SU1409659A1

SU1409659A1 - Способ получени L-пролина

Info

Publication number: SU1409659A1
Application number: SU853884279A
Authority: SU
Inventors: Шаварш Микаэлович Кочарян; Жанета Владимировна Карапетян; Сусанна Казаровна Келешян; Асмик Геворковна Азизян; Эдуард Микаэлович Акопян; Алина Владимировна Арушанян; Артур Альбертович Амбарцумян
Original assignee: Научно-Исследовательский Технологический Институт Аминокислот
Priority date: 1985-05-11
Filing date: 1985-05-11
Publication date: 1988-07-15
Also published as: YU49286A; HUT41070A; HU199898B; JPS6211099A; JPS61289893A; DE3612077A1; JPH0425799B2

Description

4ib

Q Ф О) СП

;о

Изобретение относитс к микробиологической промышленности и касаетс получени L-пролина при помопц ферментации с использованием мутантов микроорганизмов, продуцирующих L-npo- лин, что вл етс одной из важнейших аминокислот, и используетс в медицине.

Цель изобретени - повышение выхода с L-пролина,

Цель достигаетс путем использовани мутантов Brevibacterium flavum устойчивых одновременно к 3,4-деги,ц- ро-В,Ъ-пролину (далее именуетс ДП) и повышенному осмотическому давлению среды и неспособных катаболизировать L-пролин, Причем, мутации сообщающие бактери м устойчивость к ДП и повышенному осмотическому давлению сре,цы и мутации, сообщающие бактери м неспособность катаболизировать L-npo пин, как и комбинации этих мутаций обладают положительным эффектом в отношении увеличени уровн выхода L- пролина также в сочетании с иными мутаци ми, способствующими продукции Ь-пролина, например мутаци ми ауксо- трофности по L-изолейцику.

Примерами штаммов - продуцентов L-пролина, использованных в предлагаемом изобретении и хран щихс в Центральном музее промьш1ленных микроорганизмов института ВНШгенетика под соответствующими номерами ЦМПМ В вл ютс следующие мутанты Brevibac- Iteriura flavum штамм АР111 (ЦМПМ В- ;3258)Vf штамм АР110 (ЦМПМ В-3318) |штамм АР112 (ЦМПМ В-3258) и штамм |АР113 (ЦМПМ В-3260). Указанные новые штшимы получены генетико-селекционны ми приемами из штамма Brevibacterium flavum ЛТССиОб. Штаммы AP111 и API 12 вл ютс мутантами ; устойчивыми одновременно к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, а штаммы AP110 и AT113 - мутанты, устойчивые одновременно к ДП и повьш1енному осмотическому давлению и неспособные катаболизировать L-пролин, Кроме того , штаммы AP111, API 12 и АР113 вл ютс также мутантами, нуждающимис в L-изолейцине дл роста. Штаммы АР110, AP111 и AP112 и АР113 сходны, за исключением перечисленных признаков и пролинпродуцирующей способ- ности по своим культурально-морфоло гическим, культуральным и физиологи

5

0

5

0

5

0

5

ческим признакам со шт ммом Brevibacterium flavum АТСС 14067,

Мутации устойчивости к ДП и повышенному осмотическому давлению среды , неспособности катаболизировать L-пролин и ауксотрофности по L-HSO- лейцину могут быть получены поэтапно и в любом пор дке с помощью мута- генизации бактерий любым известным способом (например, обработкой N-ме- тил-N -нитро-К-нитрозогуанидином или ультрафиолетовым облучением) на каждом и последующей идентификацией соответствующих мутантов. Указанные мутации могут быть также получены у разных штаммов и совмещены в одном геноме с использованием какого- либо способа генетического обмена, например, сли ни протопластов. В качестве соединений повышающих осмотическое давление среды могут быть использованы сахароза или хлориды щелочных металлов например, хлорид натри .

Штаммы-продуценты L-пролина, использованные в предлагаемом изобретении получают следующим образом,

Пол гчение штамма Breivibacterium flavum АР110,

Штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067 выраш,ивают в м со-пептонном бульоне (далее МПБ) при 30°С с аэрацией до достижени титра 10® клеток/мл. Клетки отмывают от МПБ центрифугированием , промывают цитратным буфером, рН 5,6, вновь осаждают центрифугированием и ресуспендируют в цитратном буфере, рН 5,5, К полученной суспензии добавл ют Ы-метил-М -нитро-Ы-нит- розогуанидин (далее НГ) до конечной концентрации 300 мкг/мл и инкубируют с аэрацией в течение 20 мин при . Затем клетки отмывают от мутагена охлажденным МПБ, перенос т в пробирки с 10 мл МПБ и инкубируют 18 ч с .аэрацией при 30 С, Полученную мутагени- зированную НГ культуру осаждают центрифугированием и перенос т в пробирки cio средой № 1 состава, мг/мл: сахароза 250; Na2.SO 2; 3; . 1; MgS04-7H40 0,1; 5; 1; FeSO x , биотин 2-10 ; тиамина хлорид и ДП 1 ,5, рН 7-,4 с таким расчетом, чтобы начальный титр культуры был равен 10 клеток/мл. Культуру в пробирках выращивают с аэрацией при 30°С до помутнени (4872 ч), затем рассеивают на поверхности среды № 1, содержащей 2% агар-агара и инкубируют 48 ч при 30 С. Один из выросших на этой среде мутантов , вновь подвергают мутагенезу НГ как это описано и высеивают на поверхность агаризованной среды № 2 состава , мг/мл: глюкоза 20; 2; 3; 1; 3; l; ,0 0,1; I-IQ- -, iFeSO yHjO биотин 5-10 ; тиамина хлорид и агар-агар 20; рН 7,4. Отдельные колонии, выросшие на зтой среде через 48 ч инкубации при 30°С, 1тровер ют на способность к «росту на среде № 3, котора содержит L-пролин в качестве единственного источника углерода и азота дл роста, состав среды № 3, мг/мл: L-пролин 10; Naa.S04. 2; КгНР04 3; 1; ,MgS04 7H20 0,1; MnS04-5H2 0 1 FeS04-7Hj O биотин 5-10 ; тиамина хлорид 1 -10 . и агар-агар 20, рН 7,4. Колонии, неспособные к росту на среде № 3 через 96 ч инкубации -при

О

30 С, провер ют на пролинпродуцирую- щую способность в услови х, указанных в примере 1. Один из отобранных таким образом мутантов обозначен Вге- vibacterium flavum АР 110.

Получение штамма Brevibacterium flavum АР111.

Мутагенизированную культуру штамма А СС 14067 (услови мутагенеза такие же, как при получении штамма АР 110) высевают на среду № 2, котора содержит дополнительно L-изолейцин в концентрации 0,5 мг/мл. Среди колоний , выросших на этой среде через 48 ч инкубации при 30 С отбирают мутант , неспособный к росту на среде № 2, котора не содержит L-изолейцин Полученный изолейциновый ауксотроф вновь мутагенизировали Н7 и отбирают мутанты, устойчивые к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, как описано при получении, штамма AP110, но с той разницей что в среду № 1 внос т вместо 250 мг/мл сахарозы 20 мг/мл глюкозы и 28 мг/мл NaCl, а также 0,5-мг/мл L-изолейцина. Один из отобранных таким-образом мутантов продуцирующий повышенные количества L-пролина, обозначен Brevibacteriiim flavum АР111.

Получение штамма.Brevibacterium flavum АР 112.

Изолейц1шовый ауксотроф штамма АТСС 14067 ,индуцированный НГ, как описано при получении штамма АР 11 1-,вновь обрабатывают НГ и отбирают мутанты, устойчивые к ДП и повышенной концентрации сахарозы на среде № 1, как описано. дл получени штамма AP110 с той разницей ,что среда № 1 содержит 0,5 мг/мп L-изолейцина. Один из отобранных таким образом мутантов, продуцирующий повышенные количества L-пролина, обозначен Brevibacterium flavum AP112.

Получение штамма Brevibacterium flavum АР 113.

У штамма АТСС 14067 отбирают мутант , неспособный катаболизировать L-пролин с помощью приемов, описанных при получении штамма АР 110. На следующем этапе у полученного штамма, неспособного катаболизировать L-пролин , отбирают мутант, устойчивый к ДП и повышенной концентрации сахарозы , с помощью приемов, описанных дл получени штамма API 10. У полученного двойного мутанта, который неспособен катаболизировать L-пролин и устойчив к ДП и повышенному осмотическому давлению среды, отбирают мутант, нуждающийс в L-изолейцине дл роста, приемами, описанными при получении штамма АР 111. Один из полученных таким образом мутантов, продуцирующий повьш1енные количества L-пролина, обо- знг.чен Brevibacterium flavum AP113;

Отличительные признаки мутантных штаммов, использованных в предлагаемом изобретении, в сравнении друг с другом и штаммом АТСС 14067 даны в табл. 1.

Способность к катаболизму L-проли.- на определ ют по по влению роста в зоне нанесени капель суспензий штаммов , указанных в табл. 1, на поверхности агаризованной среды № 3 (состав среды № 3 указан) после 96 ч инкуба-, ции при 30°С. По вление роста обозначено знаком +, а отсутствие роста знаком -.

Дл определени устойчивости к ДП и повышенному осмотическому давлению среды бактерий штаммов, указанных в табл. 1, внос т из расчета 10 клеток/мл в пробирки с жидкой средой № 1 (состав среды № 1 указан), содержащей 250 мг/мл сахарозы и различные концентрации ДП (в случае штаммов API 11, AP112 и AP113 среда № 1 содержит L-изолейцин в концентрации

Oj5 мг/мл). Пробирки инкубируют в те- Ч€1ние 24 ч при 30 С с аэрацией, а за- Т(1М определ ют оптическую плотность кз льтур при 540 мкм. Представленные в табл. 1 данные выражены в процентах от оптической плотности культур, вьфащенных в среде № 1, котора не ссщержала ДП.

любым известным способом, таким как удаление бактерий и нерастворимых частиц проточным центрифугированием или фильтрацией, посадка L-пролина на ионообменные смолы с последуюи ими элюцией, концентрированием и кристаллизацией L-пролина,

П р и м е р 1, В ферментационные

Дл накоплени L-пролина в культу-1 о колбы объемом 250 мл асептически раз- рфльной жидкости мутантов, предлагае- ливают по 10 мп простерилизованной Mtix в данном изобретении, могут быть ферментационной среды следующего сос- использованы любые питательные среды, тава, г/л: сахароза 150; (NH) содержащие усво емые источники угле- 55; 1; MgS04 7H O 10; СаСО

15 50; FeS04 7H O 0,01; MnSOv5H O

0,01; ZnSO VHgO 0,01; биотин 0,0005; тиамина хлорид 0,0005; рН 8,0. Колбы инокулируют штаммом Brevibacterium flavum АР 110 и инкубируют на качалке 20

рода, азота, неорганические соли и органические вещества, стимулирующие рост микроорганизмов и продукцию L-пpoлинa.

Накопление L-пролина имеет место пфи культивировании в аэробных услови х в достаточно широком диапазоне т(мператур и значений рН, хот оптимальными вл ютс температуры 28- 3:1°С, а значени рН 6,5-8,5.

По вление L-пролина наблюдаетс чсфез 8-10 ч после начала ферментации . Однако, максимальный уровень L -пролина в культуральной жидкости достигаетс в результате полного потв течение 72 ч при 30 С. В полученной после инкубации культуральной жидкости выход L-пролина составл ет 40,5 г/л. В этих же услови х штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067 про- 25 дуцировал 3,4 г/л L-пролина.

Пример 2. Услови фермента- .ции и состав ферментационной среды, как указано в примере 1, с тем исключением , что в состав среды внос т так

рсблени источника углерода и энергии 30же L-изолейцинв концентрации 0,1 5 г/л

(через 36 ч и более после начала фер-и различные колбы инокулируют штаммам (1нтации в зависимости от использо-ми Brevibacterium flavum АР111, BreВ/1ННОЙ концентрации источника углеро-vibacterium flavum AP112 и Brevibacда и энергии)..terium flavum API 13. Выход L-пролина

Содержание L-пролина в культураль- 35 культуральных жидкост х, полученных

нЬй жидкости определ ют с помощью ме-после ферментации указан в табл. 2.

тода бумажной хроматографии и окраши- В.1НИЯ изатином.

Накопленный L-пролин может быть в щелен из культуральной жидкости

I Г

АТСС 14067

- J

AP110 (ЦМПМ В-3317)

100 13

100 76

0,01; ZnSO VHgO 0,01; биотин 0,0005; тиамина хлорид 0,0005; рН 8,0. Колбы инокулируют штаммом Brevibacterium flavum АР 110 и инкубируют на качалке 0

в течение 72 ч при 30 С. В полученной после инкубации культуральной жидкости выход L-пролина составл ет 40,5 г/л. В этих же услови х штамм Brevibacterium flavum АТСС 14067 про- 5 дуцировал 3,4 г/л L-пролина.

Пример 2. Услови фермента- .ции и состав ферментационной среды, как указано в примере 1, с тем исключением , что в состав среды внос т такВ аналогичных услови х выход L- пролина у изолейциновых ауксотрофов штамма Brevibacterium flavum АТСС 14067 не превьпиает 20 г/л.

Таблица 1

12 12 67 53

46

Редактор И. Сегл ник

Составитель Н, Афанасьева Техред Л.Олийнык

Заказ 3446/26

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушска наб., д, 4/5

Продолжение табл.1

Корректор В.Гирн к

Подписное

Claims

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-ПРОЛИНА путем ферментации с использованием мутантов микроорганизмов, относящихся к роду Brevibacterium в питательной среде, содержащей усвояемые источники углерода, азота, неорганические соли и стимуляторы роста с последующим вы делением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода L-пролина, используют мутанты Brevibacterium flavum, устойчивые одновременно к.аналогам пролина и к повышенному осмотическому давлению среды и неспособные.катализировать L-пролин.

2. Способ поп. 1, о т л и ч а - . ю щ и й с я тем, что в качестве мутантов используют штаммы бактерий Brevibacterium flavum АР 111 или Brevibacrerium flavum АР 112.

3. Способ поп. 1, о т л и ча- га щ и й с я тем, что в качестве му·* тантов используют штаммы бактерий g

Brevibacterium flavum АР 110 или Brevibacterium flavum АР 113.