JPS58220691A - 発酵法ｌ−ロイシンの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 り一ロイシン、Ｌ−バリンおよび他のアミノ酸の発酵法
による製造は重要な研究課題となっている。多数の馬の
微生物が種々のアミノ酸同族体とともに用いられて来た
。アメリカ合衆国特許第３．８６５，６９０号ＶＣｔま
、ロイシン拮抗物質に対して耐性をもたせたブレビバク
テリウム（Ｂｒｇｖｉ−ｂａｅｔｍｒｉｘｒｎ　）また
はコリネバクテリウム＜ｃｏｒｙ−ｎｍｂａｅｔｅｒｉ
ｕｍ）の菌株を培養することよるＬ−。

ロイシンの創造が記載されている。アメリカ合衆国特許
第３９７０．５１９号では、種々のアミノ酸の存在のも
とて同属の菌株を培養してＬ−ロイシンを製造している
。アメリカ合衆国特詐第亀８９＆８８８号から、α−ア
ミノ−β−ヒドロキシ吉草酸（ＡＨＶ　）に対して耐性
のあるブレビバクテリウムの突然変異菌株がＬ−、々リ
ンを製造し得ることが知られている。アメリカ合衆国特
許第へ６８ａ０７３号ｐｃ＃ｉ、インロイシン、メチオ
ニン、フェニルアラニンまたけバリン、例えばアザロイ
シンまたはＡＨＶに対す奉「促進剤」の存在のも（５璽 とでコリネ・々クテリウム属の微生物を用いるＬ−ロイ
シンの奥造方法が記載されている。アザロイシンはＬ−
ロイシン製造のための同族体として用いられている。ワ
ング（Ｗａｎｇ）等、「発酵及びｅｌＨＩ＜ｆｌ　／　
Ｃ７ｙ　−Ｊ　　（“Ｆａｒｍｅｎｔａｔ　ｉｏｎ　ａ
ｎｄＥｎｇｙｒｎｍ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ“）、ショ
アーウィリーアンド・サンオ社（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌａｙ
　ａｎｄ　５ｏｎｓ　。

Ｉｎ（１）１９７９年１８〜２０頁、参照。アメリカ合
衆国特許第３．７ｆｉ９，７８９号ｔｊＺ、−スレオニ
ンに対して耐性をもつアースロパクター・アルカニクス
（Ａｒｔｈｒｏ、ｂａｅｔｅｒ　ａｌｋａｎｉｅｕｓ　
）を利用している。Ｌ−ロイシンおよびＬ−イソロイシ
ンの前駆物質を加えて数基を増すことが出来る。

下記の文献が関係がある。

１、　アラキ、カズミ、Ｈ，ウェダおよびＳ、サイグサ
。

コリネ／考りテリウム・グルタミクムの生育因子を要す
る突然変異体を用いるＬ−ロイシンめ発酵徊造法。アグ
リカルチュラル・・々イオロジカル・ケミストリー第３
８巻（３号）５６５〜５７２頁１９７４年つ （Ａｒａｋｉ、　　Ｋａｔｕｒｎｉ、　　Ｈ，Ｕｍｄａ
　　ａｎｄ　　Ｓ、Ｓａｉｇｕｓａ。

Ｆａｒｒｎｍｎｔαｔｉｖｅ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　
ｏｆ　Ｌ−ＬａｓＣ４ｎｇｗｉｔｈ　Ａｕｚｏｔｒｏｐ
ｈｉｅ　Ｍｕｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｃｏｒｙｎｇｂａａ−
ｔｇｒｉｗｍ　ｇｌｓｔａｒｎｉｔｓｂｍ、　Ａｇｒ、
　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｕｍ。

３８（３３，５６５−５７２（１９７４）。〕２　カル
ｇＲ１Ａ、およびＪｌＭ、カルが、サルモネラ・チフイ
ムリウムの菌株におけるロイシン合成に対する最終生成
物阻害および抑制の欠如、サイエンス、第１５６巻１１
０７〜１１０９頁１９６１７年。

（Ｃａ１ｖｏ、　Ｒ，Ａ、　、ａｎｄ　Ｊ、Ｍ、　Ｃａ
１ｖｏ、　ＬａＣｋ　ｏｆＥｎｄ　−Ｐｒｏｄｕｃｔ　
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｎ　ＬａｓＣｉｎｇ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｉｎ　ａ
　５ｔｒａｉｎ　ｏｆＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈ
ｉｒｎｕｒｉｕｙｎ、−８ｃｉｅｎｃｅ、１５６゜１１
０７−１１０９（１９６７）。］ ３、　　キスミ、　Ｍ、　、Ｓ、コマツ／々うお工び１
．チ／々夕。

α−アミノ酪酸に耐性のあるセラチア・マルセツセンス
のイソロイシン・レノ々−タントＶＣ，Ｘ：るロイシン
蓄積：送還阻害および抑制の両方の欠如。ジャーナル・
オブ・・々イオケミストリー、第７３巻１０７〜１１５
頁１９７３頁。

［Ｋ１５ｘｒｎｉ、　Ｍ、、　Ｓ、Ｋｏｍａｔｓｕｂａ
ｒａ　ａｎｄ　Ｉ。

Ｃｈｉｂａｔα、　ＬＬＩｕｅｉｎｇ　Ａｃｃｕｍｕｌ
ａｔｉｏｎｓ　ｂｙＩｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　Ｒｇｖａｒ
ｔａｎｔｓ　ｏｆ　Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅ
ｎａ　Ｒｅ５ｉｓｔａｎｔ　ｔｏα−Ａｍｉｎｏｂｕｔ
ｙ−ｒｉｃ　Ａｃ１ｄ　：　Ｌａｃｋ　ｏｆ　Ｂｏｔｈ
　Ｆｓａｄｂａｃｋ　Ｉｎｈ−ｉｂｉｔｉｏｎ　ａｎｄ
　Ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｅｈｅｍ、。

７３．１０７−１１５（１９７３）。〕４、　ツチメ、
Ｔ、、Ｆ、ヨシナガ、Ｋ、りが夕、Ｈ。

モモセおよびＳ、オフムラ。菌株１６．２ｔ　８、フＬ
／ビ／９クテリウム・ラクトフェルメンツム２２５６の
突然変異体によるＬ−ロイシン生盛のための培養条件。

アグリカルチュラル・・９イオロジカル・ケミストリー
第３９巻（５号）１１４９〜１１５３頁１９７５年。

（Ｔｓｕｅｈｉｄａ、　Ｔ、、　Ｆ、Ｙｏｓｈｉｎａｇ
ａ、　Ｋ、Ｋｕｂｏｔａ。

ＨｏＭｏｍｏｓｍ　ａｎｄ　Ｓ、Ｏｋｓｍｗｒａ、Ｃｂ
ｌｔｗｒａｌＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｌ−Ｌｏ
ｓｅｉｎｇ　Ｐｒｏｄｗｅｔｉｏｎｂｙ　　５ｔｒａｉ
ｎ　Ａ　２１　ｇ、　ａ　　Ｍｕｔａｎｔ　　ｏｆ　　
Ｂｒｇｖｉｂａ−７５）。〕 ＆　ツチ〆、Ｔ、およびＨ，モモセ。ブレビバクテリウ
ム・ラクトフェルメンツム２２５６から誘導されるロイ
シンおよびバリン生成突然変異体中に存在する制御機構
の遺伝的変化。アグリカルチュラル・／ぐイオロジカル
・ケミストリー、第３９巻（１１号）２１９３−２１９
８頁１９７６年。

・、−。

（Ｔｓｘｃｈｉｄａ、　Ｔ、、　ａｎｄ　ＨｌＭｄｍｏ
ａａ　、ＧａｎｇｌｉａＣｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　Ｒｇｑ
＊１ａｔｏｒｙ　ＭｍｅｈａｎｉａｒｎｓＯｅｃｗｒａ
ｄ　ｆ　Ｌｔｓｅｉｎｍ　ａｎｄ　Ｖａｌｉｎｅ　Ｐｒ
ｏｄ＊ｅｉｎｇＭｕｔａｎｔｓ　　Ｄｅｒｉｖｅｄ　ｆ
ｒｏｍ　　ＢｒｔｔｖｉｂａｅｔｇｒｔｕｒｎＣｈｇｍ
、３９　（１１）、２１９３−２１９８　（１９７５１
，）６、　ツチダ、Ｔ、、Ｆ、ヨシナガ、Ｋ、クゲタ、
Ｈ。

モモセおよびＳ、オフムラ。プレピノ々クテリウム・ラ
クトフェルメンツム２２５６の突然変具体によるＬ−ロ
イシンの生成。アグリカルチュラル・・々イオロジカル
・ケミストリー、第３８巻（１０号）１９０９７−１９
１１頁１９７４年。

［Ｔａｕａｈｉｄａ、　Ｔ、、　Ｆ、　Ｙｏｓｈｉｎａ
ｇａ、に、　Ｋｕｂｏｔａ。

ＨｏＭｏｒｎｏａｅ　ａｎｄ　Ｓ、Ｏｋｓｍｕｒａ、Ｐ
ｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆ　Ｌ−ＬｏｊＬｅｉｎｇ　　ｂ
ｙ　　ａ　Ｍｕｔａｎｔ　　ｏｆ　Ｂｒｅｖｉｂａｅ−
（１９７４）。］　゛□　・ ７、７０イソトリツヒ９Ｍ、お工びＪ、Ｍ、トレラ。

（１９８９年）。イソロイシン、／クリンおよびロイシ
ンの生合成の制御。ジャーナル・すプ・・譬りテリオロ
ゾー、１０１−１０６頁。

［Ｆｒｅｕｎｄｌｉｃｈ、Ｍ、ａｎｄ　　ＪｏＭ、Ｔｒ
ｅｔｌａ、　（１９８９）、　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　
１ｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、　ｖａｌｉｎｅ、ａｎｄｌｏｌ
−１０６，］ ａ　イズミＹ、、Ｙ、アサノ、Ｙ、タニおよびにオガタ
。（’１’９７７年）。真正メチロトロープ、メチロモ
ナス・アミノファシェンスの同族体耐性突然変異体によ
る・９リンおよびロイシンの生成。ジャーナル・オプ・
ファーメンテ−ジョン・テクノロジー、第５５巻４５２
〜４５Ｂ頁。

（Ｉ　ｇｗｍｉ、　Ｙ、、　Ｙ、Ａｅａｎｏ、Ｙ、Ｔａ
ｎ１　ａｎｄ　Ｋ、。

Ｏｇａｔａ、（１９？　７　）、　Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ
　ｏｆ　ｖａｌｉｎｅａｎｄ　　ｌｅｇｓｉｎｇ　　ｂ
ｙ　　ａｎａｌｏｇ　　−ｒａｔｔｉａｔａｎｔ　　ｍ
５ｔａ二ｎｔａ　ｏｆ　ａｎ　ｏｂｌｉｇａｔｅ　ｒｎ
ｇｔｈｙｌｏｔｒｏｐｈ、　ＭｔｒｔルＶ−Ｔｅｃｈｎ
ｏ１．．５５，４５２−４５８゜〕９、　　キスミ、　
Ａ／、、　Ｓ、コマツパラおよび１．チ／＃夕。

（１９７７年）セ５ｆア・マルセツセンスのロイシン蓄
積性イソロイシン・レパータント中のロイシン生合成酵
素によるピルビン酸塩からのイソロイシンの生成経路。

ジャーナル・オブ・バイオケミメトリー、第８２巻９５
〜１０３頁。

［Ｋ１５ｕｒｎｉ、　Ｍ、、　Ｓ、Ｋｏｒｎａｔａ＊ｂ
ａｒａ　ａｎｄ　Ｉ。

Ｃｈｉｂａｔａ、（１９７７）′、Ｐａｔｈｗａｙ　ｆ
ｏｒ　ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｆｒ
ｏｍ　ｐｙｒｕｖαｔｇ　ｂｙ　ｌａｎｃｉｎｇｂｉｏ
ｓｙｎｔｈｇｔｉｃ　ａｎｚｙｒｎｍａ　ｉｎ　Ｉｇｕ
ｃｉｎｍ−ａｃｏｕ−ｍｘｌａｔｉｎｇ　１ｓｏｌｅｕ
ｃｉｎｅ　ｒａｖｅｒｔａｎｔｓ　ｏｆＳｍｒｒａｔｉ
ａ　ｍａｒｃａａｄｅｎａ、Ｊ、Ｂｉｏｅｈａｒｎｏ、
　８２　ｅ９５−１ｏ　’！Ｉ、”’） １０、　　キス＜、Ｍ、Ｊ、カトウ、Ｓ、コマツ／９う
。

１、チ／々夕。（１９’［年）。セラチア・マルセツセ
ンスの制御性突然変異体によるイ、ンロイシン、バリン
およびロイシンの生成。［ソエネテイクス・オプ・イン
ダストリアル・マイクロオーガニズムーバクテリア」 ［Ｋｉｓｕｍｉ、　Ｍｏ、　Ｊ、　Ｋａｔｏ、　Ｓ、Ｋ
ｏｒｎｏｔｓｕｂａｒａ。

１、Ｃｈｉｂａｔａ、（１９７３）、　Ｐｒｏｄｕｏｔ
ｉｏｎ　ｏｆｉｓｏｌｒｕｃｉｎｅ、　　ｖａｌｉｎｅ
　　ａｎｄ　　ｌａｎｃｉｎｇ　　ｂｙ　　デーｕｌａ
ｔｏｒｙ　　ｒｎｕｔａｎｔｓ　　ｏｆ　　５ｅｒｒａ
ｔｉａ　　ｒｎａｒｃｇｓｅｓｎｓ。

＠Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　ｏｆ　Ｉｎｄｘａｔｒｉａｌ　Ｍ
ｉｏｒｏｏｒｇａｎ−ｉａｍｓ　−Ｂａｃｔｅｒｉａ　
’　、　）１１、　　ロソヤーソン、Ａ、お裏びＭ、フ
ロイントリツと。（１９ｇ９年）。イソロイシン、バリ
ンおよびロイシン生合成の制御。■。ニジエリシア、・
コ１Ｊｆｆ−１２の弛緩および収斂菌株におけるロイシ
ンによる生育阻害の轡構。ピオシミカ・工・− ビオフィジカ・アクタ、１３ＲＡ２６３０２゜（Ｒｏｇ
ｔｒａｏｎ、　Ａ、、ａｎｄ　Ｍ、Ｆｒｍｘｎｄｌｉｃ
ｈ、　（１９６９）、　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　１ａｏ
ｌａｓｅｉｎａ、　ｖａｌｉｎｔｒａｎｄ　１ｒｕｅｉ
ｎｅ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、■、Ｍｅｃｈａｎｉ
ｓｒｎｏｆ　ｇｒｏｗｔｈ　１ｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｂ
ｙ　ｌｔｎｂｃｉｎｇ　１ｎｒｅｌａｘｅｄ　ａｎｄ　
ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ　５ｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｅｓｅｈ
ｇ−Ｌ−ロイシン並び罠他のアミノ酸を生成する生合成
経路に関するいくつかの一般的文献も発行されている。

下記のものを参照されたい。

１２　ツエンチルマイ、Ａ、お裏ヒ１．ホルパス。

（１９７ｇ年）２分枝鎖アミノ酸生合成の制御。

アクタ・ミクロビオロジー・アカデミ−・サイエンス・
ハンガリー、第２３巻１３７〜１４９両（５ｔｓｎｔ　
１ｒｒｎａｉ、　Ａ、ａｎｄ　Ｉ　Ｈｏｒｖａｔｈ、（
１９７６）。Ｒｇｇｔｂｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｒａｎ
ｅｈｍｄ−ｃｈａｉｎ　ａｍｉｎ。

ａｏｉｄ　ｂｉｏａｙｎｔｈｍ’ａｉｔｔ、Ａｏｔａ　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ。

Ａａａｄ、Ｓｅｉ、　Ｈｕｎｇ、、、　２４．．１３７
−１４９．）、１３．　　ア、ムノ々−ガー、Ｈ，Ｅ、
（１９’１４年）。エンテロバクテリアシアのイソロイ
シンおよび／々ザリン合成酵素の多価側＃に関与する元
素。プロシーデインダス・オツ・ファート・インターセ
クショナル・コンブレス・オプ・ＩＡＭＳ、、ｌ、　東
京。

［Ｕｍｂａｒｇｅｒ、ＨｏＥ、（１９７４）、　Ｔｈｅ
　、ｍｌｅｍｇ−ｎｔｓ　　１ｎｖｏｌｖｅｄ　　ｉｎ
　　ｔｈｅ　ｙｂｌｔｉｖａｌｍｎｔ　　ｒａｇｕｌ−
ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　１ｓｏｌｅｕｃｉｎｅ　ａ
ｎｄ　ｖａｌｉｎｅ　。

ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｅｎｚｙｍｅｓ　ｏｆ　ｔ
ｈｅ　Ｅｎｔｅｒｏｂａ−Ｔｏｋｙｏ、） １４、　　アムバーガー、Ｈ，Ｅ、（ｔｏｙｓ年）。エ
ンテロバクテリアシアのインロイシン、バリンおよびロ
イシン生合成酵素の違伝学的および生理学的制御。［ヅ
エネテイクス・オツ・インダストリアル・マイクロオー
ガニズムス」より。

［Ｕｍｂａｒｇｔｒ、ＨｏＥ、（１９７Ｌ）、Ｇｅｎｅ
ｔｉｃａｎｄ　ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｒｅｇｕ
ｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅｉｓｏｌｔｔｕｅｉｎｔ、
ｖａｌｉｎｅ　　ａｎｄ　　ｌａｎｃｉｎｇ　　ｂｉｓ
ｏｙｎ−１ｈｍｔｉｅ　ｅｎｇｙｍａｓ　ｏｆ　ｔｈｅ
　Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ−Ｃｇαｇ、Ｆｒｏｍ
　　”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａ
ｌＭｉｅｒｏｏｒｇａｎｉａｍｓ、＠） １５、　　アム／々−ガー、＃、＃、（１９７８年）。

アミノ酸生合成およびその制御。アニュアル・レビュー
・・オブ・／９イ１オ、ケミストリー、第４７巻５３３
〜６０６頁、５６３頁。

（Ｕｍｂａｒｇａｒ、Ｈ６Ｅ、（１９７Ｂ）、　　Ａｒ
ｎ１ｎｏ　Ａｃ１ｄＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ａｎｄ
　Ｉｔｓ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ、Ａｎｎ。

本発明１ｉＬ−ロイシンの同族体に対して耐性のあるブ
レビバクテリウム・チオｒ二１タリスの突然変異菌株（
ｍｕｔａｎｔ　’５ｔｒａｉｎ）を好気的条件下で培養
することを含むＬ−ロイシンの製造方法に関する。

突然変界に選げれるブレビ／９クテリウム・チオグニタ
リスの野生菌株（例えば、ＡＴＣＣ１９２４０）ｄグル
タミン酸の過剰生成の特徴を有する。

微生物がＬ−ロイシンを生成する生合成の経路は一般に
知られている。例えば、アムバーガー、［アミノ酸生合
成及びその制御Ｊ　　（Ｕｍｂａｒｇｍｒ。

”　　Ａｍ１ｎｏ　　Ａｃ１ｄ　　Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅ
ｓｉｓ　　ａｎｄ　　ＩｔｓＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ”　
）　１４？Ｌ？Ｌ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１９
７８゜４７：５６３〜５６５を参照されたい。この参考
文献に述べられているごとく、その合成はピルビン酸塩
、α−アセト乳酸塙、α、β−ジヒドロキシイソ吉草酸
填、α−ケトイソ吉草酸塩、α−イソゾロ２ルマレイン
酸塩、β−イソプロピルマレイン酸塙、α−ケトイソ力
・テロン酸塩、Ｌ−ロイシンなる段階を経て進行すると
信じられている。

天然産アミノ酸の成る種の同族体は本発明の突然変異菌
株を分離するのに適している。これらの同族体はＬ−ロ
イシンを過剰生成しない菌株ＩＬ対して毒性を有する。

この種の同族体ｖｃＶｉα−アミノーβ−ヒドロキシ吉
草酸、メタルグリシンおよびβ−ヒドロキシロイシンが
ある。

ロイシン同族体に耐性のめる突然変異菌株はプレビノク
クテリウム・チオｒニタリスの野生型菌株−ニトロソグ
アニジン等を用いて処理することＶＣより得ることが出
来る。そのあと、その菌株を同族体の存在のもとで培養
してＬ−ロイシンを過剰生成する集落を分離することが
出来る。例えば菌株鉱ゼラチン加水分解物（デトン５．
ｏｔ／ｌ、牛肉抽出物３．Ｏｆ／ｌ、寒天１５　ｆ／ｌ
、２−ヒドロキシ−β−吉草酸す゛トリウム塩２５　ｆ
／ｌなる組成物の寒天グレート上で３０℃にて２乃至７
日間培養することが出来る。

アルファーアミノ−β−ヒドロキシ吉草酸に耐性のある
プレビパクテリウノ、・チオｒニタリスのＬ−ロイシン
生成突然変異菌株の生育培養体（下記実施例２の生成物
）は＆ＡＴＣＣ３９１０４としてアメリカン・タイプ・
カルチャー・コレクション、１２３０１ノ母−り・ロー
ン通、ロックビル、メリランド州２０８５２　、（Ａｍ
ｅｒｉｃａｎ　ＴｇｇＣｕｌｔｕｒｅ　ＣｏｌｌｇＣｔ
ｉｏｎ、　　１２３０１　Ｐａｒｋ　ＬａｗｎＤｒｉｖ
ｅ　、　Ｒｏｃｋｖｉｌ　ｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　
２０８５２　）に寄託されている。

上記ブレビ／９クテリウム・チオｒニタリスの突然変異
菌株ＡＴＣＣ３９１０４の菌学的性質（ｍｏｒｐｈｏｌ
ｏｇｉａａ、ｌ　ｐｒｏｐｅｒｔｉｇｇ　）は、該変異
菌株がその親菌株ＡＴＣＣ１９２４０よりもより多くＬ
−ロイシンを生産し且りＬ−ロイシン同族体に対し耐性
であること以外は、該親菌株圧りいて公知の菌学的性質
と実質的に同じである。

ブレビバクテリウム・チオｒニタリスの分離された突然
変異菌株の発酵はｓ盪培讐または好気的条件下での深部
発酵により行うことが出来る。発酵は２５乃至４０ηに
て５乃至８（好ましくは６．５乃至７．５）のｐＨにて
行われる。媒質のｐＨの調節には炭酸カクシウムおよび
アンモニアを用いることが出来る。発酵媒質は炭素源お
よび他の元素を含む。発酵に適した炭素源ｐｃは、発酵
性糖、蛋白加水分解物および蛋白が６．る。適当な窒素
源の例は尿素、有機酸、アンモニウム塩（例えば酢酸ア
ンモニウムおよび蓚酸アンモニウム）および無機酸アン
モニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニ
ムまたは塩化アンモニウム）−である。

媒質中の炭素源および窒素源の量は０．００１乃１２０
Ｗ／Ｖパーセどトである。また、有機養分（例えば１．
トウモロフシ浸出液、ベグトン、酵母抽串物、大豆抽出
分、）および／または無機要素（例えば、燐酸カリウム
、硫酸マグネシウム、ビオチンおよびチアミンのごとき
ビタミン、およびアミノ酸例えばバリン）を媒質に加え
ることが出来る。発酵は１６乃至１７６時間で完了し、
そして発酵液中にＬ−ロイシンが蓄瀬される。

発酵が完了した後、即ち発酵液中に０．１乃至６Ｗ／Ｖ
Ａ−セントのＬ−ロイシンが蓄積した後、細胞および他
の固体培養成分が濾過または遠心分離のこと自従来の方
法により発酵液から除去される。Ｐ液または上澄液から
のＬ−ロイシンの回収および／または精製には公知の方
法を用いることが出来る。例えば、濾過された発酵液は
強陽イオン交換樹脂を用いて処理される。次に樹脂はア
ンモニア水のごとき希アルカリ溶液を用いて溶離される
。Ｌ−ロイシンを含む溶離液は合せられ、濃縮される。

メタノールまたはエタノールのごときアルカノールを該
濃縮液圧加える。沈殿した結晶をメタノール水溶液また
はエタノール水溶液のごときアルカノール水溶液から再
結晶して、Ｌ−ロイシンの純粋な結晶を得ることが出来
る。

下記の実施ｆｉＩｔ；ｉ本発明を例ら限定することなく
例示するものである。［ディフコＪ　（＠Ｄｉｆｃｏ“
）はマイクロ／＃イオロジカル・アンド・クリニカル・
ラボラトリ−の方法のための脱水和培養媒質おディフコ
・うがラドリーズ社、デトロイト、ξシガン州１９５３
年（Ｄｉｆｅｏ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＩｎｃｏｒ
ｐｏｒａｔｅｄ、ＤｇｔｒｏｉｔｌＭｉｃｈ、（１９６
３）　）□、オ、。　パ 実施例１ ３０℃にて２日間生育させたブレビ・々クテリツム・チ
オｙニタリスＡＴＣＣ培養体１９２４０の養分含有寒天
（デフイコ）斜面培養物をｐ　Ｈ７，０のｏ１Ｍ燐酸ナ
トリウム緩衝液で洗浄した。得られた細胞懸濁液を傾斜
法で滅菌試験管に入れ、それに十分量の変異誘発物質、
エチルメタンスルホネニ）（Ａ；’ＭＳ）を０．０８Ｍ
ＩＩ度になるよう罠加えた。ＥＭＳで処理された細胞を
次［３０℃にて１８゛時間培養して変異誘発物質の効果
を出させた。

培養後、細胞懸濁液を遠□心分離し、上澄液を傾斜法で
除去し、そして細胞を再び新鮮な緩衝液中に懸濁させた
。

２回洗浄して如伺なる残留する変異誘発物質を除去した
後、細胞を２５　ｔ／ｌα−アミ”ノーβ−ヒドロキシ
吉草酸（ＡＨＶ）を含む養分含有寒天の傾斜プレートの
勾配の上端部分に接種し念。

培養プレートの上−ＫｔＢ現し産耐性を有する突然変異
体を新鮮な養分含有寒天プレート１ζ移植した。３０℃
ＶＣて２４時間培養した後、分離した菌体をイソロイシ
ン媒質ｌの１−を含む管圧接種した。

１リットル当り グルコース　　　　　　　　１００Ｆ ＫＨ！ＰＯ４３ｆ ＭｇＳＯ４・７Ｂ、ＯＯ，４Ｆ Ｆｇ　５ｏ４−　’ＩＨ，ＯＯ，０１ｆＭｎＳＯ，−Ｈ
，ＯＯ，００？　５ｆ ｉＮＨ４）、Ｓｏ、　　　　　　　　　　　５０Ｆビオ
チン　　　　　　　　　１００μＶチアミンＨＣＩ　　
　　　　　　　１ダ／々クト・ソイトンｊ／（ディフコ
）　　　０．６３ｆ（Ｂａｅｔｏ−ａｏｙｔｏｎｇ） ＣａＣＯ３５Ｏｆ Ｌ／ＤＩ−、、脱、イオン化 見／　大豆粉の酵素加水分解物。［デフイコＪ　２６４
頁。

１１２℃にて１５分間オートクープ処理する前にｐＨを
ＮａＯＨを用いて７．２に調節した。

試験管を３００７ｉ！７’Ａ／、３０℃にて４日間培讐
器ｒ（入れた。ペデイオコックス・セレビシェ（Ｐｍｄ
ｉｏｃｏｃｔ、ｕｓ　ｃａｒｇｖｉｓｉａｇ　）　（Ａ
　７’　ＣＣ８Ｇ４２）を用いる・ぐイオアツセーを下
記のごとく行って、存在するＬ−ロイシンの亀を測定し
た。

１９２４Ｇ−３１と命名される耐性を有する分離物は／
々イオアツセーの結果？−６ｆ／ｌＬ−ロイシンなる測
定値を有した。

ベデイオコックス・セレビシェはその生育ｒｃ　対して
すべてＬ型のアミノ酸を必要とする。従って、／ダイオ
アツセーされるべきアミノ酸以外のすべて□ト。

の必要養分を倉む寒天媒ｉ上にペデイオコックスのロー
ン（ｌａｗｎ　）を拡げることにより発酵液中に存在す
る特定のアミノ酸の量を測定することが出来る。ミリポ
ア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｇ　）で濾過された発酵液をしみ
込ませた！！２菌Ｐ紙円板を媒質表面上に置いた場合、
核円板のまわりのペディオコックスの生育帯域を測定す
ることが出来そして標準曲線と比較する。該標準画＃ｉ
！は分析されるべきアミノ酸の既知量を含む濾紙円板の
存在のもとてペデイオコックスを生育させることにより
作成される。

ペデイオコックス・セレビシェＡＴＣＣ８０４２をミク
ロイノフルム（Ｍｉｃｒｏ　ＩｎｏｅＩＬｌｕｒｎ）発
酵液（デフイコ）４Ｘ１０−中で３７℃にて約、４４時
間生育させる。細胞を滅＠Ｉ）、１．Ｈ！０で３回洗浄
し、次九合しそして滅菌り、１．Ｈ，０１２ｄ中に再び
懸濁させる。ロイシン分析媒質ｚ６ｆおよび来天ノープ
ル（”Ｎｏｂｌｇ　）　１．５　ｆをり、Ｉ］Ｈ，０１
００ｍ！と混合することｒＣより調製されたロイシン分
析用媒質（ディフコ）のプレート上に細胞懸濁液（０，
３ｍｌ　）　＋７）ローンを拡げる。（江：ミクロ・イ
ノフルム発酵液はペプトン、酵母抽出物、デキストロー
ズ、ＫＨ，ＰＯ４およびソルビタンモノラウレート錯体
を含む市販の培養媒質である。それは［ディフコＪ２１
３頁に記載されている。ロイシン分析用媒質は同様に市
販品でありすして「ディフコ」２３０〜２３１頁に記載
されている。

該プレートから過剰の水分を蒸発させた楓、騙インチの
滅菌吸収円板（市販）に標準曲線を作るための既知量の
Ｌ−ロイシンおよび分析されるべき濾過発酵液をしみ込
ませる。

該プレートを３７℃にて２４時間培養器に置き、その時
間後生育帯域の直径を測定しそしてミリメートル単位で
記録する。標準曲線を作製し、それと未知量試料の値と
比較してＬ−ロイシンの生成量を測定することが出来る
。

微生物検知体に対する信頼性の点から、本方法はアミノ
酸生成の厳密な！量分桁値というよりもむしろ定性的な
測定値を与えるものである。

実施例２ 分離菌体１９２４０−３１は養分含有寒天上の大きい集
落および小さい集落の混合集団であることが見出された
。イソロイシン媒質すｌ中で３０”Ｃ，、ｓｏｏＲＰＭ
にて３日間生育させた場合、大きい集落がロイシンおよ
びインロイシ／より／々リン編多１１に生成し、小さい
集落についてはその逆であることが測定された。バイオ
アツセーはペデイオコックス・セレビシェを用いて行わ
れた。

１９２４０−３１−１と命名された分離菌体は０．６ｆ
／ｌのロイシンを生成した。１９２４０−３１−にと命
名された分離菌体Ｆｉ１．５ｆ／ｌロイシンを生成しそ
して続いてＡＴＣＣに寄託されそしてＡＴＣＣ３９１０
４なる受入れ番号が与えら−れた。

実施例３ 生育媒質の初期ｐＨの影響並びにフラスコの大きさおよ
び培養時間の影響を測定するために、イソロイシン媒質
ｌを調製し、そし、て種々の分量の媒質をＮａＯＨを用
いである範囲のｐＨ値（即ちオートクレーブ処理前５．
８乃至＆２）に調節した。

分離菌体１９２４０−３１−Ｋを１００−の媒質を含ｔ
ｒ５００　ｍｌ容非ジグザグ形エルレンマイヤーフラス
コおよび５０ｄの媒質を含む２５０ｍｇ容のジグザグ形
および非ソグザグ形エルレンマイヤーフラスコ中にて踵
々の時間（即ち、３乃至５日間）生育させた。

オートクレーブ処理前７．９にｐＨを調節した媒質ヲ含
む２５〇−容ジグーー形エルレンマイヤーフラスコ中に
で３０ＯＲＰＭ、３０℃にて４日間培養した場合、分５
ＩＩＩＪｌ！ｉ体１９２４０−３１−ＫＦｉ（デイオコ
ックスを用いる・ぐイオアツセーによる測定値として＆
２ｔ／ｌＬ−ロイシンの濃度を有した。

特許出願人　　〆プリュー・アール・ブレイス・アンド
・カンパニー 手続補正書 昭和５８年６月９日 特許庁１、。目　　潰　杉　Δ１」　大　　　殿１、事
件の表示 ’ｔｊ’ｉｉ４山＋ｆｊ５８−６７１５６号２、発明の
名称 祐「・痒決り一ロイシンσ＞、Ｊ、存法３、補正をする
渚 −事件との関係　　特許出願人 ４、代　理　人〒１０７ ・力、ｉｌｌ＋−４の″ゾ＋）Ｑ’ｊの＋ｉ−Ｐ＋ｒｌ
＋Ｉ７ｊ　ＨシこＬ力′の１１４（１）明則着第１６員
下から４−５１Ｔｌｌζ、「２−′　ヒドロキシ−β−
」とある倉。

「α−アミノ−β−」 と訂正する。

手続補正書 昭和５８年６　月１４日 特許片長１　若　杉　第１ｊ　　夫　　　殿１、事件の
表示 特＆Ｉに昭５８−６７１５６−号 ２、発明の名称 発酵法り一ロイシンの製法 ３、補正をする治 事件との関係　　特許出願人 （Ｊ　　所　　　アメリカ合法ｌ・１ニユーヨーク州１
００３６ニユーヨーク・アベニューオブザアメリカズ１
１１４４、代　理　人〒１０７ ６、　？ｉｉ正のｔ、ｌ象 ＋１１　　明細書第１６頁下から４−５行に、昭和５８
年６月９日付差出しの手続補正書で補正されス「α−ア
ミノ−β−」とあるを、１α−アミノ−β−ヒドロキシ
」と引止する。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、　　Ｌ−ロイシンの同族体に対して耐性のあるブレ
   ビバクテリウム・チオｒニタリス（Ｂｒｅｖ　ｉ−ｂａ
   ｃｔｅｒｉｕｍ、　ｔｈｉｏｇｍｎｉｔａｌｉｓ　）の
   突然変異菌株を好気的条件下で培養して発酵液を生成さ
   せ、そして該発酵液から蓄積したＬ−ロイシンを回収す
   ることを特徴とする、Ｌ−ロイシンの輿造方法。 ２　突然変異菌株がブレビ・々クテリウム・チオｒニタ
   リスＡＴＣＣ３９ｘｏ４である、特許請求の範囲第１項
   記載の方法。 ３、発酵を２０乃至４５℃の温度で１６乃至１７６時間
   行う、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４、培養中の発酵媒質のｐＨを５乃至８とする、特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ５、突然変異菌株がブレビバクテリウム・チオｒニタリ
   スＡＴＣＣ３９ＬＯ４であってそして発酵を２５乃至４
   ０℃にて、１６乃至１７６９間、５乃至９のｐＨにて行
   う、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、同族体がα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸、メタ
   リルグリシンおよびβ−ヒドロキシロイシンである、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 ７、同族体がα−アミノ−β−ヒドロキシ吉草酸である
   、特許請求の範囲第６項記載の方法。