DE2943727A1

DE2943727A1 - Verfahren zur aethanolfermentation

Info

Publication number: DE2943727A1
Application number: DE19792943727
Authority: DE
Inventors: Steven D Crawford; Mark S Pemberton
Original assignee: Gulf Oil Corp
Current assignee: Gulf Oil Corp
Priority date: 1978-12-06
Filing date: 1979-10-30
Publication date: 1980-06-19
Also published as: NL7907287A; US4224410A; SE7907985L; BE880416A; DK517979A; FR2443505A1; FI792744A; NO792808L; JPS55111792A; GB2036074A; SE436757B

Description

DR. JOACHIM STEFFENS

DIPLOM-CHEMIKER UND PATENTANWALT

MOZARTSTRASSE 24

D-8032 LOCHHAM(MDNCh[N

TELEFON: (089) 87 25 51 TELEX: 529830 staff d

IHR ZEICHEN:

mein zeichen: Kelly-133 29. Oktober 1979

Gulf Oil Corporation, P.O. Box 1166 Pittsburgh, Pa. 15230 USA

Verfahren zur Athanolfermentation

Die Erfindung betriffχ ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Äthanol aus Cellulose. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird ein cellulosehaltiges Substrat in einer Stufe mit Cellulaseanzymen und mit einem Mittel zur Herstellung von Äthanol zur Reaktion gebracht.

Die Herstellung von Äthanol aus Cellulose und cellulosehaltigen Materialien in einer Stufe ist in der US-PS 39 90 944 beschrieben. Abwandlungen dieser Methode sind z.B. aus der US-PS 40 09 075 bekannt.

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Professional Representativ before the European Potent Office

Postscheckkonto München Nr. 199520-805 ■ Bayerisch« Vereinsbank München Nr. 905200 (BLZ 70020270)

- JT-

Außerdem ist in den US-?Sen 37 11 392, 40 94 740 und 40 93 516 die Herstellung von Äthanol aus organischein Abfallmaterial beschrieben.

Die US-PS 40 09 075 (Koge) beschreibt die Verwendung von Saccharomyces cerevisiae als Hefe, die sich zur Umwandlung der in situ gebildeten Glucose in Äthanol eignet. Gernäß der US-PS 39 90 944 (Gauss et al.) werden Saccharomyces cerevisiae und Rhizopus javanicus für denselben Zweck verwendet. Weder in einer der US-PSen 40 93 516 und 40 94 740 (Lang) noch in der US-PS 37 11 392 (Metzger) sind spezielle Hefen beschrieben, welche Glucose in Äthanol umwandeln. Zu anderen Hefen, welche bekanntlich Glucose in Äthanol umwandeln können, sind Baker-Hefe (Baker's yeast) und Saccharomyces carlsbergensis.

Araano et al. beschreiben in "A Strongly Ethanol Assimilating New Yeast", The Society of Fermentation Technology, Japan, 53 (1975), 311, die Hefe Candida brassicae, IFO 1664, ATCC 32196 und deren einzigartige und nicht nahegelegte Unterschiede von anderen bekannten Candida-Species. Gemäß Amano et al. wird Candida brassicae, ATCC 32196, so beschrieben:

Cultura in extracto malti: Zugabe bei 25⁰C, nach 3 Tagen cellulae ovoideae ad cylindricae, 2,5-5x3-17,5 μΐη, singulares vel catenatae; pseudomycelium praesens. Sedimentum et pellicula formantur.

Cultura in striis agaro malti: Zugabe bei 17⁰C, post

unum mensem color albidus ad flavalbidus, pagina opaca,

elevata, mollis et laevis vel crispulata. Pseudomycelium praesens abundanter.

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Ascos^orae, bailistosporae et teliosporae nullae. Ferzientatio: Glucosuu.

Assinilatio originum carbinum: glucosum, galactosura, sucrosua, inaltosuin (valde exigue), raffinosum (exigue), D-xyloium (exigue), ethanolum, glycerolum, acidum lacticuin et aciduo succinicuiu.

Kalii ultras non assimilatur, arbutinum non finditur, ureura non finditur. Vitamina addita non necessaria sunt.

Temperature maxima crescentiae 43-45⁰C.

TYPUS: culture RI7Y Z-I7 in der Sammlung des Research Institute of Ferasiita'cion, Yamanashi University, Kofu, isolate e flio Brassica oleracea var. capitata in Kofu, Japonia, 1973.

V/achatua im Malzextrakt: Nach 3 Tagen bei 25⁰C sind die Zellen kurz-oval bis zylindrisch, (2,5-5)x(3-17,5) μΐη, einzeln, in Paaren oder in Ketten (Fig. 1). Pseudomycelzellen werden gebildet (Fig. 2). Ein Sediment und eine dünne, runzelige Haut werden gebildet.

Wachstum auf Malzagar: Nach 1 Monat bei 17⁰C ist die Streifenlcultur weiß bis leicht gelblich, matt, erhaben (raised), weich und glatt oder leicht runzelig.

Gleitkulturen auf Kartoffelagar: Ein Pseudomycelium mit einer baumartigen Formation wird reichlich gebildet (Figuren 3 und 4).

Bildung von Sporen: Kein Ascospor, Ballistospor oder Telio- spor wird gebildet.

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ORIGINAL INSPECTED

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Fermentation:

Glucose + Trehalose

Galactose - Lactose

Sucrose - Raffinose

Maltose - Xylose

Assimilation von Kohlenstoffverbindungen:

Glucose + D-Ribose

Galactose + L-Rhamnose

L-Sorbose - Äthanol +

Sucrose + Glycerin +

Maltose vw Erythrit

Cellobiose - Ribit

Trehalose ' - Galactit

Lactose - D-Mannit

Melibiose - D-Glucit

Raffinose w a-Methyl-D-glucosid -

Melezitose - Salicin

Inulin - DL-MiIchsäure +

lösliche Stärke - Bernsteinsäure +

D-Xylose v; Citronensäure

L-Arabinose - Inosit

D-Arabinose

Assimilation von Kaliumnitrat: keine.

Wachstum in einem vitaminfreien Medium: gutes Wachstum.

Natriumchloridtoleranz: 14 bis 15 % (Gew./Vo¹·).

Maximale Wachstumstemperatur: 43 bis 45⁰C.

Spaltung von Arbutin: negativ.

Hydrolyse von Harnstoff: negativ.

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Es wurde nunmehr gefunden, daß Candida brassicae, ATCC 32196, mehrere neue und nicht naheliegende Vorteile gegenüber herkömmlichen Hafen bei der Umwandlung in Äthanol der in situ gebildeten Glucose ergibt, welche durch Verzuckerung von Cellulosenriaterialien in einer gleichzeitigen Verzuckerungs-Fermentations-Reaktion hergestellt wird.

Somit wird die Methode der US-PS 39 90 944 (Gauss et al.) durch Verwendung von Candida brassicae anstelle von Saccharomyces cerevisiae oder Rhizopus javanicus verbessert.

Wie es vorstehend beschrieben ist und wie es dem die gleichzeitige Verzuckerung—Fermentation betreffenden Stand der Technik entspricht, kennzeichnet sich die Erfindung darin, daß eine Cellulase und ein alkoholerzeugender Mikroorganismus auf einem Substrat aus entweder Cellulose oder einer hauptsächlich aus Cellulose bestehenden Substanz gleichzeitig zur Reaktion gebracht werden.

Beispiele für als Ausgangsmaterialien erfindungsgemäß geeignete Cellulosesubstrate sind gereinigte Cellulose, Agrikulturprodukte, wie Baumwolle, Holz, Reisstroh, Weizenstroh, Maisohren (Kaiskolben) und andere Substanzen, welche überwiegend aus Cellulose bestehen, beispielsweise Zeitungen, Wellpapier, Zeitschriftenpapier und Abfallpapier. Es ist zweckmäßig, diese wirksam als Substrate für die Verzuckerungsreaktion in Gegenwart von Cellulase verwendbaren Substanzen zu pulverisieren oder zu zerkleinern. Für die Hydrolyse dieser Cellulosesubstrate genügt eine handelsübliche Cellulase. Man kann ein Enzympräparat, wie Cellulase Onotsuga, verwenden. Eine eine Cellulase enthaltende Flüssigkeit, d.h. eine KuItürflüssigkeit aus einem cellulaseerzeugenden Mikroorganismus, wie eine Kulturflüssigkeit von Trichoderma reesei QM9414

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(Trichoderma viride QK9414), ist ebenfalls verwendbar.

Die Hefe Candida brassicae, ATCC 32196 eignet sich als alkoholproduzierender Mikroorganismus, welcher gleichzeitig wit den vom Abbau der Cellulose stammenden Hexosen umgesetzt wird.

Damit das Cellulosesubstrat gleichzeitig durch eine Cellulase und die Candida brassicae zur Reaktion gebracht wird, v/ird eine wäßrige Suspension mit einem Gehalt von 1 bis 30 Gew.-Sj Cellulose oder einer hauptsächlich aus Cellulose bestehenden Substanz zubereitet und thermisch sterilisiere, um als Substrat zu dier.en. Das Substrat wird dann mit einer Cellulase (oder einer cellulasehaltigen Flüssigkeit) versetzt, und gleichzeitig wird die vorkultivierte C.brassicae zugegeben, so daß die Reaktion anaerob bei Temperaturen von etwa 30 bis 45⁰C erfolgen kann.

Ein weiterer Vorteil wurde bei der Verwendung des Mikroorganismus Candida brassicae, ATCC 32196, beobachtet. Sowohl während der Kultivierung des Organismus vor der Einimpfung in die gleichzeitige Verzuckerung - Fermentation als auch während der Fermentation allein und der gleichzeitigen Verzuckerungs-Fermentation wächst der Organismus zu einer größeren Bioniassenausbeute und insbesondere zu einer grösseren Zellenzahl pro Einheitszeit als die üblichen Hefen für die Hexose-zu-Alkohol-Fermentation. Die Kultivierung von C.brassicae, ATCC 32196, in einem Nährmedium bei Tem-· peraturen von 30 bis 45⁰C ergibt somit mehr aktive Zellen für die Beimpfung des gleichzeitigen Verzuckerungs-Fermentations-Reaktionsgemisches, und die Biomassenrückstände sind nach der Fermentation oder gleichzeitigen Verzuckerungs-Fermentation größer und gewährleisten somit größere Nebenproduktverminderungen hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit

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der Herstellung von Äthanol aus Cellulose. Das Biomassenprodukt ist ein Tiernährfutter mit hohem Proteinwert.

Ferner werden hohe Zellenausbeuten über einen breiten Temperaturbereich erzielt. Es wurde festgestellt, daß ausserordentlich hohe Zellenausbeuten bei Temperaturen bis 42/43⁰C bei einer Temperatur gezüchtet werden können, bei welchen Temperaturen die meisten Hefen keine Propagierung zeigen.

Zum besseren Verständnis der Erfindung dienen die beigefügten Zeichnungen und deren Erläuterung, welche jedoch nicht im einschränkenden Sinne aufzufassen ist.

In sämtlichen Zeichnungen repräsentieren die Kurven eine vernünftige Interpretation der Aktivität als Funktion der Temperatur, bei welcher die Aktivität festgestellt wird. Die Kurven werden gezogen, um die erzielten Werte aufzuzeigen, und spezielle Punkte entsprechen experimentellen Werten.

In jeder Kurve haben die speziellen Punkte folgende Be-

Candida brassicae ATCC 32196 Saccharomyces cerevisiae ATCC 4126 Saccharomyces cerevisiae ATCC 4132 Saccharomyces carlsbergensis IAM 4787 Saccharomyces cerevisiae ATCC 24858

Figur 1 veranschaulicht die Geschwindigkeit der Bildung von Äthanol während eines 24-stündigen Zeitraums bei der angegebenen Temperatur für verschiedene Hefen, wobei die Kultivierung in einem 100 g/l Glucose enthaltenden Medium, welches die üblichen Wachstumszusätze enthält, erfolgt;

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deutung:	(O)
Kreise	(Δ)
Dreiecke	(X)
Kreuze	(D)
Quadrate	(O)
Rhomben

- sr -

Figur 2 veranschaulicht die tatsächliche Glucosekonzentration einer Hefekultur, welche in einem 20 g/l Glucose enthaltenden Medium wächst, 12 Stunden nach der Beimpfung und Reaktion bei den verschiedenen angegebenen Temperaturen.

Figur 3 zeigt die Hefezellenzahl im Biomassenrückstand nach 24 Stunden bei den angegebenen Temperaturen einer gleichzeitigen Verzuckerung - Fermentation von Cellulose nach der Methode der US-PS 39 90 944 (Gauss) nach Beimpfung mit einer äquivalenten Konzentration von Cellulase, abgeleitet von Trichoderma reesei QM 9414, und identische Zellenzahlen der verschiedenen Hefen.

Figur 4 zeigt die Massenkonzentration von Zelleneinheiten, welche nach 12 Stunden V/achstum der angegebenen Hefe am glucosehaltigen Nährnedium (wie oben für Fig. 2 definiert) bei verschiedenen Temperaturen erhältlich sind. Die Figuren 3 und 4 veranschaulichen die zugefügten Zellwachstumscharakteristika von Candida brassicae, ATCC 32196.

Figur 5 zeigt die gesamte Äthanolausbeute nach 24 Stunden gleichzeitiger Verzuckerung—Fermentation, durchgeführt bei verschiedenen Temperaturen. Die Kurven zeigen, daß bei Temperaturen von 37,5 bis 4O⁰C die Hefe Candida brassicae ATCC 32196 der üblichen Saccharomyces cerevisiae und Saccharomyces carlsbergensis etwa äquivalent ist, daß jedoch bei Temperaturen oberhalb 40⁰C die Aktivität der Hefe hoch bleibt, ohne daß eine Verminderung der Alkoholproduktion eintritt. Da die gleichzeitige Verzuckerung — Fermentation ein insgesamt exothermer Prozeß ist, welcher im allgemeinen bei 37,5 bis 40 ⁰C erfolgt, ist die Fähigkeit der Hefe zur Beibehaltung der Aktivität bei oberhalb 40⁰C wirtschaftlich vorteilhaft, weil kostspielige und komplizierte Kühlvorrichtungen nicht erforderlich sind und eine teilweise "weglaufende" Reaktion ohne Verlust an Alkohol-

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ausbeute toleriert werden kann.

Die Fermentation und Hefeproduktion wird dadurch vorgenommen, daß man eine wäßrige Aufschlämmung der Hefe zu einem Nährmedium, welches 2 % Glucose, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % Malzextrakt und 0,5 % Pepton enthält, unter langsamem bis mittlerem Rühren (1 20 Upm) und einer Belüftungsgeschwindigkeit von 1 v/v/m zugibt. Ein pH-Wert von 5.0 wird durch intermittierende Zugabe standardisierter Reagentien aufrechterhalten. Die Zellen werden nach 24-stündigem Wachstum bei 38⁰C abzentrifugiert, und der Zellenkuchen dient für die Fermentation von Glucose oder bei einer gleichzeitigen Verzuckerungs-Fermentations-Reaktion, wie nach der Methode der US-PS 39 90

ZUSAMMENFASSUNG

Die Fermentation von Glucose und gleichzeitige Verzuckerung-Fermentation von Cellulose unter Verwendung von Cellulase und einer Hefe werden durch Verwendung der Hefe Candida brassicae, ATCC 32196, verbessert.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung von Alkohol aus Cellulose durch gleichzeitige Zugabe von Cellulase und einer Hefe zu einem cellulosehaltigen Material und Isolierung und Gewinnung des resultierenden Äthanols, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida brassicae ATCC 32196 verwendet.

2. Verfahren zur Herstellung von Äthanol aus fermentierbaren Zuckern durch Fermentation, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida brassicae ATCC 32196 verwendet.

3. Verfahren zur Herstellung von Kefeprotein aus dem Wachstum einer Fermentationshefe in einem Nährmedium, dadurch gekennzeichnet, daß man als Hefe Candida brassicae ATCC 32196 verwendet.

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ORIGINAL INSPECTED