ala Ile Lys Met Ile Phe Lys Tyr Leu Pro Arg Ala Tyr
        675                 680                 685
Lys Asn Gly Thr Asn Asp Ile Glu Ala Arg Glu Lys Met Ala His Ala
    690                 695                 700
Ser Asn Ile Ala Gly Met Ala Phe Ala Asn Ala Phe Leu Gly Val Cys
705                 710                 715                 720
His Ser Met Ala His Lys Leu Gly Ala Met His His Val Pro His Gly
                725                 730                 735
Ile Ala Cys Ala Val Leu Ile Glu Glu Val Ile Lys Tyr Asn Ala Thr
            740                 745                 750
Asp Cys Pro Thr Lys Gln Thr Ala Phe Pro Gln Tyr Lys Ser Pro Asn
        755                 760                 765
Ala Lys Arg Lys Tyr Ala Glu Ile Ala Glu Tyr Leu Asn Leu Lys Gly
    770                 775                 780
Thr Ser Asp Thr Glu Lys Val Thr Ala Leu Ile Glu Ala Ile Ser Lys
785                 790                 795                 800
Leu Lys Ile Asp Leu Ser Ile Pro Gln Asn Ile Ser Ala Ala Gly Ile
                805                 810                 815
Asn Lys Lys Asp Phe Tyr Asn Thr Leu Asp Lys Met Ser Glu Leu Ala
            820                 825                 830
Phe Asp Asp Gln Cys Thr Thr Ala Asn Pro Arg Tyr Pro Leu Ile Ser
        835                 840                 845
Glu Leu Lys Asp Ile Tyr Ile Lys Ser Phe
    850                 855
 
<210>7
<211>336
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>7
 
Met Asn Lys Ala Asp Tyr Lys Gly Val Trp Val Phe Ala Glu Gln Arg
1               5                   10                  15
Asp Gly Glu Leu Gln Lys Val Ser Leu Glu Leu Leu Gly Lys Gly Lys
            20                  25                  30
Glu Met Ala Glu Lys Leu Gly Val Glu Leu Thr Ala Val Leu Leu Gly
        35                  40                  45
His Asn Thr Glu Lys Met Ser Lys Asp Leu Leu Ser His Gly Ala Asp
    50                  55                  60
Lys Val Leu Ala Ala Asp Asn Glu Leu Leu Ala His Phe Ser Thr Asp
65                  70                  75                  80
Gly Tyr Ala Lys Val Ile Cys Asp Leu Val Asn Glu Arg Lys Pro Glu
                85                  90                  95
Ile Leu Phe Ile Gly Ala Thr Phe Ile Gly Arg Asp Leu Gly Pro Arg
            100                 105                 110
Ile Ala Ala Arg Leu Ser Thr Gly Leu Thr Ala Asp Cys Thr Ser Leu
        115                 120                 125
Asp Ile Asp Val Glu Asn Arg Asp Leu Leu Ala Thr Arg Pro Ala Phe
    130                 135                 140
Gly Gly Asn Leu Ile Ala Thr Ile Val Cys Ser Asp His Arg Pro Gln
145                 150                 155                 160
Met Ala Thr Val Arg Pro Gly Val Phe Glu Lys Leu Pro Val Asn Asp
                165                 170                 175
Ala Asn Val Ser Asp Asp Lys Ile Glu Lys Val Ala Ile Lys Leu Thr
            180                 185                 190
Ala Ser Asp Ile Arg Thr Lys Val Ser Lys Val Val Lys Leu Ala Lys
        195                 200                 205
Asp Ile Ala Asp Ile Gly Glu Ala Lys Val Leu Val Ala Gly Gly Arg
    210                 215                 220
Gly Val Gly Ser Lys Glu Asn Phe Glu Lys Leu Glu Glu Leu Ala Ser
225                 230                 235                 240
Leu Leu Gly Gly Thr Ile Ala Ala Ser Arg Ala Ala Ile Glu Lys Glu
                245                 250                 255
Trp Val Asp Lys Asp Leu Gln Val Gly Gln Thr Gly Lys Thr Val Arg
            260                 265                 270
Pro Thr Leu Tyr Ile Ala Cys Gly Ile Ser Gly Ala Ile Gln His Leu
        275                 280                 285
Ala Gly Met Gln Asp Ser Asp Tyr Ile Ile Ala Ile Asn Lys Asp Val
    290                 295                 300
Glu Ala Pro Ile Met Lys Val Ala Asp Leu Ala Ile Val Gly Asp Val
305                 310                 315                 320
Asn Lys Val Val Pro Glu Leu Ile Ala Gln Val Lys Ala Ala Asn Asn
                325                 330                 335
 
<210>8
<211>1011
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>密码子对经优化的ETF alpha
 
<400>8
atgaacaagg ctgactacaa gggtgtctgg gttttcgctg aacaaagaga tggtgaatta   60
caaaaggttt ctttggaatt gctaggtaag ggtaaggaaa tggctgaaaa attgggtgtt  120
gaattgactg ctgtcttatt gggtcacaac actgaaaaga tgtccaagga cttgttgtcc  180
cacggtgctg acaaggtttt ggctgctgac aacgaattat tagctcattt ctccactgac  240
ggttacgcca aggttatctg tgacttggtc aacgaaagaa agccagaaat cttattcatc  300
ggtgctactt tcatcggtag agacttgggt ccaagaattg ctgccagatt gtctactggt  360
ttgactgctg actgtacctc tttggatatc gatgtcgaaa accgtgactt gttggctacc  420
agaccagctt tcggtggtaa cttgattgct accattgtct gttctgacca cagacctcaa    480
atggccaccg tcagaccagg tgtctttgaa aaattgccag ttaacgatgc taacgtttct    540
gatgacaaga tcgaaaaggt tgccatcaaa ttgactgctt ctgatatcag aaccaaggtt    600
tccaaggttg tcaaattggc caaggacatt gctgatatcg gtgaagccaa ggttttggtt    660
gctggtggtc gtggtgttgg ttccaaggaa aacttcgaaa aattggaaga attagcttct    720
ttgttgggtg gtaccattgc tgcttccaga gctgccattg aaaaggaatg ggttgacaag    780
gacttgcaag tcggtcaaac cggtaagacc gtcagaccaa ctttgtacat tgcttgtggt    840
atctctggtg ccatccaaca cttggctggt atgcaagact ctgactacat cattgccatc    900
aacaaagatg tcgaagctcc aatcatgaag gttgctgatt tggccattgt cggtgatgtc    960
aacaaggttg ttccagaatt gattgctcaa gtcaaggctg ctaacaatta a            1011
 
<210>9
<211>259
<212>PRT
<213>Clostridium acetobutylicum
 
<400>9
 
Met Asn Ile Val Val Cys Leu Lys Gln Val Pro Asp Thr Ala Glu Val
1               5                   10                  15
Arg Ile Asp Pro Val Lys Gly Thr Leu Ile Arg Glu Gly Val Pro Ser
            20                  25                  30
Ile Ile Asn Pro Asp Asp Lys Asn Ala Leu Glu Glu Ala Leu Val Leu
        35                  40                  45
Lys Asp Asn Tyr Gly Ala His Val Thr Val Ile Ser Met Gly Pro Pro
    50                  55                  60
Gln Ala Lys Asn Ala Leu Val Glu Ala Leu Ala Met Gly Ala Asp Glu
65                  70                  75                  80
Ala Val Leu Leu Thr Asp Arg Ala Phe Gly Gly Ala Asp Thr Leu Ala
                85                  90                  95
Thr Ser His Thr Ile Ala Ala Gly Ile Lys Lys Leu Lys Tyr Asp Ile
            100                 105                 110
Val Phe Ala Gly Arg Gln Ala Ile Asp Gly Asp Thr Ala Gln Val Gly
        115                 120                 125
Pro Glu Ile Ala Glu His Leu Gly Ile Pro Gln Val Thr Tyr Val Glu
    130                 135                 140
Lys Val Glu Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Ile Arg Lys Ala Trp Glu
145                 150                 155                 160
Asp Gly Tyr Glu Val Val Glu Val Lys Thr Pro Val Leu Leu Thr Ala
                165                 170                 175
Ile Lys Glu Leu Asn Val Pro Arg Tyr Met Ser Val Glu Lys Ile Phe
            180                 185                 190
Gly Ala Phe Asp Lys Glu Val Lys Met Trp Thr Ala Asp Asp Ile Asp
        195                 200                 205
Val Asp Lys Ala Asn Leu Gly Leu Lys Gly Ser Pro Thr Lys Val Lys
    210                 215                 220
Lys Ser Ser Thr Lys Glu Val Lys Gly Gln Gly Glu Val Ile Asp Lys
225                 230                 235                 240
Pro Val Lys Glu Ala Ala Ala Tyr Val Val Ser Lys Leu Lys Glu Glu
                245                 250                 255
His Tyr IIe
 
<210>10
<211>780
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>密码子对经优化的ETF beta
 
<400>10
atgaacattg ttgtttgttt gaagcaagtt ccagacactg ctgaagtcag aattgaccca     60
gtcaagggta ctttaatcag agaaggtgtt ccatctatca tcaacccaga cgacaagaac    120
gctttggaag aagctttggt tttgaaggac aactacggtg ctcacgttac cgtcatttcc    180
atgggtccac ctcaagccaa gaacgctttg gttgaagctt tggccatggg tgctgatgaa    240
gctgtcttat tgactgacag agctttcggt ggtgctgata ctttagctac ctctcacacc    300
attgctgctg gtatcaagaa attgaaatac gatatcgtct ttgccggtcg tcaagccatc    360
gatggtgata ccgctcaagt cggtccagaa attgctgaac atttgggtat tccacaagtc    420
acctacgttg aaaaggttga agttgacggt gacactttga agatcagaaa ggcttgggaa    480
gacggttacg aagttgttga agtcaagact ccagttctat tgactgccat caaggaattg    540
aacgttccaa gatacatgtc cgttgaaaag atcttcggtg ctttcgacaa ggaagtcaag    600
atgtggactg ctgatgatat cgatgtcgac aaggccaact tgggtttgaa aggttctcca    660
accaaggtca agaaatcttc taccaaggaa gtcaagggtc aaggtgaagt cattgacaaa    720
ccagtcaagg aagctgccgc ttacgttgtt tccaagttga aggaagaaca ctacatctaa    780
 
<210>11
<211>469
<212>PRT
<213>Listeria innocua
 
<400>11
 
Met Glu Ser Leu Glu Leu Glu Gln Leu Val Lys Lys Val Leu Leu Glu
1               5                   10                  15
Lys Leu Ala Glu Gln Lys Glu Val Pro Thr Lys Thr Thr Thr Gln Gly
            20                  25                  30
Ala Lys Ser Gly Val Phe Asp Thr Val Asp Glu Ala Val Gln Ala Ala
        35                  40                  45
Val Ile Ala Gln Asn Cys Tyr Lys Glu Lys Ser Leu Glu Glu Arg Arg
    50                  55                  60
Asn Val Val Lys Ala Ile Arg Glu Ala Leu Tyr Pro Glu Ile Glu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ala Thr Arg Ala Val Ala Glu Thr Gly Met Gly Asn Val Thr Asp
                85                  90                  95
Lys Ile Leu Lys Asn Thr Leu Ala Ile Glu Lys Thr Pro Gly Val Glu
            100                 105                 110
Asp Leu Tyr Thr Glu Val Ala Thr Gly Asp Asn Gly Met Thr Leu Tyr
        115                 120                 125
Glu Leu Ser Pro Tyr Gly Val Ile Gly Ala Val Ala Pro Ser Thr Asn
    130                 135                 140
Pro Thr Glu Thr Leu Ile Cys Asn Ser Ile Gly Met Leu Ala Ala Gly
145                 150                 155                 160
Asn Ala Val Phe Tyr Ser Pro His Pro Gly Ala Lys Asn Ile Ser Leu
                165                 170                 175
Trp Leu Ile Glu Lys Leu Asn Thr Ile Val Arg Asp Ser Cys Gly Ile
            180                 185                 190
Asp Asn Leu Ile Val Thr Val Ala Lys Pro Ser Ile Gln Ala Ala Gln
        195                 200                 205
Glu Met Met Asn His Pro Lys Val Pro Leu Leu Val Ile Thr Gly Gly
    210                 215                 220
Pro Gly Val Val Leu Gln Ala Met Gln Ser Gly Lys Lys Val Ile Gly
225                 230                 235                 240
Ala Gly Ala Gly Asn Pro Pro Ser Ile Val Asp Glu Thr Ala Asn Ile
                245                 250                 255
Glu Lys Ala Ala Ala Asp Ile Val Asp Gly Ala Ser Phe Asp His Asn
            260                 265                 270
Ile Leu Cys Ile Ala Glu Lys Ser Val Val Ala Val Asp Ser Ile Ala
        275                 280                 285
Asp Phe Leu Leu Phe Gln Met Glu Lys Asn Gly Ala Leu His Val Thr
    290                 295                 300
Asn Pro Ser Asp Ile Gln Lys Leu Glu Lys Val Ala Val Thr Asp Lys
305                 310                 315                 320
Gly Val Thr Asn Lys Lys Leu Val Gly Lys Ser Ala Thr Glu Ile Leu
                325                 330                 335
Lys Glu Ala Gly Ile Ala Cys Asp Phe Thr Pro Arg Leu Ile Ile Val
            340                 345                 350
Glu Thr Glu Lys Ser His Pro Phe Ala Thr Val Glu Leu Leu Met Pro
        355                 360                 365
Ile Val Pro Val Val Arg Val Pro Asp Phe Asp Glu Ala Leu Glu Val
    370                 375                 380
Ala Ile Glu Leu Glu Gln Gly Leu His His Thr Ala Thr Met His Ser
385                 390                 395                 400
Gln Asn Ile Ser Arg Leu Asn Lys Ala Ala Arg Asp Met Gln Thr Ser
                405                 410                 415
Ile Phe Val Lys Asn Gly Pro Ser Phe Ala Gly Leu Gly Phe Arg Gly
            420                 425                 430
Glu Gly Ser Thr Thr Phe Thr Ile Ala Thr Pro Thr Gly Glu Gly Thr
        435                 440                 445
Thr Thr Ala Arg His Phe Ala Arg Arg Arg Arg Cys Val Leu Thr Asp
    450                 455                 460
Gly Phe Ser Ile Arg
465
 
<210>12
<211>1407
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>acdh L.innocua cpo
 
<400>12
atggaatctt tggaattgga acaattagtc aagaaggttt tgttggaaaa attggctgaa     60
caaaaggaag ttccaaccaa gaccaccacc caaggtgcca agtccggtgt tttcgatacc    120
gtcgatgaag ctgtccaagc tgccgtcatt gctcaaaact gttacaagga aaaatctttg    180
gaagaaagaa gaaacgttgt caaggccatc agagaagctt tatacccaga aatcgaaacc    240
attgctacca gagctgttgc tgaaaccggt atgggtaatg tcaccgataa aatcttgaag    300
aacactttag ctatcgaaaa gactccaggt gttgaagact tgtacactga agttgctacc    360
ggtgacaacg gtatgacttt atacgaatta tctccatacg gtgtcatcgg tgctgttgct    420
ccatctacca acccaactga aactttgatc tgtaactcca tcggtatgtt ggctgctggt    480
aacgccgttt tctactctcc tcacccaggt gccaagaaca tctctttatg gttgattgaa    540
aagttgaaca ctatcgtcag agattcttgt ggtattgaca acttgattgt caccgttgcc    600
aagccatcta tccaagctgc tcaagaaatg atgaaccacc caaaggttcc attgttggtc    660
atcactggtg gtccaggtgt tgtcttgcaa gctatgcaat ctggtaagaa ggttatcggt    720
gctggtgctg gtaaccctcc atccatcgtt gacgaaaccg ctaacattga aaaggctgct    780
gctgacattg tcgacggtgc ttcctttgac cataatatct tgtgtatcgc tgaaaagtct    840
gttgttgccg ttgactccat tgctgacttc ttgttgttcc aaatggaaaa gaacggtgct    900
ttgcacgtca ctaacccatc tgatatccaa aaattggaaa aggttgccgt cactgacaag    960
ggtgtcacca acaagaaatt ggttggtaag tctgccactg aaatcttgaa agaagctggt    1020
attgcttgtg atttcacccc aagattgatc attgtcgaaa ctgaaaagtc ccacccattc    1080
gctactgttg aattgttgat gccaattgtt ccagttgtca gagttccaga cttcgatgaa    1140
gctttggaag ttgccattga attggaacaa ggtctacatc acactgctac catgcactct    1200
caaaacatct ccagattgaa caaggctgcc cgtgacatgc aaacctccat ctttgtcaag    1260
aacggtccat ctttcgctgg tttaggtttc agaggtgaag gttccaccac tttcaccatt    1320
gctactccaa ctggtgaagg tactaccact gcccgtcact tcgctagaag aagaagatgt    1380
gtcttgactg atggtttctc cattaga                                        1407
 
<210>13
<211>13286
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>pBOL34整合载体
 
<400>13
aagcttgcat gcctgcaggt cgacggcgcg ccgggcccgt ttaaacggcc ggccaaggtg     60
agacgcgcat aaccgctaga gtactttgaa gaggaaacag caatagggtt gctaccagta    120
taaatagaca ggtacataca acactggaaa tggttgtctg tttgagtacg ctttcaattc    180
atttgggtgt gcactttatt atgttacaat atggaaggga actttacact tctcctatgc    240
acatatatta attaaagtcc aatgctagta gagaaggggg gtaacacccc tccgcgctct    300
tttccgattt ttttctaaac cgtggaatat ttcggatatc cttttgttgt ttccgggtgt    360
acaatatgga cttcctcttt tctggcaacc aaacccatac atcgggattc ctataatacc    420
ttcgttggtc tccctaacat gtaggtggcg gaggggagat atacaataga acagatacca    480
gacaagacat aatgggctaa acaagactac accaattaca ctgcctcatt gatggtggta    540
cataacgaac taatactgta gccctagact tgatagccat catcatatcg aagtttcact    600
accctttttc catttgccat ctattgaagt aataataggc gcatgcaact tcttttcttt    660
ttttttcttt tctctctccc ccgttgttgt ctcaccatat ccgcaatgac aaaaaaatga    720
tggaagacac taaaggaaaa aattaacgac aaagacagca ccaacagatg tcgttgttcc    780
agagctgatg aggggtatct cgaagcacac gaaacttttt ccttccttca ttcacgcaca    840
ctactctcta atgagcaacg gtatacggcc ttccttccag ttacttgaat ttgaaataaa    900
aaaaagtttg ctgtcttgct atcaagtata aatagacctg caattattaa tcttttgttt    960
cctcgtcatt gttctcgttc cctttcttcc ttgtttcttt ttctgcacaa tatttcaagc   1020
tataccaagc atacaatcaa ctatctcata tacaatgaag gaagttgtta ttgcttctgc   1080
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cgaagttatc ttaggtaacg ttttgcaagc tggtttaggt caaaacccag ctcgtcaagc   1260
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ttctggtttg agaactgttt ctttggctgc tcaaatcatc aaggctggtg acgctgatgt   1380
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ttacggtcct ttctacgcta ccaaggctgc tatcgaaaag gctggttgga ccgttgacga    1980
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caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac    12480
cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt    12540
cgtgtcttac cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct    12600
gaacgggggg ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat    12660
acctacagcg tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt    12720
atccggtaag cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg  12780
cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt  12840
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gaaacagcta tgaccatgat tacgcc                                       13286
 
<210>14
<211>16359
<212>DNA
<213>人工序列
 
<220>
<223>pBOL36整合载体
 
<400>14
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cacaacaata ccagtccgga tcaactggca ccatctctcc cgtagtctca tctaattttt    120
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Claims (18)

1.能够以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例生产丁醇和乙醇的真核细胞。
2.根据权利要求1或2的真核细胞，其中所述细胞包含至少一种失活的核苷酸序列，所述核苷酸序列编码生产乙醇所需的酶。
3.根据权利要求1到3中任一项的真核细胞，其中所述细胞包含编码丁酰基-CoA脱氢酶的核苷酸序列，和至少一种编码异源电子传递黄素蛋白的核苷酸序列。
4.根据权利要求1到4中任一项的真核细胞，其中所述细胞包含编码下述异源酶的核苷酸序列，所述异源酶具有在胞质溶胶中将丙酮酸、乙醛或乙酸转化为乙酰-CoA的酶活性。
5.根据权利要求1到4中任一项的真核细胞，其中所述细胞是酵母，优选地是Saccharomyces属。
6.真核细胞，其为具有登录号CBS 122885的Saccharomycescerevisiae，或具有登录号CBS 123039的Saccharomyces cerevisiae。
7.用于提高能够生产丁醇的真核细胞的丁醇生产的方法，所述方法包括：
-对能够生产丁醇的真核细胞种群进行诱变；和
-针对提高的丁醇生产选择突变体真核细胞种群。
8.用于制备丁醇和乙醇的方法，所述方法包括在合适的发酵液中发酵根据权利要求1到6中任一项的真核细胞，其中丁醇和乙醇以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例被生产。
9.根据权利要求8的方法，其中发酵液中生产的丁醇量至少为0.4g/l。
10.根据权利要求8或9的方法，其中所述真核细胞是酵母，优选地属于Saccharomyces属。
11.根据权利要求8到10中任一项的方法，其中从所述发酵液中回收丁醇和乙醇。
12.根据权利要求8到11中任一项的方法，所述方法还包括将丁醇与乙醇分离，获得含有少于1％丁醇的乙醇和含有少于1％乙醇的丁醇。
13.用于从包含丁醇和乙醇的水性溶液中回收丁醇和乙醇的方法，其中所述丁醇∶乙醇比例在1∶2到1∶100之间，所述方法包括从水性溶液中分离乙醇/丁醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离乙醇/水混合物；从乙醇/丁醇/水混合物中分离丁醇/水混合物；以及回收丁醇和乙醇。
14.根据权利要求13的方法，其中所述水性溶液是发酵液。
15.根据权利要求13或14的方法，其中分离丁醇/水混合物包括使部分乙醇/丁醇/水混合物达到10℃到40℃之间的温度。
16.根据权利要求1到15中任一项的方法，所述方法以工业规模进行。
17.能够通过根据权利要求8到12中任一项的方法获得的发酵液，所述发酵液以1∶2到1∶100之间的丁醇∶乙醇比例包含丁醇和乙醇。
18.能够通过根据权利要求8到16中任一项的方法获得的丁醇和/或乙醇作为化学品或作为生物燃料的用途。
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